JP6183289B2 - 細胞培養デバイス - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するためのウエル（細胞培養室）を有し、そのウエル内に細胞の培養に適した環境を形成するための細胞培養デバイスに関するものである。そのような細胞培養デバイスは、例えば生体内の微小環境の模擬を行なうことにより、細胞の機能や細胞に対する薬剤の効用を解析するために使用されるものである。細胞培養デバイスは生体内の微小環境の模擬できるため、例えば肝細胞を入れることで肝臓の解毒作用を模擬するためのデバイスとして利用することができる。また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から得られた網膜細胞を培養するために利用することができる。

近年、小さな基板上に様々な機能を集積するμＴＡＳ（micro Tatal Analysis System）の研究が盛んに行なわれており、微少空間での細胞培養機能を集積する研究も特に盛んに行なわれている。微小空間の利用するメリットとして、高価な試薬消費量の低減、熱容量が小さいことから温度の均一性に優れることや温度変化の追従性が良いことなどがある。特に、小型かつ密閉型の細胞培養デバイスにすることで、試薬の蒸発を防ぎ、試薬の置換を容易にし、細胞培養の分野では特に問題となる外界からの雑菌の混入を防ぐことができる。

微少空間での細胞培養においてのメリットとして、観察が必要な面積が小さく、顕微鏡を移動せずに常に全ての細胞を観察できるように設計できることが挙げられる。細胞培養は主に細胞培養室の底面において行なわれるが、細胞が底面以外の部分に接着して培養されることがある。細胞培養室の底面以外に接着した細胞は観察が難しいため、そのような細胞の存在する容器を用いると不具合のある細胞が存在する可能性があり、医療用途に用いることができない。したがって、観察できない細胞ができる限り存在しないように、細胞培養デバイスの細胞培養室以外の部分に細胞が接着しないようにすることが好ましい。

特開２００４−３６１２０５号公報 特開２００６−２２０５６６号公報 特開２０１１−２４４７１３号公報

細胞の接着を防止するための一般的な対策としては、細胞の接着が好ましくない部位にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などによる親水化処理などの細胞非接着処理を行なうことが知られている。また、細胞を接着して培養する細胞培養面には、培養に適したコーティングをすることも知られている。

細胞培養デバイスとしては、細胞培養面である細胞培養室の底面には細胞の培養に適したコーティングなどの処理が施され、細胞培養面以外の部分、例えば細胞培養室に通じる流路などの壁面には細胞の接着を防止する細胞非接着処理が施されていることが好ましい。しかし、細胞培養デバイスは微小でかつ微細なデバイスであるため、局所的な表面処理が難しい。例えば、薬液によって細胞培養面に細胞接着処理を施そうとすると、必ず細胞培養室に通じる流路の壁面も同じ処理が施されてしまう。同様に、細胞培養面以外の部分に細胞非接着処理を施そうとしても、必ず細胞培養面も同じ処理が施されてしまう。

そこで、本発明は、細胞培養面とそれ以外の面に対して異なる表面処理を施すことができる構成を有する細胞培養デバイスを提供することを目的とするものである。

本発明にかかる細胞培養デバイスは、底をもつ開口を一方側の面に有する容器、ベース部材及びカバー部材を有し、容器の開口内底面の中央部にベース部材を配置して該底面に密着させ、さらに開口にカバー部材を嵌め込んで構成する。容器の開口内底面の中央部は平坦になっている。ベース部材は、耐薬品性を有する弾性材料からなり、開口内底面よりも小さい主平面及びその主平面に対して垂直に設けられた貫通孔を有する。カバー部材は、耐薬品性を有する材料からなり、開口に嵌合する平面形状をもち、開口に嵌め込まれたときに外周面で開口の内側壁面を保持するとともに、開口内底面側の平面がベース部材に密着するように構成されている。容器、ベース部材及びカバー部材が一体として構成された際、ベース部材の貫通孔の内側側面と開口内底面の一部によって画された空間により細胞培養室が構成される。カバー部材には、細胞培養室に液を供給するための流路をなす貫通孔が設けられている。

容器の開口の平面形状として円形が挙げられる。かかる形状の開口を有するものとして一般的なシャーレを用いることができる。

その場合、カバー部材は少なくとも周縁部が弾性材料で構成され、外径が開口の内径よりも大きくなっていることが好ましい。カバー部材の外径が開口の内径よりも大きくなっていることにより、開口に嵌め込まれたカバー部材の周縁部の弾性力によってカバー部材の外周面が開口の内側壁面を保持する力が強くなり、カバー部材の開口内底面側の平面がベース部材に密着した状態をより確実に維持することができる。これにより、細胞培養室内の液密性をより確実に確保することができる。

カバー部材の弾性材料で構成された周縁部としては、カバー部材の外周面に設けられ、弾力性をもって外周面と開口の内側壁面との間に介在して開口の内側壁面を保持する保持部材であってもよい。かかる保持部材としては、例えばＯリングを挙げることができる。

カバー部材の中心を対象としたカバー部材の周縁部の２ヶ所の位置に、それらの位置でカバー部材を挟むようにしてカバー部材を保持し、開口への嵌め込み又は開口からの取出しを可能とする切欠き部が設けられていてもよい。そうすれば、ピンセットなどを用いてカバー部材を容器へ装着したり容器から取り出したりする作業が容易になる。

カバー部材の開口内底面側の面においてベース部材と接する部分はその周囲よりも底面側へ突出した凸平面であることが好ましい。そうすれば、カバー部材とベース部材との間の密着面における面圧が高まり、細胞培養室内の液密性をさらに高めることができる。

本発明にかかる細胞培養デバイスの好ましい実施の態様は、カバー部材全体が弾性材料によって構成されており、開口に嵌め込まれたカバー部材の周縁部を弾性変形させて開口内底面側へ均等に押し込んだ状態にし、その弾性力によって凸平面を開口内底面側へ押し付け、開口内底面とベース部材との間及びベース部材とカバー部材との間の気密及び液密を保持するものである。かかる態様にすることで、細胞培養室内の液密性をさらに高めることができる。

また、カバー部材全体が弾性材料によって構成されており、カバー部材の開口内底面側とは反対側の面の中央部に凹部が設けられていてもよい。そうすれば、カバー部材の外周面が開口の内側壁面から応力を受けたときに、カバー部材が底面側の面を底面側へ押し出す方向に変形しやすくなり、ベース部材に対する開口内底面側への押圧力を高めて細胞培養室内の液密性を高めることができる。

開口内底面に細胞接着処理が施されていることが好ましい。これにより、細胞培養室に送り込んだ細胞をその底面に接着させることができる。

また、ベース部材及びカバー部材には細胞非接着処理が施されていることが好ましい。そうすれば、本発明の細胞培養デバイスのうち、細胞培養室の底面以外の部分に細胞非接着処理が施されていることになり、細胞培養面である細胞培養室の底面以外の面に細胞が接着することを防止することができる。

ベース部材の貫通孔の内側側面は該ベース部材の一方の面側（容器開口の底面側）へいくにしたがって内径が小さくなる方向に傾斜していることが好ましい。そうすれば、細胞培養室の底面を観察する際にその底面に細胞培養室の内壁面の影が生じることを防止することができる。

本発明の細胞培養デバイスは、別々の部材である容器、ベース部材及びカバー部材を組み合わせて構成するものであるので、容器、ベース部材及びカバー部材に対して別々の表面処理を施すことができる。これにより、細胞培養面である細胞培養室の底面をなす開口内底面には細胞接着処理を施し、ベース部材やカバー部材には細胞非接着処理を施すことができる。そして、この細胞培養デバイスは、容器の開口内底面の中央部にベース部材を配置し、さらに開口にカバー部材を嵌め込んで構成するものであるので、専用の治具や工具を用いなくても手作業で構成することができ、デバイスの組立作業が容易である。

細胞培養デバイスの一実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＡ−Ａ位置における断面図である。 同実施例の各部材を示す図であり、（Ａ）はカバー部材、（Ｂ）はベース部材、（Ｃ）は容器である。 細胞培養デバイスの他の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ位置における断面図である。 同実施例の細胞培養デバイスを示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＣ−Ｃ位置における断面図である。 細胞培養デバイスのさらに他の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は（Ａ）のＤ−Ｄ位置における断面図である。

細胞培養デバイスの一実施例について図１及び図２を用いて説明する。

この細胞培養デバイスは、底をもつ開口を一方側の面に有する容器２、その容器２内に配置されるベース部材４及びカバー部材６を備えている。容器２は例えばシャーレなどの透明容器であり、開口内底面２ａは平坦である。容器２の開口の内径は例えば３５ｍｍであり、深さは例えば９．５ｍｍである。

細胞培養デバイスは、容器２の開口内底面２ａの中央部にベース部材４を配置して密着させ、さらにカバー部材６を開口に嵌め込んでカバー部材６の凸平面部６ａをベース部材４に密着させることで構成する。ベース部材４に設けられた貫通孔４ａと開口内底面２ａの一部によって細胞培養室８が画される。

細胞培養室８内の液密は、開口内底面２ａとベース部材４の間の接触面及びベース部材４とカバー部材６との間の接触面のシール性が保たれることで確保されるようになっている。開口内底面２ａとベース部材４との間の接触面のシール性が確保されるためには、開口内底面２ａは全面が平坦である必要はなく、少なくともベース部材４と接する中央部が平坦であればよい。容器２の平面形状及び開口の平面形状は円形に限られず、多角形等いかなる形状であってもよい。

ベース部材４は、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などガス透過性に優れ、耐薬品性と弾力性を有する材料により構成された、例えば円板状の部材である。ベース部材４の主平面には細胞培養室８を画す貫通孔がその中央部に設けられ、さらに主平面のうち一方の面に細胞培養室８に通じる流路１２及び１４をなす溝が設けられている。なお、ベース部材４の平面形状は必ずしも円形である必要はない。

ベース部材４は、流路１２及び１４をなす溝が設けられている面とは反対側の面が開口内底面２ａ側を向いた状態で開口内底面２ａの中央部に配置される。細胞培養室８を画す貫通孔４ａの内側側面は、その内径が開口内底面２ａへいくにしたがって小さくなるように傾斜している。これにより、細胞培養室８の側壁が傾斜し、底面８ａの内径は上面の内径よりも小さくなる。細胞培養室８内は容器２の下面側（開口の開口が設けられている面とは反対側）から観察されるため、容器２の下面側から見たときに細胞培養室８の側壁が広がる方向へ傾斜し、それによって細胞培養室８の底面８ａに側壁の影が生じることが防止される。

ベース部材４は、細胞培養室８を画す貫通孔や流路をなす溝を有する鋳型を作成しておき、転写によって作成することができる。なお、細胞培養室８を画す貫通孔４ａは、打ち抜き工具を用いて形成してもよい。細胞培養室８を画す貫通孔は、例えば細胞培養室８の底面８ａの直径が２．５ｃｍ程度になるように形成する。流路１２及び１４をなす溝の寸法は、例えば幅が１ｍｍ程度、深さが０．１ｍｍ程度である。

カバー部材６は、ベース部材４と同様に、例えばＰＤＭＳなどガス透過性に優れ、耐薬品性と弾力性を有する材料により構成されている。カバー部材６の平面形状は円形であり、容器２の開口に嵌め込まれるようになっている。カバー部材６の外径φ２は容器２の開口の内径φ１よりも僅かに大きくなっている。カバー部材６の外径が容器２の開口の内径よりも僅かに大きくなっていることで、カバー部材６が容器２の開口に嵌め込まれたときにカバー部材６の外周面が容器２の開口の内側壁面に密着して該壁面を保持し、容器２の開口内における自身の位置を維持する。カバー部材６の寸法は、例えば厚みが６ｍｍ、外径が３６ｍｍである。

カバー部材６は、開口内底面２ａ側の面の中央部に開口内底面２ａ側へ突起した凸平面部６ａを有する。凸平面部６ａの平面形状はベース部材４と同じ円形であり、同程度の外径を有する。この凸平面部６ａの先端平面がベース部材４に密着する。カバー部材６の外周面は容器２の開口内側壁面を保持するため、容器２の開口にカバー部材６を嵌め込んでカバー部材６の凸平面部６ａをベース部材４に押し付ければ、その状態が維持される。

カバー部材６の凸平面部６ａとは反対側の面の中央部に凹部６ｂが設けられている。凹部６ｂは、カバー部材６の外周面が容器２の内側壁面から応力を受けたときに凸平面部６ａを底面２ａ側へ押し出す方向にカバー部材６が変形することを許容するものである。容器２の内側壁面からの応力によってカバー部材６が凸平面部６ａを底面２ａ側へ押し出す方向に変形することで、凸平面部６ａがベース部材４に押し付けられ、開口内底面２ａとベース部材４との間及びベース部材４と凸平面部６ａの先端面との間のシール性が向上する。

凹部６ｂの形状は特に限定されない。例えば図３に示されているように、凹部６ｂの内側側面が、開口内底面２ａ側へいくにしたがってその内径を小さくする方向に傾斜していてもよい。また、凹部６ｂは必ずしも設けられている必要はない。

