JP2017143838A - Ｔ細胞受容体ベータ定常領域に対する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原抗体（ｃａｒ） - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）またはＴＲＢＣ２に選択的に結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；細胞；そのようなＣＡＲを含むそのようなＴ細胞；および対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための、そのような細胞の使用を提供すること。
【解決手段】本発明者らは、対象における悪性Ｔ細胞を、顕著な割合の健康なＴ細胞に影響を及ぼすことなく枯渇させることを可能にする方法を考案した。具体的には、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置に使用するためのＴＲＢＣ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴＲＢＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発した。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置において有用な細胞および作用因子に関する。

発明の背景
リンパ系悪性腫瘍は、Ｔ細胞に由来するものまたはＢ細胞に由来するもののいずれかに大きく分けることができる。Ｔ細胞悪性腫瘍は、臨床的かつ生物学的に不均一な障害の群であり、合わせて非ホジキンリンパ腫の１０〜２０％および急性白血病の２０％を占める。最も一般的に同定される組織学的サブタイプは、特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。全ての急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のうちの一部２０％がＴ細胞表現型である。

これらの状態は、一般には、例えばＢ細胞悪性腫瘍と比較して攻撃的に挙動し、推定５年生存率はわずか３０％である。Ｔ細胞リンパ腫の場合では、播種性疾患、好ましくない国際予後指標（ＩＰＩ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）スコアおよび節外性疾患の罹患率を示す患者の高い割合を伴う。化学療法単独では通常は有効ではなく、現行の処置で治癒する患者は３０％未満である。

さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブなどの免疫療法によって転帰が劇的に改善されるのとは異なり、Ｔ細胞悪性腫瘍を処置するために利用可能な、同等に有効であり、毒性が最小である免疫療法薬は現在存在しない。Ｔ細胞障害に対する免疫療法の開発における重要な難しさは、クローンＴ細胞と正常Ｔ細胞のマーカー発現がかなり重複しており、クローン（悪性）細胞を同定することが明白に可能な単一の抗原が存在しないことである。

Ｂ細胞悪性腫瘍を処置するために汎Ｂ細胞抗原を標的とする場合にも同じ問題が存在する。しかし、この場合、Ｂ細胞コンパートメントの同時枯渇により、大多数の患者により容易に寛容される比較的軽微な免疫抑制がもたらされる。さらに、特に長期間にわたる正常Ｂコンパートメントの枯渇が生じる療法では、プールされた免疫グロブリンを投与することによって正常Ｂコンパートメントの喪失を大きく抑止することができる。Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とする場合には状況が全く異なる。この場合、Ｔ細胞コンパートメントの同時枯渇により、重度の免疫抑制および重度の毒性が生じる。さらに、Ｔ細胞コンパートメントの喪失を減らす満足のいく方法は存在しない。

毒性は、一部において、治療用モノクローナル抗体アレムツズマブの臨床効果によって例示される。この作用因子は、ＣＤ５２を発現する細胞を溶解し、Ｔ細胞悪性腫瘍においていくらかの有効性がある。この作用因子の有用性は、Ｔ細胞の枯渇に大きく起因して細胞免疫不全が極めて大きく、感染のリスクが著しく上昇することによって著しく限定される。

