DE10346451B4

DE10346451B4 - Verfahren zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern

Info

Publication number: DE10346451B4
Application number: DE10346451A
Authority: DE
Inventors: Ralf Dr. Ehret; Elke Thedinga; Axel Kob; Heiko Holst
Original assignee: BIONAS GmbH
Current assignee: BIONAS GmbH
Priority date: 2003-10-03
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2023-10-04
Also published as: WO2005033261B1; JP2007507335A; WO2005033261A3; DE10346451A1; EP1667795A2; US20070037285A1; WO2005033261A2

Abstract

Verfahren zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern dadurch gekennzeichnet,
a) dass ein Fluid durch einen in einen Tropfraum oberhalb eines Reaktionsraumes (2) mündenden zweiten Durchtrittskanal (6) tropft oder fließt, so dass Luftblasen, die mit dem Fluid transportiert werden, in die Umgebung entweichen und
b) dass das Fluid durch einen ersten Durchtrittskanal (5), welcher in den Reaktionsraum (2) mündet, abgesaugt wird und so die Höhe der Fluidgrenze (4) sowie das Vorratsvolumen bestimmt wird und
c) dass die Höhe des Reaktionsraumes (2) durch einen Kopf (7) begrenzt wird und
d) dass die Veränderungen und/oder Zustände mittels Sensorsystemen (13) im Reaktionsraum (2) und/oder im ersten Durchtrittskanal (5) gemessen werden und
e) dass die Durchströmung der Flüssigkeit durch den Reaktionsraum (2) kontinuierlich oder abwechselnd in Fluss- oder Stoppphasen erfolgt.

Description

Untersuchungen an Zellkulturen werden in Reaktionskammern durchgeführt. Im Reaktionsraum können Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, Enzyme, Antikörper und chemische Verbindungen überwacht und/oder zur Reaktion gebracht werden. Es sind Reaktionskammern bekannt, bei denen sich am Boden des Reaktionsraumes Sensorsysteme unterschiedlicher Art befinden.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern und eine Versorgungseinheit, welche bei Untersuchungen an Zellkulturen für die Einbringung eines flüssigen Kulturmediums benötigt wird.

Bekannte Vorrichtungen dienen dazu, in einer bestimmten zeitlichen Abfolge den Zellen frisches Kulturmedium oder ein in diesem Kulturmedium gelösten Wirkstoff zuzuführen beziehungsweise verbrauchtes Medium aus dem Zellkulturbereich zu entfernen. Das zugeführte Medium und der Zellkulturbereich müssen vor Kontamination durch Mikroorganismen und vor übermäßiger Verdunstung geschützt sein. Dies sind wichtige Voraussetzungen für die sensitive Messung zellulärer Reaktionen.

In der DE 19920811 A1 wird eine Vorrichtung zur Durchführung von Untersuchungen an Zellkulturen, die sich in einem flüssigen Kulturmedium befinden, beschrieben. Es ist ein Trennkörper vorgesehen, welcher der auf einer Aufnahme befindlichen Zellkultur annäherbar ist und oberseitig des Kulturmediums einen Reaktionsraum begrenzt. Innerhalb des Trennkörpers sind ein oder mehrere Durchtrittskanäle vorgesehen, die in den kleinvolumigen Teilraum des Aufnahmebehältnisses münden. Das konvektive Vermischen des im Reaktionsraum und im Reservoirraum befindlichen Mediums erfolgt, indem über den Durchtrittskanal ein bestimmtes Flüssigkeitsquantum an Kulturmedium dem Reaktionsraum zugeführt und wieder abgesaugt wird. Die konvektive Vermischung erfolgt über den Strömungskanal zwischen Trennkörper und Aufnahmebehältnis. An der Unterseite des Trennkörpers befindet sich eine Profilierung mit konvexer Wölbung, wodurch Luft- bzw. Gasblasen entweichen können.

