TWI393882B - 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法 - Google Patents

用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法 Download PDF

Info

Publication number
TWI393882B
TWI393882B TW98141985A TW98141985A TWI393882B TW I393882 B TWI393882 B TW I393882B TW 98141985 A TW98141985 A TW 98141985A TW 98141985 A TW98141985 A TW 98141985A TW I393882 B TWI393882 B TW I393882B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
dissolved oxygen
electrode array
cell
array wafer
electrode
Prior art date
Application number
TW98141985A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201120441A (en
Inventor
Ching Chou Wu
Chia Yin Yuan
Shih Yu Fu
Yu Fen Kuo
Original Assignee
Nat Univ Chung Hsing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nat Univ Chung Hsing filed Critical Nat Univ Chung Hsing
Priority to TW98141985A priority Critical patent/TWI393882B/zh
Publication of TW201120441A publication Critical patent/TW201120441A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI393882B publication Critical patent/TWI393882B/zh

Links

Description

用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法
本發明係有關於一種溶氧電極陣列晶片，尤其是一種用於評估細胞呼吸活性且圖案化培養細胞之溶氧電極陣列晶片。
細胞為生物體之最小生命單位，以細胞作為檢測單元可代表生物體直接的生理反應。由於細胞需不斷的合成許多大分子(如蛋白質)來維持生理的正常運作，在這些生化合成的過程中，須消耗大量的ATP，才能克服生化反應所需的活化能以促使生化合成反應發生。而ATP的合成則藉由生命體吞食、消化與吸收外界進來的食物進行氧化，供此生理所需。請參照反應式一所示，如一莫耳的葡萄糖分子在經過醣原酵解(glycolysis)與檸檬酸循環(citric acid cycle)後可生成38莫耳的ATP，同時在此氧化過程中也消耗6莫耳的氧分子，因此氧氣分子在ATP的合成過程中扮演著重要的角色。故氧氣的消耗量可代表生命體的生理活性。當細胞生理活性愈高，需合成大量蛋白質時，將消耗掉較多的氧氣來合成較多的ATP，以協助蛋白質的合成，因此直接監測胞外溶氧的變化，將可得知細胞呼吸活性狀態。細胞耗氧量檢測的方法有很多種，可分成光學法(如冷光、螢光，與磷光等)以及電化學法。
C6 H12 O6 +6O2 →6CO2 +6H2 O+38ATP ΔG=-686kcal/mol
反應式一
目前電化學法的電極與儀器具有易微小化的特性，且溶氧檢測時不須額外標定，電化學法已被廣泛地應用至細胞呼吸活性的檢測。
目前市面上商品化之電化學式細胞呼吸活性檢測晶片的簡介如下：
(I)德國Bionas公司之Analyzing system及Metabolic chip：
德國Bionas公司的多參數細胞生理分析系統可對胞外酸化率(離子選擇性場效電晶體感測器(ion sensitive field effect transistor,ISFET))、氧氣消耗率(安培法感測器)及細胞貼附性(交指狀電極導電度感測器)進行整合性量測。其主要晶片設計是將細胞培養於封裝製作完成的晶片中，由晶片上方兩端以微管道的方式輸送細胞培養液及測試藥物，其內部緩衝液體積約為10μL。此感測晶片之特點是能承受滅菌時的高溫高壓，並於培養時避免細胞受到外界污染，容易與微電子電路整合並具有檢測快速與樣本試劑量少等優點；缺點是在矽基材表面無法進行圖案化細胞外基質修飾，致使細胞於植入貼附時，無法固定感測電極與細胞生長區的位置，僅能使用相對活性變化來量化細胞活性。上述商品化量測晶片皆以封閉式微流道進行液體更換，並以矽為基材，其不透光性阻礙光學法檢測細胞型態的對照性。
(II)DOX-96
