JP2010510493A - 生体試料の連続分析 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] 本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、2006年11月16日に出願された、「Sequential Analysis of Biological Samples(生体試料の連続分析)」と題する、米国特許出願番号11/560,599の一部継続出願である。
[0046] 請求項に係る発明の主題をより明瞭かつ簡潔に記載して説明するために、以下の記載と付帯の特許請求の範囲に使用する特定の用語について以下の定義を提供する。
[0071] 本発明の1つの態様による生体試料は、固体又は液体であってよい。生体試料の好適な例には、限定されないが、培養物、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰、精液、尿、糞、涙液、唾液、注射針吸引物、皮膚の外部部分、気道、腸管、及び尿生殖路、腫瘍、臓器、細胞培養物又は細胞培養成分、又は固体組織切片が含まれてよい。いくつかの態様において、生体試料は、そのまま、即ち、目的の標的の採取及び/又は単離なしに分析してよい。代わりの態様において、標的の採取及び単離は、分析に先立って実施してよい。いくつかの態様において、本明細書に開示する方法は、生体試料のin vitro分析に特に適している場合がある。
[0077] 標的は、生体試料の表面に存在しても(例えば、組織切片の表面上の抗原)、試料のバルクに存在してもよい(例えば、緩衝溶液中の抗体)。いくつかの態様において、標的は、生体試料の表面に本来は存在していない場合があり、標的を表面上で利用可能にするように生体試料を処理しなければならない場合がある(例、抗原復帰、酵素消化、エピトープ回復、又はブロッキング)。いくつかの態様において、標的は、血液、血漿、血清、又は尿のような体液に存在してよい。いくつかの他の態様において、標的は、組織中に、細胞表面か又は細胞内部のいずれかで固定してよい。
[0088] いくつかの態様では、結合剤と標識(シグナルジェネレータ又は酵素)を直接的に(即ち、リンカーなしに)互いへ連結させてよい。他の態様では、結合剤と標識(シグナルジェネレータ又は酵素)を、リンカーを介して互いへ連結させてよい。本明細書に使用する場合、「連結させる」は、一般に、あらゆる物理化学的な手段によって互いへ安定的に結合した2つの実体(例えば、結合剤とシグナルジェネレータ)に言及する。この連結の特質は、それがいずれの実体の有効性も実質的には損なわないというようなものであり得る。結合剤と標識は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用により互いに連結してよい。非共有結合性相互作用には、限定されないが、疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合相互作用、高アフィニティー相互作用(ビオチン-アビジン又はビオチン-ストレプトアビジン複合体化のような)、又は他のアフィニティー相互作用が含まれてよい。
[0093] 本明細書に開示する方法は、特異的なやり方で標的へ物理的に結合する結合剤の使用に関わる。いくつかの態様において、結合剤は、標的へ十分な特異性をもって結合してよく、即ち、結合剤は、他のあらゆる分子へ結合するより大きなアフィニティーで標的へ結合してよい。いくつかの態様において、結合剤は、他の分子へ結合してよいが、その結合は、その非特異的結合がバックグラウンドレベルであるか又はその付近であり得るようなものであろう。いくつかの態様において、目的の標的への結合剤のアフィニティーは、他の分子へのそのアフィニティーの少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、又はそれ以上である範囲にあり得る。いくつかの態様では、アフィニティーの差が最大である結合剤を利用してよいが、それらは、その標的への最大アフィニティーのものでなくてもよい。
[0111] 本明細書に開示する方法に適したシグナルジェネレータの種類は、行われる分析の特質、使用するエネルギー源及び検出器の種類、利用する酸化剤の種類、結合剤の種類、標的の種類、又は結合剤とシグナルジェネレータの間の付着の形式(例、切断可能又は非切断可能)が含まれる、様々な要因に依存する場合がある。
[0121] いくつかの態様において、プローブには、酵素へ連結した結合剤が含まれてよい。いくつかの態様において、好適な酵素は、基質の化学反応を触媒して、試料中に存在する受容体(例、フェノール基)又は試料が結合している固体支持体へ結合し得る反応産物を作製する。受容体は、外因性(即ち、試料又は固体支持体へ外的に付着する受容体)又は内因性(試料又は固体支持体にもともと存在する受容体)であり得る。単一の酵素が基質の化学反応を触媒して、標的近くの複数のシグナルジェネレータを共有結合させることができるとき、シグナル増幅が生じ得る。
[0129] 化学剤には、シグナルジェネレータ、酵素、又はシグナルジェネレータと結合剤又は酵素基質の間の切断可能リンカー(存在するならば)を修飾することが可能な1以上の化学物質が含まれてよい。化学剤は、固体、溶液、ゲル、又は懸濁液の形態の試料と接触させてよい。
[0137] 生体試料をプローブと接触させて、プローブを生体試料中の標的へ結合させることができる。いくつかの態様において、標的は、プローブとの結合のためにに容易にはアクセス可能でない場合があり、生体試料をさらに処理して、標的とプローブ中の結合剤との間の結合を、例えば、抗原復帰、酵素消化、エピトープ回復、又はブロッキングを介して促進してよい。
[0154] シグナルジェネレータからのシグナルは、検出システムを使用して検出することができる。使用する検出システムの特質は、使用するシグナルジェネレータの特質に依存してよい。検出システムには、電子スピン共鳴(ESR)検出システム、電荷結合素子(CCD)検出システム(例、放射性同位元素用)、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡(AFM)検出システム(ミクロビーズの検出用)、走査型トンネル顕微鏡(STM)検出システム(ミクロビーズの検出用)、光学的検出システム、近接場検出システム、又は全内部反射(TIR)検出システムが含まれてよい。
[0158] 化学剤を試料へ適用して、シグナルを修飾してよい。いくつかの態様において、シグナル修飾には、シグナルの特徴の変化、例えば、シグナルの強度の減少、シグナルピークのシフト、共鳴周波数の変化、又はシグナル除去をもたらすシグナルジェネレータの切断(除去)の1以上が含まれてよい。いくつかの態様では、化学剤を適用して、蛍光シグナルジェネレータと酵素(利用すれば)を実質的に不活性化することによって、シグナルを修飾してよい。いくつかの態様において、化学剤には、蛍光シグナルジェネレータを実質的に酸化し得る、酸化剤が含まれてよい。いくつかの態様では、化学剤を適用して、切断可能連結を実質的に酸化してシグナルジェネレータを切り離すことによって、シグナルを修飾してよい。
[0163] 生体試料又は固体支持体へ結合した試料は、第一プローブについて上記に記載した1以上の手順を使用して、後続のプローブと接触させてよい。後続のプローブは、先の工程で結合した標的と異なる標的へ結合されることが可能であり得る。先のプローブ接触工程において複数のプローブを生体試料と接触させ得る態様において、後続のプローブは、先のプローブセットにより結合する標的とは異なる標的へ結合することが可能であり得る。いくつかの態様では、後続のプローブ接触工程において、生体試料を複数のプローブと接触させてよい。酵素へ連結した結合剤をプローブとして利用し得る態様では、結合工程に、蛍光シグナルジェネレータへ連結した酵素基質と酵素の反応に関わる反応工程がさらに含まれてよい。
[0168] 上記に記載の1以上の検出方法を使用して、後続のシグナルジェネレータ(後続のプローブに存在する)からの後続(例、第二、第三、等)シグナルの1以上の特徴を観測することができる。いくつかの態様では、上記技術の1以上を使用して、シグナル強度、シグナル波長、シグナル位置、シグナル頻度、又はシグナルシフトを決定することができる。第一シグナルと同様に、入手した後続シグナル(例えば、蛍光シグナル)は、デジタルシグナル(例えば、デジタル化画像)の形態で記録してよい。いくつかの態様において、後続シグナルを観測することには、生体試料の光学像をキャプチャーすることも含まれてよい。
[0169] いくつかの態様では、試料を後続(例、第二、第三、等)のプローブと接触させた後で、シグナルジェネレータの酸化と後続のプローブ投与を複数回繰り返してよい。いくつかの態様では、第二プローブからの第二シグナルを観測した後で、生体試料を酸化剤と接触させて、第二プローブからのシグナルを修飾してよい。さらに、第三プローブをこの生体試料と接触させてよく、ここで第三プローブは、第一及び第二プローブと異なる標的へ結合することが可能であり得る。同様に、第三プローブからのシグナルを観測し、続いてそのシグナルを修飾する酸化剤を適用してよい。この結合、観測、及び酸化の工程は、さらなる標的へ結合することが可能なn番目のプローブを使用して、反復的に複数回繰り返してよく、多様なプローブ及び/又はシグナルジェネレータを使用して、多様な標的についての情報をユーザーに提供する。酵素へ連結した結合剤をプローブとして利用し得る態様では、結合工程に、蛍光シグナルジェネレータへ連結した酵素基質と酵素の反応が関与する反応工程がさらに含まれてよい。いくつかの態様では、この酸化、結合、反応(適用可能であれば)、及び観測の工程を1回以上繰り返してよい。いくつかの態様では、この酸化、結合、反応(適用可能であれば)、及び観測の工程を少なくとも5回、少なくとも10回、又は少なくとも20回繰り返してよい。
[0171] いくつかの態様において、生体試料には、細胞又は組織が含まれてよく、試料は、第一プローブ又は後続プローブとの接触工程の前、間、又は後に形態染色剤と接触させてよい。形態染色剤には、細胞型又は疾患状態の同定を促進するために、異なる細胞成分を染色し得る色素が含まれてよい。いくつかの態様において、形態染色剤は、プローブ中のシグナルジェネレータから容易に識別可能であってよく、即ち、染色剤は、プローブからのシグナルと重なる可能性があるシグナルを放出し得ない。例えば、蛍光形態染色剤では、形態染色剤からのシグナルは、プローブに使用するフルオロフォアと同じ波長において自己蛍光を発し得ない。
[0177] いくつかの態様では、対照プローブを生体試料中の1以上の標的へ結合させてよい。いくつかの態様では、対照プローブを第一プローブ接触工程と同時に標的へ結合させてよい。いくつかの態様では、対照プローブを第一プローブと同時に生体試料へ適用してよい。いくつかの態様では、対照プローブを連続的に、即ち、第一プローブの適用の前又は後に、しかし酸化剤の適用前に生体試料へ適用してよい。
[0183] いくつかの態様では、第一シグナル、後続シグナル、又は第一シグナル及び後続シグナルを分析して、生体試料に関する情報を得ることができる。例えば、いくつかの態様では、第一シグナルの存在又は非存在が第一標的(第一結合剤へ結合することが可能な)の生体試料における存在又は非存在を示す場合がある。同様に、第二シグナルの存在又は非存在は、第二標的(生体試料中の第二結合剤へ結合することが可能な)の生体試料における存在又は非存在を示す場合がある。複数のプローブを使用して複数の標的を分析し得る態様において、特定のシグナルの存在又は非存在は、対応する標的の生体試料中の存在又は非存在を示す場合がある。
[0191] 1容量の1 M重炭酸ナトリウム、3容量の水、及び1容量の30パーセント(v/v)過酸化水素を混合することによって、過酸化水素(H2O2)の溶液を重炭酸ナトリウム緩衝液において調製した。過酸化水素との混合に先立って、水酸化ナトリウムを使用して、重炭酸ナトリウムのpHをpH10へ調整した。
[0196] 過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)の0.2 M溶液を0.1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に混合することによって、NaIO4の溶液を調製した。シアニン色素(Cy3、Cy5、及びCy7)の3つの別々の水溶液を約2μMの濃度で調製した。シアニン色素溶液のアリコートをNaIO4溶液のアリコートと混合して、約1μM NaIO4と1μMシアニン色素の最終濃度の溶液(試料5(Cy3)、6(Cy5)、及び7(Cy7))を調製した。1μMシアニン色素水溶液(NaIO4を含まない)を対照として使用した。
[0200] NaOH溶液を0.1 Mと1 Mの濃度で調製した。シアニン色素、Cy3、Cy5、及びCy7の3つの別々の水溶液を2μMの濃度で調製した。シアニン色素溶液のアリコートを2つの異なる濃度のNaOHのNaOH溶液:0.1 M NaOH(試料9A、10A、及び11A)と1 M NaOH(試料9B、10B、及び11B)のアリコートと混合した。1μMシアニン色素水溶液(NaOHを含まない)を対照として使用した。
[0203] トリス[2-カルボキシエチル]-ホスフィン塩酸塩(TCEP.HCl)を1 M-重炭酸ナトリウム緩衝液(最終pH7.7)に混合することによって、求核試薬の5パーセント(w/v)溶液を調製した。シアニン色素、Cy3、Cy5、及びCy7の3つの別々の水溶液を約2μMの濃度で調製した。シアニン色素溶液のアリコートをTCEP.HCl溶液のアリコートと混合して、試料13(Cy3)、14(Cy5)、及び15(Cy7)を調製した。1μMシアニン色素水溶液(TCEP.HClを含まない)を対照として使用した。
[0205] 過酸化水素(H2O2)の6%(v/v)溶液を0.8×PBS(最終pH6.6)に混合することによって、H2O2の溶液をリン酸緩衝化生理食塩水溶液(PBS)において調製した。シアニン色素、Cy3及びCy7の2つの別々の水溶液を約2μMの濃度で調製した。シアニン色素溶液のアリコートをH2O2溶液のアリコートと混合して、試料16(Cy3)及び17(Cy7)を調製した。1μMシアニン色素水溶液(H2O2を含まない)を対照として使用した。
[0208] パラフィンに包埋した組織スライドとしてヒト成人の組織試料を入手した。この組織試料には、結腸(Biochain、T2234090)、正常乳房組織(Biochain、T2234086)、前立腺癌(Biochain、T2235201-1)、結腸腺癌(Biochain、T2235090-1)、乳房組織マイクロアレイ(Imgenex、IMH367、p61)、乳房TMA(Imgenex、IMH367、p32)、及び正常前立腺(Biochain、T2234201)のスライドが含まれた。ヒト成人組織のパラフィン包埋スライドを免疫組織化学プロトコールへ処して、それらを染色用に調製した。このプロトコールには、脱パラフィン、再水和、インキュベーション、及び洗浄が含まれた。脱パラフィンは、スライドを Histochoice(又はトルエン)で10分間、頻繁に振り混ぜながら洗浄することによって行った。脱パラフィンの後で、スライドをエタノール溶液で洗浄することによって、組織試料を再水和した。洗浄は、濃度を減少させた3つの異なるエタノール溶液で行った。使用するエタノールの濃度は、90容量%、70容量%、及び50容量%であった。次いで、このスライドをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.4)で洗浄した。組織の膜透過化は、0.1重量パーセント溶液のTriton TX-100でスライドを洗浄することによって行った。抗原回復には、pH6.0のクエン酸緩衝液(Vector Unmasking 溶液)を使用した。このスライドを圧力容器において緩衝液へ15分間曝して、その後室温で20分間冷却した。次いで、このスライドを、PBSと900μLの3容量パーセントウシ血清アルブミン(BSA)で、37℃で45分間洗浄することによって、非特異的結合に対してブロッキングした。二次抗体(任意選択)での染色のために、このスライドを、二次抗体宿主種からの100μLの血清でもブロッキングした。
[0209] 以下の手順に従って、色素共役抗体を調製した。共役化と染色に使用する抗体には、抗増殖細胞核抗原、クローンpc10(シグマアルドリッチ、P8825);抗平滑筋αアクチン(SmA)、クローン1A4(シグマ、A2547);ウサギ抗βカテニン(シグマ、C2206);マウス抗パンサイトケラチン、クローンPCK-26(シグマ、C1801);マウス抗エストロゲン受容体α、クローン1D5(DAKO、M7047);βカテニン抗体、クローン15B8(シグマ、C7738);ヤギ抗ビメンチン(シグマ、V4630);サイクル(cycle)アンドロゲン受容体クローンAR441(DAKO、M3562);フォン・ウィルブラント因子VII、ケラチン5、ケラチン8/18、e-カドヘリン、Her2/neu、エストロゲン受容体、p53、プロゲステロン受容体、βカテニン;ロバ抗マウス(Jackson Immunoresearch、715-166-150);及び、ロバ抗ウサギ(Jackson Immunoresearch、711-166-152)が含まれた。
[0211] 実施例6で調製したスライドを、実施例7で調製した色素共役抗体とともにインキュベートした。インキュベーションは、3パーセントBSAにおいて37℃で45分間行った。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。二次抗体を使用するときは、スライドをBSAにおいて二次抗体と37℃で45分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。一次抗体又は二次抗体を染色したスライドを形態染色剤、DAPIで対比染色して、カバースリップを施した。
[0213] NaOH溶液とH2O2溶液をシグナル破壊に使用した。500μLの50容量パーセントNaOHと49.5 mLのPBSを使用して、NaOH溶液を調製した。NaOH溶液の最終pHは、11.9〜12.5付近であった。10 mLの0.5 M炭酸ナトリウム(pH10)、5 mLの30容量パーセントH2O2、及び35 mLの水を混合することによって、H2O2溶液を調製した。穏やかに振り混ぜながら、スライドをNaOH又はH2O2溶液中に15分間入れた。15分後、このスライドをPBSで再び洗浄し、カバースリップを施し、色素破壊の効力をチェックするために再び撮像する(任意選択)か、又は再染色して撮像した。実施例8に記載の方法を使用して、再染色及び再撮像の工程を行った。撮像に続き、スライドをシグナル破壊、染色、及び撮像のサイクルへ処して、この方法を複数の回数繰り返した。1〜9の異なる抗体を使用して、組織試料を撮像した。シアニン系列で撮像後、スライドは、形態染色剤のH&Eで任意選択的に染色及び撮像した。
[0214] 正常結腸のスライドを一次抗体であるマウス抗増殖細胞核抗原(PCNA)クローン、pc10で染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出して、試料18Aを作製した。試料18Aを撮像してから、NaOH溶液で処理して試料18Bを作製し、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。図12は、試料18A(色素破壊前)と試料18B(色素破壊後)の顕微鏡写真を(10倍率で)示す。NaOHでの処理の後で、Cy3からのシグナルは、ほとんど又はまったく残っていなかった。
[0215] 正常結腸のスライドを一次抗体であるマウス抗平滑筋αアクチン(SmA)クローン1A4で染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出して、試料19Aを作製した。試料19Aを撮像してから、NaOH溶液で処理して試料19Bを作製し、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。図13は、試料19A(色素破壊前)と試料19B(色素破壊後)の顕微鏡写真を(10倍率で)示す。NaOHでの処理後、Cy3からのシグナルの少量が残った。
[0216] 正常乳房組織を一次抗体であるSmAで染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出し、DAPIで対比染色して、試料20Aを作製した。試料20Aを撮像してからNaOH溶液で処理して試料20Bを作製し、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。試料20Bを一次抗体であるウサギ抗βカテニンで再染色し、Cy3共役抗ウサギで検出して、試料20Cを作製した。試料20Cを撮像してからH&Eで対比染色して、試料20Dを作製して再び撮像した。
[0218] 前立腺癌組織を一次抗体であるマウス抗パンサイトケラチンクローン、PCK-26で染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出して、試料21Aを作製した。試料21Aを撮像してから、DAPIで対比染色して、試料21Bを作製した。試料21Bを撮像してからNaOH溶液で処理して試料21Cを作製して、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。試料21Cを一次抗体であるSmAで再染色し、Cy3共役抗ウサギで検出して、試料21Dを作製して再び撮像した。
[0220] 結腸腺癌のスライドを一次抗体であるマウス抗パンサイトケラチンクローン、PCK-26で染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出して、試料22Aを作製した。試料22Aを撮像してから、DAPIで対比染色して、試料22Bを作製した。試料22Bを撮像してからNaOH溶液で処理して試料22Cを作製して、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。試料22Cを一次抗体であるSmAで再染色し、Cy3共役抗ウサギで検出して、試料22Dを作製して再び撮像した。
[0222] 乳房組織マイクロアレイ(試料23A)をDAPI及びCy3チャネルで撮像して、この組織からの自己蛍光を測定した。次いで、試料23AをDAPIで染色して試料23Bを作製し、撮像してからNaOHで処理して試料23Cを作製して、再び撮像した。試料23Aを一次抗体であるマウス抗エストロゲン受容体αクローン1D5でも染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで検出して、試料23Dを作製した。試料23Dを撮像してからNaOH溶液で処理して試料23Eを作製し、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。
[0224] 乳房試料を一次抗体であるマウス抗パンサイトケラチンクローンPCK-26で染色し、Cy3共役ロバ抗マウスで可視化して検出して試料24Aを作製して、DAPIで対比染色して(示さず)、撮像した。次いで、試料24AをNaOH溶液で処理してCy3シグナルを除去し(示さず)、一方、DAPIシグナルを保持して試料24Bを作製して、図18の試料24Bに示すように撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。試料24BをCy3直接共役βカテニン抗体で再染色して試料24Cを作製して、再び撮像した。この試料を再びNaOHで処理し、Cy3直接共役SmA抗体で標識して試料24Dを作製して、再び撮像した。得られる画像を記録し、擬似着色し、重ね合わせて(試料24E)、発現抗原についての空間的な情報を得た。試料24DをH&Eでさらに染色して、試料24Fを作製した。
[0226] 染色に先立って画像を撮り、各チャネルから生じる自己蛍光を基準化した。正常前立腺スライドを2つの一次抗体:ヤギ抗ビメンチン及びマウス抗パンサイトケラチンのカクテルで染色した。この2つの一次抗体を二次抗体:Cy3共役ロバ抗ヤギ及びCy5共役ロバ抗マウスの第二カクテルで検出して、試料25AのCy3及びCy5をそれぞれ作製した。試料25Aを撮像してから、NaOH溶液で処理した。次いで、この組織を2つの一次抗体:ウサギ抗αカテニン(これは、Cy3共役二次抗体で後に検出する)とCy5共役抗アンドロゲン受容体で連続的に染色して、試料25B(それぞれ、25B-Cy3と25B-Cy5)を作製した。撮像に続き、試料をNaOH溶液で処理し、7種のCy直接共役抗体を使用して、染色-撮像-NaOH処理-染色の工程を続けた(試料25C〜25I)。使用する抗体は:平滑筋αアクチン、βカテニン、パンカドヘリン、フォン・ウィルブランド因子VII、ケラチン5、ケラチン8/18、及びe-カドヘリンであった。各染色工程には、DAPIでの対比染色が含まれた(試料25J)。
[0228] 染色に先立って画像を撮り、各チャネルから生じる自己蛍光を基準化した。正常前立腺のスライドをCy3直接共役抗パンカドヘリンで染色して、試料26Aを作製した。このスライドを撮像してH2O2で処理し(試料26B)、Cy3共役抗ビメンチンで再染色し(試料26C)、H2O2で処理し(試料26D)、Cy3共役抗パンサイトケラチンで再染色し(試料26E)、H2O2で処理し(試料26F)、Cy3共役抗SmAで再染色して(試料26G)、H2O2で処理した(試料26H)。
[0230] 正常前立腺(試料27A)をCy3チャネルで撮像して、この組織からの自己蛍光を測定した。次いで、試料27AをCy3共役抗SmAで染色して試料27Bを作製し、撮像してからNaOHで処理して試料27Cを作製して、再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。図21は、試料27A〜Cの顕微鏡写真を示す。NaOH処理の後で、試料27Cに示す残存染色を観測した。
[0232] 2つの前立腺のスライドをCy3直接共役SmAで染色した(試料28A及び28B、左パネル)。いずれのスライドにも同一の前処理工程、濃度、抗原回復を与えて、唯一の違いは、シグナル破壊の方法であった:方法1は、NaOHで行って(試料28C)、もう一方の方法は、H2O2で行った(試料28D)。この他に2つの前立腺のスライドをCy3直接共役パンカドヘリンで染色した(試料29A及び29B、右パネル)。いずれのスライドにも同一の前処理工程、濃度、抗原回復を与えて、唯一の違いは、シグナル破壊の方法であった:方法1は、NaOHで行って(試料29C)、もう一方の方法は、H2O2で行った(試料29D)。
[0234] 2つの前立腺スライドをCy3直接共役パンカドヘリンで染色した(試料30A及び30B)。両方のスライドに、抗原回復が含まれる同一の前処理工程を与えて、唯一の違いは、シグナル破壊の方法であった;方法1は、NaOHで行って、もう一方の方法は、H2O2で行った。このスライドを9回の擬似染色-及び-シグナル破壊サイクルへ処した後にCy3共役パンサイトケラチンで染色して、図24の試料30C及び試料30Dを作製した。
[0236] 結腸組織のスライドを一次抗体であるウサギ抗βカテニンで染色して、Cy3共役ロバ抗ウサギ二次抗体で検出して、試料31Aを作製した。試料31Aを撮像してからNaOH溶液で処理して試料31Bを作製し、これを再び撮像した。本明細書の実施例8及び9に記載の手順に従って、染色、撮像、及び色素破壊の工程を実施した。試料31BをCy3共役抗ウサギ二次抗体で再染色して試料31Cを作製して、再び撮像した。図27は、試料31A〜Cの顕微鏡写真を示す。図27は、NaOH処理の後で、一次抗体が試料へ結合したままであることを示す。
[0239] 使用する抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)酵素へ直接共役したウサギ抗β-カテニン、マウス抗ケラチン5、及びHRP抗体へ共役したロバ抗マウスであった。HRP酵素の基質は、Cy5共役チラミド基質であった。
[0240] 実施例6のように調製したスライドを実施例23で調製したHRP共役抗β-カテニン抗体とインキュベートした。一次抗体インキュベーションは、3パーセントBSAにおいて37℃で45分間行った。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。このHRP染色スライドを、PBS/0.1%Triton X-100においてCy5共役チラミド基質とともに10分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。次いで、Cy5チラミド基質をZeiss Axio Imagerで撮像した。使用する倍率は、他に述べなければ、20倍であった。図29は、β-カテニンについて染色後の試料33の顕微鏡写真を示す。画像獲得の後で、スライドをPBSで洗浄して、シグナル破壊に備えた。
[0241] シグナル破壊にH2O2溶液を使用した。10 mLの0.5 M炭酸ナトリウム(pH10)、5 mLの30容量パーセントH2O2、及び35 mLの水を混合することによって、H2O2溶液を調製した。穏やかに振り混ぜながら、スライドをH2O2溶液中に15分間入れた。15分後、このスライドをPBSで再び洗浄し(試料34)、カバースリップを施し、再び撮像して、色素破壊の効力をチェックした。この再撮像工程は、実施例24において上記に記載した方法を使用して行った。図29は、シグナル修飾後の試料34の顕微鏡写真を示し、シグナル破壊後のシグナルの実質的な除去を示す。次いで、試料34をCy5-チラミドと再インキュベートして、HRP酵素の残存活性を定量して、上記のように撮像した。図29は、試料35の顕微鏡写真及びさらなるCy5が無いことを示し、HRP酵素はH2O2溶液によって化学的に不活性化され、それによりさらなる酵素基質反応が起こらない。
[0242] 実施例25からのスライド(試料35)をマウス抗ケラチン5抗体とインキュベートした。このインキュベーションは、3パーセントBSAにおいて37℃で45分間行った。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。次いで、ケラチン5抗体を、BSA中のHRP共役ロバ抗マウス抗体で、37℃で45分間検出した。このHRP染色スライドを実施例25のようにCy5共役チラミド基質とインキュベートした。インキュベーション後、スライドを何回ものPBS洗浄へ処した。このCy5再染色スライド(試料36)を形態染色剤、DAPIで対比染色して、カバースリップを施した。カバースリップを施したスライドを、実施例24において上記に記載の方法を使用して再撮像した。図29は、k5タンパク質について染色後の試料36の顕微鏡写真を示す。
[0244] 標的タンパク質、β-カテニンペプチド(シグマ、26561-1 ロットR1078-005)、及びCEA抗原をフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜に3つの異なる濃度:1マイクログラム、100ナノグラム、及び10ナノグラムでスポットした。このブロットを、1×TBS-T(トリス緩衝化生理食塩水Tween20緩衝液)中5%ミルクを室温で1時間使用してブロッキングした。
[0245] 実施例27で調製したブロットを一次抗体、ウサギ抗β-カテニン抗体(シグマ、C7738)とインキュベートした。インキュベーションは、抗体の1:200希釈で、1×TBS-T中1パーセントミルクを室温(RT)で1時間使用して行った。インキュベーション後、ブロットを何回もの洗浄へ処した。次いで、このブロットを、1:500希釈で、1×TBS-T中1パーセントミルクを室温(RT)で1時間使用して、色素共役二次抗体であるロバ抗ウサギCy5(実施例6のように調製する)とインキュベートした。インキュベーション後、このブロット(試料37)を1×TBS-Tで洗浄した。このブロット(試料37)の画像を、Cy5チャネルと450 Vの電圧設定を使用するTyphoon Imager(GE Healthcare)でキャプチャーした。図30は、試料37の画像を示す。図30に示すように、β-カテニン標的タンパク質の3つの異なる濃度について、様々なシグナル強度のスポットが観測される。
[0246] シグナル破壊にH2O2溶液を使用した。10 mLの0.5 M炭酸ナトリウム(pH10)、5 mLの30容量パーセントH2O2、及び35 mLの水を混合することによって、H2O2溶液を調製した。実施例28で調製したブロットを、穏やかに振り混ぜながら、H2O2溶液中に室温で15分間入れた。15分後、このブロットを、1×TBS-Tを5分間使用して3回洗浄して、試料38を作製した。このブロット(試料38)を再撮像して、ブロットの画像を、Cy5チャネルと450 Vの電圧設定を使用するTyphoon Imager(GE Healthcare)でキャプチャーした。図30は、試料38の画像を示す。図30に示すように、色素破壊工程の後ではスポットが観測されず、Cy5の実質的に完全な破壊を示した。
[0247] 実施例29からのブロットを一次抗体であるマウス抗CEA抗体とインキュベートした。インキュベーションは、1:200希釈で、1×TBS-T中1パーセントミルクを室温(RT)で1時間使用して行った。インキュベーション後、ブロットを何回もの洗浄へ処した。次いで、このブロットを、1:500希釈で、1×TBS-T中1パーセントミルクを室温(RT)で1時間使用して、色素共役二次抗体であるロバ抗マウスCy5(実施例6において調製)とインキュベートした。インキュベーション後、このブロット(試料39)を何回もの洗浄へ処した。このブロット(試料39)の画像を、Cy5チャネルと450 Vの電圧設定を使用するTyphoonでキャプチャーした。図30は、試料39の画像を示す。図30に示すように、CEA抗原の3つの異なる濃度について、様々なシグナル強度のスポットが観測される。本実施例は、単一のシグナルジェネレータを使用して、2つの異なる標的を検出し得ることを例示する。
[0248] 試料37、38、39、及び40についてさらに分析して、各ペプチドについて検出される3つのスポットのシグナルを定量した(図30に、分析に選択した領域の代表例を示し、図30では、4〜9と番号付けた四角により領域を強調する)。図30に示すように、各試料からの各ペプチドスポットのシグナルを3つのバックグラウンドスポット、1、2、及び3の平均に対して正規化した。図31は、試料37、38、39、及び40のスポットの相対シグナル強度のプロットであり、シグナル強度が色素破壊工程の後で10分の1に低下することを示す(試料38)。
[0250] アレクサ488、BODIPY FL C5(D6184)、ヒドロキシクマリン(H1193)は、Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)より入手し;ATTO495、ATTO635、及びATTO655は、ATTO-TEC(ジーゲン、ドイツ)より入手し;DY-734-NHSは、Dyomics(イェナ、ドイツ)より入手し;フルオレセインカダベリンは、Biotium 社(カリフォルニア州ヘイワード)より入手した。ヤギ抗マウスIgG-Cy3とヤギ抗マウスIgG-Cy5は、Jackson ImmunoResearch Laboratories 社(ペンシルベニア州ウェストグローブ)より入手した。DPBSとPBSは、Invitrogen より入手し;16%PFAは、Electron Microscopy Sciences(ペンシルヴェニア州ハットフィールド)より入手した。ヤギ血清は、Vector Laboratories(カリフォルニア州バーリンゲーム)より入手した。他の試薬は、いずれもシグマ(ミズーリ州セントルイス)より入手した。
[0253] 一次抗体に対する酸化剤の効果を検討するために、様々な酸化剤溶液(表1に記載する)をプレートの半分へ30分間加えてから、PBSで徹底的に濯いだ。利用する酸化試薬は、過酸化水素、臭素水溶液、過マンガン酸カリウム、ジクロム酸ナトリウム、I2/KI溶液、過酸化t-ブチル、及びt-ブチル過酸化水素であった。プレートの他の半分は、並行してPBSインキュベーション及び洗浄をした対照として使用して、酸化剤溶液は適用しなかった。プローブに対する塩基の効果を検査するために、NaOH、水性DBU(ジアゾビシクロ-ウンデセン)、及び水性ブチルアミンのような、様々な塩基もプレートと接触させた。対照剤としてPBSを適用した。
[0257] フルオロフォア標識細胞に対する酸化剤の効果を検討するために、様々な酸化剤溶液(表1に記載する)を様々な横行(プレートの対照部分)へ30分間加えた。実施例33に記載のように、徹底した洗浄の後で、プレートを再び読み取った。
[0258] 光学密度(O.D.)を使用しして、色素破壊をモニタリングした。10μlの色素を等量の酸化溶液と混合してから、この混合溶液の2μlをND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies 社、デラウェア州ウィルミントン)へロードした。200 nm〜750 nmに及ぶフル・スペクトルで光学密度(O.D.)を読み取った。動態試験用に、0、5分、15分、及び30分の時点で測定値を取った。
[0259] 色素破壊の動態を試験するために、実施例36に記載の方法を使用して、過酸化水素(1.5%H2O2、pH10)を酸化剤として使用し、Cy3とCy5を代表的な色素として使用した。色素-酸化溶液混合物の蛍光スペクトルを30分の時間の間モニタリングした。図32は、Cy3及びCy5のスペクトルの時間プロフィールを示す。色素破壊を示す、O.D.の速やかな減少を観測した。いずれの場合でも、1.5%H2O2中15分のインキュベーションにより、色素をほとんど破壊することができた。ピーク励起時のO.D.値は、Cy3とCy5の両方で15分後に2%まで低下した。
[0260] 0〜1.5%のH2O2濃度の範囲を試験して、実施例35に記載の方法を使用して、吸光度スペクトルを30分にわたりモニタリングした。H2O2溶液のpHは、10に保った。Cy3を色素として使用して、吸光度をそのピーク波長の550 nmで記録した。図33に示すように、0.1%H2O2を除いて他のすべてのH2O2濃度はきわめて似た結果を示し、15分以内に色素吸光度を5%までほとんど低下させた。0.5%、1%、及び1.5%の濃度での処理の間には、統計学的有意差がない(P>0.1)。
[0261] 実施例35に記載の方法を使用して、一団の蛍光色素を、異なるフルオロフォアに対するH2O2(3%H2O2、pH10)の効果について試験した。吸光度スペクトルを30分にわたりモニタリングして、吸光度値を図34に示す。ここに示すデータは、時間0でのO.D.に対して正規化した、色素の最大吸光度波長でのO.D.値である。光退色に対する感受性がきわめて強いフルオレセインは、この酸化法に対して、相対的に安定していた。ATTO496とアレクサ488も、他の色素と比較した場合、この酸化剤に対してさほど感受性が強くなかった。図34は、これらの色素がH2O2を使用して破壊され得ることを示す。
[0262] 実施例36に記載の方法を使用して、ある範囲のH2O2濃度(20倍〜2000倍希釈)を試験して、吸光度スペクトルを30分にわたりモニタリングした。H2O2溶液のpHは、10に保った。この吸光度値をQD655の溶液の対照試料と様々な濃度(20倍〜2000倍希釈)で比較した。
[0265] 試料41(FAM-CAD、H2O2、及びH2O(1:1:1)、42(FAM-CAD、H2O2、及びFeCl3(1:1:1))、43(FAM-CAD、H2O、及びFeCl3(1:1:1))、44(FAM-CAD及びH2O(1:2))について、異なる酸化剤条件を使用して、フルオレセイン色素、FAMカダベリン(「FAM-CAD」)の吸光度スペクトルを測定した。フルオレセイン-カダベリンの溶液を9%過酸化水素と2%FeCl3水溶液と1:1:1の容量比で混合した。この混合物をそのまま5分間静置させた。FeCl3の添加がpHを強酸性へ変化させて、フルオレセインスペクトルが酸性条件の下で異なることが知られているので、UV/VISスペクトル測定に先立って、1 N NaOHの添加により溶液を塩基性にし、濾過して、そのスペクトルを記録した。過酸化水素を水に置き換えること、又はFeCl3溶液を水に置き換えることのいずれか以外は同様に処理した溶液を対照として使用した。FeCl3と過酸化水素をともに水に置き換えた溶液も、別の対照として使用した。過酸化物の存在下で、泡の形成のためにスペクトルはややノイズがあって、ベースラインが上昇するが、スペクトルは、対照試料が影響を受けないのに対して、試験試料では、ほとんどすべてのフルオレセインが破壊されることを明瞭に示した。図36に示すように、試料42では5分後に吸光度が著しく低下して、酸化剤を利用してヒドロキシルラジカルを創出することによってフルオレセインが破壊され得ることを示した。
Claims (25)
- 生体試料中の複数の標的をプローブする方法であって:
(a)複数の標的を含有する生体試料を提供する工程;
(b)試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの蛍光プローブを結合させる工程;
(c)試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの対照プローブを結合させる工程;
(d)工程(b)において結合した蛍光プローブからのシグナルと工程(c)において結合した対照プローブからの対照シグナルを観測する工程;
(e)その蛍光プローブを選択的に不活性化して対照プローブは不活性化しない酸化剤を含んでなる溶液を工程(d)の試料へ適用する工程;
(f)工程(e)の試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの蛍光プローブを結合させる工程;並びに
(g)工程(f)において結合した蛍光プローブからのシグナルを観測する工程
を含んでなる、前記方法。 - 工程(d)における溶液が塩基性溶液である、請求項1の方法。
- 塩基性溶液が約10のpHを有する、請求項2の方法。
- 塩基性溶液が還元剤も界面活性剤も含有しない、請求項2の方法。
- 対照プローブの約20%より多くを不活性化せずに酸化工程を実施する、請求項1の方法。
- 酸化剤が、過酸化水素、過マンガン酸カリウム、ジクロム酸ナトリウム、臭素水溶液、ヨウ素-ヨウ化カリウム、及びt-ブチル過酸化水素より選択される、請求項1の方法。
- 蛍光プローブが結合剤と蛍光シグナルジェネレータを含む、請求項1の方法。
- 蛍光シグナルジェネレータがシアニン色素を含む、請求項1の方法。
- 対照プローブが放射性同位元素を含む、請求項1の方法。
- 対照プローブが4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを含む、請求項1の方法。
- 試料が全細胞又は組織切片を含む、請求項1の方法。
- 試料がタンパク質又は核酸を含む、請求項1の方法。
- 工程(e)〜(g)を1回以上繰り返す、請求項1の方法。
- 工程(e)〜(g)を少なくとも5回、少なくとも10回、又は少なくとも20回繰り返す、請求項1の方法。
- 酸化工程(e)を約30分未満の間実施する、請求項1の方法。
- 酸化工程(e)を約30秒〜約15分の間実施する、請求項1の方法。
- 酸化工程(e)を室温で実施する、請求項1の方法。
- 工程(b)における蛍光シグナルジェネレータが工程(e)における蛍光シグナルジェネレータと同じである、請求項1の方法。
- 工程(b)における蛍光シグナルジェネレータが工程(e)における蛍光シグナルジェネレータとは異なる、請求項1の方法。
- 工程(c)及び工程(f)において観測される蛍光シグナルが単一の検出チャネルにおいてともに検出可能である、請求項1の方法。
- 工程(c)又は工程(f)において観測される蛍光シグナルが異なる検出チャネルにおいて独立的に検出可能である、請求項1の方法。
- 工程(c)において観測される蛍光シグナルと対照シグナルが異なる検出チャネルにおいて独立的に検出可能である、請求項1の方法。
- 生体試料中の複数の標的をプローブする方法であって:
(a)複数の標的を含有する生体試料を提供する工程;
(b)試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの蛍光プローブを結合させる工程;
(c)試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの対照プローブを結合させる工程;
(d)工程(b)において結合した蛍光プローブからのシグナルと工程(c)において結合した対照プローブからの対照シグナルを観測する工程;
(e)その蛍光プローブを選択的に不活性化して対照プローブは不活性化しない酸化剤を含んでなる塩基性溶液を工程(d)の試料へ適用する工程;
(f)工程(e)の試料中に存在する1以上の標的へ少なくとも1つの蛍光プローブを結合させる工程;
(g)工程(f)において結合した蛍光プローブからのシグナルを観測する工程;並びに
(h)試料中の少なくとも2つの標的を同時定位する工程
を含んでなる、前記方法。 - 対照プローブが形態染色剤を含む、請求項23に記載の方法。
- 生体試料中の複数の標的をプローブするためのキットであって:
対照プローブと、蛍光シグナルジェネレータへ連結した結合剤を含んでなる複数の蛍光プローブを含んでなり、ここで酸化剤は、試料へ適用されるときに、その蛍光プローブを実質的に不活性化して、対照プローブは不活性化しない、前記キット。
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