Flüssigkeiten können je nach Umgebungsbedingungen Gase speichern oder abgeben (Gasaustausch mit der Umgebung) wobei immer der Sättigungszustand angestrebt wird. So kann es u.a. in Abhängigkeit von Temperatur und Druck zu erheblichen Gaseinlagerungen kommen. Bei Entspannung und Temperaturerhöhung wird ein Teil des Gases wieder an die Umgebung abgegeben was zu Blasenbildung führen kann. In geschlossenen Systemen können diese Blasen transportiert werden und zu Störungen von chemischen-, physikalischen- und biologischen Abläufen, Messergebnissen bzw. des Messumfeldes (z.B. Schäden am Zellteppich oder innerhalb eines Reaktionsraumes, Verhindern von chemischen Reaktionen an Oberflächen durch Anlagern von Luftblasen) führen.

Nachteil des Standes der Technik ist es, dass Gasblasen entstehen können, welche die Zellkultur bzw. die Messung durch die Sensoren beeinträchtigen.

Zur Vermeidung bzw. Verringerung von Störungen durch Luftblasen sind verschiedene Verfahren und Geräte bekannt.

Ein Teil dieser Systeme (Vakuum, Erwärmung, Ultraschall, ...) kann die Flüssigkeit teil- oder nahezu vollständig entgasen. Hier muss jedoch darauf geachtet werden, dass beim Weitertransport der Flüssigkeiten keine erneute Gasaufnahme erfolgen kann (gasundurchlässige Transportbehälter/Rohre/Schläuche). Weiterhin kann es durch die Entgasung zur Veränderungen der Eigenschaften der Flüssigkeit (z.B. denaturieren von Proteinen durch Erwärmung) bzw. zu Beeinflussungen an den Sensoren kommen. Aus diesen Gründen sind die beschriebenen Entgasungsverfahren für Anwendungen, die auf halb-offenen Systemen beruhen, mit lebenden (z.B. sauerstoffzehrenden) Zellen arbeiten und/oder keine Manipulation der Flüssigkeit erlauben, nicht geeignet.

Weitere Verfahren zur Luftblasenunterdrückung sind z.B. sogenannte Luftblasenfallen im Schlauchsystem. Luft-/Gasblasen steigen in einem dafür vorgesehen Bereich auf und werden im „Abfluss" nicht weitertransportiert. Nachteil dieses Verfahrens ist das zusätzliche Totvolumen (Zeitverzögerung/Durchmischung beim Medienwechsel) und die ggf. notwenige Abgasungsstelle, die Kontakt mit der Umwelt herstellt (z.B. Kontamination möglich). Weiterhin kann das System nur Luftblasen entfernen, die sich im Schlauch vor der Falle (in Pumprichtung) befinden. Weitere Luftblasenbildung im nachfolgenden Schlauch-/Leitungssystem ist nicht ausgeschlossen.

Bei der in WO 02/072423 A1 vorgestellten Lösung handelt es sich um Multiwell-Platten, die ein geschlossenes System darstellen. Durch eine Art Gummistopfen erfolgt ein luftdichter Abschluss. Dadurch wird das Messobjekt steril gehalten. Luftblasen, wenn sie denn vorhanden sind, spielen hier für die Messung keine Rolle, können aber auch nicht entweichen. Das Fluid wird durch einen Kanal in den Reaktionsraum gedrückt, wobei der Kanal 22 oberhalb des Kanals 96 liegt, durch den das überflüssige Fluid wieder hinausgedrückt wird. Der Reaktionsraum ist auch der Einlassraum für das Fluid. Es gibt keinen Tropfraum, der gesamte Raum ist durch das Fluid ausgefüllt. Ein Fluidaustausch erfolgt dadurch, dass das überflüssige Fluid (eventuell mit Luftblasen) aus dem Reaktionsraum gedrückt wird. Das Problem der Luftblasen bleibt bestehen.

DE 10019862 A1 zeigt eine Anordnung mit zwei Durchtrittkanälen zur Volumen/Höhenreduktion. Das Volumen ist durch die Höhe des Absaugkanals festgelegt aber nicht durch einen Kopfträger bestimmt. Ein Gasaustausch über die Fluidgrenze ist gewünscht. Es ist kein Abflusskanal mit einer definierten Flussrate vorhanden.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine luftblasenfreie Messung in Reaktionskammern zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern zu ermöglichen. Auf eine Entgasung soll ganz verzichtet werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Patentansprüche 1 bis 4 gelöst.