1999年Amano等人開發出一種新的氧氣電極感測器，結合多通道檢測與不昂貴的可拋棄式電極，構成一96-well檢測盤，每一well裡皆含有可拋棄式的三極式金電極(工作、輔助、參考電極皆為金電極)，每一well裡產生之氧氣由電極感測藉由multipotentiostat轉換成電流值，再由電腦輸出資料，而分析數據的方法與使用光學法量測傳統96-well microplate很相近。其特點為可拋棄式電極，較不昂貴，容易操作使用，且可有效率的進行藥物篩選，以及可長時間即時監測。目前被應用至檢測肺癌細胞對異黃酮的反應，細菌分類，以及抗菌敏感性測試等。但缺點是無法與流體系統結合只能作單次性量測，隨機性的培養也可能因細胞與電極間的距離變化，而致使量測產生改變。
(III)掃瞄式電化學顯微鏡法(Scanning Electrochemical Microscope，SECM)
SECM是使用探針式超微電極，掃描量測不同區域具電化學活性之分析物的氧化還原電流的方法，當探針式電極在接近於樣本表面進行掃描時，不同種類的樣本會影響電流之變化量，例如當樣本為絕緣性物質時，會阻擋電活性物質擴散至電極表面，從而導致量測的電流減少；若樣本具導電性可再生電活性物質時，則會有較大的電活性物質生成擴散到探針電極上，使得檢測電流增加，之後依據其電流的變化量來評估樣本的性質。由於SECM可精確控制電極與細胞間的距離，因此，可準確評估與分析細胞呼吸速率的變化。但SECM儀器昂貴、微電極製作不易限制了SECM被廣泛應用於細胞呼吸活性檢測的潛力。
由上述背景簡介得知，目前已商品化之細胞活性感測系統，仍具有下列缺點：
1、目前的細胞晶片於細胞呼吸活性檢測時，因細胞為隨機性培養，電極易受細胞的吸附而造成汙染或改變電極面積，而降低或干擾溶氧還原電流的訊號，導致電極產生較低的穩定度和靈敏度。感測器與細胞之間的距離也影響溶氧電流的大小，故無法重覆地量測出細胞活性的變化量，因此若能圖樣化培養細胞，固定電極與細胞間的距離，將可避免上述之問題；
2、目前的細胞晶片無法固定細胞貼附區域與感測電極之距離，因此僅能以活性變化百分比量化細胞活性，於精準性上需多次實驗加以驗證；
3、細胞活性感測系統皆以矽作為晶片底材，限制了光學性觀測；
4、目前的細胞晶片無法與微流體控制系統的整合，以進行高通量測試。
本發明人有鑑於既有之細胞呼吸活性感測系統隨機性培養細胞而易造成電極污染，且精準性無法提高，因此經過長時間的研究以及不斷試驗後，終於發明出此用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法。
本發明之目的在於提供一種溶氧電極陣列晶片，尤其是一種結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片應用於細胞呼吸活性評估。
為達上述目的，本發明所運用的技術手段係在於提供一種結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片，係包括：一感測晶片，包括一基材、一細胞貼附區、一輔助電極、複數個溶氧電極、一絕緣層及複數個工作窗口，該細胞貼附區、該輔助電極及該複數個溶氧電極係間隔設於該基材上，該絕緣層係披覆於該基材之表面，且覆蓋至少部分的該輔助電極以及該複數個溶氧電極，並穿設有圓形之一細胞培養孔以露出該細胞貼附區，於該絕緣層上相對於各溶氧電極及該輔助電極的位置分別穿設一工作窗口，各溶氧電極之工作窗口工作窗口係相鄰於該細胞貼附區，且各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離係小於該細胞貼附區半徑(r)的五倍(5r)，各溶氧電極之工作窗口工作窗口之間距係小於0.5r，該輔助電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離大於該細胞貼附區半徑(r)的五倍(5r)；一微流道墊高層，係結合於該感測晶片頂面，包括一墊高膜本體、一微流道層及一細胞培養槽，該墊高膜本體位於該感測晶片之頂面，且於該墊高膜本體一側設有一流通貫槽，該微流道層結合於該墊高膜本體之頂面，並包括一底面、一微流道及一抽液孔，該微流道係凹設於該底面，且該微流道對應該流通貫槽的區域之形狀與位置係與該流通貫槽相符，該抽液孔穿設於該微流道層的一側並連通該微流道，該抽液孔與該流通貫槽係位於相異側，該細胞培養槽貫穿於該微流道層微流道層及該墊高膜本體且連通於該微流道及該抽液孔，以露出該細胞貼附區與各溶氧電極之工作窗口。
其中，該基材係為玻璃。
其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極係為金層。其中，該墊高膜本體之厚度為50μm。
其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極與該基材間係包括一鈦層。
其中，該細胞貼附區半徑為200μm。
其中，該輔助電極與該細胞貼附區的距離為9.5r。
較佳的是，所述之溶氧電極的數量係為六個。
其中，各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離分別為1.25r、1.5r、2.25r、2.75r、4.25r以及4.75r。
其中，該墊高膜本體係為一層聚二甲基矽氧烷(poly(dimethylsiloxane),PDMS)薄膜。
