JPH11510681A - 核酸アレイへの比較蛍光ハイブリダイゼーション - Google Patents

核酸アレイへの比較蛍光ハイブリダイゼーション

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JPH11510681A JP8517815A JP51781596A JPH11510681A JP H11510681 A JPH11510681 A JP H11510681A JP 8517815 A JP8517815 A JP 8517815A JP 51781596 A JP51781596 A JP 51781596A JP H11510681 A JPH11510681 A JP H11510681A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は標的核酸の相対コピー数の測定方法及び疾患と関連する染色体異常の正確なマッピング方法を提供する。本発明の方法は固体表面に固定された標的核酸を使用し、それらに差別的に標識された核酸の二つの組を含むサンプルがハイブリッド形成される。次いで固体表面への標識核酸のハイブリダイゼーションが通常の技術を使用して検出される。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸アレイへの比較蛍光ハイブリダイゼーション 発明の背景 本発明は種々の疾患と関連する遺伝子異常の検出方法及びマッピング方法に関 する。特に、本発明は配列のその他のコレクション中のこれらの配列のコピー数 に対し配列のコレクション中の特別な核酸配列のコピー数を比較するための核酸 ハイブリダイゼーション方法の使用に関する。 多くのゲノム研究及び遺伝子研究は疾患の研究及び検出のための細胞集団間の 遺伝子量または発現の相違の同定に関する。例えば、多くの悪性度は癌遺伝子の 活性化または腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化をもたらすＤＮＡ配列の獲得また は損失を伴う。腫瘍性形質転換及びその後の進行をもたらす遺伝的イベントの同 定は、疾患に関する生物学的基礎を形成し、治療応答の予知を改善し、かつ早期 の腫瘍検出を可能にしようとする努力を促し得る。 加えて、周産期の遺伝的問題は染色体セグメントの損失または獲得、例えば、 トリミソー21症候群またはミクロ欠失症候群から頻繁に生じる。こうして、この ような異常の周産期の検出方法は疾患の早期診断に有益であり得る。 細胞遺伝学は、増幅または欠失された染色体領域を検出するための従来の方法 である。しかしながら、細胞遺伝学技術の分解能は約10Mb（ギムザ染色された染 色体中のバンドのおそよの幅）よりも大きい領域に制限される。多数のトランス ロケーション及びその他の遺伝子変化を有する複雑な核型において、従来の細胞 遺伝学的分析は殆ど実用性がない。何となれば、核型情報が充分に解読し得ない からである。更に、通常の細胞遺伝学的バンディング分析は時間を浪費し、多大 の労力を要し、しかも頻繁に充分な中期染色体を得ることの困難なことのために 困難であり、または不可能である。加えて、遺伝子増幅、均一な染色領域(HSR) 、またはDM染色体の細胞遺伝学的用法指示は、増幅される配列の同定に寄与する 情報を与えない。 更に最近の方法は分子技術を使用してサンプル中の所定の核酸配列の量を評価 することを可能にする。これらの方法（例えば、サザンブロッティング）は単離 されたＤＮＡにハイブリッド形成されるクローン化ＤＮＡプローブまたはＲＮＡ プローブを使用する。サザンブロッティング及び関連技術は、たとえゲノムが有 益な核型情報を排除するように重度に再配列されるとしても有効である。しかし ながら、これらの方法は分析すべき配列に特異性のプローブの使用を必要とする 。こうして、ゲノムの特別な推測領域に関する先の情報が利用できない場合、一 度に非常に多くの個々のプローブを使用して夫々の標本の完全ゲノムを調査する ことが必要である。 比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)は増幅または欠失された配列の存在 を検出し、その位置を同定する更に最近のアプローチである。Kallioniemi ら， Science 258: 818-821（1992）及びWO 93/18186 を参照のこと。CGH はゲノム再 配列にもかかわらず増加及び減少を明らかにする。CGH の一つの実施において、 ゲノムＤＮＡが正常な基準細胞からだけでなく、試験細胞（例えば、腫瘍細胞） から単離される。２種の核酸が差別的に標識され、次いで基準細胞の中期染色体 にin situ でハイブリッドを形成される。基準ＤＮＡ及び試験ＤＮＡの両方中の 反復配列が除去され、またはそれらのハイブリダイゼーション能力が或る手段に より低下される。増加または減少されたコピー数である試験細胞中の染色体領域 が、２種のＤＮＡからのシグナルの比が変化されている領域を検出することによ り迅速に同定し得る。例えば、試験細胞中のコピー数の減少された領域は、ゲノ ムのその他の領域と比較して基準よりも試験ＤＮＡから比較的低いシグナルを示 すであろう。試験細胞中のコピー数の増加された領域は試験ＤＮＡから比較的高 いシグナルを示すであろう。 こうして、CGH は配列の先の知識がなくても変異体コピー数を有する配列の位 置を発見し、マッピングする。特定配列のプローブが必要とされず、単一ハイブ リダイゼーションのみが必要とされる。コピー数の減少または増加が配列の一つ のコピーの損失または獲得に制限される場合、CGH 分解能は通常約5-10 Mb であ る。 増大された感度、染色体異常の更に正確な局在化を与え、遺伝子発現のレベル の相違を検出し得る新しい技術が疾患の診断に特に望ましい。本発明はこれらの 利益及びその他の利益を提供する。 発明の要約 本発明は核酸分子の第一コレクション中の少なくとも二つの核酸配列のコピー 数を第二コレクション中の同配列のコピー数に対して定量的に比較する方法を提 供する。その方法は第一コレクション中の核酸分子及び第二コレクション中の核 酸分子を夫々第一標識及び第二標識で標識することを含む。第一標識及び第二標 識は互いに区別できるべきである。こうして生成されたプローブが、標的要素へ の核酸ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で複数の標的要素と接 触される。プローブは同時または連続に標的要素に接触し得る。 夫々の標的要素は固体担体に結合された標的核酸分子を含む。標的要素中の夫 々の配列の一つ以上のコピーが存在し得る。標的要素中の標的核酸の配列複雑度 は標識された核酸の第一コレクション及び第二コレクションの配列複雑度よりも 極めて小さい。 標的要素及びプローブの両方に関する核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、また はｃＤＮＡであってもよい。核酸はあらゆる生物に由来していてもよい。