JP6120314B2 - 細胞培養デバイス - Google Patents

Description

本発明は、細胞の培養に適した環境を形成するための培養室を有する細胞培養デバイスに関する。

細胞培養は、一般的にシャーレ等の容器に細胞及び液体状の培地を収容した状態で行われる。しかし、近年、半導体製造分野での微細加工技術（μTAS（micro Total Analysis System））の進歩に伴って医療やバイオテクノロジーの研究分野でも微細加工技術によって製造されたマイクロデバイスの応用が進められており、こうしたマイクロデバイスを用いた細胞培養が行われるようになっている。

細胞を上記のような微細空間で培養することの利点としては、高価な試薬の消費量を低減することができること、熱容量が小さいため温度の均一性に優れ、また温度変化の追従性がよいこと、細胞培養面積が小さいため顕微鏡の観察視野を大きく移動させることなく観察できるように設計することができ、観察用スペースが小さくすむことなどが挙げられる。

例えば、特許文献１には、微細加工により貫通孔や流路を形成したガラス基板又はシリコン基板の上下に、透明ガラス基板をフッ酸溶液又は接着剤で接合したマイクロデバイスが記載されている。このマイクロデバイスは、透明ガラス基板で塞がれた貫通孔（培養室）の容積が1μL以下となるように設計されている。

特許文献２には、酸化又はエッチングにより窪み（培養室）を形成したシリコンディスクの上部を、血清や栄養物質等を透過させることができる透過性／半透過性膜で覆ったマイクロデバイスが記載されている。このマイクロデバイスは、その上下をニッケル板と板状の磁石で挟み、磁力を利用してシリコンディスクとその上部の膜を保持する構造になっている。

培養細胞を医療用途に用いる場合、顕微鏡によって細胞の形態を観察し、正常な細胞と異常な細胞を選別しなければならないことがある。培養室の底面以外に接着し成長した細胞を観察することは困難であるため、培養室の底面に細胞接着処理を施したり、底面以外の内面に細胞非接着処理を施したりすることが、しばしば行われる。

しかし、マイクロデバイスの培養室は、直径数mm程度の微細空間であるため、特許文献２のマイクロデバイスのように、シリコンディスクにエッチングで窪みを形成して培養室としたものでは、底面と側面が繋がっているため、底面だけ、或いは側面だけに表面処理を行ったり、底面と側面に別の表面処理を行ったりすることが困難である。

特許文献１のマイクロデバイスも、培養室の側面、上面、底面を形成する各部材をフッ酸溶液又は接着剤で接合した後では、底面だけ、或いは側面だけに表面処理を行ったり、底面と側面に別の表面処理を行ったりすることが困難である。

特開2006-220566号公報（[0029]〜[0034]、図2） 特開平10-276763号公報

これに対して、特許文献１のマイクロデバイスでは、各部材を接合する前であれば、底面やそれ以外の面に単独で表面処理を施すことができる。しかし、細胞接着処理或いは細胞非接着処理のために、細胞親和性の高い層或いは細胞親和性の低い層を部材表面にコーティングすると、このコーティングが邪魔になってフッ酸溶液で接合することができない。又、接着剤による接合についても、コーティングが邪魔になって各部材の接合力が低下する。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養室の底面部分とそれ以外の部分が別個の部材からなるものにおいて、各部材に個別の表面処理を行った後でも容易且つ密接に接合することが可能な細胞培養デバイスを提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞培養デバイスは、
貫通孔を有する第１基板と、
前記貫通孔の一端を塞ぐように前記第１基板の下面側に配置される第２基板と、
前記第１基板と前記第２基板とを磁気吸引力によって接合させる磁力対である第１保持部材及び第２保持部材と
を含み、前記第１保持部材は前記貫通孔を取り囲むように環状に前記第１基板側に配置され、前記第２保持部材は前記第２基板側に配置されていることを特徴とする。
ここで、「磁力対」とは、磁石と、磁石に吸引される強磁性体、又は、磁石と磁石である。

また、本発明に係る細胞培養デバイスは、
貫通孔を有する第１基板と、
前記貫通孔の一端を塞ぐように前記第１基板の一面側に配置される第２基板と、
前記貫通孔の他端を塞ぐように前記第１基板の他面側に配置された第３基板と、
前記第１基板と前記第２基板とを磁気吸引力によって接合させる磁力対である第１保持部材及び第２保持部材と
を含み、前記第１保持部材は前記貫通孔の中心軸を取り囲むように環状に前記第３基板に配置され、及び前記第２保持部材は前記第２基板側に配置されていることを特徴とする。