本發明還關於一種結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片之製法，係包括：於一基材頂面設置有一細胞貼附區，且間隔沉積複數個溶氧電極及一輔助電極，於各電極頂面設置形成一絕緣層，並於該絕緣層上相對於各電極的位置分別形成一工作窗口，以露出對應之電極，並於該絕緣層上穿設有圓形之一細胞培養孔以顯示出該細胞貼附區而形成一感測晶片；提供一微流道層，由該微流道層的底面凹設有一微流道，並於該微流道層穿設一抽液孔，該抽液孔係連通於該微流道；提供一墊高膜本體，將該墊高膜本體結合於該微流道層的下方而形成一微流道墊高層，並於該微流道墊高層穿設形成一細胞培養槽，且該細胞培養槽係與該微流道及該抽液孔互相連通；將該微流道墊高層组裝於該感測晶片頂面而形成該溶氧電極陣列晶片，且該細胞培養槽係露出該細胞貼附區與各溶氧電極之工作窗口。
其中，該基材係為玻璃。
其中，該墊高膜本體係將該PDMS溶液塗佈於一基板頂面固化所形成。
較佳的是，該墊高膜本體係以氧氣電漿處理方式結合於該微流道層的下方而形成該微流道墊高層。
較佳的是，該墊高膜本體之厚度為50μm，該細胞貼附區的半徑為200μm，所述之溶氧電極的數量係為六個，各溶氧電極與該細胞貼附區中心分別為0.25mm、0.3mm、0.45mm、0.55mm、0.85mm以及0.95mm。
較佳的是，於一基材上沉積形成該輔助電極及該複數個溶氧電極前，係先將鈦層濺鍍於該基材頂面，再沈積一金層於該鈦層上，並利用舉離(lift-off)製程將金層部分溶解後形成該輔助電極與該複數個溶氧電極；再進一步於各電極頂面形成一絕緣層，並經過曝光、顯影及硬烤而於各電極上分別形成一工作窗口。
本發明又關於一種用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片，其係如前述之製法所製成者。
本發明所提供之用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法，藉由上述技術手段，可以獲得的優點及增進之功效至少包括：
1、本發明利用圖樣化培養細胞，可重覆地量測出細胞活性的變化量，同時本發明之溶氧電極陣列，分佈在圓型細胞圖案區所呈現之半球形溶氧消耗擴散半徑內，因此可量化分析細胞的呼吸速率。
3、本發明之基材可選用具透光性之玻璃，以利細胞型態觀察。
4、本發明電極陣列晶片與微流體系統整合，可增加細胞培養液或測試藥劑注入的方便性，與正常細胞生理所需環境的控制。
5、本發明之微流道墊高層可進行大體積細胞培養，使細胞處於正常生理狀態下受檢測，同時藉由該墊高膜本體以舉離微流道高度，可減少以微流道替換液體時所產生之剪切力。
為能詳細瞭解本發明的技術特徵及實用功效，並可依照說明書的內容來實施，詳細說明如後：
請參閱第四圖所示，本發明所述之感測電極的位置佈置(layout)將在圖樣化的細胞貼附區(15)周圍，依半球形擴散理論設計電極感測位置。若細胞圖案區為圓形且其圖樣半徑小於200μm時，其氧消耗濃度梯度之有效擴散半徑(151)可以圖案區半徑的五倍範圍計算，因此可將數個電極分散在此擴散範圍內，偵測出離細胞圖案區不同距離的溶氧濃度。
本發明所述之細胞圖案區的表面耗氧量及耗氧速率計算公式，則是假設細胞圖案區為穩態消耗源，且表面氧濃度分佈呈現一半球形擴散，在細胞圖案區週圍之氧氣濃度與離細胞圖案區表面之距離(r)的關係式如公式一所示：
r s 為細胞圖案區的半徑；r 為電極所在的位置；C(r)為微電極所在位置的溶氧濃度；C*和Cs 分別為測試液與細胞圖案區表面之氧濃度；C*為0.209mM(37℃,5% CO2 )；Cs 決定於以C(r)與r s /(r +r s )作圖時的斜率；本發明所述之氧氣消耗速率(F )可由公式二求得。
F =2πrs D (C *-C s )　公式二
D為氧擴散係數，在室溫下水溶液中為2.10×10-5 cm2 /s。
請參閱第一圖所示，本發明用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法，其係包括以下步驟：
一、製備感測晶片
(a)基材清潔
請參閱第一至三圖所示首先清除基材(11)表面之油污與灰塵，以增加金屬濺鍍於基材(11)上的附著性，本發明之基材(11)係為玻璃，先將玻璃放入載玻片架內，浸入異丙醇(isopropanol，IPA)溶液中，以超音波震盪30min，再以二次蒸餾水超音波震盪5min後更換二次水，重複3~5次清洗乾淨。接著將玻璃吹乾後，浸入食人魚溶液(piranha solution)中，該食人魚溶液為體積比3：1之96% H2 SO4 與30% H2 O2 配製而成，以80℃進行隔水加熱與超音波震盪30min，取出玻璃後，再以二次蒸餾水超音波震盪重複3~5次清洗乾淨而完成玻璃清潔。
(b)電極位置設計
請再參閱第四圖所示，本發明之電極的位置佈置(layout)係將在圖樣化的細胞貼附區(15)周圍，依半球形擴散理論設計電極感測位置。若將圓形細胞貼附區(15)內的細胞假想為氧氣消耗源，其溶氧梯度之有效擴散半徑(151)係以圓形細胞貼附區(15)半徑的五倍範圍作計算，只要將感測電極陣列佈置在有效擴散半徑(151)範圍內，即可量測到離細胞不同位置的氧氣消耗量。本發明係先預設一圖樣化之細胞貼附區(15)，其半徑為200μm，並將預設之細胞貼附區(15)半徑的五倍範圍內預設為有效擴散半徑(151)，再預設以6個(20μm×20μm)超微帶狀電極(ultramicroband electrode)構成電極陣列，分佈於該細胞貼附區(15)周圍，且位於所預設之有效擴散半徑(151)的範圍內，將各預設之電極分別標示代號(E1~E6)，且各預設之電極位置離細胞貼附區(15)中心距離分別為1.5r、1.25r、2.25r、4.75r、4.25r、2.75r(即0.3mm、0.25mm、0.45mm、0.95mm、0.85mm、0.55mm)，而輔助電極(121)係為薄膜金電極，面積為0.7484mm2 ，設置在離圖樣化的細胞貼附區(15)9.5r(即1.9mm)遠的地方，避免與工作電極產生交叉干擾(crosstalk)。。