Das Verfahren zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Fluid aus einem Vorratbehälter abgezogen oder abgepumpt und zu einer Versorgungseinheit transportiert wird. Das Fluid tropft oder fließt über einen zweiten Durchtrittskanal (Einlasskanal) in einen Tropfraum, so dass Luftblasen, die mit dem Fluid transportiert werden, an der Fluidgrenze bleiben oder sofort in die Umgebung entweichen. Sie können somit nicht in den Reaktionsraum gelangen. Oberhalb eines Kopfes und eines Reaktionsraums bildet das Fluid einen Vorrat. Die Höhe der Fluidgrenze und somit das Vorratsvolumen wird mit Hilfe eines ersten Durchtrittskanals (Absaugkanal) bestimmt und ein Fluidaustausch erfolgt im Reaktionsraum durch die Absaugung über den Absaugkanal und das dadurch hervorgerufene Nachfließen des Fluids aus dem Tropftraum.

In einem Ausführungsbeispiel wird die Höhe der Fluidgrenze und somit das Vorratsvolumen mit Hilfe eines dritten Durchtrittskanals (Absaugkanal) bestimmt.

Die Veränderung des Fluids oder einer Oberfläche im Reaktionsraum wird durch lebende Zellen und/oder chemische, biochemische und/oder immunologische Reaktionen ausgelöst, wobei die Fluid-Ver- und -Entsorgung gleichzeitig oder nacheinander abläuft.

Im Reaktionsraum und/oder im ersten Durchtrittskanal sind Sensorsysteme zur Detektion der Veränderung im Fluid angeordnet.

Die Durchströmung der Flüssigkeit erfolgt durch den Reaktionsraum kontinuierlich oder abwechselnd in Fluss- oder Stoppphasen.

Der Reaktionsraum ist durch einen Hebemechanismus des Kopfträgers veränderbar. Das Fluid im Tropfraum wird dadurch mit dem Fluid im Reaktionsraum vermischt. In einem Ausführungsbeispiel wird die Flüssigkeit im Tropfraum (durch das Absaugen der Flüssigkeit aus dem Reaktionsraum) in den Reaktionsraum hineingezogen.

Im Reaktionsraum kann eine Membran derart angeordnet sein, dass Teile des Reaktionsraumes von einer direkten Anströmung durch das Fluid ausgeschlossen sind.

Ein in den Reaktionsraum mündender erster Durchtrittskanal dient als Absaugung für ein Fluid. Der Einlass des Fluids erfolgt über einen zweiten Durchtrittskanal oberhalb der Fluidgrenze.

In einem Ausführungsbeispiel besteht der Kopfträger aus einem Kopf mit einem stielförmigen Schaft und einer Verdickung für die Aufnahme des zweiten Durchtrittskanals.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel befindet sich oberhalb der Verdickung und innerhalb des Aufnahmebehälters eine weitere Verdickung für die Aufnahme eines dritten Durchtrittskanals, der als Notabsaugung einen Überlauf verhindert.

Eine weitere Ausführung zeigt, dass der zweite Durchtrittskanal für die Zuleitung des Fluids neben dem Kopfträger angeordnet ist. Der erste Durchtrittskanal befindet sich im Boden des Reaktionsraumes.

Die Oberfläche der Versorgungseinheit kann mit einer hydrophoben und/oder hydrophilen Beschichtung versehen sein.

Durch diese konstruktiv optimierte Versorgungseinheit, welche für die Versorgung mit frischem und die Entsorgung von verbrauchten Reaktionskomponenten sorgt, und einer neuen Fluidführung sind Entgaser bzw. Blasenfallen unnötig.

Die Blasen entweichen direkt am Durchflusskopf in unmittelbarer Nähe zum Reaktionsraum und werden am Transport zum Reaktionsraum gehindert, wobei die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften des Fluids unverändert bleiben.

Die Ausführungsbeispiele werden anhand der Zeichnungen erläutert.
1 – erfindungsgemäße Versorgungseinheit mit Absaugung und Einlass
2 – erfindungsgemäße Versorgungseinheit mit Absaugung, Einlass und Notabsaugung
3 – erfindungsgemäße Versorgungseinheit in einer weiteren Ausführung
In 1 wird die erfindungsgemäße Versorgungseinheit dargestellt. In einen Aufnahmebehälter 10 befindet sich ein Kopfträger 1, der den Reaktionsraum 2 begrenzt. Im Reaktionsraum 2 können Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, Enzyme, Antikörper und chemische Verbindungen überwacht und/oder zur Reaktion gebracht werden. Am Boden des Reaktionsraumes 2 und/oder im ersten Durchtrittskanal 5 können sich Sensorsysteme 13 unterschiedlicher Art befinden. Das können z.B. elektrische, optische und/oder akustische Sensoren sein. Eine Membran 14 im Reaktionsraum 2 kann z.B. Suspensionszellen oder andere bewegliche Reaktionskomponenten im Reaktionsraum 2 zurückhalten oder eine direkte Anströmung (Scherkräfte) von adhärent wachsenden Zellen oder Reaktionskomponenten an Oberflächen verhindern.
In 2 wird dargestellt, wie durch den erfindungsgemäßen Kopfträger 1 mit dem ersten Durchtrittskanal 5 als Absaugung, dem zweiten Durchtrittskanal 6 als Einlass und dem dritten Durchtrittskanal 11 als Notabsaugung ein Überlaufen verhindert werden kann.
Der Kopfträger 1 hat einen Kopf 7 mit sich anschließendem stielförmigen Schaft 8. Ein in den Reaktionsraum 2 mündender erster Durchtrittskanal 5 dient als Absaugung für ein Fluid 3. Der Einlass erfolgt über einen zweiten Durchtrittskanal 6 in einen Tropfraum oberhalb der Fluidgrenze 4. Dieser zweite Durchtrittskanal 6 befindet sich in einer zum stielförmigen Schaft 8 beispielsweise halbkegelförmig abgeschrägten Verdickung 9. Durch diese Anordnung ist es möglich, dass im Reaktionsraum 2 keine ungewollten Blasen bzw. Gase entstehen.
Über den zweite Durchtrittskanal 6 wird aus einem Vorratsbehälter über ein Schlauch- und/oder Rohrsystem ein bestimmtes Flüssigkeitsquantum an Kulturmedium dem bereits vorhandenen Fluid 3 zugeführt. Das Fluid 3 tropft oder fließt über den zweiten Durchtrittskanal 6 in den Tropfraum. Luftblasen bleiben an der Fluidgrenze 4 oder entweichen sofort in die Umgebung. Über den ersten Durchtrittskanal 5 wird das Fluid aus dem Reaktionsraum 2 abgesaugt. So gelangt stets unverbrauchtes blasenfreies Kulturmedium in den Reaktionsraum 2, indem das Fluid 3 aus dem Vorrat im Tropfraum nachströmt. Das Fluid 3 im Tropfraum wird durch das Absaugen der Flüssigkeit aus dem Reaktionsraum 2 in den Reaktionsraum 2 hineingezogen. Die Höhe der Fluidgrenze 4 und somit das Vorratsvolumen wird mit Hilfe des ersten Durchtrittskanals 5 bestimmt.
Die Höhe der Fluidgrenze 4 kann auch mit Hilfe des dritten Durchtrittskanals 11 als Notabsaugkanal bestimmt werden.
In 3 wird eine weitere Ausführung der Anordnungen für den ersten und zweiten Durchtrittskanal 5, 6 gezeigt. Hierbei ist der zweite Durchtrittskanal 6 für die Zuleitung des Fluids neben dem Kopfträger 1 und der erste Durchtrittskanal 5 im Boden des Reaktionsraumes 2 angeordnet. Theoretisch sind auch andere, äquivalente Anordnungen möglich.
Wird der Reaktionsraum 2 durch einen Hebemechanismus des Kopfträgers 1 verändert, vermischt sich das Fluid 3 im Tropfraum mit dem Fluid im Reaktionsraum 2.
Wird die Oberfläche des Kopfträgers 1 und/oder des Aufnahmebehälters 10 mit einer hydrophoben und/oder hydrophilen Beschichtung versehen, werden die Eigenschaften der Fluide an den Oberflächen so beeinflusst, dass Luftblasen in den Fluiden einfacher entweichen können und Blasen direkt am Durchflusskopf in unmittelbarer Nähe zum Reaktionsraum 2 abgefangen und am Transport zum Reaktionsraum 2 gehindert werden.
Mögliche Abmessungen der einzelnen Komponenten sind folgende:

Höhe des Reaktionsraumes 200–500 μm

Höhe des Tropfraumes 0,5–3 mm

Höhe der Fluidgrenze 1–5 mm

Öffnungsdurchmesser der Durchtrittskanäle 0,5–1 mm
Die Vorteile des neuen Systems sind zum Einen der einfache Aufbau und zum Anderen, dass keine Veränderung am Medium (Flüssigkeit) erfolgt, da der Gasanteil im Fluid nicht geändert wird (Entgaser (Wärme, Vakuum)). Es erfolgt keine Ultraschallentgasung oder Erwärmung. Die Zellen können ausreichend mit Gasen (z.B. O₂) versorgt werden.
Ebenso können auf Grund blasenfreier und elektrisch sicher gekoppelter Absaugung eine ggf. für die Messung notwendige Referenzelektrode oder andere externe Sensoren so platziert werden, dass sie selbst bzw. ihr Elektrolyt keinen ungewollten Einfluss auf die Messung haben.
Ein weiterer Vorteil ist, dass der Reaktionsraum minimiert werden kann, der Platz zum „Durchschleusen" von Luftblasen ist nicht mehr nötig. Ebenso werden durch die Verkleinerung des Reaktionsraumes Veränderungen des Fluids aufgrund von Oberflächenreaktionen detektierbar sowie kleinere Volumina an Testsubstanzen/Testmaterialien ermöglicht.

1: Kopfträger
2: Reaktionsraum
3: Fluid
4: Fluidgrenze
5: erster Durchtrittskanal
6: zweiter Durchtrittskanal
7: Kopf
8: stielförmiger Schaft
9: Verdickung
10: Aufnahmebehälter
11: dritter Durchtrittskanal
12: halbzylinderförmige Verdickung
13: Sensorsysteme
14: Membran

Claims

Verfahren zur Überwachung von Veränderungen und Zuständen in Reaktionskammern dadurch gekennzeichnet, a) dass ein Fluid durch einen in einen Tropfraum oberhalb eines Reaktionsraumes (2) mündenden zweiten Durchtrittskanal (6) tropft oder fließt, so dass Luftblasen, die mit dem Fluid transportiert werden, in die Umgebung entweichen und b) dass das Fluid durch einen ersten Durchtrittskanal (5), welcher in den Reaktionsraum (2) mündet, abgesaugt wird und so die Höhe der Fluidgrenze (4) sowie das Vorratsvolumen bestimmt wird und c) dass die Höhe des Reaktionsraumes (2) durch einen Kopf (7) begrenzt wird und d) dass die Veränderungen und/oder Zustände mittels Sensorsystemen (13) im Reaktionsraum (2) und/oder im ersten Durchtrittskanal (5) gemessen werden und e) dass die Durchströmung der Flüssigkeit durch den Reaktionsraum (2) kontinuierlich oder abwechselnd in Fluss- oder Stoppphasen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Höhe der Fluidgrenze (4) und somit das Vorratsvolumen mit Hilfe eines dritten Durchtrittskanals (11) bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass eine Veränderung des Fluids (3) oder einer Oberfläche im Reaktionsraum (2) durch lebende Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, Enzyme, Antikörper und/oder chemische, biochemische und/oder immunologische Reaktionen ausgelöst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran (14) im Reaktionsraum (2) derart angeordnet ist, so dass Teile des Reaktionsraumes (2) von einer direkten Anströmung durch das Fluid ausgeschlossen sind.