したがって、上記の不都合を伴わない、Ｔ細胞悪性腫瘍の標的化処置のための新しい方法が必要とされている。

図１は、αβＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体の図である。Ｔ細胞受容体は、６つの異なるタンパク質鎖から形成され、細胞表面上に発現するにはこれらが小胞体に集合しなければならない。ＣＤ３複合体の４つのタンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εおよびＣＤ３δ）がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を包む。このＴＣＲは、複合体に特定の抗原特異性を与え、２つの鎖：ＴＣＲαおよびＴＣＲβで構成される。各ＴＣＲ鎖は、膜に対して遠位の可変成分および膜に対して近位の定常成分を有する。ほぼ全てのＴ細胞リンパ腫および多くのＴ細胞白血病でＴＣＲ／ＣＤ３複合体が発現する。 図２は、Ｔ細胞受容体再構成の間のＴ細胞受容体β−定常領域（ＴＲＢＣ）−１とＴＲＢＣ２との分離を示す図である。各ＴＣＲベータ鎖は、特定のベータ可変（Ｖ）領域、多様性（Ｄ）領域、連結（Ｊ）領域および定常（ＴＲＢＣ）領域のゲノム組換えにより形成される。ヒトゲノムは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２として公知の２つの非常に類似した機能的に同等のＴＲＢＣ遺伝子座を含有する。ＴＣＲ遺伝子再構成の間、Ｊ領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかと再結合する。この再構成は恒久的なものである。Ｔ細胞は、それらの表面上に単一のＴＣＲの多くのコピーを発現し、したがって、各Ｔ細胞は、β鎖定常領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかによってコードされるＴＣＲを発現する。 図３は、ヒトＴＲＢＣ１およびヒトＴＲＢＣ２のアミノ酸レベルでのアラインメントを示す図である。ＴＲＢＣ１によってコードされるＴＣＲβ定常鎖とＴＲＢＣ２によってコードされるＴＣＲβ定常鎖は、４つのアミノ酸の差異でのみ異なる：ＴＲＢＣの３位においてＫ／Ｎ；ＴＲＢＣの４位においてＮ／Ｋ；ＴＲＢＣの３６位においてＦ／Ｙ；ＴＲＢＣの１３５位においてＶ／Ｅ。 図４は、ＪＯＶＩ−１抗体がＴＲＢＣ１には結合するがＴＲＢＣ２には結合しないことを決定的に実証するグラフである。細胞の遺伝子操作を使用して、ＪＯＶＩ−１モノクローナル抗体がＴＣＲβ定常鎖のＴＲＢＣ１バリアントを認識することを決定的に実証した。トリシストロン性レトロウイルスカセットを生成した。これは、マイナー組織適合性抗原ＨＡ１を認識するヒトＴＣＲのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方を、都合のよいマーカー遺伝子として切断型ヒトＣＤ３４と一緒にコードした。ＨＡ１ ＴＣＲは元来はＴＲＢＣ２である。ＴＲＢＣ１をＴＲＢＣ２から弁別するＴＣＲβ定常領域内の４つの残基をＴＲＢＣ１によってコードされるものに変化させた以外は第１のレトロウイルスカセットと同一である第２のレトロウイルスカセットを生成した。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方をノックアウトしたジャーカットＴ細胞に、いずれかのベクターを用いて形質導入した。これらの細胞を、ＣＤ３４に対する抗体とコンジュゲートした、汎ＴＣＲ／ＣＤ３抗体またはモノクローナルＪＯＶＩ−１のいずれかを用いて染色し、フローサイトメーターで分析した。上の列は、汎ＴＣＲ／ＣＤ３抗体対ＣＤ３４（形質導入のマーカー）を用いた染色を実証し、下の列はＪＯＶＩ−１対ＣＤ３４を用いた染色を実証する。形質導入された細胞において同様のＴＣＲ／ＣＤ３染色が実証されるが、ＴＲＢＣ１＋ｖｅ細胞のみがＪＯＶＩ−１で染色される。したがって、ＪＯＶＩ−１はＴＲＢＣ１に特異的であり、さらに、ＴＲＢＣ１および２種のＴＣＲを区別するために抗体を使用することが可能である。 図５は、ＪＯＶＩ−１ ｍＡｂにより、ＴＲＢＣの残基３および４が認識されることによってＴＲＢＣ１がＴＲＢＣ２から弁別されることを示すグラフである。ＪＯＶＩ−１によってどのようにＴＲＢＣ１がＴＲＢＣ２から識別されるかを正確に決定するために、上記のＨＡ１ ＴＣＲ ＴＲＢＣ２構築物を変異させて２種のＴＲＢＣ１／２ハイブリッドを作製した。ＴＣＲβ定常鎖の残基３および４のみをＴＲＢＣ２のものからＴＲＢＣ１において見いだされるものに変化させるように追加的なバリアントを生成した。残基３６のみをＴＲＢＣ２において見いだされるものからＴＲＢＣ１において見いだされるものに変化させたさらなるバリアントを作製した。ＴＣＲノックアウトジャーカットＴ細胞に、これらの新しい構築物を用いて形質導入した。図４に記載されている、ＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１を形質導入した元のジャーカットを対照として使用した。ジャーカットＴ細胞をＪＯＶＩ−１で染色し、フローサイトメーターを用いて分析した。ＪＯＶＩ−１の染色を形質導入されていないＴＣＲノックアウトジャーカットＴ細胞の染色の上に重ねている。ＪＯＶＩ−１によりＴＲＢＣ１ ＴＣＲを発現するジャーカットは染色されたが、ＴＲＢＣ２ ＴＣＲは染色されなかった。ＪＯＶＩ−１によりＴＲＢＣ残基３および４のみがＴＲＢＣ１のものであるＴＲＢＣ１／２ハイブリッドは染色された。ＪＯＶＩ−１によりＴＲＢＣ残基３６のみがＴＲＢＣ１のものであるジャーカットＴ細胞は染色されなかった。 図６は、ＴＲＢＣ１の正常ドナーＴ細胞発現の例を示すグラフである。正常ドナー末梢血単核細胞をＣＤ３に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ８に対する抗体およびＪＯＶＩ−１に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団が上のパネルに示されている。この集団の各々をゲーティングし、前方散乱対ＪＯＶＩ−１染色をそれぞれＹ軸およびＸ軸に示す。これらのデータから、ＣＤ４＋コンパートメントおよびＣＤ８＋コンパートメントの両方が、ＴＲＢＣ１＋ｖｅである細胞およびＴＲＢＣ１−ｖｅである細胞を含有することが示される。これは、１ドナーからの代表的なデータである。 図７は、何名かの正常ドナーにおけるＴＲＢＣ１＋Ｔ細胞を示すグラフである。１０名の正常ドナーから採血し、上の図４に記載の通り末梢血単核細胞を染色した。ＣＤ４コンパートメントおよびＣＤ８コンパートメントの両方におけるＴＲＢＣ１ Ｔ細胞の割合の集計データが、中央値および範囲と共に棒グラフに示されている。全てのドナーがＴＲＢＣ１＋コンパートメントおよびＴＲＢＣ１−コンパートメントを有した。ＴＲＢＣ１＋細胞の％中央値＝３６％。 図８は、ＪＯＶＩ−１で染色されたＴ細胞悪性腫瘍由来細胞株を示すグラフである。いくつかの細胞株がＴ細胞悪性腫瘍から誘導されている。これらの細胞株の多くは、依然としてＴＣＲを発現する。ジャーカット（Ｔ細胞白血病細胞株）、ＨＰＢ−ＡＬＬ（別のＴ細胞白血病細胞株）およびＨＤ−Ｍａｒ−２（Ｔ細胞リンパ腫細胞株）を試験のために選択した。これらの細胞株を汎ＴＣＲ／ＣＤ３抗体で染色することにより、本発明者らは３種全てがＴＣＲを発現することを実証することができた（左側のパネル、アイソタイプ対照染色の上に重ねた染色）。次に、ＪＯＶＩ−１を用いた染色により、本発明者らはこれらのＴ細胞株がＴＲＢＣ１陰性またはＴＲＢＣ１陽性のいずれかであることを決定することができた。ジャーカット細胞（ＴＲＢＣ１＋）のみがＪＯＶＩ−１で染色され、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞またはＨＤ−Ｍａｒ−２（ＴＲＢＣ２＋）細胞はＪＯＶＩ−１で染色されず、これにより、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２が排他的に発現されることが裏付けられる。 図９は、ＪＯＶＩ−１ ｍＡｂを用いたＴＲＢＣ１ Ｔ細胞の選択的な死滅を示すグラフである。野生型ジャーカットＴ細胞（ＣＤ３４−、ＴＲＢＣ１＋）を、ＣＤ３４マーカー遺伝子（ＣＤ３４＋ＴＲＢＣ２＋）と共発現させたＴＲＢＣ２を用いて形質導入したＴＣＲαβノックアウトジャーカットＴ細胞と混合した。これらの細胞を、１時間にわたり、ＪＯＶＩ−１のみと一緒にインキュベートした、またはＪＯＶＩ−１および補体と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ３４、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤについて染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。アネキシン−Ｖ陰性かつ７１ＡＡＤ暗集団によって定義される生集団におけるＣＤ３４発現が下に示されている。（ａ）ＪＯＶＩ−１のみ；（ｂ）ＪＯＶＩ−１と補体。ＴＲＢＣ１ Ｔ細胞の選択的な死滅（ＣＤ３４−）が観察される。 図１０は、ポリクローナルエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞を２つのほぼ同等のＴＲＢＣ１／２集団に分割できることを示すグラフである。十分に確立された方法を使用して、発明者らは正常ドナーの末梢血からＥＢＶ特異的Ｔ細胞を選択的に増大させた。その後の株は、自己由来ＥＢＶ感染Ｂ細胞（自己ＬＣＬ）に対して高程度に選択的であり、同種異系ＥＢＶ感染Ｔ細胞（非自己ＬＣＬ）に対しては活性ではなく、また、非特異的ＮＫ活性もなかった（Ｋ５６２細胞に対して試験することによって測定した場合）。そのような株は、ドナーのＥＢＶ免疫を代表する。（ｂ）ＪＯＶＩ−１を用いて染色したところ、これらのＴ細胞は、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２にほぼ同等に分類された。 図１１は、ＪＯＶＩ−１ ＶＨおよびＶＬのアノテートされた配列を示す図である。超可変領域に下線を引き、太字で示した。 図１２は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫はＴＲＢＣ制限されるが、正常循環Ｔ細胞はＴＲＢＣ制限されないことを実証するグラフである。循環Ｔ細胞リンパ腫細胞を有する患者から末梢血Ｔ細胞を採取した。末梢単核細胞を単離し、ＣＤ５、ＴＣＲおよびＪＯＶＩ−１を含む抗体のパネルを用いて染色した。正常Ｔ細胞および悪性Ｔ細胞をフローにおいてＣＤ５発現強度によって弁別することができた。ＣＤ５明（正常Ｔ細胞）は、ほぼ同等のＴＲＢＣ１集団およびＴＲＢＣ２集団を有した。ＣＤ５中間集団およびＣＤ５暗集団（腫瘍）は全てＴＲＢＣ２陽性であった。この患者にＴＲＢＣ２を対象とする療法を行った場合、リンパ腫が根絶され、Ｔ細胞のおよそ半分が助かる。 図１３は、ＪＯＶＩ−１に由来するＶＨおよびＶＬが正しかったこと、およびそれらを単鎖可変断片としてフォールディングさせることができることを実証するグラフである。元のハイブリドーマの上清、組換えＪＯＶＩ−１抗体およびトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から生成したｓｃＦｖ−Ｆｃを使用して、いくつもの細胞株：ジャーカットＴＣＲノックアウト、野生型ジャーカット、ｅＢＦＰ２を共発現するベクターにおけるＴＲＢＣ１ ＴＣＲを用いて形質導入したジャーカットＴＣＲノックアウト；ｅＢＦＰ２を共発現するベクターにおけるＴＲＢＤ２ ＴＣＲを用いて形質導入したジャーカットＴＣＲノックアウトを染色した。染色をフローサイトメトリーによって分析した。組換え抗体およびｓｃＦｖのどちらもＴＲＢＣ２を発現する細胞に結合した。 図１４は、異なる構成のＪＯＶＩ−１に基づくＣＡＲを示す図である。ＣＡＲは、一般には、結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインで構成される。この試験では、ＪＯＶＩ−１ ｓｃＦｖ；ＣＤ８ストーク（ｓｔａｌｋ）、ＦｃＲ結合を除去する変異を有するヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのいずれかに由来するスペーサー；またはヒトＩｇＧ１に由来するスペーサーで構成されるＣＡＲを生成した。 図１５は、ＪＯＶＩ−１に基づくＣＡＲの機能を示すグラフである。正常ドナー末梢血Ｔ細胞に、上記の異なるＣＡＲを用いて形質導入した。また、対照としてＣＤ１９特異的ＣＡＲを用いてＴ細胞に形質導入した。次いで、これらのＴ細胞に、標的細胞：ジャーカット−ＴＣＲノックアウト細胞およびジャーカット野生型細胞およびラジ細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞リンパ腫株）を負荷した。異なる標的に対するエフェクターのクロム放出データが示されている。ＪＯＶＩ−１ ＣＡＲ Ｔ細胞によりジャーカットは死滅したが、ラジ細胞またはＴＣＲがノックアウトされたジャーカットは死滅しなかった。 図１６は、ＪＯＶＩ−１ ＣＡＲ Ｔ細胞培養物の自己パージ（ｓｅｌｆ−ｐｕｒｇｉｎｇ）を示すグラフである。Ｔ細胞は、ほぼ同じ数のＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞またはＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞のいずれかのＴ細胞で構成されるので、ＣＡＲの導入後に、培養物の「兄弟殺し」または自己パージが特定の量で起こる可能性がある。これが事実であることが実証された。本実施例では、形質導入後にＣＡＲ Ｔ細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。偽形質導入されたものと形質導入されたものとを比較することにより、Ｔ細胞集団がＴＲＢＣ１陽性Ｔ細胞を失うことを観測することができる。 図１７は、Ｔ細胞大顆粒白血病（Ｔ−ＬＧＬ）のクローン性の調査を示すグラフである−患者Ａ 図１８は、Ｔ細胞大顆粒白血病（Ｔ−ＬＧＬ）のクローン性の調査を示すグラフである−患者Ｂ 図１９は、Ｔ細胞大顆粒白血病（Ｔ−ＬＧＬ）のクローン性の調査を示すグラフである−患者Ｃ 図２０は、ポリクローナルＴ細胞リンパ腫（ＰＣＴＬ）のクローン性の調査を示すグラフである−患者Ｄ 図２１は、ＴＲＢＣペプチドファージ選択戦略を示す図である。Ａ）表面上に直接または間接的に固定化したＴＲＢＣペプチドに対する２ラウンドの固相ファージディスプレイ選択。Ｂ）ビオチン化ＴＲＢＣペプチドに対する３ラウンドの液相ファージディスプレイ選択。 図２２は、ＴＲＢＣペプチドファージディスプレイ選択からのポリクローナルファージアウトプットの分析を示すグラフである。ＢＳＡ／ＯