JP7025934B2

JP7025934B2 - 生物フラックスの較正のための方法及び装置

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Publication number: JP7025934B2
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Inventors: アンドリュー・シー・ニールソン
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Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2022-02-25
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Description

［関連出願の相互参照］
無し。

本発明は、例えば生物フラックスを測定する機器であるフラックスアナライザの改善された較正のための方法及び装置に関する。

生細胞は一般に、その周囲環境からの酸素（Ｏ２）を消費し、二酸化炭素（ＣＯ２）、乳酸塩等の代謝副産物、及び様々なその他の代謝副産物を放出する。フラックスアナライザは、酸素消費速度（ＯＣＲ）、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）、ＣＯ２産生速度（ＣＰＲ）、及び／又はその他の生物フラックスパラメータの測定を可能にする。そのような測定は、これらの生細胞によって行われる代謝過程に関する有用な情報を提供し得る。

生細胞のＯＣＲ及びＥＣＡＲの１つの既知の測定方法は、ウェルプレート中でこれらの生細胞によって生成されるＯ２及びＨ＋を一連の蛍光センサを使用して測定することによるものである。Ｏ２及びＨ＋のフラックスを検出するのに蛍光センサを用いるアナライザの一例は、特許文献１及び特許文献２に一般的に記載されているSeahorse社フラックスアナライザである。それらの蛍光センサは、蛍光シグナルの強度を経時的に測定する。生細胞を含む試料の場合には、それらの経時的なシグナルは、細胞の代謝によって消費又は産生されるＯ２分子及びＨ＋イオンの産生速度又は消費速度に比例することとなる。このデータを使用することで、生細胞によって消費及び産生されたＯ２分子及びＨ＋イオンのフラックスが計算される。

フラックスアナライザ及びフラックス測定に関連した問題には、標準化がないことと、正確な較正（calibration）基準の入手の困難さとが含まれる。フラックスは、定常状態条件で測定されるのではなく経時的に測定されるので、センサ及び周囲媒体への化学的な拡散又は浸透の速度は、複合体を生成する分析物と動的な測定環境との間で変動し得る。最近では、これらの問題に対処するために、フラックス測定システムは一般に、各々の分析物に付随する様々な速度定数を補償する複雑なアルゴリズムを適用している。これらの速度定数は、生物学的基準に基づいて実験的に導き出される。システム性能の最終確認は、通常、或る特定の種類の既知の細胞含量を含む生物学的標準を使用して行われ、例えば、十分に明らかにされている齧歯類の不死化骨格筋線維芽細胞系統（Ｃ２Ｃ１２）が、標準としてしばしば使用される。上記細胞系統は、使用前にレベル２の生物学研究所において、培養下で維持されている。アッセイのための調製にあたり、上記細胞はトリプシン処理され、計数され、そしてウェルプレート中に播種される。播種量は、播種の２４時間後に、細胞集団が測定可能な密集度まで増殖して、機器で使える状態となるように制御される。細胞は播種後に成長／増殖し続けるので、再現可能な結果を得るためにはアッセイのタイミングが重要である。さらに、細胞系統は、本来変動性であり、継代、遺伝子型、培養条件によって引き起こされる変動性の影響を受ける。これらの変量のため、アッセイの間におけるウェル間の典型的な再現性は、しばしば２０％ｃｖを上回る。生物学的標準の変動性によって、生物学的標準がフラックス測定システムの性能を確認するために使用するのに適した標準ではなくなる。

ウェルプレート内でフラックスを生成させるためのその他の方法には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、硫酸ナトリウム、又はレドックス反応のような酵素／触媒の使用が含まれる。これらの方法は、以前から使用されているが、それらもまた変動性及び複雑性の影響を受ける。例えば、典型的な酵素反応は、反応することで所望のシグナルを生成する２種以上の化合物に依存する。２つの化合物の反応は、濃度依存的であり、したがって、フラックスは、触媒が反応の一部として消費される場合には、変動性（非線形）である。さらに、これらの方法は、速度定数の点で調整が難しく、２種以上のフラックスが望まれる場合には複雑になる。生物学的活性を再現するそのような方法のためには、反応成分を、プレートの底に付着させ、制御可能な速度で線形に異化させることが必要となる。これらの要求がアッセイを困難にし、複雑にする。

米国特許第７，２７６，３５１号米国特許第８，２０２，７０２号

まとめると、フラックスアナライザの動作を較正するために、使用される細胞に頼らないデバイスのようなより良い標準が求められている。

本開示の較正装置の一実施形態の断面図である。図１Ａの較正装置のウェルの拡大断面図である。２種の分析物のフラックス速度を測定するためにプランジャを受け入れている較正装置のウェルの拡大断面図である。

本明細書で使用される用語「フラックス（flux）」は、時間の関数としてのパラメータの変化を意味する。その変化は、そのパラメータによって表される反応物の消費又は反応により見込まれ得る。

ここで図１Ａ及び図１Ｂに関して、本開示のフラックスブロックは全体として符号１００によって示される。フラックスブロック１００は、（１）第一のフレーム１０２、（２）第二のフレーム１０４、及び（３）選択的透過性の膜１０６を含む。この実施形態においては、フラックスブロック１００の第一のフレーム１０２及びフラックスブロック１００の第二のフレーム１０４は、連結されているか、又は一体形成されている。例えば、フラックスブロック１００は、相応して連結される２個以上の個別に形成された部分（例えば二分の一片（halves））から形成され得る。それらのフレームは、永久的に又は取り外し可能に相互係止する、例えば共にはまり合う（snap）縁部などの物理的対合面を有し得る。或いはそれらのフレーム同士は、接着剤又はろう付けによって互いに連結され得る。

より具体的には、第一のフレーム１０２は、（１）第一の壁部１０８、（２）第二の壁部１１０、（３）第三の壁部１１２、及び（４）第四の壁部（断面図では示されず）を含む、複数の壁部を備える。第一のフレーム１０２の壁部は、内側表面及び外側表面を含む。或る特定の実施形態においては、第一のフレーム１０２は、マルチウェルマイクロプレート又はウェルプレートを画定する。第一のフレーム１０２の複数の壁部は、複数のウェル１１４を部分的に取り囲んでいる。或る特定の実施形態においては、第一のフレーム１０２の複数のウェル１１４は、４個の異なる列及び６個の異なる行で配列されている。このように、この実施形態における第一のフレーム１０２は、２４個のウェルを含む。複数のウェル１１４は、錐形又は部分錐形であってよい。

或る特定の実施形態においては、第一のフレーム１０２の複数のウェル１１４は、種々の列数、種々の行数、又はそれらの組み合わせで配列されていてよい。例えば、本開示のフラックスブロック１００のもう一つの実施形態は、８個の異なる列及び１２個の異なる行で配列されている複数のウェル１１４を含むウェルプレートを含み得る。このように、ウェルプレートのこのもう一つの実施形態は、９６個のウェルを含み得る。フラックスブロックの更にもう一つの実施形態は、単一行のウェル、例えば単一行の８個、１２個、１６個、又は２４個のウェルを含む。フラックスブロックの更にもう一つの実施形態は、１６個の異なる列及び２４個の異なる行を含む。このように、ウェルプレートのこのもう一つの実施形態は、３８４個のウェルを含み得る。

図１Ｂは、フラックスブロック１００の第一のフレーム１０２の単一のウェル１１４の拡大図、並びに膜１０６及び第二のフレーム１０４とのその関係を図示している。このウェル１１４の壁部１１６は、１種以上の適切な液体試料の容量を保持するように構成されているウェル空間１１８を画定する。ウェル１１４の壁部１１６は、内側表面及び外側表面を含む。ウェル１１４は、以下で更に記載されるように、プランジャ又はその他のセンサを受け入れるように構成されている。

本開示のフラックスブロック１００は、充填材１５０を含み得る。充填材１５０は任意であり得ることが推察されるべきである。充填材１５０は、第一のフレーム１０２及び／又は第二のフレーム１０４と同じ材料でできていてよい。また、充填材１５０は、その他の適切な材料でできていてもよい。充填材１５０は、フラックスブロック１００の動作を妨げるべきではない。

ウェル１１４は、ウェル底部１２０を含む。ウェル１１４のウェル底部１２０は、第一の表面１２１及び第二の表面１２２を含む。第二の表面１２２は、第一のセパレータ１２４に係合する。ウェル底部１２０及び第一のセパレータ１２４は、それぞれ開口部を有し、それらが一緒になってウェル開口部１２６を画定している。ウェル開口部１２６は、ＣＯ２、Ｏ２及び／又はその他の気体分子若しくは液体分子を、ウェル１１４のウェル空間１１８中及び／又はその外に移動させることを可能にする。或る特定の実施形態においては、液体分子及び／又は固体分子は、ウェル開口部１２６を通じて移動することで、ウェル１１４のウェル空間１１８の中及び／又はその外に更に移動することができる。

或る特定の実施形態においては、ウェル底部１２０の第一の表面１２１は、非平坦表面を有し、その内周部よりもその外周部でわずかに高くなっていてよい。或る特定の実施形態においては、センサ止め部１２３は、ウェル１１４のウェル底部１２０の第一の表面１２１から延びている。センサ止め部１２３は、プランジャがウェル１１４のウェル空間１１８中に送り込まれるときに、そのプランジャに係合するように構成されている。それに代えて又はそれに加えて、第一の表面１２１の高くなった部分がセンサ又はプランジャに係合することで、低い方の部分にセンサ又はプランジャが接触することが防止され得る。センサ／プランジャの使用に関する更なる詳細は、以下で述べられる。或る特定の実施形態においては、本開示のフラックスブロック１００は、ウェル１１４のウェル底部１２０の第一の表面１２１に連結された、そこから延びる１個以上のセンサ止め部１２３を含み得る。或る特定の実施形態においては、１個以上のセンサ止め部１２３は、ウェル１１４のウェル壁部１１６の内側表面によって画定され得る。１個以上のセンサ止め部１２３は、角度を有しても又は傾斜していてもよい。本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、傾斜又は角度を有しているのではなく、段状に存在する１個以上のセンサ止め部１２３を含み得る。このように、それらの１個以上のセンサ止め部１２３の上面は、ウェル１１４のウェル底部１２０の上面１２１と平行であってよい。

各々のウェルは、面積Ａ１を有する開口部を有する頂部と、面積Ａ２を有する円筒形又は正方形であってよい底部とを有してよく、そのウェルは、テーパ状の側壁によって画定され得る。Ａ２は、Ａ１よりも大幅に小さくてよい。座面が設けられることで、障壁に配置されたセンサのための積極的な止め部として働くことができる。この座面は、米国特許第７，２７６，３５１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で述べられるように、局所的に減少された媒体の容量をもたらすことを可能にする。一実施形態においては、座面は、ウェルの底面上の複数の盛り上がったドット部、例えば３個のドット部によって画定され得る。ウェルの面積及び深さは、任意の大きさであってよく、好ましくは、面積Ａ１が、４０ｍｍ^２～６０ｍｍ^２、或いは５０ｍｍ^２、面積Ａ２が、９ｍｍ^２～１５ｍｍ^２、或いは１１．４ｍｍ^２、及び、ウェルの深さが、１ｍｍから１６ｍｍ、或いはそれ以上までの範囲、好ましくは約１５ｍｍであってよい、から選択することができ、これらの寸法を有する実施形態は、単一列又は行のウェルを含むプレート、及び２４個又は９６個のウェルを含むプレートを含む。プレートが３８４個のウェルを含むもう一つの実施形態においては、ウェルの面積Ａ１及びＡ２並びに深さは、上記と同じであるか、又は上記の数に比例している。好ましくは、ウェル同士は、互いに等しく間隔が空けられている。マイクロウェルプレート中の各々のウェルは、本質的に同じ寸法を有してよく、又は様々な寸法を有してよい。

第二のフレーム１０４は、（１）第一の壁部１２８、（２）第二の壁部（見えていない）、（３）第三の壁部１３２、（４）第四の壁部（図示せず）、（５）第五の壁部１３６、及び（６）第六の壁部１３８を含む、複数の壁部を備える。この実施形態においては、第一の壁部１２８は、管（図示せず）を受け入れるように構成された取り入れ口／取り出し口１４０を画定する。本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、取り入れ口／取り出し口１４０を画定する第二のフレーム１０４のその他の適切な壁部を備え得ると推察されるべきである。第二のフレーム１０４の壁部は、内側表面及び外側表面を含む。第六の壁部１３８を取り外すことで、フラックスブロック１００を洗浄することができる。第六の壁部１３８は、洗浄又は補修のような適切な目的のために第二のフレームから取り外すことが可能である。

或る特定の実施形態においては、第二のフレーム１０４の壁部は、ＣＯ２、Ｏ２又はそれらの組み合わせのような適切な物質の体積を保持するように構成されたチャンバ１３９を画定する。チャンバ１３９は、その他の物質の体積を保持することができ、かつ該チャンバは、そのような物質を保持するために、例えばその表面上にコーティングを有することによって適合させることができることが推察されるべきである。さらに、本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、１種以上の適切な液体試料、その他の１種以上の適切な気体試料又はそれらの組み合わせの体積を保持するように構成されたチャンバ１３９を画定する第二のフレーム１０４の壁部を備え得ることが推察されるべきである。上記チャンバは、複数の部分チャンバに分けられていてよく、上記フレームは、異なる部分チャンバについて異なる取り入れ部－取り出し部を有してよい。

上壁部１３６の第一の表面１４２は、第二のセパレータ１４４に係合している。上壁部１３６及び第二のセパレータ１４４は、存在するのであれば、ウェル開口部１２６と位置合わせされているチャンバ開口部１４６を画定する。チャンバ開口部１４６及びウェル開口部１２６は、ＣＯ２、Ｏ２及び／又はその他の分子を第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中に、及び／又はそこから外へ、そしてウェル空間１１８中に移動させることが可能なほど十分に位置合わせされているか、又は同心である。

選択的透過性の膜１０６は、１種以上の物質を該透過性の膜１０６を越えて透過可能に構成されており、ここで、これらの物質は、フラックスアナライザによって測定されるフラックスを構成するか、又は該フラックスを生ずる。例えば、上記膜は、ＣＯ２、Ｏ２又はその両方を、膜の一方の側からもう一方の側へと通過させることを可能にし得る。また、選択的透過性の膜は、水、その他の溶剤及びその他の分子の１つ以上に対する障壁としても働く。一般に、透過性の膜は、ウェル中の液体のチャンバ中への大量移動を妨げる。図１Ｂに図示されるように、選択的透過性の膜１０６は、第一のセパレータ１２４と第二のセパレータ１４４との間に挟持される。第一のセパレータ１２４及び第二のセパレータ１４４は、ウェル１１４のウェル底部１２０の第二の表面１２２と第二のフレーム１０４の第五の壁部１３６の第一の表面１４２との間に位置している場合に透過性の膜１０６がほぼ動かないように構成されている。透過性の膜１０６は、ウェル１１４のウェル空間１１８と第二のフレーム１０４のチャンバ１３９との間の境界として働く。

フラックスブロック１００の或る特定の実施形態においては、第一のセパレータ１２４及び第二のセパレータ１４４は、第一のフレーム１０２と第二のフレーム１０４との間に位置している場合に、透過性の膜１０６が、第二のフレーム１０４の上壁部１３６の第一の表面１４２及びウェル１１４のウェル底部１２０の第二の表面１２２から等距離であるように構成されている。本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態においては、第一のセパレータ１２４及び第二のセパレータ１４４は、第一のフレーム１０２と第二のフレーム１０４との間に位置している場合に、透過性の膜１０６が、第二のフレーム１０４の上壁部１３６の第一の表面１４２からウェル１１４のウェル底部１２０の第二の表面１２２までのその他の適切な距離に位置するように構成されていてよい。上記セパレータ及びフレームは、適切な位置合わせを保証するための位置合わせ印を有し得る。さらに、透過性の膜１０６は、ウェル１１４のウェル空間１１８と第二のフレーム１０４のチャンバ１３９との間の境界である。

或る特定の実施形態においては、本開示のフラックスブロック１００は、第一のセパレータ１２４及び第二のセパレータ１４４を含まない。そのような実施形態においては、選択的透過性の膜１０６は、第二のフレーム１０４の上壁部１３６の第一の表面１４２及びウェル１１４のウェル底部１２０の第二の表面１２２に係合する。或る特定の実施形態においては、上記膜は、第一のフレーム１０２に最も近い第二のフレーム１０４の面全体にわたって広がっている。そのような実施形態においては、膜１０６は、ウェル１１４のウェル空間１１８と第二のフレーム１０４のチャンバ１３９との間の境界である。さらに、膜１０６は、第一のフレーム１０２及び第二のフレーム１０４のどちらか又は両方と一体であってよいことが推察されるべきである。上記膜は、第一のフレーム及び／又は第二のフレームの本質的に全表面にわたって広がっている単独のシートであってよいか、又はウェル開口部を覆う別々のパッチであってよい。

本開示のフラックスブロック１００は、成形されたプラスチック、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート又はその他の適切な材料から形成され得る。ウェルの底部は、ウェル中のセンサがウェル中の内容物によって放出若しくは反射された光を収集するように不透明若しくは反射性であってよく、又はウェルの底部は、光がこれらの底部を通過することが可能であるように透明であってよい。或る特定の実施形態においては、ウェルの側部は、或るウェルから別のウェルへの光学的クロストーク又は光コンタミネーションを減らすように不透明である。幾つかの実施形態においては、例えば発光測定で使用するためには、ウェルは、白色又は反射性であってよい。

或る特定の実施形態においては、透過性の膜１０６は、ポリメチルペンテンフィルム、例えばＴＰＸフィルムである。或いは透過性の膜１０６は、ポリスチレンであってよい。さらに、或る特定の実施形態は、その他の適切な材料でできた選択的透過性の膜を含み得ることが推察されるべきである。幾つかの実施形態においては、上記膜は装置から取り外し可能であるため、その膜を取り替えることで、較正装置を一新することができる。

本開示のフラックスブロック１００は、較正アプリケーションを実行するウェルベースの分析システム、例えば光学的システム又はフラックスアナライザを較正するにあたって使用するために設計されている。幾つかの実施形態においては、本開示のフラックスブロックをフラックスアナライザの較正に使用する方法は、第二のフレームのチャンバを、既知のＣＯ２濃度、例えば１００％で充填することと、第一のフレームのウェルのウェル空間を、既知のＣＯ２濃度、例えば０％を有する緩衝溶液で充填することと、ＣＯ２若しくはＯ２又は水素イオンのような分析物の濃度の変化を経時的に測定することとを含む。幾つかの実施形態においては、本方法は、フラックスアナライザが合格するか又は不合格となるかを評価することを更に含む。幾つかの実施形態においては、本方法は、測定値を１つ以上の基準と比較することと、その測定値がその基準を満たすかどうかを判定することとを更に含み、これらの実施形態においては、上記基準は、単独の値又は値の範囲であってよい。幾つかの実施形態においては、本方法は、補正係数をアナライザに、又は更なる較正のために適用することを評価することを更に含む。

より具体的には、本方法は、管（図示せず）を第二のフレーム１０４の第一の壁部１２８の取り入れ口／取り出し口１４０に連結することを含み得る。ＣＯ２分子は、管中を通り、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中に移動し、したがって、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９は１００％のＣＯ２でパージされる。換言すれば、チャンバ１３９中のＣＯ２の分圧は、１００％である。第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中のＯ２の分圧は、０％である。チャンバ１３９を１００％のＣＯ２でパージしたら、配管装置は、取り入れ口／取り出し口１４０から取り外される。シール（図示せず）は、第二のフレーム１０４の第一の壁部１２８の外側表面に係合することによって、取り入れ口／取り出し口１４０を覆う。該シールは、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９が、ＣＯ２分子を収容することを可能にするので、ＣＯ２はチャンバ１３９から出て行かず、かつその他の１種以上の気体試料又は液体試料は、チャンバ１３９に入らない。

さらに、本方法は、第一のフレーム１０２の複数のウェル１１４のウェル空間１１８を、適切な容量の試験溶液、例えばｐＨ７．４を有する緩衝溶液で充填することを含む。ウェル空間１１８は、その他の１種以上の適切な液体試料の容量及び／又は生細胞周りの媒体の容量を保持することができる。さらに、本方法は、ＣＯ２のような１つ以上のパラメータにおける変化又はフラックスを測定することを含む一方で、緩衝溶液を周囲条件下で平衡化することを可能にする。周囲条件は一般に、約２１％のＯ２及び０．０３％のＣＯ２であるガス分圧の条件を含む。周囲条件下での平衡化によって、緩衝溶液は、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中のＣＯ２の１００％の分圧より低いＣＯ２の分圧を含むように平衡化する。このＣＯ２の分圧の差は、透過性の膜１０６にまたがるＣＯ２の濃度勾配を生成する。したがって、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中のＣＯ２濃度が、緩衝溶液を含むウェル１１４のウェル空間１１８中よりも高い場合は、ＣＯ２は、膜を越えて移動し続けることとなる。さらに、緩衝溶液が周囲条件下で平衡化する間に、Ｏ２の濃度勾配が形成する。したがって、緩衝溶液を含むウェル１１４のウェル空間１１８中のＯ２の濃度は、Ｏ２の０％の分圧を含む第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中よりも高い。

上記の濃度勾配が第二のフレーム１０４のチャンバ１３９と第一のフレーム１０２のウェル１１４のウェル空間１１８との間に形成する場合に、Ｏ２分子及びＣＯ２分子は、それらの濃度勾配を下方へ動かす。換言すれば、それぞれの分子は、より高い濃度の領域から第二の濃度へと移動する。そのような場合に、ＣＯ２は、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９からウェル１１４のウェル空間１１８へと移動する。より具体的には、ＣＯ２分子は、チャンバ開口部１４６を通じて移動する。さらに、ＣＯ２分子は、透過性の膜１０６を越えて透過する。さらに、ＣＯ２分子は、ウェル１１４のウェル開口部１２６中を進み、そこでさらにＣＯ２分子は、第一のフレーム１０２のウェル１１４のウェル空間１１８中の緩衝溶液中で可溶化する。Ｏ２分子は、ウェル１１４のウェル空間１１８から第二のフレーム１０４のチャンバ１３９へと移動する。より具体的には、Ｏ２分子は、ウェル１１４のウェル空間１１８のウェル開口部１２６を通じて移動する。さらに、Ｏ２分子は、透過性の膜１０６を越えて透過する。さらに、Ｏ２分子は、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９のチャンバ開口部１４６中を進み、チャンバ１３９を満たし、こうして第二のフレーム１０４のチャンバ１３９中のＯ２分圧が増大する。平衡化時間の間のウェル中のＯ２分子及びＣＯ２分子の変化又はフラックスは、以下でより詳細に説明されるように、高い信頼度で計算することができる。したがって、Ｏ２分子及びＣＯ２分子の濃度は、平衡化の間に測定することができ、そして測定値を計算値と比較することができ、アナライザの精度を決定することができる。測定値が計算値と異なる場合には、補正措置を講じることができる。補正措置は、アナライザを調節すること、補正係数を既存の測定値及び／又は見込みの測定値に適用すること、又はセンサを洗浄若しくは取り替えることであってよい。こうして、アナライザは較正される。

ＣＯ２分子が緩衝溶液中で可溶化する場合に、ＣＯ２分子は、以下の反応：
ＣＯ２（気体）＋Ｈ２Ｏ（液体）＜－＞Ｈ^＋（水溶液）＋ＨＣＯ３^－（水溶液）
を起こす。

換言すれば、ＣＯ２分子は、緩衝溶液中の水（Ｈ２Ｏ）分子と反応して、水素イオン、すなわちＨ＋イオンを形成する。Ｈ＋イオンの形成は、溶液のｐＨの低下を引き起こす。

或る特定の実施形態においては、Ｏ２分子及びＨ＋イオンの濃度の変化を測定し、さらにそれぞれの分析物のフラックスを計算する方法は、プランジャ２６０を、第一のフレーム２０２のウェル２１４のウェル空間２１８中に送り込むことを含む。プランジャ２６０は、１個以上のセンサ２６４を含む（例えば、内蔵、保持又は支持する）。図２は、第一のフレーム２０２の第一のウェル２１４の１つのウェル空間２１８におけるこの過程及び装置の一実施形態を図示している。この実施形態においては、透過性の膜２０６は、第一のセパレータ２２４及び第二のセパレータ２４４に係合する。

プランジャ２６０は、手動式若しくは自動式のアクチュエータ又はその他の支持体から延びている。障壁２６２は、プランジャ２６０の一方の端部に配置されている。１個以上のセンサ２６４が、プランジャ２６０の障壁２６２の遠位端に配置されている。センサの一例は、蛍光インジケータ、例えばシリコーンゴムのような酸素透過性の物質中に包埋された酸素消光型蛍光体（oxygen-quenched fluorophore）である。蛍光インジケータは、ウェル中の成分の存在及び／又は濃度に依存する蛍光シグナルを提供する。その他の種類の既知のセンサ、例えば電気化学的センサ、ＩＳＦＥＴセンサ、及び電流測定センサ、例えばクラーク電極のようなセンサを使用することができる。

或る特定の好ましい実施形態においては、１個以上の光学センサは、蛍光センサを含む。蛍光センサは、緩衝溶液中のＯ２分子及びＨ＋イオンの濃度の一定期間にわたる変化速度に比例する蛍光シグナルの強度を検出するように構成される。１個以上のセンサ２６４は、光ファイバ又はワイヤ２７０を介して、較正手続きを実行するプロセッサを含むシステム２６６と電気的に通信する。較正手続きは、１個以上のセンサ２６４によってウェル２１４のウェル空間２１８中の緩衝溶液中の分析物との通信を検知して収集、計測又は測定されたデータ（例えば測定されたフラックス）を使用して、システム２６６を較正するようにプログラムされる。

幾つかの実施形態においては、自動化された動作によって、プランジャ２６０は、第一のフレーム２０２のウェル空間２１８中に下降する。単一のプランジャが、所与のウェル中に下降し、プランジャ同士は、例えば、標準的な２４－ウェルプレート、９６－ウェルプレート、又は３８４－ウェルプレートのような標準的なウェルプレート中のウェルの位置と位置合わせされるように精密に間隔が空けられていてよい。プランジャ２６０の障壁２６２は、センサ止め部２２３に係合する。プランジャ２６０の障壁２６２とウェル２１４のプランジャ止め部２２３との係合は、低減された容量の媒体を有するマイクロウェル２６８を画定する。この実施形態においては、マイクロウェル２６８は、上記の１つ以上の化学反応又はその他の反応を実施する緩衝溶液の低減された容量を保持する。本開示のフラックスブロック１００の幾つかの実施形態においては、マイクロウェル２６８は、１０マイクロリットル未満の容量の緩衝溶液を保持するように構成されている。この容量は、ウェルの底部の面積（例えば、１１．４ｍｍ^２）及び障壁止め部（stop barrier）の高さ（例えば、０．２ｍｍ）によって画定され得る。或る特定の実施形態においては、マイクロウェル２６８は、１０マイクロリットルより多い容量の緩衝溶液又はその他の適切な１種以上の液体試料を保持するように構成され得る。この容量のマイクロウェル２６８は、１個以上のセンサ２６４が一定時間にわたるＯ２分子及びＨ＋イオンの濃度の変化を測定することを可能にする。それというのも、Ｏ２分子は、マイクロウェル２６８から第二のフレーム２２８のチャンバ２３９へと移動し、そしてＣＯ２分子は、第二のフレーム２２８のチャンバ２３９からマイクロウェル２６８へと移動し、引き続き上記の化学反応を起こすからである。この容量のマイクロウェル２６８は、測定感度を更に高める。マイクロウェル２６８は、静止プランジャの障壁又はセンサのその他の支持体又は構成体が、第一のフレーム２０２のウェル２１４のセンサ止め部に係合するように、第一のフレーム２０２を、静止プランジャに向けて移動させることによって画定され得ることが推察されるべきである。センサ止め部は任意であり、試料より上にある所望の高さにセンサを位置決めする構成体であれば、どのようなものでも使用することができる。

マイクロウェル２６８が画定されたら、１個以上の光学センサ２６４は、ウェル２１４のマイクロウェル２６８中のＯ２分子及びＨ＋イオンの濃度の一定期間にわたる変化速度に比例する蛍光シグナルの変化を検出する。１個以上のセンサ２６４は、これらの濃度の変化を表すデータを、ワイヤ又は光ファイバ２７０を介してアナライザシステム２６６に送る。較正アプリケーションを実行するプロセッサは、このデータを受け取り、それぞれの分析物のフラックスを測定する。さらに、プロセッサは、（１）それぞれの分析物の測定されたフラックス速度、及び（２）較正手続きに予定された補正係数を用いて光学アナライザ２６６を較正する。プランジャの使用についての更なる詳細は、米国特許第７，２７６，３５１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に提供される。

或る特定の実施形態においては、本開示のフラックスブロック１００のウェル２１４の直径、特にウェル２１４の底部での直径Ｄ２（図２に示される）は、プランジャ２６０の障壁２６２の直径Ｄ１（図２に示される）より僅かに小さく、こうして障壁２６２は、該障壁２６２がウェル２１４の障壁止め部２２３に係合する場合に、マイクロウェル２６８の容量とウェル２１４のウェル空間２１８の残りの容量との間に境界を画定する。

或る特定の実施形態においては、本開示のフラックスブロック１００は、それぞれの分析物が透過性の膜を通って移動する場合に、それぞれの分析物の一定時間にわたる所望のフラックス速度（Ｑ）を維持するように構成され得る。より具体的には、以下の等式における変数：（１）透過性の膜の厚さ（ｔ）、（２）透過性の膜の表面積（Ａ）、（３）気体試料及び／又は液体試料の透過性の膜にまたがる濃度差（ｄＰ１）、（４）第二のフレームのチャンバ中の気体試料のガス圧（ｄＰ２）、並びに（５）透過性の膜の透過係数（Ｋ）は、それぞれの分析物の所望のフラックス速度が保持されるように調節され得る。これらの変数は、以下の等式、
Ｑ＝ＫＡｄＰ１ｄＰ２／ｔ
において、透過性の膜を越えて移動するそれぞれの分析物の所望のフラックス速度が保持されるように調節及び使用することができる。

本開示のフラックスブロック１００及び較正方法の或る特定の実施形態においては、Ｏ２分子に望ましいフラックス速度は、約１００ピコモル／分～１５０ピコモル／分である。膜パラメータ、例えば厚さ及びその膜が作られる材料は、該膜がその検討される使用条件（試験流体の圧力（ｄＰ１）及び所望のフラックス速度で膜を通過することとなるＣＯ２のような物質の分圧（ｄＰ２）を含む）下で所望のフラックス速度を有することとなるように選択され得る。ｄＰ１の単位は、ｐｓｉであり、ｄＰ２の単位は、百分率である。試験流体が１００％ＣＯ２ガスであるフラックスブロックでの使用のために検討されるポリメチルペンテン材料の膜については、その厚さは一般に、５０μｍから１５０μｍまでの範囲となり、その面積は一般に、１ｍｍ^２から５ｍｍ^２までの範囲となる。同じ条件下でのポリスチレンの膜については、その厚さは一般に、５μｍから１５μｍまでの範囲となり、その面積は一般に、１ｍｍ^２から５ｍｍ^２までの範囲となる。ウェル開口部の面積を選択することで、膜の面積は決定され得る。

本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、グルコース、アミノ酸、脂肪、及び活性剤等の炭素源を、第二のフレーム１０４のチャンバ１３９、ウェル２０２のウェル空間１１８、ウェル２０２の部分ウェル２１６、又はそれらの組み合わせ中に送達可能なように構成され得る。さらに、或る特定の実施形態は、Ｏ２の分圧、液体試料及び／又は気体状試料のｐＨ等のようなバイオリアクタの環境条件を制御するように構成及び／又は使用され得ることが推察されるべきである。

本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、溶存ガス（例えば、Ｏ２、ＣＯ２、ＮＨ３）、イオン（例えば、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋）、タンパク質（例えば、サイトカイン、インスリン、ケモカイン、ホルモン、抗体）、基質（例えば、グルコース、脂肪酸、アミノ酸、グルタミン、グリコゲン、ピルビン酸塩）、塩、及び／又は無機物のようなその他の適切な分析物のフラックス速度を測定するように構成され得る。上記成分は、細胞の少なくとも一部によって培地から取り出され得る。上記成分は、細胞の少なくとも一部によって培地中に分泌され得る。

さらに、本開示のフラックスブロック１００の或る特定の実施形態は、（１）第一のフレーム、及び（２）第二のフレームを含む２個以上の、例えば２個の個別の着脱可能な部材から形成又は作製され得ることが推察されるべきである。第一のフレーム及び第二のフレームのそれぞれは、第一のフレームを第二のフレームに、及びその逆に（永久的又は取り外し可能に）取り付けることをそれぞれ可能にする第一の取付機構及び第二の取付機構を備える。

また、本開示は、フォイルバッグ中に密封された１個以上のフラックスブロックを含むキットを提供する。フラックスブロックは、フォイルバッグ中に密封されていれば、最大７日間、保持され得ることが判明した。

実施例１
この実施例は、本開示のフラックスブロックが、フラックスアナライザ用の補正係数を決定するためにどのようにして使用され得るかを実証するものである。この実施例においては、図１の一般的な配置を有する５個のフラックスブロックを評価することで、それぞれのフラックスブロック中のそれぞれのウェル中でのセンサの繰り返しの測定からセンサ補正係数を計算した。上記のように、補正係数を較正に適用することで、フラックスアナライザが較正される。補正係数を適用して、フラックスアナライザを較正することによって、センサから収集されるデータについての変動係数が改善する。

上記５個のフラックスブロックは、２４個のウェルを含んでいた。それぞれのフラックスブロックを、４回の試験にて全体で２０回の試験にわたり評価した。チャンバを１００％のＣＯ２ガスで充填し、ウェルには少ない容量のリン酸緩衝食塩水を入れた。ＥＣＡＲ及びＯＣＲデータを、それぞれのフラックスブロックのそれぞれのウェルにおいてSeahorse社ＸＦ２４アナライザを使用して（より具体的には、そのアナライザ中の蛍光センサを使用して）測定した。さらに、そのデータを使用して、以下に記載されるように、フラックスアナライザのそれぞれのセンサを較正するために適用されるべき補正係数を計算した。

補正係数を計算することに関連するデータを、表１乃至表６Ｂで列挙する。このデータは一般に、本開示のフラックスブロックの試験及び使用を代表するものである。これらの表において、「再充填なし」とは、チャンバ中の気体が試験の間に補充されない一連の試験を指し、「再充填あり」は、チャンバ中の気体が試験の間に補充される一連の試験を指す。表１に示されるように、第一のフラックスブロック（ＦＢ１と表示される）を、４回にわたり試験した。ＥＣＡＲ及びＯＣＲデータは、それぞれの試験において２４個のウェルのそれぞれにおいて測定した。その他の４個のフラックスブロックを評価する場合には、同じデータをそれぞれの試験において収集した。

それぞれのフラックスブロックのそれぞれの試験について全てのＥＣＡＲ及びＯＣＲデータを収集することによって、５個全てのフラックスブロックのそれぞれのウェルについての平均ＥＣＡＲ及びＯＣＲを計算した。このデータは、表６に「ＡＶＧ」として表されている。例えば、評価された５個のフラックスブロック中のウェル１についての平均ＥＣＡＲ測定値は、７４であった。平均ＥＣＡＲ測定値及び平均ＯＣＲ測定値は、５個のフラックスブロック全体にわたるそれぞれのウェルについて計算した。このようにして、平均センサ測定値を、所与のセンサについて、単一のフラックスブロックでの繰り返しの測定又は幾つかのフラックスブロックでの多重測定によって取得することができる。

センサ補正係数を計算するために、それぞれのセンサから（つまり、５個全てのフラックスブロック全体にわたる同じ位置のウェルから）平均ＥＣＡＲ及びＯＣＲ測定値を計算した。これらの測定値は、５個のフラックスブロックのそれぞれのウェル（ウェル１、ウェル２、．．．ウェル２４）のそれぞれの平均ＥＣＡＲ及びＯＣＲ読取り値の平均を取ることによって計算した。さらに、１個のフラックスブロックの全てのウェル全体にわたるＥＣＡＲ測定値及びＯＣＲ測定値の標準偏差を、５個のフラックスブロックのそれぞれのウェルについてのそれぞれのＥＣＡＲ及びＯＣＲ平均読取り値から計算した。５個の全てのフラックスブロックの同じウェルにおいて同じセンサを使用した。例えば、アナライザのセンサ２４を、５個のフラックスブロックのそれぞれにおけるウェル２４におけるＥＣＡＲ及びＯＣＲを測定するために使用した。平均ＥＣＡＲ及びＯＣＲ並びにＥＣＡＲ測定値及びＯＣＲ測定値についての標準偏差を使用して、全てのフラックスブロックについてのＥＣＡＲ及びＯＣＲの変動係数を計算した。表６に見られるように、ＥＣＡＲ測定値についての変動係数は１０％であり、ＯＣＲ測定値についてのＣＶは４％であった。このデータは、５個のフラックスブロックの間でＥＣＡＲ測定値及びＯＣＲ測定値のウェル間での良好な再現性を示している。

さらに、１個のフラックスブロックの平均ＥＣＡＲ測定値をアナライザ中のそれぞれのセンサからの測定値の間での平均ＥＣＡＲによって除算することによって、１個のフラックスブロックのそれぞれのウェルについての補正係数を計算した。表７Ａに見られるように、平均変動係数は、それぞれのフラックスブロックの変動係数から計算した。この平均ＣＶは１２であった。さらに、表７Ｂは、ＣＶがどのように減少するか、したがって、フラックスブロックを使用することで収集されたデータに補正係数を適用した場合に結果の再現性がどのように改善するかを示している。表７Ｂにおいて、補正係数を、１個のフラックスブロックのそれぞれのウェルからの平均ＥＣＡＲ測定値にかける数として使用することで、１個のフラックスブロックのそれぞれのウェルからの較正された平均ＥＣＡＲ測定値に一致した。１個のフラックスブロックのそれぞれのウェルの平均ＥＣＡＲ測定値は、このようにして調節された。さらに、１個のフラックスブロックのそれぞれのウェルの補正された平均ＥＣＡＲ測定値の平均を取ることで、７％の平均変動係数に一致した。このように、補正係数を適用することによって、２４個のセンサのアナライザの平均変動係数は５％低下したので、それは、フラックスアナライザの較正に際して補正係数を適用することで、改善された結果が得られることを示している。

実施例２
この実施例は、本開示のフラックスブロックと、生物学的な（細胞ベースの）標準とを、フラックスアナライザから測定値を取ることで比較している。この実施例において、フラックスブロックは、図１の一般的な配置を有していたが、幾つかのフラックスブロックは９６個のウェルを有していた。フラックスブロック及び細胞ベースの標準をそれぞれ使用して、Seahorse社ＸＦ２４及びＸＦ９６フラックスアナライザからＯＣＲ及びＥＣＡＲ測定値を取得した。細胞ベースの標準は、コンフルエントな細胞単層（Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋線維芽細胞）であった。表８Ａは、ＸＦ２４アナライザからのデータを示し、表８Ｂは、ＸＦ９６アナライザからのデータを示している。このデータは一般に、本開示のフラックスブロックの試験及び使用を代表するものである。それらの表は、標準のウェル間の変動係数（ＣＶ）（これらのウェルで使用されたアナライザのセンサについてのＣＶ）を報告している。また次に、それぞれのアナライザによって測定されたＯＣＲ及びＥＣＡＲの速度／フラックス（アナライザの全ての２４個又は９６個のセンサから計算した）がある。ＯＣＲについて、異なるウェルプレート間でのＣＶが計算され、それは、細胞ベースの標準が使用された場合には３９％であるが、フラックスブロックが使用された場合にはたったの１８％であった。ＥＣＡＲについては、ＣＶは、細胞ベースの標準の場合に３４％であり、フラックスブロックの場合に２２％であった。このように、フラックスブロックは、細胞ベースの標準よりもはるかに低い標準に起因する変動（アナライザを原因とし得る変動とは対照的）を有する測定値をもたらした。

ウェル間の変動（つまり、単一のウェルプレートの個々のウェルの２４個又は９６個の測定値からのＣＶ）に関して、フラックスブロックを使用した測定値の幾つかは、細胞ベースの標準よりも高いＣＶ数をもたらした。ＸＦ２４アナライザについては、ＥＣＡＲのＣＶ％は、細胞ベースのアッセイの場合に８％であり、フラックスブロックの場合に１３％であった。ＸＦ９６アナライザについては、ＯＣＲのＣＶ％は、細胞ベースの標準の場合に５％であり、フラックスブロックの場合に９％であった。しかしながら、この変動の少なくとも幾つかは、標準ではなく、むしろセンサを原因とするものである。

本明細書で引用された、特許、特許出願及び刊行物を含む参考資料の全ては、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。

本開示においては、語句「含む」、「備える」が見られる場合はいつでも、その代わりに、語句「本質的にからなる」又は「からなる」が使用され得ることが考えられる。単数の使用は、具体的に示される場合を除き、複数を含む。用語「約」が値の前にある場合はいつでも、本明細書はまた、用語「約」を除いたその値の記載も提供し、逆もしかりであると理解されるべきである。

本開示においては、本明細書に示されたいずれの機能も、そのような機能を発揮するための１つ以上の手段によって発揮され得る。本明細書に記載される方法に関しては、本明細書はまた、これらの方法を実施するための装置の記載も提供すると解釈される。本明細書に記載される装置に関しては、本明細書はまた、そのような装置の構成部材、部品、部分の記載も提供すると解釈される。

従属形式請求項が米国特許実務に従って単項従属を有するが、どの従属形式請求項におけるそれぞれの特徴も、その他の従属形式請求項又は独立形式請求項のそれぞれの特徴と組み合わせることができる。

本明細書に記載される、本発明における好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正は、当業者には明らかであろうと理解されるべきである。そのような変更及び修正は、本明細書の発明主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく、かつその意図された利点を減らすことなく行われ得る。したがって、そのような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲に含まれるものと解釈される。
なお、出願当初の特許請求の範囲の記載は以下の通りである。
請求項１：
底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつ前記ウェル開口部と少なくとも部分的に重なる少なくとも１つのチャンバ開口部を有する、前記第一のフレームと連結又は一体形成された第二のフレームと、
前記第一のフレームと第二のフレームとの間で、前記ウェル開口部と前記チャンバ開口部とを隔てる選択的透過性の膜と
を備える、フラックスアナライザを較正する装置。
請求項２：
前記膜は、Ｏ２、ＣＯ２又はその両方に対して本質的に透過性であり、かつ水に対して本質的に不透過性である、請求項１に記載の装置。
請求項３：
前記チャンバ開口部は、複数のチャンバ開口部であり、それぞれのウェル開口部は、チャンバ開口部と位置合わせされている、請求項１に記載の装置。
請求項４：
前記第二のフレームは、前記第一のフレームの向かい側に、前記チャンバへの到達が可能なように適合された取り外し可能又は滑動可能な壁部を備える、請求項１に記載の装置。
請求項５：
さらに、前記膜の第一の側に第一のセパレータを備え、かつ前記膜の第二の側に第二のセパレータを備え、それらのセパレータの両方ともセパレータ開口部を備え、かつ該第一のセパレータ及び第二のセパレータは、前記第一のフレームと前記第二のフレームとの間に挟装されており、かつ前記セパレータ開口部が、前記ウェル開口部及び前記チャンバ開口部と位置合わせされるように配置されている、請求項１に記載の装置。
請求項６：
前記ウェルは、少なくとも部分的に該ウェルの深さに沿った錐形状を有する、請求項１に記載の装置。
請求項７：
前記第一のフレームは、それぞれのウェルの底部に底壁を備え、かつそれぞれの底壁は、前記ウェル開口部の１つを取り囲み、かつウェルのそれぞれの底壁は、１個以上のセンサ止め部を備える、請求項１に記載の装置。
請求項８：
前記膜は、一方のフレーム又は両方のフレームに物理的又は化学的に固定されている、請求項１に記載の装置。
請求項９：
前記膜は、前記装置から取り外し可能であるため、その膜を取り替えることで、較正装置を一新することができる、請求項１に記載の装置。
請求項１０：
底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつ前記ウェル開口部と少なくとも部分的に重なる少なくとも１つのチャンバ開口部を有する、前記第一のフレームと連結又は一体形成された第二のフレームと、
前記第一のフレームと第二のフレームとの間で、前記ウェル開口部と前記チャンバ開口部とを隔てる、選択的透過性の膜と
を備える装置の複数のウェルを、既知の値を有する第一の分析物を含有する試験溶液で充填するステップと、
前記試験溶液を、前記第一の分析物を測定するフラックスセンサと接触させるステップと、
前記装置の第二のフレームのチャンバに、前記膜を通る物質を含有する試験流体を供給するステップと、
前記第一の分析物のフラックスを測定することであって、測定されたフラックスを取得するステップと
を含む、フラックスアナライザの較正方法。
請求項１１：
前記フラックスアナライザを、少なくとも部分的に前記測定されたフラックスに基づいて調節するか、又は前記測定されたフラックスを調節することで、補正された測定されたフラックスを取得する、請求項１０に記載の方法。
請求項１２：
前記フラックスを測定するステップは、複数のウェルの２個以上において前記第一の分析物のフラックスを測定して、複数のウェルフラックス測定値を取得し、それらの複数のウェルフラックス測定値の平均を計算し、その平均を前記ウェルフラックス測定値によって除算することによってウェル補正係数を計算することを含み、かつ、
前記測定されたフラックスを調節するステップは、前記ウェルフラックス測定値をウェル補正係数によって乗算することを含む、請求項１１に記載の方法。
請求項１３：
前記第一の分析物は、Ｈ＋であり、かつ前記測定されたフラックスは、ＥＣＡＲである、請求項１０に記載の方法。
請求項１４：
さらに、前記第一の分析物のフラックスを測定すると同時に、第二の分析物のフラックスを測定することを含み、かつ前記第二の分析物は、Ｏ２であり、かつ前記測定されたフラックスは、ＯＣＲである、請求項１０に記載の方法。
請求項１５：
前記比較することは、測定されたフラックスを計算されたフラックスへと本質的に変換する前記第一の分析物についての第一の補正係数を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。
請求項１６：
さらに、前記第一の補正係数を、前記フラックスアナライザを調節するために使用するか、又は前記フラックスアナライザに付属するソフトウェアにおいて使用することを含む、請求項１５に記載の方法。
請求項１７：
前記第一の分析物を、複数のウェル中で測定し、かつ前記測定されたフラックスは、それぞれのウェルについての個々のフラックス測定値を含む、請求項１０に記載の方法。
請求項１８：
前記物質は前記膜を通り、そして計算されたフラックスの点で前記第一の分析物を変化させ、かつ前記方法は、前記測定されたフラックスと前記計算されたフラックスとを比較することを含み、かつ前記フラックスアナライザを、少なくとも部分的に前記測定されたフラックスと前記計算されたフラックスとの比較に基づいて調節することを含む、請求項１０に記載の方法。
請求項１９：
膜と、第一のフレームと、第二のフレームとを準備するステップであって、
底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつチャンバ開口部を有する第二のフレームと、
選択的透過性の膜と
を準備するステップと、
前記ウェル開口部を、前記チャンバ開口部と少なくとも部分的に重なるように位置合わせするステップと、
前記ウェル開口部と前記フレーム開口部とを隔てるように、前記膜を、第一のフレームと第二のフレームとの間に配置するステップと、
該膜を、該第一のフレームと前記第二のフレームとの間で固定するステップと
を含む、フラックスアナライザを較正する装置の作製方法。
請求項２０：
膜を準備する前記ステップは、
第一の分析物の膜を通じた所望のフラックス速度を測定するステップと、
膜パラメータを選択することで、該第一の分析物の透過性の膜を越える所望のフラックス速度を取得するステップであって、該膜パラメータが、少なくとも材料及び厚さを含み、ここで、前記所望のフラックス速度が、式、
Ｑ＝ＫＡｄＰ１ｄＰ２／ｔ
（該式中、Ｑは、所望のフラックス速度であり、ｔは膜の厚さであり、Ａは、それぞれのウェル開口部上の膜の表面積であり、ｄＰ１は、透過性の膜を越える気体試料及び／又は液体試料の濃度差であり、ｄＰ２は、第二のフレームのチャンバ中の試験流体のガス圧であり、かつＫは、透過性の膜の透過係数である）により定義されるステップと、
該膜パラメータを有する膜を選択して、所望のフラックス速度を得るステップと
を含む、請求項１９に記載の方法。

１００フラックスブロック
１０２第一のフレーム
１０４第二のフレーム
１０６選択的透過性の膜
１０８第一の壁部
１１０第二の壁部
１１２第三の壁部
１１４ウェル
１１６壁部
１１８ウェル空間
１２８第一の壁部
１３２第三の壁部
１３６第五の壁部
１３８第六の壁部
１３９チャンバ
１４０取り入れ口／取り出し口
１５０充填材

Claims

底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつ前記ウェル開口部と少なくとも部分的に重なる少なくとも１つのチャンバ開口部を有する、前記第一のフレームと連結又は一体形成された第二のフレームと、
前記第一のフレームと第二のフレームとの間で、前記ウェル開口部と前記チャンバ開口部とを隔てる選択的透過性の膜と
を備え、
前記膜は、Ｏ _２、ＣＯ _２又はその両方に対して本質的に透過性であり、かつ水に対して本質的に不透過性である、フラックスアナライザを較正する装置。
前記チャンバ開口部は、複数のチャンバ開口部であり、それぞれのウェル開口部は、チャンバ開口部と位置合わせされている、請求項１に記載の装置。
前記第二のフレームは、前記第一のフレームの向かい側に、前記チャンバへの到達が可能なように適合された取り外し可能又は滑動可能な壁部を備える、請求項１に記載の装置。
さらに、前記膜の第一の側に第一のセパレータを備え、かつ前記膜の第二の側に第二のセパレータを備え、それらのセパレータの両方ともセパレータ開口部を備え、かつ該第一のセパレータ及び第二のセパレータは、前記第一のフレームと前記第二のフレームとの間に挟装されており、かつ前記セパレータ開口部が、前記ウェル開口部及び前記チャンバ開口部と位置合わせされるように配置されている、請求項１に記載の装置。
前記ウェルは、少なくとも部分的に該ウェルの深さに沿った錐形状を有する、請求項１に記載の装置。
前記第一のフレームは、それぞれのウェルの底部に底壁を備え、かつそれぞれの底壁は、前記ウェル開口部の１つを取り囲み、かつウェルのそれぞれの底壁は、１個以上のセンサ止め部を備える、請求項１に記載の装置。
前記膜は、一方のフレーム又は両方のフレームに物理的又は化学的に固定されている、請求項１に記載の装置。
前記膜は、前記装置から取り外し可能であるため、その膜を取り替えることで、較正装置を一新することができる、請求項１に記載の装置。
底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつ前記ウェル開口部と少なくとも部分的に重なる少なくとも１つのチャンバ開口部を有する、前記第一のフレームと連結又は一体形成された第二のフレームと、
前記第一のフレームと第二のフレームとの間で、前記ウェル開口部と前記チャンバ開口部とを隔てる、選択的透過性の膜と
を備える装置の複数のウェルを、既知の値を有する第一の分析物を含有する試験溶液で充填するステップと、
前記試験溶液を、前記第一の分析物を測定するフラックスセンサと接触させるステップと、
前記装置の第二のフレームのチャンバに、前記膜を通る物質を含有する試験流体を供給するステップと、
前記第一の分析物のフラックスを測定することであって、測定されたフラックスを取得するステップと
を含み、
前記膜は、Ｏ _２、ＣＯ _２又はその両方に対して本質的に透過性であり、かつ水に対して本質的に不透過性である、フラックスアナライザの較正方法。
前記フラックスアナライザを、少なくとも部分的に前記測定されたフラックスに基づいて調節するか、又は前記測定されたフラックスを調節することで、補正された測定されたフラックスを取得する、請求項９に記載の方法。
前記フラックスを測定するステップは、複数のウェルの２個以上において前記第一の分析物のフラックスを測定して、複数のウェルフラックス測定値を取得し、それらの複数のウェルフラックス測定値の平均を計算し、その平均を前記ウェルフラックス測定値によって除算することによってウェル補正係数を計算することを含み、かつ、
前記測定されたフラックスを調節するステップは、前記ウェルフラックス測定値をウェル補正係数によって乗算することを含む、請求項１０に記載の方法。
前記第一の分析物は、Ｈ＋であり、かつ前記測定されたフラックスは、ＥＣＡＲである、請求項９に記載の方法。
さらに、前記第一の分析物のフラックスを測定すると同時に、第二の分析物のフラックスを測定することを含み、かつ前記第二の分析物は、Ｏ２であり、かつ前記測定されたフラックスは、ＯＣＲである、請求項９に記載の方法。
前記比較することは、測定されたフラックスを計算されたフラックスへと本質的に変換する前記第一の分析物についての第一の補正係数を決定することを含む、請求項９に記載の方法。
さらに、前記第一の補正係数を、前記フラックスアナライザを調節するために使用するか、又は前記フラックスアナライザに付属するソフトウェアにおいて使用することを含む、請求項１４に記載の方法。
前記第一の分析物を、複数のウェル中で測定し、かつ前記測定されたフラックスは、それぞれのウェルについての個々のフラックス測定値を含む、請求項９に記載の方法。
前記物質は前記膜を通り、そして計算されたフラックスの点で前記第一の分析物を変化させ、かつ前記方法は、前記測定されたフラックスと前記計算されたフラックスとを比較することを含み、かつ前記フラックスアナライザを、少なくとも部分的に前記測定されたフラックスと前記計算されたフラックスとの比較に基づいて調節することを含む、請求項９に記載の方法。
膜と、第一のフレームと、第二のフレームとを準備するステップであって、
底部にウェル開口部をそれぞれ有する複数のウェルを含む第一のフレームと、
チャンバ及び該チャンバへの取り入れ口を画定し、かつチャンバ開口部を有する第二のフレームと、
選択的透過性の膜と
を準備するステップと、
前記ウェル開口部を、前記チャンバ開口部と少なくとも部分的に重なるように位置合わせするステップと、
前記ウェル開口部と前記チャンバ開口部とを隔てるように、前記膜を、第一のフレームと第二のフレームとの間に配置するステップと、
該膜を、該第一のフレームと前記第二のフレームとの間で固定するステップと
を含み、
前記膜は、Ｏ _２、ＣＯ _２又はその両方に対して本質的に透過性であり、かつ水に対して本質的に不透過性である、フラックスアナライザを較正する装置の作製方法。
膜を準備する前記ステップは、
第一の分析物の膜を通じた所望のフラックス速度を測定するステップと、
膜パラメータを選択することで、該第一の分析物の透過性の膜を越える所望のフラックス速度を取得するステップであって、該膜パラメータが、少なくとも材料及び厚さを含み、ここで、前記所望のフラックス速度が、式、
Ｑ＝ＫＡｄＰ１ｄＰ２／ｔ
（該式中、Ｑは、所望のフラックス速度であり、ｔは膜の厚さであり、Ａは、それぞれのウェル開口部上の膜の表面積であり、ｄＰ１は、透過性の膜を越える気体試料及び／又は液体試料の濃度差であり、ｄＰ２は、第二のフレームのチャンバ中の試験流体のガス圧であり、かつＫは、透過性の膜の透過係数である）により定義されるステップと、
該膜パラメータを有する膜を選択して、所望のフラックス速度を得るステップと
を含む、請求項１８に記載の方法。