カバー部材６には、細胞培養室８に対して培養液などの液の注入や排出を行なうための流路をなす貫通孔６ｃ，６ｄ及び６ｅが設けられている。貫通孔６ｃは細胞培養室８の上面に通じるようにカバー部材６の中央部に設けられ、貫通孔６ｄと６ｅはそれぞれ細胞培養室８に通じる流路１４，１６の端部に対応する位置に設けられている。これらの貫通孔６ｃ，６ｄ及び６ｅは打ち抜き工具によって形成することができる。また、ＰＤＭＳの硬化の際に用いられる鋳型を加工して形成してもよい。貫通孔６ｃ，６ｄ及び６ｅの内径は例えば１ｍｍである。

ベース部材４とカバー部材６は予め貼り合わせされていてもよい。ベース部材４とカバー部材６が予め貼り合わせされていれば、ベース部材４の位置決めが容易であり、この細胞培養デバイスの組立てが容易になる。ベース部材４とカバー部材６は、例えばプラズマ処理などによって表面を活性化することにより貼り合わせることができる。ベース部材４とカバー部材６を貼り合わせる際は、ベース部材４の表面に設けられた流路１４及び１６をなす溝の端部の位置に貫通孔６ｄと６ｅがくるようにカバー部材６の位置を合わせる。

容器２の開口の内面には、ベース部材４及びカバー部材６と一体化される前の段階において、疎水性処理など細胞を接着させるための細胞接着処理のほか、例えばマトリゲルの塗布などの細胞培養に必要な処理を予め施しておくことが好ましい。そうすれば、容器２にベース部材４とカバー部材６を一体化させたときに形成される細胞培養室８の底面８ａが細胞接着処理などの細胞培養に必要な処理が施された状態となり、細胞培養室８に細胞を導入する際の細胞の通り道となる流路１２，１４や貫通孔６ｃ，６ｄ，６ｅの内面にはそのような処理が施されていない状態となる。

さらに、ベース部材４及びカバー部材６には、容器２に一体化される前の段階において、例えばＰＥＧを用いた親水性処理など細胞の接着を抑制する細胞非接着処理を施しておくことが好ましい。そうすれば、容器２にベース部材４とカバー部材６を一体化させて細胞培養デバイスを構成したときに、細胞培養デバイスの内部のうち細胞培養室８の底面には細胞接着処理など細胞培養に必要な処理が施され、それ以外の部分には細胞非接着処理が施された状態となる。これにより、細胞培養デバイス内に細胞を流し込んだときに、細胞培養室８に導入すべき細胞がその道中の流路１２，１４や貫通孔６ｃ，６ｄ，６ｅの内面に接着することなく確実に細胞培養室８の底面８ａに確実に到達し、適切な場所において細胞培養を実施することができる。

図３は細胞培養デバイスの他の実施例を示している。この実施例では、容器２の開口へのカバー部材６の挿入及び開口からのカバー部材６の取出しを容易に行なうことができるように、ピンセットなどによってカバー部材６を挟んで保持するための切欠き１６をカバー部材６の周縁部に設けている。

図４は、カバー部材６の周縁部を開口内底面２ａ側へ押し込むことによって、カバー部材６の弾性力を利用して容器２の開口内底面２ａとベース部材４との間及びベース部材４とカバー部材６との間のシール性をさらに高めた実施例を示している。カバー部材６の周縁部を開口内底面２ａ側へ押し込むと、カバー部材６の外周面が開口の内側壁面を保持することによってその状態が維持され、カバー部材６の弾性力（復元力）によって凸平面部６ａを開口内底面２ａ側へ押し出そうとする力が作用し、開口内底面２ａとベース部材４との間及びベース部材４とカバー部材６との間のシール性が向上する。

図４の実施例では、カバー部材６の開口内底面２ａ側の面の周縁部にリング状に突起した突起部６ｆが設けられている。突起部６ｆが均一に開口内底面２ａに接するようにカバー部材６の周縁部を開口内底面２ａ側へ押し込むことで、カバー部材６の周縁部の押し込み量が均一になり、凸平面部６ａがベース部材４に対して均一に押し付けられる。

なお、必ずしもカバー部材６の全体がＰＤＭＳのような弾性力を有する材料で構成されている必要はない。要はカバー部材６の外周面の少なくとも一部が容器２の開口の内側壁面を保持するようになっていればよい。

図５はカバー部材６をＰＤＭＳなどの弾性力を有する材料ではなくＰＰ（ポリプロピレン）やＰＣ（ポリカーボネート）などで構成し、その外周にＯリング１８（保持部材）を設けた例を示している。Ｏリング１８はカバー部材６の外周面の一部を構成する。

図５の実施例では、カバー部材６自体（Ｏリング１８を除く）の外径は容器２の開口の内径よりも小さく、Ｏリング１８の外径が容器２の開口の内径よりも僅かに大きくなっている。カバー部材６が容器２の開口に嵌め込まれたときにＯリング１８が開口の内側壁面を保持し、開口内におけるカバー部材６の位置を固定する。これにより、凸平面部６ａがベース部材４に密着した状態で維持される。また、Ｏリング１８によってＯリング１８の内側の空間（図においてＯリング１８よりも下側にある区間）の気密性が保たれるので、それによっても開口内底面２ａとベース部材４との間及びベース部材４とカバー部材６との間のシール性が確保される。

２ 容器
２ａ 開口内底面
４ ベース部材
４ａ ベース部材の貫通孔
６ カバー部材
６ａ 凸平面部
６ｂ 凹部
６ｃ，６ｄ，６ｅ カバー部材の貫通孔
６ｆ 突起部
８ 細胞培養室
８ｂ 細胞培養室の底面（細胞培養面）
１２，１４ 流路
１６ 切欠き
１８ Ｏリング

Claims (11)

1. 底をもつ開口を一方側の面に有し、その開口内底面の中央部が平坦な容器と、
   耐薬品性を有する弾性材料からなり、前記開口内底面よりも小さい主平面及びその主平面に設けられた貫通孔を有し、前記主平面のうち一方の面を前記開口内底面側にして前記開口内底面の中央部に配置されて前記開口内底面に密着するベース部材と、
   前記開口内底面に前記ベース部材が配置された状態の前記開口に嵌め込んで前記ベース部材に密着する耐薬品性を有するカバー部材であって、前記開口に嵌合する平面形状をもち、前記開口に嵌め込まれたときに外周面で前記開口の内側壁面を保持するとともに、前記開口内底面側の平面が前記ベース部材に密着するように構成されたカバー部材と、を備え、
   前記ベース部材の前記貫通孔の内側側面と前記開口内底面の一部によって画された空間により細胞培養室が構成され、
   前記カバー部材に、前記細胞培養室に液を供給するための流路をなす貫通孔が設けられている細胞培養デバイス。
2. 前記開口の平面形状は円形である請求項１に記載の細胞培養デバイス。
3. 前記カバー部材は少なくとも周縁部が弾性材料により構成されており、その外径が前記開口の内径よりも大きい請求項２に記載の細胞培養デバイス。
4. 前記カバー部材の外周面に、弾力性をもって前記外周面と前記開口の内側壁面との間に介在して前記開口の内側壁面を保持する保持部材が設けられている請求項３に記載の細胞培養デバイス。
5. 前記カバー部材の中心を対象とした前記カバー部材の周縁部の２ヶ所の位置に、それらの位置で前記カバー部材を挟むようにして前記カバー部材を保持し、前記開口への嵌め込み又は前記開口からの取出しを可能とする切欠き部が設けられている請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
6. 前記カバー部材の前記開口内底面側の面のうち前記ベース部材と接する部分はその周囲よりも前記開口内底面側へ突出した凸平面である請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
7. 前記カバー部材全体が弾性材料によって構成されており、
   該細胞培養デバイスは、前記開口に嵌め込まれた前記カバー部材の周縁部を弾性変形させることによって前記開口内底面側へ均等に押し込んだ状態にし、その弾性力によって前記凸平面を前記開口内底面側へ押し付け、前記開口内底面と前記ベース部材との間及び前記ベース部材と前記カバー部材との間の気密及び液密を保持するものである請求項６に記載の細胞培養デバイス。
8. 前記カバー部材全体が弾性材料によって構成されており、該カバー部材の前記開口内底面側とは反対側の面の中央部に凹部が設けられている請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
9. 前記開口内底面に細胞接着処理が施されている請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
10. 前記ベース部材及び前記カバー部材には細胞非接着処理が施されている請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
11. 前記ベース部材の前記貫通孔の内側側面は該ベース部材の一方の面側へいくにしたがって内径が小さくなる方向に傾斜している請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。

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