(c)電極製作
電極沈積可使用蒸鍍法或濺鍍法，以鉻或鈦當作黏著層，再沈積上金當作電化學感測層，電極的圖案化可利用標準的蝕刻(etching)製程或舉離(lift-off)製程完成，以製作出預設之電極。請再參閱第一至三圖所示，係於清潔後之玻璃上塗佈AZ 4620正光阻，經曝光顯影定義出電極的形狀後，進一步以濺鍍法或蒸鍍法沉積一50nm之鉻層或鈦層作為黏著層，再於該黏著層上形成厚度250nm之金層作為一感測平面(12)，利用蝕刻(etching)製程或舉離(lift-off)技術以移除光阻即可於玻璃上形成一輔助電極(121)及六溶氧電極(122)。
(c)絕緣層製作
將SU8-3010負光阻作為絕緣層(13)並塗佈於各電極上作第一層塗佈以形成絕緣層(14)。第一階段係以500rpm旋轉塗佈15秒，第二階段以3000rpm塗佈40秒，再經於65℃下烘烤30秒，並分別於75℃與85℃下烘烤2分鐘，再逐步升溫至95℃烘烤10分鐘，使其厚度約為10μm；再利用設計之光罩透過曝光機於光能300mJ/cm3 下曝光30秒，進行曝後烤加強光交連程度與結構後，再於65℃下烘烤10分鐘，並分別於75℃與85℃下烘烤2分鐘，再逐步升溫至95℃硬烤10分鐘，最後對晶片顯影即可於該絕緣層(14)上相對於各溶氧電極(122)的位置穿設形成一工作窗口1(16)，並於依前述設計之細胞貼附區(15)位置，於該玻璃上，對應於該絕緣層(14)的範圍顯示出一細胞貼附區(15)。
二、製備微流道墊高層
(a)製備微流道層
請參閱第五(A)圖(a)~(d)所示，係先準備一玻璃基板(30)，將該玻璃基板(30)經過清潔後塗佈SU8負型光阻(31)，經曝光顯影，並移除光阻(31)後即形成母模(32)。請參閱第五(B)圖(e)~(h)所示，將聚二甲基矽氧烷(poly(dimethylsiloxane),PDMS)主劑與固化劑以10：1(w/w%)攪拌混合均勻並除去氣泡後，澆鑄於該母模(32)上，並於加熱板上加熱1.5h後即固化，待其冷卻後自該母模(32)取下而形成一微流道層(22)，由該微流道層(22)的底面凹設有一微流道(222)，其高度約為200μm，再以玻璃毛細管於該微流道層(22)穿設一抽液孔(223)，該抽液孔(223)係相對形成於該微流道(222)一側的位置。
(b)製備墊高膜本體
將PDMS主劑與固化劑以10：1(w/w%)的比例調配後旋轉塗佈於乾淨之一壓克力表面，置於加熱板上待其固化形成一墊高膜本體(21)於壓克力基板上，其厚度約為50μm。(c)製備微流道墊高層
請參閱第一、二、六圖所示，將該墊高膜本體(21)與該微流道層(22)以功率100W的氧氣電漿處理10秒，並使該墊高膜本體(21)結合於該微流道層(22)的下方，於兩者結合同時，該壓克力基板係與該墊高膜本體(21)分離，將該墊高膜本體(21)的一部分撕除而形成一流通貫槽(211)，該流通貫槽(211)的形狀與位置係與該微流道層(22)的一側相符，且該流通貫槽(211)係與該插設孔(224)位於同側，使液體能流至參考電極的位置以進行量測，而形成一微流道墊高層(20)，於該微流道層(22)穿設一插設孔(224)，該插設孔(224)係相對形成於該微流道(222)另一側的位置，再於該微流道墊高層(20)穿設形成一細胞培養槽(23)，且該細胞培養槽(23)係相對位於該微流道(222)的中段位置，且藉由該微流道(221)連通該抽液孔(222)及該插設孔(224)，該細胞培養槽(23)並與該微流道(222)、該抽液孔(223)該插設孔(224)及該流通貫槽(211)互相連通，而該細胞培養槽(23)的底緣與該微流道(222)之間距為50μm；
(d)製備結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片
請參閱第二、三、六圖所示，將該微流道墊高層(20)以壓克力夾具组裝於感測晶片(10)上方，且六溶氧電極(122)之工作窗口(16)與修飾後的細胞貼附區(15)自該細胞培養槽(23)露出，即形成結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片。
本發明之結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片，其係包括一感測晶片(10)及一微流道墊高層(20)，其中：該感測晶片(10)包括一基材(11)、一細胞貼附區(15)、一輔助電極(121)、六溶氧電極(122)、一黏著層、一絕緣層(14)及七工作窗口(16)，該基材(11)係為玻璃材質，該細胞貼附區(15)、該輔助電極(121)及六溶氧電極(122)位於該基材(11)上且為一金層，且該六溶氧電極(122)係呈相互平行之條狀排列，該黏著層係為一鈦層，且位於該基材(11)與該感測平面(12)之間，該絕緣層(14)係由SU8負型光阻(31)所組成，其係披覆於該感測平面(12)及該基材(11)表面，於該絕緣層(14)係穿設有圓形之一細胞培養孔(141)，該細胞培養孔(141)設於六溶氧電極(122)的中間位置，以露出該位於該基材(11)之該細胞貼附區(15)，於該絕緣層(14)上相對於各溶氧電極(122)及該輔助電極(121)的位置分別穿設一工作窗口(16)，請再參閱第三、四圖所示，各溶氧電極(122)之工作窗口(16)係相鄰於該細胞貼附區(15)，且各溶氧電極(122)之工作窗口(16)與該細胞貼附區(15)中心的距離係小於該細胞貼附區(15)半徑(r)的五倍(5r)，各溶氧電極(122)之工作窗口(16)之間距係小於0.5r，該輔助電極(121)之工作窗口(16)與該細胞貼附區(15)中心的距離大於(5r)，於本實施例中，各溶氧電極(122)之工作窗口(16)與該細胞貼附區(15)中心的距離分別為1.25r、1.5r、2.25r、2.75r、4.25r以及4.75r，該輔助電極(121)之工作窗口(16)與該細胞貼附區(15)中心的距離係為9.5r；請參閱第一、二、六圖所示，該微流道墊高層(20)係結合於該感測晶片(10)頂面，包括一墊高膜本體(21)、一微流道層(22)及一細胞培養槽(23)，該墊高膜本體(21)位於該感測晶片(10)之頂面，係包括一流通貫槽(211)，該微流道層(22)結合於該墊高膜本體(21)之頂面，並包括一底面(221)、一微流道(222)、一抽液孔(223)及一插設孔(224)，該微流道(222)係凹設於該底面(221)，且該微流道(222)對應該流通貫槽(211)的區域之形狀與位置係與流通貫槽(211)相符，該抽液孔(223)穿設於該微流道層(22)的一側，並連通於該微流道(222)，該插設孔(224)穿設於該微流道層(22)的另一側，並連通於該微流道(222)且該插設孔(224)與該流通貫槽(211)係位於同側，該細胞培養槽(23)與該微流道(222)、該抽液孔(223)、該插設孔(224)及該流通貫槽(211)互相連通，而該細胞培養槽(23)的底緣與該微流道(222)之間距為50μm，並露出該細胞貼附區(15)與六溶氧電極(122)之工作窗口(16)。
實施例
在使用本發明進行檢測時，係於該微流道墊高層(20)結合該感測晶片(10)前，利用微模造(micromolding)技術使細胞外基質能局部化修飾於該感測晶片(10)之該玻璃上，使細胞能選性的貼附在感測晶片(10)表面，請參閱第七圖所示，先製作與細胞貼附區(15)尺寸相同之一母模，再透過PDMS翻模而形成PDMS層(60)，並以雷射加工機對PDMS層(60)穿設一孔洞(61)，將PDMS層(60)之該孔洞(61)對準感測晶片(10)之細胞貼附區(15)，首先注入0.001%聚左旋離胺酸(70)(poly-L -lysine)靜置修飾15min，接著注入10μg mL-1 纖黏連蛋白(fibronectin)(71)修飾1h後，將PDMS層(60)掀離，以雙重蒸餾水清洗，最後注入0.3mg mL-1牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(72)修飾絕緣層(14)SU8表面1h；由於聚左旋離胺酸(70)較易吸附在親水性的玻璃表面，而聚左旋離胺酸(70)修飾後使玻璃之基材(11)表面帶有氨基，使纖黏連蛋白(71)易吸附，而牛血清白蛋白(72)較易吸附在疏水性的SU8上，因此在未修飾有纖黏連蛋白(71)的絕緣層(14)區域可修飾上牛血清白蛋白(72)，待修飾結束後以磷酸緩衝溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，即可完成細胞圖案化之預處理步驟。預處理結束後，請參閱第八圖所示，將30μL密度為1×10-6 cell/mL之人類肝癌細胞株(HepG2)細胞懸浮液覆蓋於修飾有纖黏連蛋白(71)之細胞貼附區(15)上方，使細胞沉降貼附約15-20min後以PBS清洗，然後加入培養液置於細胞培養箱中約2天(需視不同種類細胞而定)，即完成圖案化細胞於感測晶片(10)上。
請參閱第六圖所示，將完成圖案化細胞之感測晶片(10)與該微流道墊高層(20)結合後，以外插的商業化Ag/AgCl當作參考電極(40)並插入於該插設孔(224)內，薄膜金電極作為輔助電極(121)，微注射泵(syringe pump)(50)係插設於該抽液孔(223)並連通於該微流道(222)以方便流體更換，利用10mM細胞培養液(HBS)溶液以進行細胞在沒有營養源狀況下的呼吸活性。
請參閱第四、九(a)圖所示，加入30μL以10mM4-羥乙基乙磺酸(HEPES)為緩衝分子之細胞培養液(HBS)，進行耗氧率量測10分鐘；同前述步驟分別量測10mM HBS+25mM葡萄糖(glucose)、10mM HBS+25mM glucose+1%胰島素(insulin)進行比較，最後以胰蛋白酶(trypsin)將細胞移除。