JP4475525B2 - 偏光解消法による生体高分子のスクリーニング方法 - Google Patents
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しかし、ゲル電気泳動を用いた手法は時間がかかって稼動率が高くないという問題点だけでなく、ゲル電気泳動を用いた手法や表面プラズモン共鳴を用いた手法は、実際の生理学的な系で測定することができないため実情を反映していないという問題があった。
本発明は測定対象物である生体高分子を特異的に認識して結合する核酸を実際の生理学的な系で測定して評価できるようにすることを目的とするものである。
(a)前記反応室に測定対象物又は前記蛍光プローブを導入する導入ステップ、
(b)前記ステップにおいて前記反応室に測定対象物が先に入れられた場合はその後に前記反応室に蛍光プローブを導入し、又は前記ステップにおいて前記反応室に蛍光プローブが先に入れられた場合はその後に前記反応室に測定対象物を導入することにより、前記測定対象物に蛍光プローブを接触させて反応を開始させる反応開始ステップ、及び
(c)前記反応室内の測定対象物と蛍光プローブを含む前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求める測定ステップを実行し、測定ステップの結果に基づいてどの蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが測定対象物を特異的に認識して結合するかを見つける。
試料反応液の体積は1μL以下である。
r(t)=(IVV(t)−IVH(t))/(IVV(t)+2IVH(t))
=Σaiexp(−t/θi)
θ=1/6D
=ηV/kT
ここで、
IVV:蛍光の縦偏光成分強度
IVH:蛍光の横偏光成分強度
D:回転拡散係数
η:粘度
V:分子の体積
k:ボルツマン定数
T:絶対温度(K)
I:個々の分子(あるいは結合部位)を表わし、上記の説明では回転運動成分
ai:比例係数(存在割合の比)で、aiをすべて足すと1になる
測定対象物と蛍光プローブが相互作用した物質を経時的に検出することを目的とした場合、蛍光偏光解消法は相互作用を定量的に測定することが原理的に可能であるが、測定したい蛍光以外に試料中の培地やレンズから発生する自家蛍光(背景光)がノイズとして含まれることがあるため、これを除去することができれば好都合である。自家蛍光は寿命が短いものが多いことを利用して、自家蛍光が消滅した後に目的の蛍光を検出することにより自家蛍光によるノイズを除去することができる。
蛍光偏光解消法として時間分解蛍光偏光解消法を採用し、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が200ナノ秒から2マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なうようにすれば、自家蛍光によるノイズを除去することができる。
蛍光偏光解消法には定常光励起による蛍光偏光解消法と時間分解蛍光偏光解消法があるが、前者の定常光励起による蛍光偏光解消法は通常の蛍光顕微鏡により実施することができる。そこで、本発明の好ましい蛍光偏光解消法としての時間分解蛍光偏光解消法を実施する装置の一例を図1に示す。
得られたIVV、IVHを演算手段で演算することで蛍光異方性を求めることができる。この演算手段もデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
マイクロチップ2は3枚のガラス基板20,22,24が接合されて構成されている。ガラス基板20は厚みが1.0mmの石英ガラス、ガラス基板22は厚みが0.5mmの石英ガラス、ガラス基板24は厚みが0.17mmのカバーガラスである。カバーガラスの材質は限定されないが、石英、BK−7、パイレックス(登録商標)など、自家蛍光の少ないものが望ましい。
マイクロチップ2中の反応室32の形状は直径1mm、深さが0.5mmで、容量は約0.4μLである。
L1〜L7,S1の塩基配列と相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドをフルオレセインで標識したものをF−L1等と表すことにする。
その結果を表1にまとめて示す。
rpとrrRNAとの比較から蛍光異方性の変化量を知ることができる。F−L1,F−L2及びF−L7のFプローブはrRNAとの混合によりFプローブの蛍光異方性が増加しており、これらのFプローブが16SrRNAの対応する位置に結合していることがわかる。F−L3〜F−L6及びF−S1ではFプローブの蛍光異方性の増加がみられず、これらの対応する位置ではFプローブが結合しにくいことを示している。
なお、表1中のτpはFプローブ自体の蛍光の平均寿命、τrRNAはFプローブと16SrRNAの混合物の24時間後の蛍光の平均寿命である。KdはFプローブと16SrRNAの結合物の平衡解離定数である。
20,22,24 ガラス基板
26 流路溝
28,30 試料導入又は排出のための貫通穴
32 反応室用の貫通穴
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110>Kyoto Institute of Technology
Shimadzu Corporation
<120>Screening method of biopolymer by fluorescence depolarization spectroscopy and reaction vessel used therefor
<130>K1050058
<160>8
<210>1
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>1
gcc gta ctc c
<210>2
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>2
ccg tgt ctc a
<210>3
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>3
cag taa ttc c
<210>4
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>4
atc gtt tac g
<210>5
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>5
gaa cgt att c
<210>6
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>6
gta tct aat c
<210>7
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>7
gcg ttg cat c
<210>8
<211>10
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>unsure
<400>8
gta tca gat g
Claims (5)
- 1分子内にターゲットサイトとなる複数個の塩基配列をもつRNA又はDNAを測定対象物とし、それらのターゲットサイトの塩基配列のそれぞれに対して相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを蛍光標識したものをそれぞれのターゲットサイトに対する蛍光プローブとして用意し、
基体内部に容積が1μL以下の反応室をもち、外部からその反応室につながる流路が形成され、前記反応室の上側又は下側が励起光照射による蛍光測定が可能な透明部材となっている反応容器を用い、
前記蛍光プローブのそれぞれについて個々に、
(a)前記反応室に測定対象物又は前記蛍光プローブを導入する導入ステップ、
(b)前記ステップにおいて前記反応室に測定対象物が先に入れられた場合はその後に前記反応室に蛍光プローブを導入し、又は前記ステップにおいて前記反応室に蛍光プローブが先に入れられた場合はその後に前記反応室に測定対象物を導入することにより、前記測定対象物に蛍光プローブを接触させて反応を開始させる反応開始ステップ、及び
(c)前記反応室内の測定対象物と蛍光プローブを含む前記試料反応液に励起光を照射して蛍光偏光解消法により蛍光異方性を測定するとともに、この測定を反応開始から所定の時間にわたって行なうことにより蛍光異方性の変化量と変化速度の少なくとも一方を求める測定ステップ、
を備えて、
前記測定ステップの結果に基づいてどの蛍光プローブのオリゴヌクレオチドが測定対象物を特異的に認識して結合するかを見つけることを特徴とするスクリーニング方法。 - 前記蛍光プローブのオリゴヌクレオチドはアンチセンス分子である請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 前記蛍光偏光解消法は時間分解蛍光偏光解消法である請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- 前記蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が200ナノ秒から2マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内で蛍光異方性の測定を行なう請求項3に記載のスクリーニング方法。
- 1つの基体に前記反応室及び流路が複数個形成されており、複数の蛍光プローブについて並行して測定を行なう請求項1から4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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