上記の細胞培養デバイスでは、第１保持部材と第２保持部材の間（磁力対間）に作用する磁気吸引力により、第１基板と第２基板が密接に接合され、第１基板の貫通孔と第２基板により培養室が形成される。このとき、貫通孔の内面が培養室の側面に、第２基板の表面が培養室の底面となる。従って、側面と底面に対してそれぞれ別個に表面処理を行い易い。

上記構成の細胞培養デバイスにおいて、第１基板の第２基板との接合面には、前記貫通孔の周縁部を除いて凹部が形成されていることが望ましい。さらに、前記凹部は、第１保持部材と第２保持部材の間に形成されていることが望ましい。

この場合、第１保持部材と第２保持部材の間に働く磁気吸引力の大きさは変わらないが、両者の間の第１基板と第２基板の接触面の面積が小さくなるため、該接触面の応力は大きくなる。その結果、第１基板は第２基板により密接に接合される。

第１保持部材は第１基板の内部に完全に埋め込まれていることが望ましい。

この場合、第１保持部材に細胞や培地が付着することがないため、第１保持部材が錆びて接合力が低下するのを防止することができる。

前記第１基板は、ガス透過性を有する樹脂から作製されていることが望ましく、また、親水性であることが望ましい。

また、第１基板の第３基板との接合面には、その一端が前記貫通孔に連通した流路が形成され、第３基板には、前記流路に連通した孔が形成されていてもよい。

この場合、該孔及び流路を介して細胞や培地等を導入したり培地を排出したりすることができるため、細胞を長期間培養することが可能となる。

本発明に係る細胞培養デバイスは、培養室の側面を形成する第１基板と、培養室の底面を形成する第２基板とが、第１保持部材と第２保持部材の間に作用する磁気吸引力により密接に接合される。第１基板と第２基板は別個の部材であるため、それぞれに、細胞非接着処理、細胞接着処理を行った後、両者を磁気吸引力で接合することができ、培養室の局所的な処理が容易に可能となる。

本発明の一実施例に係る細胞培養デバイスの第１基板の上面図(a)、AA'矢視断面図(b)。 同実施例の細胞培養デバイスの上面図(a)、AA'矢視断面図(b)。 本発明の別の実施例に係る細胞培養デバイスの第１基板の上面図(a)、AA'矢視断面図(b)。 同実施例の細胞培養デバイスの上面図(a)、AA'矢視断面図(b)。 本発明のさらに別の実施例に係る本発明に係る細胞培養デバイスの、貫通孔の中心軸を含む断面図。

［第１実施例］
本発明に係る細胞培養デバイスの第１実施例について、図１及び２を参照しつつ詳述する。図１は、本実施例の第１基板の上面図(a)、AA'矢視断面図(b)であり、図２は、該第１基板を含む同実施例の細胞培養デバイスの上面図(a)、AA'矢視断面図(b)である。なお、図１及び２では、説明のため内部構造の一部を透過させて図示している。

第１基板１１は、ポリジメチルシルオキサン（PDMS）（ダウコーニング社製、SILPOT184）から成る直径30mm厚さ4mmの円盤状基板であり、中央には直径2.5mmの貫通孔１２が形成されている。PDMSはガス透過性に優れた材料として知られている。ここで、第１基板１１において、貫通孔１２の中心軸側を基板の中心側、その反対側を外側とし、培養時に細胞培養ディッシュ２１と接する側の面を底面、その反対の面を上面とする。第１基板１１には、内径6mm外径20mm厚さ1mmの環状のネオジム磁石３１（第１保持部材に該当する）が貫通孔１２を取り囲むように封入されており、さらに、底面に繋がる開口として環状凹部１４が形成されている。

上記の第１基板１１は、以下のように作製した。まず、中心から6mm〜24mmの部位まで溝１５が形成されるように加工した円盤状鋳型（直径30mm厚さ4mm）にPDMSを注入し硬化させた。この円盤状基板の中央に、貫通孔１２（直径2.5mmm）を打ち抜き工具によって形成した。さらに、溝１５にネオジム磁石３１を挿入した後PDMSを再注入し硬化させた。環状凹部１４は、PDMS再注入の際、溝１５の容積より少ない量のPDMSを注入することによって形成した。
なお、この作製方法は一例にすぎず、適宜の方法によって第１基板１１を作製してよい。例えば、貫通孔１２は、鋳型を加工して形成してもよいし、環状凹部１４は、円盤状基板の硬化したPDMSを削ることによって形成してもよい。また、第１基板１１の素材もPDMSに限定されることはないが、ガス透過性に優れた材料であることが望ましい。