比較培養液中含有glucose或insulin分子時對胞外呼吸活性的影響，其結果發現距離細胞圖案區中心1.25r的電極(E2)在含有25mM glucose與25mM glucose+1% insulin的細胞培養液中，耗氧率相對於10mM HEPES為緩衝分子之細胞培養液時的耗氧率分別增為0.4222μM/min與0.3835μM/min；距離細胞圖案區中心2.75r的電極(E6)耗氧率分別為0.2355μM/min與0.3834μM/min，因此，細胞圖案區與溶氧電極之距離有相關性，離細胞圖案區越近之電極所測得的耗氧率較高，細胞呼吸活性的變化，可用此耗氧率或耗氧量來加以定量比較；第九(b)圖則以第九(a)圖中不同電極所測得之氧濃度值，對應離細胞圖案區中心的距離，依最小平方法以半球形擴散模型進行擬合(fitting)，可得在量測穩定5min後、施加藥物後約5min(添加glucose)與10min(添加insulin)的濃度與距離關係圖，其結果顯示不論在HBS溶液、添加glucose或是添加insulin時皆具高相關係數(R2 ＞0.9404)，顯示此細胞所造成的擴散行為，可以半球形模式來加以解釋。第九(b)圖曲線擬合(fitting curve)所得之斜率，即為主體溶液(bulk solution)與細胞圖案區表面的氧濃度差(ΔC)，再利用公式二計算氧氣消耗率(F)，在量測穩定5min後、施加藥物後約5min(添加glucose)與10min(添加insulin)時，氧氣消耗率分別為8.49×10-14 mol/s、9.24×10-14 mol/s，與9.67×10-14 mol/s，結果驗證細胞在有glucose營養源的環境下，其呼吸速率為沒有營養源狀況下的1.09倍，當加入1% insulin溶液時，因為insulin可幫助glucose容易進入細胞中，更可以提高細胞之活性，故氧氣消耗率增加為在HBS溶液中的1.14倍。
重複試驗細胞圖案化培養之呼吸活性測試，並比較細胞圖案區中心不同距離之單點電極(single point)耗氧率，與電極陣列(array fitting)依最小平方法fitting半球形擴散模型所計算出之耗氧速率作比較，請參閱表一所示。
由表一計算出上述之兩種方式分析耗氧率再現性，可知以單點電極方式分析無法計算出在HBS溶液中的耗氧率，且再現性較差，如E2和E6電極在葡萄糖中分別為154.78%與140.10%，在insulin中分別為106.92%與71.46%；而以本發明之電極陣列方式之耗氧率再現性，在HBS、glucose與insulin中分別為21.9%、24.4%與22.9%，再現性皆比以單點電極方式分析高。由上述之結果可知以半球形擴散模型計算溶氧電極陣列的方式，可得較精確的耗氧速率。
因此，本發明係使用玻璃作為基材，於光學觀測細胞時更加便利，且由於溶氧電極的係採用金屬薄膜，適合以蒸鍍或濺鍍於玻璃基材上，可簡化感測電極製作程序，再者，藉由細胞圖樣化技術與電極陣列之設計，則可固定每次實驗時細胞與感測電極之距離，其細胞耗氧速率的數據分析能以半球形擴散模型來解釋，以提高量測再現性，又電極陣列位於圖案化細胞的氧氣消耗擴散層內，可量化分析細胞的呼吸速率，此外，此晶片易與微流體控制系統整合，可進行藥、毒物的高通量檢測，而本發明之微流道墊高層可進行大體積細胞培養，使細胞處於正常生理狀態下受檢測，同時藉由該墊高膜本體以舉離微流道高度，可減少以微流道替換液體時所產生之剪切力。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，凡依本發明申請專利範圍及說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
(10)．．．感測晶片
(11)．．．基材
(12)．．．感測平面
(121)．．．輔助電極
(122)．．．溶氧電極
(14)．．．絕緣層
(141)．．．細胞培養孔
(15)．．．細胞貼附區
(151)．．．有效擴散半徑
(16)．．．工作窗口
(20)．．．微流道墊高層
(21)．．．墊高膜本體
(211)．．．流通貫槽
(22)．．．微流道層
(221)．．．底面
(222)．．．微流道
(223)．．．抽液孔
(224)．．．插設孔
(23)．．．細胞培養槽
(30)．．．玻璃基板
(31)．．．光阻
(40)．．．參考電極
(50)．．．微注射泵
(60)．．．PDMS層
(61)．．．孔洞
(70)．．．聚左旋離胺酸
(71)．．．纖黏連蛋白
(72)．．．牛血清白蛋白
第一圖係本發明較佳實施例之溶氧電極陣列晶片立體示意圖。
第二圖係本發明較佳實施例之溶氧電極陣列晶片立體分解示意圖。
第三圖係本發明較佳實施例之溶氧電極陣列晶片俯視放大圖。
第四圖係本發明較佳實施例之感測電極陣列設計示意圖。
第五(A)圖(a)~(d)係本發明較佳實施例之微流道墊高層製作流程示意圖。
第五(B)圖(e)~(h)係本發明較佳實施例之微流道墊高層製作流程示意圖。
第六圖係本發明較佳實施例之溶氧電極陣列晶片剖面示意圖。
第七圖係本發明較佳實施例之圖案化表面修飾製作流程示意圖。
第八圖係本發明較佳實施例之HepG2細胞圖樣化培養之結果圖。
第九(a)圖係本發明較佳實施例之以溶氧電極陣列量測HepG2細胞圖樣對葡萄糖或胰導素所測得之氧濃度對應時間圖。
第九(b)圖係本發明較佳實施例之以溶氧電極陣列量測HepG2細胞圖樣對葡萄糖或胰導素所測得之氧濃度對應電極距離圖。
(10)．．．感測晶片
(11)．．．基材
(12)．．．感測平面
(121)．．．輔助電極
(122)．．．溶氧電極
(14)．．．絕緣層
(141)．．．細胞培養孔
(15)．．．細胞貼附區
(16)．．．工作窗口
(20)．．．微流道墊高層
(21)．．．墊高膜本體
(211)．．．流通貫槽
(22)．．．微流道層
(222)．．．微流道
(223)．．．抽液孔
(224)．．．插設孔
(23)．．．細胞培養槽