通常、 標的要素及びプローブ中の核酸は同種からのものである。 標的要素は複数のビーズの如き別々の担体にあってもよく、または標的要素の アレイがガラス顕微鏡スライドの如き単一固体表面にあってもよい。標的要素中 の標的核酸の核酸配列は、比較コピー数情報が所望される核酸配列である。例え ば、要素の配列は疾患と関連することが知られている染色体位置に由来していて もよく、疾患との関連が試験される染色体領域の代表であるように選択されても よく、または転写が分析される遺伝子に相当していてもよい。 プローブを標的要素に接触させた後に、夫々の結合の量、及び結合比が夫々の 標的要素について測定される。典型的には、標的要素への結合の比が大きい程、 その要素に結合する２種のプローブ中の配列のコピー数の比が大きい。こうして 、標的要素間の比の比較がプローブ中の異なる配列のコピー数の比の比較を可能 にする。 これらの方法は典型的には蛍光in situ ハイブリダイゼーションに適した技術 を使用して行われる。こうして、第一標識及び第二標識は通常蛍光標識である。 標的核酸へのプローブ中の反復配列のハイブリダイゼーションを抑制するため に、未標識ブロッキング核酸(例えば、Cot-1 DNA)がプローブと混合し得る。こ うして、本発明はゲノム中の非反復配列の分析に集中する。 典型的な実施態様において、プローブ核酸の一つのコレクションが研究中の試 験細胞、細胞集団、または組織から調製され、プローブ核酸の第二コレクション が基準細胞、細胞集団、または組織から調製される。基準細胞は正常な非疾患細 胞であってもよく、またはそれらは疾患のその他の局面に関する標準として利用 できる疾患組織のサンプルからのものであってもよい。例えば、基準プローブが 正常細胞から単離されたゲノムＤＮＡである場合、その他に対するそのプローブ 中の夫々の配列のコピー数が知られている（例えば、夫々の常染色体配列の二つ のコピー、及びジェンダーに依存する夫々の性染色体配列の一つまたは二つのコ ピー）。試験プローブとのこれの比較が正常からの変化の検出を可能にする。ま た、基準プローブは、その異なる配列間のコピー数の実質的な変化を含み得る原 発性腫瘍からのゲノムＤＮＡから調製されてもよく、また試験プローブがその腫 瘍からの転移細胞のゲノムＤＮＡから調製されてもよく、その結果、その比較は 原発性腫瘍とその転移の間の相違を示す。更に、両方のプローブが正常細胞から 調製されてもよい。例えば、異なる組織の正常細胞の間のｍＲＮＡ集団の比較は 組織分化の重要な特徴である分化遺伝子発現の検出を可能にする。こうして、一 般に、試験及び基準という用語は２種のプローブを区別するために便宜上使用さ れるが、それらはそれらが含む核酸のその他の特徴を意味しない。 また、本発明は本発明の方法を実施するのに有益な物質を含むキットを提供す る。本発明のキットは標的核酸のアレイを結合した固体担体及び正常基準ゲノム に相当する核酸、または基準細胞型からのｃＤＮＡ等を含む容器を含む。更に、 キットは２種の異なる蛍光体、試験ゲノム、別の基準ゲノムを標識するための試 薬等を含んでいてもよい。定義 “核酸アレイ”は複数の標的要素であり、夫々がプローブ核酸にハイブリッド を形成させる固体表面に固定された一種以上の標的核酸分子を含む。 標的要素の“標的核酸”は典型的にはゲノムの特定領域中にそれらの起点を有 し（例えば、ゲノムライブラリーからのクローンまたは幾つかの連続クローン） 、または機能性遺伝単位に相当し、これは完全であってもよく、また完全でなく てもよい（例えば、完全ｃＤＮＡまたは部分ｃＤＮＡ）。また、標的核酸はinte r-Alu またはこのようなクローンに由来する縮重オリゴヌクレオチドプライマー PCR 産物を含み得る。遺伝子発現が分析されている場合、標的要素は完全ｃＤＮ Ａまたは部分ｃＤＮＡを含み得る。 標的要素の標的核酸は、例えば、特定遺伝子を含んでいてもよく、または関係 する細胞、例えば、腫瘍細胞中に増加または減少されたコピー数で存在すると推 測される染色体領域であってもよい。また、標的要素は、異常なレベルで転写さ れると推測される、ｍＲＮＡ、またはこのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを 含んでいてもよい。 また、標的要素は未知の重要性または位置の核酸を含んでいてもよい。このよ うな要素のアレイは、サンプルが完全ゲノム、単一染色体、または染色体の一部 を含むが、これらに限定されないゲノムの所望の部分を連続的に、または別の位 置でサンプリングする位置に相当し得る。標的要素の数及び夫々中の核酸の複雑 度はサンプリングの密度を決めるであろう。例えば、夫々の標的が異なるゲノム クローンからのＤＮＡを含む、300 の標的要素のアレイは、10メガベースの間隔 で完全ヒトゲノムをサンプリングし得る。夫々がゲノムＤＮＡの100kb を含む、 30,000の要素のアレイはヒトゲノムの完全な包含を与え得る。 同様に、アノミマスｃＤＮＡクローンからの核酸を含む標的要素のアレイは関 係する幾つかの細胞中で差別的に発現し得るこれらの同定を可能にし、それによ り注意をこれらの遺伝子の研究に集中するであろう。 種々の寸法の標的要素が本発明のアレイに使用し得る。一般に、小さい標的要 素が好ましい。典型的には、標的要素は直径が約1cm 未満であろう。一般に、要 素サイズは１μm から約３mmまで、好ましくは約５μm〜約１mmである。 アレイの標的要素は異なる密度で固体表面に配置し得る。標的要素の密度は幾 つかの因子、例えば、標識の性質、固体担体等に依存するであろう。 当業者は、夫々の標的要素が異なる長さ及び配列の標的核酸の混合物を含み得 ることを認めるであろう。こうして、例えば、標的要素はＤＮＡのクローン化断 片の一つより多いコピーを含んでもよく、また夫々のコピーが異なる長さの断片 に分解されてもよい。本発明の標的配列の長さ及び複雑度は本発明に重要ではな い。当業者はこれらの因子を調節して所定のハイブリダイゼーション操作に最適 のハイブリダイゼーション及びシグナル発生を得、かつ異なる遺伝子またはゲノ ム位置の間の必要とされる分解能を得ることができる。典型的には、標的配列は 約１kb〜約１Mbの複雑度を有するであろう。 好ましい実施態様において、本発明の標的は、それらが由来する縮合中期染色 体と関連する上部構造を実質的に欠いている核酸である。真核染色体へのＤＮＡ の詰め込みの一般的な性質は当業者に公知である。簡単に言えば、真核染色体の 上部構造は多くのオーダーの複雑度を含む。ＤＮＡがヒストンコアー付近で覆わ れて規則的な反復ヌクレオソームを形成し、これらが順に互いに詰め込まれてし っかりと縮合された30nmのクロマチン繊維を生じる。次いでクロマチン繊維が種 々のループ状ドメインで詰め込まれて中期染色体中に高次の折り畳み及び縮合を 生じる。本発明の核酸標的は天然産の縮合中期染色体のこれらの特徴の幾つかま たは全部を欠いている。真核染色体の全般の構造の一般的な説明について、Alb- ertsら，Molecular Biology of the Cell 第二編，496-506 頁，Garland Publi- shing Inc．New York，1989 を参照のこと。 “核酸”または“核酸分子”という用語は一本鎖形態または二本鎖形態のデオ キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを表し、特に限定しない 限り、天然産ヌクレオチドと同様に機能し得る天然ヌクレオチドの既知類縁体を 含むであろう。 本明細書に使用される“プローブ”は一つ以上の型の化学結合、通常水素結合 形成により相補配列の標的核酸に結合することができる核酸分子（ＲＮＡまたは ＤＮＡ）の集合と定義される。プローブは以下に記載されるように直接または間 接に標識されることが好ましい。それらは典型的には高複雑度のものであり、例 えば、細胞または細胞集団から単離された完全ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから 調製される。 “複雑度”という用語は、Britten ら，Methods of Enzymol．29:363（1974） により確立されたようなこの用語の通常の意味に従って本明細書に使用される。 また、核酸複雑度の更なる説明について、Cantor and Schimmel Biophysical C- hemistry: Part III 1228-1230を参照のこと。 “実質的に結合する”はプローブ核酸と標的核酸の間の相補ハイブリダイゼー ションを表し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少して標 的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を得ることにより調節し得るわずかな不適 合を含む。 “特異的ハイブリダイゼーション”または“特異的にハイブリッドを形成する ”という用語は、プローブ核酸が標的核酸に実質的に結合し、かつ特定のストリ ンジェンシー条件下でアレイ中のその他の核酸に実質的に結合しないハイブリダ イゼーションを表す。当業者はハイブリッド形成条件のストリンジェンシーの緩 和が配列不適合を寛容させることを認めるであろう。寛容される不適合の程度は ハイブリダイゼーション条件の適当な調節により調節し得る。 また、当業者は、本明細書に記載された特別な核酸の正確な配列がその他に“ 実質的に同一”であり、かつ相補核酸に実質的に結合する能力を保持するプロー ブまたは標的を生成するように或る程度修飾し得ることを認めるであろう。この ような修飾は本明細書中の個々の配列を参考にすることにより特別に包含される 。ポリヌクレオチド配列の“実質的な同一性”という用語は、通常のパラメータ ーを使用して以下に記載される方法を使用して、ポリヌクレオチドが基準配列と 比較して少なくとも90％、更に好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する 配列を含むことを意味する。 ２種の核酸配列は、２種の配列中のヌクレオチドの配列が以下に記載されるよ うに最大の一致のために配列される時に同じである場合に“同一”であると言わ れる。“相補性”という用語は、相補配列が基準ポリヌクレオチド配列の全部ま たは一部に相補性であることを意味するために本明細書に使用される。 ２種（またはそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は典型的には二つ の配列の配列を“比較ウインドー”にわたって比較して配列類似性の局所領域を 同定し、比較することにより行われる。本明細書に使用される“比較ウインドー ”は少なくとも約20、通常約50〜約200 、更に通常約100 〜約150 の連続位置の セグメントを表し、この場合、二つの配列が最適に整列された後に配列が連続位 置 の同じ数の基準配列と比較し得る。 比較のための配列の最適の整列は、Smith 及びWaterman Adv.Appl.Math.2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman 及びWunsch J.Mol.Biol.48:443(1 970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson 及びLipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S .A.)85: 2444(1988)の類似性方法に関する研究、これらのアルゴリズムの計算機 化された実施により行われてもよい。 “配列同一性の％”は、比較ウインドーにわたって二つの最適に整列された配 列を比較することにより測定され、その比較ウインドー中のポリヌクレオチド配 列の部分は二つの配列の最適の整列のための基準配列（これは付加または欠失を 含まない）と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。％は、同 じ核酸塩基が両方の配列中に生じて適合位置の数を生じる位置の数を測定し、適 合位置の数を比較のウインドー中の位置の合計数で割り、その結果に100 を掛け て配列同一性の％を得ることにより計算される。 ヌクレオチド配列が実質的に同じであるという別の指示は、二つの分子がスト リンジェント条件下で同じ配列にハイブリッドを形成するかどうかである。スト リンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境中で異なるであろう。一般に 、ストリンジェント条件は特定のイオン強度及びpHで特定配列の熱融点(Tm)より も約５℃低いように選ばれる。Tmは、標的配列の50％が完全に適合したプローブ にハイブリッドを形成する温度（特定のイオン強度及びpHにおける）である。 図面の簡単な説明 図１はcMYC癌遺伝子の増幅を検出する本発明の方法の能力を示す実験の顕微鏡 写真を示す。cMYC癌遺伝子の増幅を含む標識Colo-320 DNA、及び標識正常ヒトＤ ＮＡを二つの標的要素からなるアレイにハイブリッドを形成させた。一つの標的 要素はクローン化cMYC癌遺伝子配列を含み、他方はColo-320細胞系中で増幅され ないことが知られているヒトゲノム(21D7)の領域からのクローン化配列を含んで いた。夫々の標的要素はクローンに相当する一本鎖断片を含む。断片をアビジン 被覆ガラス粒子に固定した。 好ましい実施態様の説明 本発明は異常な核酸コピー数の比較方法及び疾患と関連する染色体異常のマッ ピング方法を提供する。本発明の方法は固体担体に固定された標的核酸を使用し 、これに差別標識プローブ核酸がハイブリッドを形成される。次いで標的への標 識核酸のハイブリダイゼーションが通常の技術を使用して検出される。 本発明の方法は標的要素に結合することができる配列のコピー数を比較する。 本発明の方法により検出し得るコピー数の変化は異なる方法で生じ得る。例えば 、コピー数は染色体領域の増幅または欠失の結果として変化し得る。また、コピ ー数は、プローブまたは標的核酸中の配列を変化してそれらの結合を充分に減少 する遺伝的再配列により減少し得る。標的核酸 本発明の標的核酸は実際にはあらゆる起源に由来し得る。典型的には、標的は 関係する染色体、関係する染色体領域、関係する完全ゲノム、ｃＤＮＡライブラ リー等に沿った代表的な位置に由来する核酸分子であろう。これらの標的核酸は 、例えば、ゲノムクローンのinter-Alu PCR 産物、ゲノムクローン、ｃＤＮＡ等 の制限消化産物から得られた核酸の比較的長い（典型的には、数千の塩基）断片 であってもよい。幾つかの実施態様において、標的核酸は関係する特別な領域を スパンするクローンの先にマッピングされたライブラリーである。 使用するための標的核酸の選択は或る種の症状との特別な染色体または染色体 領域の関連の先の知識により影響されるかもしれない。国際出願WO 93/18186 、 上記文献は染色体異常及び関連疾患のリストを提供し、これらが科学文献に記載 されている。また、コピー数中の頻繁な変化を受ける新しい領域を同定する完全 ゲノムスクリーニングが本発明の方法を使用して行い得る。これらの実施態様に おいて、標的要素は通常完全ゲノムにわたって分布された位置の代表的な核酸を 含む。幾つかの実施態様（例えば、高い複雑度の多数の標的要素を使用する）に おいて、ゲノム中の全ての配列がアレイ中に存在し得る。 幾つかの実施態様において、関係する特別な染色体領域からの先にマッピング されたクローンが標的として使用される。このようなクローンが遺伝子学の世界 的なイニシアチブの迅速な発展の結果として利用可能になりつつある。 マッピングされたクローンは単一染色体、多種染色体、または染色体のセグメ ントから構築されたライブラリーから調製し得る。通常の技術がベクター、例え ば、コスミド、酵母人工染色体(YAC)、バクテリア人工染色体(BAC)及びP1ファー ジ中の適当なサイズの断片をクローン化するのに使用される。 上記のようにしてクローンライブラリーを生じることが可能であるが、完全染 色体をスパンするライブラリーがまた市販されている。例えば、ヒトゲノム及び その他のゲノムからの染色体特異性ライブラリーがClonetech(South San Fran-c isco，CA)またはATCCから入手し得る（ATCC/NIH Repository of Catalogue of H uman and Mouse DNA Probes and Libraries，第７編，1993を参照のこと）。 必要により、上記クローンは遺伝的または物理的にマッピングし得る。例えば 、FISH及びデジタル画像分析が所望の染色体に沿ってコスミドを局在化するのに 使用し得る。この方法が、例えば、Lichter ら，Science，247:64-69（1990）に 記載されている。次いで物理的にマッピングされたクローンがCGH またはその他 の方法を使用して同定された関係する領域を最終的にマッピングするのに使用し 得る。固体表面への標的核酸の付着 核酸を種々の固体表面に固定する多くの方法が当業界で知られている。例えば 、固体表面は膜、ガラス、プラスチック、またはビードであってもよい。所望の 成分が非特異的結合により共有結合または非共有結合付着し得る。固体表面にお ける核酸の固定が以下に充分に説明される。 天然及び合成の両方の、多種の有機ポリマー及び無機ポリマー、並びにその他 の物質が固体表面の材料として使用し得る。例示の固体表面として、ニトロセル ロース、ナイロン、ガラス、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポ リホルムアルデヒド、セルロース、及びセルロースアセテートが挙げられる。そ の他に、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン 等が使用し得る。使用し得るその他の材料として、紙、セラミック、金属、メタ ロイド、半導体材料、サーメット等が挙げられる。その他に、ゲルを生成する物 質が使用し得る。このような材料として、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リ ポ多糖、ケイ酸塩、アガロース及びポリアクリルアミドが挙げられる。固体表面 が多孔質である場合、種々の細孔サイズが系の性質に応じて使用し得る。 表面を調製する際に、種々の性質を得るために、多数の異なる材料が特にラミ ネートとして使用し得る。例えば、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン） または巨大分子の混合物（例えば、デンハルト溶液）が非特異的結合を避け、共 有結合接合を簡素化し、シグナル検出等を増進するのに使用し得る。 化合物と表面の間の共有結合が所望される場合、表面は通常多官能であり、ま たは多官能化し得るであろう。表面に存在し、結合に使用し得る官能基として、 カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキシル基 、メルカプト基等が挙げられる。多種の化合物を種々の表面に結合する方法が公 知であり、文献に充分に説明されている。例えば、分子への種々の官能基の導入 による核酸の固定方法が知られている（例えば、Bischoffら，Anal.Biochem．16 4:336-344(1987); Kremsky ら，Nuc.Acids Res．15:2891-2910(1987)を参照のこ と）。修飾ヌクレオチドを含むPCR プライマーを使用して、または修飾ヌクレオ チドによる酵素末端標識により、修飾ヌクレオチドが標的に入れられる。 本発明の核酸アレイ用の膜担体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリ プロピレン）の使用が、標的を比較的高い要素密度（例えば、30-40/cm2まで） で配置する手動方法及びロボット方法を使用する良く開発された技術のために有 利である。加えて、このような膜が一般に入手でき、膜へのハイブリダイゼーシ ョンに関するプロトコル及び装置が公知である。しかしながら、多くの膜材料は かなりの蛍光放出を有し、この場合、蛍光標識がハイブリダイゼーションを検出 するのに使用される。 所定のアッセイフォーマットを最適化するために、当業者は膜型、蛍光体、励 起バンド及び放出バンド、スポットサイズ等の異なる組み合わせについて蛍光検 出の感度を測定し得る。加えて、低い蛍光バックグラウンド膜が記載されている （例えば、Chu ら，Electrophoresis 13:105-114（1992）を参照のこと）。 候補膜に関する種々の直径のスポットの検出の感度は、例えば、蛍光末端標識 ＤＮＡ断片の一連の希釈液をスポットすることにより容易に測定し得る。次いで これらのスポットが通常の蛍光顕微鏡を使用して画像形成される。こうして、蛍 光体及び膜の種々の組み合わせから得られる感度、直線性、及びダイナミックレ ンジが測定し得る。既知の相対比率の蛍光体の対の連続希釈液がまた分析されて 精度を測定することができ、その蛍光比測定は検出器及び膜蛍光により許される ダイナミックレンジにわたって実際の蛍光体比を反映する。 膜よりも極めて低い蛍光を有する基材、例えば、ガラス、石英、または小さい ビーズ上の配置が極めて良好な感度を達成し得る。例えば、直径約１mmから約１ μm までの範囲の種々のサイズの要素がこれらの材料とともに使用し得る。少量 の濃縮された標的ＤＮＡを含む小さいアレイ膜が高い複雑度の比較ハイブリダイ ゼーションに都合良く使用される。何となれば、夫々の要素への結合に利用でき るプローブの合計量が制限されるからである。こうして、得られるシグナルが高 度に局在化され、かつ鮮明であるように、少量の濃縮された標的ＤＮＡを含む小 さいアレイ膜を有することが有利である。このような小さいアレイ膜は典型的に は104/cm2より大きい密度を有する配置で使用される。面積１cm2の定量的蛍光画 像を形成することができる比較的簡単なアプローチが記載されており、単一画像 中の多数の員からのデータの獲得を可能にする（例えば、Wittrup ら，Cytometr y 16:206-213（1994）を参照のこと）。 ガラスまたは合成石英ガラスへの標的核酸の共有結合付着が幾つかの既知技術 に従って達成し得る。このような基材は非常に低い蛍光基材、及び高度に有効な ハイブリダイゼーション環境を与える。 市販の試薬を使用する、核酸をガラスにカップリングするための多くの可能な アプローチがある。例えば、幾つかの官能基を有するシラン処理された(silani- zed)ガラスの調製用の材料が市販されており、または通常の技術を使用して調製 し得る。また、ガラスよりも少なくとも10倍低い自己蛍光を有する、石英カバー スリップがシラン処理し得る。 標的はまた市販の被覆ビーズまたはその他の表面に固定し得る。例えば、ビオ チン末端標識核酸が市販のアビジン被覆ビーズに結合し得る。また、ストレプト アビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体が、例えば、通常のプロトコル（例えば、 Smith ら，Science，258:1122-1126（1992）を参照のこと）に従ってプロテイン Ａを使用するタンパク質媒介カップリングによりシラン処理されたガラススライ ドに付着し得る。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識核酸が通常の技術に従 って調製し得る。 ビーズに付着された核酸へのハイブリダイゼーションは、それらをハイブリダ イゼーション混合物中で懸濁させ、次いでそれらを洗浄後に分析用のガラス基材 に付着することにより行われる。また、アビジン被覆を有し、またはそれを有し ない、常磁性粒子、例えば、酸化鉄(III)粒子が使用し得る。 従来技術はまたハイブリダイゼーションによる配列決定及び特別な配列の検出 を含む種々の用途のための高密度アレイを生じることができる技術を記載してい る（例えば、Fodor ら，Science 767-773(1991)及び米国特許第5,143,854 号明 細書を参照のこと）。プローブ核酸の調製 標的核酸について、多種の核酸が本発明の方法においてプローブ核酸として使 用し得る。プローブは、例えば、特別な生物、組織または細胞型からの完全ゲノ ムに相当するゲノムＤＮＡを含んでいてもよく、または単一染色体の如きゲノム の一部を含んでいてもよい。 一種以上の特別な遺伝子の発現レベルを比較するために、プローブ核酸は関係 する生物、組織または細胞から調製されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに由来し得る 。例えば、試験ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡは、正常な基準細胞からのｍＲＮＡまた はｃＤＮＡとともに、標準化ｃＤＮＡライブラリーからのクローンのアレイにハ イブリッド形成し得る。加えて、２種の細胞集団からのゲノムＤＮＡからつくら れたプローブがｃＤＮＡアレイにハイブリッド形成されて、ゲノム中の変異体Ｄ ＮＡコピー数の領域から得られるｃＤＮＡを検出し得る。 本発明の方法は核酸の二つ以上の集団のあらゆる組み合わせ中の特別な配列の コピー数を比較するのに適している。当業者は、比較されるサンプル核酸の特別 な集団が本発明に重要ではないことを認めるであろう。例えば、ゲノムまたはｃ ＤＮＡが２種の関連種から比較し得る。また、２種以上の組織または細胞型中の 特別な遺伝子の発現のレベルが比較し得る。上記のように、これらの方法は疾 患の診断に特に有益である。 通常の操作が適当な組織から核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を単離するのに使 用し得る（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning - A Laboratory Manual，C old Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y．(1985)を参照のこ と）。また、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの通常の調製方法が使用し得る。 核酸が単離される特別な細胞または組織は特別な用途に依存するであろう。典 型的には、癌と関連する異常の検出のために、ゲノムＤＮＡが腫瘍細胞から単離 される。疾患の出生前の検出のために、胎児組織が使用されるであろう。 組織サンプルが小さく、その結果、少量の核酸が入手できる場合、縮重プライ マーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の如き増幅技術が使用し得る。PCR の一般的な説明について、PCR Protocols，Innisら編集，Academic Press，1990 を参照のこと。加えて、PCR は高コピー数の反復配列の間で配列を選択的に増幅 するのに使用し得る。これらの方法は高度に反復散在された配列（例えば、Alu ）に相補性のプライマーを使用して、Alu ファミリーの二つの員の間にある配列 を選択的に増幅する（Nelsonら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 86:6686(1989)を参 照のこと）。 上記のように、細胞遺伝レベルのCGH は、例えば、正常ゲノムと腫瘍ゲノムの 間のコピー数の相違の領域を同定することにより疾患遺伝子に関する研究を促進 している。例えば、CGH 研究は乳癌におけるコピー数変化の分析に適用されてい た（例えば、Kallioniemi ら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91:2156-2160（1994） を参照のこと）。 CGH において、コピー数変化がマッピングし得る分解能は数メガベースのオー ダーである。本発明では、分解能は標的要素中のゲノムＤＮＡセグメントの長さ 及び隣接クローン間の地図位置の相違の関数である。通常のCGH によるよりも10 倍より良好な分解能が本発明により得られる。この改良された局在化は疾患に関 与する重要な遺伝子を同定し、微小欠失症候群におけるようなゲノムの小さい領 域を伴う異常の更に感度の良い検出を可能にしようとする努力を促すであろう。核酸プローブの標識 上記のように、標的核酸にハイブリッドを形成される核酸は標識されてハイブ リダイゼーション複合体の検出を可能にすることが好ましい。下記のハイブリダ イゼーションに使用された核酸プローブはハイブリダイゼーション反応の前に検 出可能に標識し得る。また、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な 標識が選択し得る。上記のように、標的核酸アレイは同時または連続に２種以上 のプローブ核酸にハイブリッドを形成される。こうして、プローブは別々かつ区 別できる標識で夫々標識される。 プローブ核酸に付着された特別な標識または検出可能な基は、それが標的配列 へのプローブのハイブリダイゼーションに有意に干渉しない限り、本発明の重要 な局面ではない。検出可能な基は検出可能な物理的性質または化学的性質を有す るあらゆる物質であり得る。このような検出可能な標識が核酸ハイブリダイゼー ションの分野で良く開発されており、一般にこのような方法に有益な殆どの標識 が本発明に適用し得る。こうして、標識は分光学的手段、光化学的手段、生化学 的手段、免疫化学的手段、電気学的手段、光学的手段または化学的手段により検 出可能なあらゆる組成物である。本発明に有益な標識として、蛍光色素（例えば 、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射 能標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素（例えば、ホースラデ ィッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びELISA に普通使用さ れるその他の酵素）が挙げられる。 核酸は、検出可能な抗リガンドが利用できるリガンドを使用して間接的に標識 し得る。例えば、ビオチニル化核酸が当業界で公知の技術に従って標識されたア ビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出し得る。その他に、抗原分子ま たはハプテン分子が標識された抗血清またはモノクローナル抗体を使用して検出 し得る。例えば、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン標識プロ ーブまたはジゴキシゲニン標識プローブがこれらの化合物と特異的に免疫反応性 の抗体（例えば、FITC標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー・マンハ イム））を使用して検出し得る。その他に、チミジン−チミジン二量体の標識抗 体が使用し得る(Nakane ら，ACTA Histochem.Cytochem．20:229(1987))。 一般に、できるだけ少ないコピー数で検出可能であり、それによりアッセイの 感度を最大にし、しかもバックグラウンドシグナルより上で検出可能である標識 が好ましい。局在化シグナルを与え、それにより夫々の標的要素からのシグナル の空間的分解能を与える標識が選択されることが好ましい。 標識は当業者に知られている種々の手段でＤＮＡにカップリングし得る。好ま しい実施態様において、プローブはnick翻訳またはランダムプライマー伸長を使 用して標識されるであろう(Rigbyら，J.Mol.Biol.，113: 237(1977)またはSam-b rook ら，Molecular Cloning - A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L-a boratory，Cold Spring Harbor，N.Y．(1985))。標的への標識核酸のハイブリダイゼーション ２種のプローブ中の特別な核酸配列のコピー数は、プローブを一つ以上の標的 核酸アレイにハイブリッドを形成することにより比較される。標的要素の夫々に 関してプローブにより生じた、ハイブリダイゼーションシグナル強さ、及び強さ の比が測定される。典型的には、標的要素に関するシグナル強さの比が大きい程 、その要素に結合する２種のプローブ中の配列のコピー数の比が大きい。こうし て、標的要素間のシグナル強さの比の比較が、プローブ中の異なる配列のコピー 数の比の比較を可能にする。 通常のハイブリダイゼーション技術が標的核酸アレイを探査するのに使用され る。好適な方法がCGH 技術を記載する文献(Kallioniemiら，Science 258: 818-8 21(1992)及びWO 93/18186)に記載されている。一般的な技術に関する幾つかのガ イド、例えば、Tijssen，Hybridization with Nucleic Acid Probes, パートＩ 及びII（Elsevier，アムステルダム1993）が利用できる。in situ ハイブリダイ ゼーションに適した技術の説明について、Gallら，Meth.Enzymol.，21:470-480( 1981)及びAngerer ら，Genetic Engineering: Principles and Methods Setlow 及びHollaender編集，７巻，43-65 頁(plenum Press,ニューヨーク1985)を参照 のこと。 一般に、核酸ハイブリダイゼーションは下記の主要工程を含む。(1)標的核酸 の固定; (2)標的ＤＮＡの接近可能性を増大し、かつ非特異的結合を減少するた めのプレハイブリダイゼーション処理; (3)固体表面上の核酸への核酸の混合物 のハイブリダイゼーション; (4)ハイブリダイゼーション中に結合されなかった 核酸断片を除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄及び(5)ハイブリ ッドを形成した核酸断片の検出。これらの工程の夫々中に使用される試薬及び使 用に関するそれらの条件は特別な適用に応じて変化する。 幾つかの適用において、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックす ることが必要である。反復配列のハイブリダイゼーション能力を除去し、かつ／ または損なうための幾つかの方法が知られている（例えば、WO 93/18186 を参照 のこと）。 例えば、バルク操作が使用し得る。ヒトゲノムを含む多くのゲノム中で、共有 された反復ＤＮＡの主要部分がAlu の如き高度に反復された配列の二三のファミ リー中に含まれる。これらの方法は、相補配列のハイブリダイゼーション比がそ れらの濃度の増加につれて増大するという事実を利用する。こうして、一般に高 濃度で存在する反復配列が変性及びハイブリダイゼーション条件下のインキュベ ーション後にその他の配列よりも迅速に二本鎖になるであろう。次いで二本鎖核 酸が除去され、残りがハイブリダイゼーションに使用される。二本鎖配列からの 一本鎖配列の分離方法は、ヒドロキシアパタイトまたは固体担体に付着された固 定された相補核酸を使用することを含む。また、部分的にハイブリッドを形成さ れた混合物が使用でき、二本鎖配列は標的にハイブリッドを形成するのに使用で きないであろう。 また、ハイブリダイゼーション能が抑制されるべきである配列に相補性である 未標識配列がハイブリダイゼーション混合物に添加し得る。この方法は反復配列 だけでなく、その他の配列のハイブリダイゼーションを抑制するのに使用し得る 。例えば、“Cot-1”DNAがサンプル中の反復配列のハイブリダイゼーションを選 択的に抑制するのに使用し得る。Cot-1 DNA を調製するために、ＤＮＡが抽出さ れ、剪断され、変性され、COt-1 に再生される（再会合速度論及びCOt 値の説明 について、Tijssen,上記文献48-54 頁を参照のこと）。高度の反復配列は更に迅 速に再アニールするので、得られるハイブリッドはこれらの配列について高度に 濃縮されている。残りの一本鎖配列（即ち、単一コピー配列）がS1ヌクレアーゼ で消 化され、二本鎖Cot-1 DNA が精製され、サンプル中の反復配列のハイブリダイゼ ーションをブロックするのに使用される。Cot-1 DNA は上記のように調製し得る が、それはまた市販されている(BRL)。ハイブリダイゼーションからの検出可能なシグナルの分析 標識プローブにより生じたシグナルの検出及び分析のための通常の方法が使用 し得る。特別な方法はプローブに使用した標識に依存するであろう。一般に、蛍 光標識が好ましい。こうして、蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH)に好 適な方法が本発明に好適である。核酸アレイは蛍光顕微鏡中で多色ビーム−スプ リッターで画像形成されて着色依存性画像シフトを避ける。異なる着色画像がCC D カメラで得られ、デジタル化画像がコンピューター中に貯蔵される。次いでコ ンピュータープログラムがアレイにより生じたシグナルを分析するのに使用され る。 シグナルを視覚化するのに好ましい方法がKallioniemi ら，上記文献及びWO/1 8186 に記載されている。結果のディスプレイを促進し、蛍光強さの小さい相違 を検出する感度を改良するために、デジタル画像分析系が使用されることが好ま しい。好ましい系はQUIPS(定量的画像処理系に関する頭辞語)であり、これは自 動化ステージ、焦点調節及びフィルターホイールを備えた通常の蛍光顕微鏡をベ ースとする自動化画像分析系(Ludl Electronic Products，Ltd.，Hawthorne，NY )である。フィルターホイールが励起波長の選択のために顕微鏡の蛍光励起通路 に取り付けられている。ダイクロイックブロック中の特別なフィルター(Chroma T-echnology，Brattleboro，VT)が画像レジストレーションシフトを生じないで 多種色素の励起を可能にする。顕微鏡は二つのカメラポートを有し、その一つが スライド上の関心のある領域を見つけるのに使用されるだけでなく、焦点調整に 使用される感度の良い高速ビデオ画像ディスプレイ用のインテンシファイド(int e-nsified)CCD カメラ(Quantex Corp.，Sunnyvale，CA)を有する。その他のカメ ラポートは高分解能及び高感度で実際の画像獲得に使用される冷却CCD カメラ(P h-otometrics Ltd.，Tucson，AZ 製のモデル200)を有する。 冷却CCD カメラはVME バスによりSUN 4/330 ワークステーション(SUN Micros- ystems，Inc.，Mountain View，CA)にインターフェースされる。多色画像の完全 な獲得が、画像処理ソフトウェアパッケージSCIL-Image（Delft Centre fpr Im- age Processing，Delft,オランダ）を使用して調節される。 実施例１ この実施例は、cMYC癌遺伝子の増幅を含む、腫瘍細胞系、Colo-320中の特定の 配列の増幅の検出を実証する。 Colo-320 DNAの一つのアリコートをnick翻訳によりFITC-dUTP で標識し、第二 アリコートをテキサスレッド-dUTP ヌクレオチドで標識した。正常なヒトＤＮＡ を基準ゲノムとして使用した。二つのアリコートを試験ゲノムと同様に標識した 。 ハイブリダイゼーションアレイは二つの標的要素からなった。一方はcMYC癌遺 伝子配列を含み、他方はColo-320細胞系中で増幅されないことが知られているヒ トゲノム(21D7)の領域からの配列を含んでいた。これらの二つの遺伝子座に関す るP1クローン(インサート長さ約80kb)(LBL/UCSF Resource for Molecular Cyt-o genics から得られる)からのＤＮＡを単離し、制限酵素HindIII で完全に切断し 、数百bpから10kb以上までの長さの範囲の断片を生じた。得られるオーバーハン グの一つの塩基を、ビオチン-dATP を使用して詰め込み、そのＤＮＡを変性した 。こうして、夫々の一本鎖断片を単一ビオチンで末端標識した。夫々のクローン に相当する一本鎖断片をアビジン被覆した調節された多孔質ガラス(CPG Inc.)“ ５μm 粒子”(サイズ及び形状が非常に不均一である)の異なるアリコートと反応 させた。こうして、粒子の一つの集団はcMYC標的配列を含み、他方は21D7配列を 含んでいた。FITC-dUTP を使用する粒子に関する一本鎖ＤＮＡのランダムプライ ミング標識は、それがその表面に制限されることを示した。これらの大きい断片 は明らかに粒子中の細孔に実質的に侵入しなかった。 二つの比較ハイブリダイゼーションを行って標識プローブの異なる挙動等のた めの潜在的な人為現象について調節した。 1)FITC標識Colo-320ゲノムＤＮＡ300ng 及びテキサスレッド標識正常ゲノムＤ ＮＡ300ng 、並びに未標識COt-1 DNA10 μg をハイブリダイゼーション混合物20 μl に溶解して50％のホルムアルデヒド、2xSSC 、及び10％のデキストランスル フェートの最終濃度を得た。これを70℃に加熱してＤＮＡを変性し、10μl を cMYC配列を含む少数の粒子に添加した。残りの10μl を同様に21D7を含む少数の 粒子に添加した。 2)このハイブリダイゼーションは、蛍光体標識を逆にした以外は最初のものと 同様であった。こうして、Colo-320をテキサスレッドで標識し、正常ゲノムＤＮ ＡをFITCで標識した。ハイブリダイゼーションは37℃で36〜48時間進行し、粒子 を洗浄し、蛍光アンチ−フェード(anti-fade)中で懸濁させ、顕微鏡スライドに 取り付けた。 粒子を通常の蛍光顕微鏡で観察した。ハイブリダイゼーションシグナルは粒子 の表面で顕著であった（不連続の蛍光グラニュールとして現れる）。代表的な粒 子中の個々の蛍光体の定量的CCD カメラ画像を粒子の赤道面付近に焦点を合わせ た顕微鏡を伴うデジタル顕微鏡系で獲得した。“直径”10〜15μm であるように 選択された粒子に関する画像を図１に示す。それらのサイズのために、夫々の粒 子の殆どが焦点からはずれていた。上部パネルは、Colo-320 DNAをFITCで標識し 、正常ＤＮＡをテキサスレッドで標識した時の結果を示し、一方、下部パネルは 標識を逆にした場合の結果を示す。夫々のパネル中で、上部の列はテキサスレッ ドを示し、下部の列はFITC画像を示す。左の二つの欄は21D7標的配列を含む粒子 を示し、一方、右の二つの欄はcMYC配列を含む粒子である。画像の全てに関する 露出は１秒であり、それらはコントラストを増強しないで、またバックグラウン ドを引かないで示される。 上部パネルは、テキサスレッド標識された正常なゲノムＤＮＡが２種の異なる 21D7粒子及び２種のcMYC粒子に関してほぼ等しい強さを生じたことを示す。しか しながら、cMYC粒子へのFITC標識Colo-320 DNAのハイブリダイゼーションの強さ が21D7粒子へのハイブリダイゼーションの強さよりも実質的に高かった。これは 細胞系中の21D7配列よりも多いcMYCのコピーの存在を示す。何となれば、cMYC粒 子に関するColoシグナル対正常シグナルの比が21D7粒子に関する比よりも実質的 に高いからである。cMYC粒子に関するFITCシグナルは粒子の端部で環を形成し、 優勢な表面染色を示す。 逆標識による下部パネルは、FITC標識正常ゲノムＤＮＡによるシグナルが粒子 の全てに関してほぼ等しかったが、一方、テキサスレッド標識Colo-320 DNAが cMYC粒子に関して鮮明なシグナルを生じたことを示す。こうして、検出された増 幅は使用した標識スキームとは独立であった。 蛍光比の定量的測定は、粒子の厚さ及び自己蛍光のためにこれらの粒子につい て困難であった。しかしながら、およその推定は、cMYC粒子に関するColo対基準 シグナルの比が21D7粒子に関する比よりも３倍（そしておそらく20倍）よりも大 きいことを示した。 以上の実施例は本発明を説明するために提示されるものであり、その範囲を限 定するために提示されるものではない。本発明のその他の変化が当業者に容易に 明らかであり、請求の範囲により包含される。本明細書で引用された全ての刊行 物、特許、及び特許出願は参考として本明細書に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピンケル ダニエル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94595 ウォルナットクリーク マンザニ ータ コート 31 (72)発明者 グレイ ジョー ダブリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94127 サンフランシスコ サンタ ポー ラ アベニュー 50 (72)発明者 アルバートソン ドナ イギリス ケンブリッジ シービー１ ２ エイチエフ グリソン ロード 42

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸分子の二つ以上のコレクション中の核酸配列のコピー数を比較する方法 であって、 その方法が (a) 固体表面に結合された複数の標的要素を用意し（夫々の標的要素は標的 核酸を含む）、 (b) 標的要素を (i) 標的ヌクレオチド配列に実質的に相補性の配列を含む標識核酸の第 一コレクション、及び (ii)標的ヌクレオチド配列に相補性の配列を含む少なくとも第二の標的 核酸 と接触させ（第一標識及び第二標識は互いに区別できる）、そして (c) 標的核酸への第一及び第二の標識相補性核酸の結合の量を検出すること を特徴とする核酸配列のコピー数を比較する方法。 ２．標的核酸がＤＮＡである請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．標的核酸がｃＤＮＡである請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．第一及び第二の標識核酸がヒトＤＮＡを含む請求の範囲第１項に記載の方法 。 ５．標的核酸が約1000〜約1,000,000 ヌクレオチドの複雑度である請求の範囲第 １項に記載の方法。 ６．標的核酸配列に相補性の配列の複雑度がコレクションの全複雑度の１％未満 である請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．固体担体が複数のビーズである請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．固体担体がガラスである請求の範囲第１項に記載の方法。 ９．第一標識及び第二標識が蛍光標識である請求の範囲第１項に記載の方法。 10．核酸の第一コレクション及び第二コレクションを処理して反復配列の結合を 抑制する請求の範囲第１項に記載の方法。 11．核酸の第一コレクション及び第二コレクションを反復配列を含む未標識ブロ ッキング核酸と混合する請求の範囲第10項に記載の方法。 12．未標識ブロッキング核酸がCot-1 DNA である請求の範囲第11項に記載の方法 。 13．第一標識核酸が試験細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含み、かつ第二標 識核酸が基準細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む請求の範囲第１項に記載 の方法。 14．第一標識核酸が試験ゲノムからのものであり、かつ第二標識核酸が正常基準 ゲノムからのものである請求の範囲第１項に記載の方法。 15．試験ゲノムが胎児組織からの核酸を含む請求の範囲第14項に記載の方法。 16．試験ゲノムが腫瘍からの核酸を含む請求の範囲第14項に記載の方法。 17．核酸サンプル中の核酸配列の定量用キットであって、 キットが (a) 前もって選択された標的核酸のアレイを結合させた固体担体（この場合 、アレイは少なくとも二つの員を有する）、及び (b) 基準核酸を含む容器（この場合、前記基準核酸はアレイの少なくとも一 つの員に相補性である配列及び非相補性である配列を含む） を含むことを特徴とするキット。 18．相補性核酸及び非相補性核酸のモル比が1:100 未満である請求の範囲第17項 に記載のキット。 19．標的核酸が約1000〜約1,000,000 ヌクレオチドの複雑度である請求の範囲第 17項に記載のキット。 20．キットが２種の異なる蛍光標識を更に含む請求の範囲第17項に記載のキット 。 21．固体担体がガラスである請求の範囲第17項に記載のキット。 22．基準核酸が哺乳類のものであり、哺乳類ゲノム核酸である請求の範囲第17項 に記載のキット。 23．哺乳類ゲノム核酸がヒト起源のものである請求の範囲第22項に記載のキット 。
JP51781596A 1994-12-09 1995-12-08 核酸アレイへの比較蛍光ハイブリダイゼーション Expired - Lifetime JP4338783B2 (ja)

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