第２基板として、ポリスチレン製の細胞培養ディッシュ２１を用いる。
細胞培養ディッシュ２１を載せるプレート４１（アルミ製又は樹脂製）には、ネオジム磁石３１と同じ内径外径で、ネオジム磁石３１との間に磁気吸引力が働くように配置された環状のネオジム磁石３２（第２保持部材に該当する）が嵌め込まれており、環状のネオジム磁石３２の内側のプレート４１部分には、少なくとも貫通孔１２より大きな、貫通している開口４２が形成されている。プレート４１とネオジム磁石３２は、接着剤によって接合されている。

図２に示すように、細胞培養時に、第１基板１１を載せた細胞培養ディッシュ２１をプレート４１に載せると、第１基板１１内のネオジム磁石３１とプレート４１内のネオジム磁石３２との間に磁気吸引力が働き、第１基板１１は細胞培養ディッシュ２１に密接に接合される。第１基板１１の底面には、貫通孔１２の周縁部を除いて環状凹部１４が形成され、第１基板１１と細胞培養ディッシュ２１の接触面の面積が小さくされているため、該接触面の応力は、第１基板１１の底面全面が細胞培養ディッシュ２１と接している場合より大きくなり、第１基板１１の周縁部は細胞培養ディッシュ２１により強く接合される。環状凹部１４は、ネオジム磁石３１とネオジム磁石３２との間、さらにはその外周側にわたって形成されていることが望ましい。

本実施例では、第１保持部材、第２保持部材として両方にネオジム磁石を用いたが、第１保持部材と第２保持部材は、両者の間に磁気吸引力が働き、細胞培養の間、各部材を接合し続けることができる磁力対であれば特に限定されず、一方が磁石で他方が強磁性体であってもよい。磁石もネオジム磁石に限定されない。より高温で使用可能なより強力な磁石の例として、例えば、サマリウムコバルト磁石が挙げられる。

本実施例に係る細胞培養デバイス７０では、第１基板１１の貫通孔１２が培養室７１の側面となり、細胞培養ディッシュ２１の表面が培養室７１の底面となる。そこで、第１基板１１と細胞培養ディッシュ２１を滅菌（例えばγ線滅菌またはオートクレーブ滅菌）した後、細胞培養ディッシュ２１に細胞接着処理を施し、及び／又は第１基板１１に細胞非接着処理を施してから、細胞培養ディッシュ２１を挟んで第１基板１１内のネオジム磁石３１とプレート４１内のネオジム磁石３２の間に磁気吸引力が働くように、第１基板１１とプレート４１を組み合わせることによって、本実施例に係る細胞培養デバイス７０が完成される。そのため、微少空間である培養室７１の局所的処理が容易となる。
また、本実施例に係る細胞培養デバイス７０の各部材は磁気吸引力によって接合されているため、組み立て時に多少のずれが生じた場合でも、各部材を分解して組み立てなおすことが容易にできる。

細胞接着処理としては、例えば、正常細胞の培養に必須なタンパク質（コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等）を部材表面にコーティングする方法などが挙げられる。
細胞非接着処理としては、例えば特許3731921号公報に開示のような、部材表面に親水化処理を施すことでタンパク質の吸着を抑制する方法などが挙げられる。

細胞培養は、細胞培養デバイス７０の培養室７１に細胞を播種し、培地を第１基板１１が覆われるまで入れ、細胞培養デバイス７０の上部に蓋（例えば透明な樹脂製又は石英ガラス製）をした後、インキュベータ内に静置して行われる。
ネオジム磁石３１は、第１基板１１の内部に完全に埋め込まれており、培養室７１に導入される細胞や培地等と触れることがないため、細胞や培地等の付着を原因とするネオジム磁石３１の磁気吸引力の低下やサビを防止し、各部材の接合力が低下することを防ぐことができる。

本実施例に係る細胞培養デバイス７０では、各部材の接合に外部の治具を用いておらず、また、ネオジム磁石３１とネオジム磁石３２の厚みは充分薄いため、細胞培養デバイス７０の厚みは、従来の細胞培養デバイスの厚みと略同じである。従って、従来の細胞培養デバイスで用いられる培養システムや観察システムで培養や観察を行うことができる。

本実施例に係る細胞培養デバイス７０では、培養室７１の上部が開いているため、この部分から培地交換や位相差顕微鏡での観察が容易に可能である。
本実施例に係る細胞培養デバイス７０では、プレート４１のうち、培養室７１の底面の下方（すなわち貫通孔１２の下方）に配置されるプレート４１部分に開口４２が形成されており、この開口４２を通してプレート４１の下からも細胞を観察できるようになっている。従って、例えばIn Cell Analyzer 2000（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）のような、培養細胞を下方から観察する装置を利用することができる。プレート４１の開口４２は貫通孔１２より大きく形成してされているため、細胞培養デバイス７０を磁気吸引力によって組み立てた時、第１基板１１の貫通孔１２の中心軸とプレート４１の開口４２の中心軸とが多少ずれてもプレート４１の開口４２から培養室７１の底面全体を観察することが可能である。

［第２実施例］
本発明に係る細胞培養デバイス７０の第２実施例について、図３及び４を参照しつつ詳述する。図３は、本実施例の第１基板と第３基板の上面図(a)、AA'矢視断面図(b)であり、図４は、該第１基板と該第３基板とを含む本実施例に係る細胞培養デバイス７０の上面図(a)、AA'矢視断面図(b)である。なお、図３及び４では、説明のため内部構造の一部を透過させて図示している。
以下には、第１実施例と異なる点のみを記載する。特に記載がない点は第１実施例と同様である。

本実施例の第１基板１１と第３基板５１は、PDMSから成る20mm角の基板である。
第１基板１１は、厚み1.3mmであり、中央には直径2.5mmの貫通孔１２が形成されている。ここで、第１基板１１において、貫通孔１２の中心軸側を基板の中心側、その反対を外側とし、培養時に細胞培養ディッシュ２１と接する側の面を底面、その反対の面を上面とする。第１基板１１の上面には、2本の流路（幅0.5mm深さ0.2mm）１７ａ及び１７ｂが形成されており、各流路１７ａ、１７ｂの一端は貫通孔１２へ連通している。第１基板１１の底面には、貫通孔１２を取り囲むように環状凹部１４が形成されている。貫通孔１２は、培養室の壁面に起因する影によって培養室７１内の細胞が観察できないことがないように、観察に用いる顕微鏡のレンズの性能に合わせて、すり鉢状とすることが望ましい。

第３基板５１は、厚み3mmであり、内部に内径6mm外径10mm厚さ2mmのネオジム磁石３１（第１保持部材に該当する）が封入されている。第３基板５１には、ネオジム磁石３１より外側の部分に2つの孔（直径1.5mm）５２ａ及び５２ｂが形成されており、本細胞培養デバイス７０を組み立てると、この孔５２ａ、５２ｂは、それぞれ、流路１７ａ、１７ｂの他端に連通する。
第１基板１１と第３基板５１は、例えば真空プラズマなどで表面を活性化させて接合されている。

第１基板１１と第３基板５１の他の点や細胞培養ディッシュ２１、第２保持部材に該当するネオジム磁石３２を含むプレート４１は、第１実施例と同様である。

図４に示すように、細胞培養時に、接合された第１基板１１と第３基板５１を載せた細胞培養ディッシュ２１をプレート４１に載せると、第３基板５１内のネオジム磁石３１とプレート４１内のネオジム磁石３２との間に磁気吸引力が働き、第１基板１１と細胞培養ディッシュ２１は密接に接合される。本実施例においても、第１実施例と同様に、第１基板１１の細胞培養ディッシュ２１との接触面には、前記貫通孔１２の周縁部を除いて環状凹部１４が形成されており、両者の接触面が小さくなるため、該接触面の応力は、第１基板１１の底面全体が細胞培養ディッシュ２１と接している場合より大きくなる。その結果、第１基板１１の周縁部は細胞培養ディッシュ２１により強く接合される。環状凹部１４は、第１基板１１が細胞培養ディッシュ２１と接触する面の面積を小さくするように、前記貫通孔１２を取り囲むように形成されていることが望ましく、ネオジム磁石３１とネオジム磁石３２との間、さらにはその外周側にわたって形成されていることがより望ましい。

本実施例に係る細胞培養デバイス７０においても、培養室７１の側面（第１基板１１の貫通孔１２の内側）と底面（細胞培養ディッシュ２１の表面）は別々の部材であるため、第１基板１１又は第３基板５１と接合した後の第１基板１１と細胞培養ディッシュ２１に、それぞれ別個に、細胞非接着処理、細胞接着処理を行った後、両者を磁気吸引力で接合することができ、培養室７１の局所的な処理が容易に可能となる。

また、本実施例に係る細胞培養デバイス７０には、細胞や培地を導入するための孔５２ａ及び流路１７ａと、培地を排出するための孔５２ｂ及び流路１７ｂとが設けられているため、細胞を長期間培養することが可能となる。

［第３実施例］
本発明に係る細胞培養デバイス７０の第３実施例について、図５を参照しつつ詳述する。図５は、本実施例に係る細胞培養デバイス７０の、貫通孔１２の中心軸を含む断面図である。以下には、第１実施例と異なる点のみを記載する。特に記載がない点は第１実施例と同様である。

第１基板１１には、ネオジム磁石３１の上に、ネオジム磁石３１を覆うように、第１ヨーク６１が封入されている。第１ヨーク６１は、内径がネオジム磁石３１と同じで、外径がネオジム磁石３１より大きい。第１ヨーク６１の外周側の端部は、ネオジム磁石３１の厚みと同じ程度、底面側に突出していることが望ましく、この突出した部分６１ａは、環状凹部１４の外周縁より内側にあることがより望ましい。また、第１ヨーク６１は、第１基板１１に完全に埋め込まれていることが望ましい。
プレート４１には、ネオジム磁石３２の下に、内径がネオジム磁石３２と同じで、外径が第１基板１１より大きい第２ヨーク６２が包含されている。第２ヨーク６２の外周側の端部６２ａは、ネオジム磁石３２の厚みと同じ程度、上面側に突出していることが望ましい。プレート４１とネオジム磁石３２と第２ヨーク６２とは、接着剤によって接合されている。
本実施例において、第１ヨーク６１、第２ヨーク６２の厚み分だけ、第１基板１１、プレート４１の厚みが適宜変更されている。

本実施例に係る細胞培養デバイス７０によれば、ネオジム磁石３１からネオジム磁石３２への磁力線又はネオジム磁石３２からネオジム磁石３１への磁力線は、第１ヨーク６１と第２ヨーク６２によって第１基板１１の外周側に集中するように流れが変えられるため、培養室７１を通らず、培養細胞に対する磁気吸引力の影響を低減させることができる。

第１ヨーク６１、第２ヨーク６２としては、SPCCやS45Cなどが挙げられる。しかし、第１ヨーク６１、第２ヨーク６２の素材・配置は、ネオジム磁石３１からネオジム磁石３２への磁力線又はネオジム磁石３２からネオジム磁石３１への磁力線の流れを、培養細胞に影響を及ぼさないようにすることができる素材・配置であればよく、上記の素材・配置に特に限定されない。

以上、本発明を実施するための形態について具体例を挙げて説明を行ったが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。

１１…第１基板
１２…貫通孔
１４…環状凹部
１５…溝
１７ａ、１７ｂ…流路
２１…細胞培養ディッシュ
３１、３２…ネオジム磁石
４１…プレート
４２…開口
５１…第３基板
５２ａ、５２ｂ…孔
６１…第１ヨーク
６２…第２ヨーク
７０…細胞培養デバイス
７１…培養室

Claims (9)

1. 貫通孔を有する第１基板と、
   前記貫通孔の一端を塞ぐように前記第１基板の下面側に配置される第２基板と、
   前記第１基板と前記第２基板とを磁気吸引力によって接合させる磁力対である第１保持部材及び第２保持部材と
   を含み、前記第１保持部材は前記貫通孔を取り囲むように環状に前記第１基板側に配置され、前記第２保持部材は前記第２基板側に配置されていることを特徴とする細胞培養デバイス。
2. 貫通孔を有する第１基板と、
   前記貫通孔の一端を塞ぐように前記第１基板の一面側に配置される第２基板と、
   前記貫通孔の他端を塞ぐように前記第１基板の他面側に配置された第３基板と、
   前記第１基板と前記第２基板とを磁気吸引力によって接合させる磁力対である第１保持部材及び第２保持部材と
   を含み、前記第１保持部材は前記貫通孔の中心軸を取り囲むように環状に前記第３基板に配置され、及び前記第２保持部材は前記第２基板側に配置されていることを特徴とする細胞培養デバイス。
3. 前記第１基板の前記第２基板との接合面には、前記貫通孔の周縁部を除いて凹部が形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養デバイス。
4. 前記凹部は、前記第１保持部材と前記第２保持部材の間に位置するように形成されていることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養デバイス。
5. 前記凹部は、前記第１保持部材よりも外側に大きくなるように形成されていることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養デバイス。
6. 前記第１保持部材は前記第１基板内に完全に包埋されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養デバイス。
7. 前記第１基板は親水性基板であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養デバイス。
8. 前記第１基板はガス透過性を有する樹脂から作製されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養デバイス。
9. 第１基板の第３基板との接合面には、その一端が前記貫通孔に連通した流路が形成され、第３基板には、前記流路に連通した孔が形成されていることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養デバイス。

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