Claims (29)

  1. 一種結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片，係包括：一感測晶片，包括一基材、一細胞貼附區、一輔助電極、複數個溶氧電極、一絕緣層及複數個工作窗口，該細胞貼附區、該輔助電極及該複數個溶氧電極係間隔設於該基材上，該絕緣層係披覆於該基材之表面，且覆蓋住至少部分的該輔助電極以及該複數個溶氧電極，並穿設有圓形之一細胞培養孔以露出該細胞貼附區，於該絕緣層上相對於各溶氧電極及該輔助電極的位置分別穿設一工作窗口，各溶氧電極之工作窗口係相鄰於該細胞貼附區，且各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離係小於該細胞貼附區半徑(r)的五倍(5r)，各溶氧電極之工作窗口之間距係小於0.5r，該輔助電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離大於該細胞貼附區半徑(r)的五倍(5r)；一微流道墊高層，係結合於該感測晶片頂面，包括一墊高膜本體、一微流道層及一細胞培養槽，該墊高膜本體位於該感測晶片之頂面，且於該墊高膜本體一側設有一流通貫槽，該微流道層結合於該墊高膜本體之頂面，並包括一底面、一微流道及一抽液孔，該微流道係凹設於該底面，且該微流道對應該流通貫槽的區域之形狀與位置係與該流通貫槽相符，該抽液孔穿設於該微流道層的一側並連通該微流道，該抽液孔與該流通貫槽係位於相異側，該細胞培養槽貫穿於該微流道層及該墊高膜本體且連通於該微流道及該抽液孔，以露出該細胞貼附區與各溶氧電極之工作窗口。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該基材係為玻璃。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極係為金層。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極係為金層。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該墊高膜本體之厚度為50μm。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極與該基材間係包括一鈦層。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極及該複數個溶氧電極與該基材間係包括一鈦層。
  8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該細胞貼附區半徑為200μm。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該細胞貼附區半徑為200μm。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該細胞貼附區半徑為200μm。
  11. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該墊高膜本體係為一層聚二甲基矽氧烷(poly(dimethylsiloxane),PDMS)薄膜。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該墊高膜本體係為一層聚二甲基矽氧烷(poly(dimethylsiloxane),PDMS)薄膜。
  13. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極與該細胞貼附區的距離為9.5r。
  14. 如申請專利範圍第5項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極與該細胞貼附區的距離為9.5r。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，該輔助電極與該細胞貼附區的距離為9.5r。
  16. 如申請專利範圍第12項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，所述之溶氧電極的數量係為六個。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，所述之溶氧電極的數量係為六個。
  18. 如申請專利範圍第14項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，所述之溶氧電極的數量係為六個。
  19. 如申請專利範圍第16項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離分別為1.25 r、1.5 r、2.25 r、2.75 r、4.25 r以及4.75 r。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離分別為1.25 r、1.5 r、2.25 r、2.75 r、4.25 r以及4.75 r。
  21. 如申請專利範圍第18項所述之溶氧電極陣列晶片，其中，各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距 離分別為1.25 r、1.5 r、2.25 r、2.75 r、4.25 r以及4.75 r。
  22. 一種結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片之製法，係包括：於一基材頂面設置有一細胞貼附區，且間隔沉積複數個溶氧電極及一輔助電極，於各電極頂面設置形成一絕緣層，並於該絕緣層上相對於各電極的位置分別形成一工作窗口，以露出對應之電極，並於該絕緣層上穿設有圓形之一細胞培養孔以顯示出該細胞貼附區而形成一感測晶片，其中各溶氧電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離係小於該細胞貼附區半徑(r)的五倍(5r)，該輔助電極之工作窗口與該細胞貼附區中心的距離大於5r；提供一微流道層，由該微流道層的底面凹設有一微流道，並於該微流道層穿設一抽液孔，該抽液孔係連通於該微流道；提供一墊高膜本體，將該墊高膜本體結合於該微流道層的下方而形成一微流道墊高層，並於該該微流道層及該墊高膜本體穿設形成一細胞培養槽，且該細胞培養槽係與該微流道及該抽液孔互相連通；將該微流道墊高層組裝於該感測晶片頂面而形成該溶氧電極陣列晶片，且該細胞培養槽係露出該細胞貼附區與各溶氧電極之工作窗口。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之溶氧電極陣列晶片之製法，其中，該基材係為玻璃。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之溶氧電極陣列晶片 之製法，其中，該墊高膜本體係將該PDMS溶液塗佈於一基板頂面固化所形成。
  25. 如申請專利範圍第23項所述之溶氧電極陣列晶片之製法，其中，該墊高膜本體係將該PDMS溶液塗佈於一基板頂面固化所形成。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之溶氧電極陣列晶片之製法，其中，該墊高膜本體係以氧氣電漿處理方式結合於該微流道層的下方而形成該微流道墊高層。
  27. 如申請專利範圍第22至26項中任一項所述之溶氧電極陣列晶片之製法，其中，該墊高膜本體之厚度為50 μm，該細胞貼附區的半徑為200 μm，所述之溶氧電極的數量係為六個，各溶氧電極與該細胞貼附區中心分別為0.25mm、0.3mm、0.45mm、0.55mm、0.85mm以及0.95mm。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之溶氧電極陣列晶片之製法，於一基材上沉積形成該輔助電極及該複數個溶氧電極前，係先將鈦層濺鍍於該基材頂面，再沈積一金層於該鈦層上，並利用舉離(lift-off)製程溶解部分金層而形成該輔助電極與該複數個溶氧電極；再進一步於各電極頂面形成一絕緣層，並經過曝光、顯影及硬烤而於各電極上分別形成一工作窗口。
  29. 一種用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片，其係如申請專利範圍第22至28項中任一項所述之製法所製成者。
TW98141985A 2009-12-09 2009-12-09 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法 TWI393882B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW98141985A TWI393882B (zh) 2009-12-09 2009-12-09 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW98141985A TWI393882B (zh) 2009-12-09 2009-12-09 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201120441A TW201120441A (en) 2011-06-16
TWI393882B true TWI393882B (zh) 2013-04-21

Family

ID=45045174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW98141985A TWI393882B (zh) 2009-12-09 2009-12-09 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法

Country Status (1)

Country Link
TW (1) TWI393882B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI470224B (zh) * 2011-12-22 2015-01-21 Univ Chang Gung 檢測系統及檢測方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003076892A2 (en) * 2001-08-06 2003-09-18 Vanderbilt University Device and methods for measuring the response of at least one cell to a medium

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003076892A2 (en) * 2001-08-06 2003-09-18 Vanderbilt University Device and methods for measuring the response of at least one cell to a medium

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
James R. Kraly et al.,"Review: Microfluidic Applications in Metabolomics and Metabolic Profiling", Anal Chim Acta.2009 Oct 19 653(1): 23-35 *
Liao WY et al, "Detections of pH and Dissolved Oxygen by Microfluidic Sensing Array.", Abs. 920, 205th Meeting, © 2004 The Electrochemical Society, Inc. *
Wu CC et al, "A Clark-type oxygen chip for in situ estimation of the respiratory activity of adhering cells.", Talanta. 2010 Apr 15;81(1-2):228-34. Epub 2009 Dec 3 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201120441A (en) 2011-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marrero et al. Gut-on-a-chip: Mimicking and monitoring the human intestine
JP6803164B2 (ja) 複数検知型のバイオ電子試験プレート
Arık et al. Barriers-on-chips: Measurement of barrier function of tissues in organs-on-chips
CN104203808B (zh) 具有纳米结构电极的生物传感器
KR100885074B1 (ko) 미세유로형 센서 복합 구조물
US20170173578A1 (en) Microfluidic devices for the rapid detection of analytes
KR100968524B1 (ko) 생체 시료 분석용 마이크로-나노 플루이딕 바이오칩
KR100841355B1 (ko) 무동력 혈액분리수단을 구비한 바이오센서 칩
DE602004011688D1 (de) Analyttestsystem zur bestimmung der konzentration eines analyten in einer physiologischen flüssigkeit
Müller et al. Measurement of respiration and acidification rates of mammalian cells in thermoplastic microfluidic devices
RU2658516C2 (ru) Аппарат c матрицей электрохимических датчиков
JP2010510502A (ja) 流体のイオンセンサー及びその製造方法
CN102539485B (zh) 细胞迁移高分辨率阻抗实时跟踪测控装置及其制造方法和应用方法
Numthuam et al. Synergistic effects of micro/nano modifications on electrodes for microfluidic electrochemical ELISA
US20100015656A1 (en) Arrangement For On-Line Measurements on Cells
Bunge et al. Microfluidic oxygen sensor system as a tool to monitor the metabolism of mammalian cells
TWI393882B (zh) 用於細胞呼吸活性評估並結合圖案化細胞培養之溶氧電極陣列晶片及其製法
TWI377345B (en) A cell-activity estimation chip used for detecting multi-physiological parameters
EP4031004A1 (en) Device and method for pre-term birth risk assessment
Brazaca et al. The use of biological fluids in microfluidic paper-based analytical devices (μPADs): Recent advances, challenges and future perspectives
Frey et al. Continuous-flow multi-analyte biosensor cartridge with controllable linear response range
TWI244550B (en) Electrochemistry test unit, biological sensor, the manufacturing method, and the detector
JP2005351882A (ja) 微小分析デバイスと酵素の分析方法
Zhang Modular multi-organ-on-chips platform with physicochemical sensor integration
KR102627967B1 (ko) 바이오 타겟을 위한 바이오 검출기 디바이스

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees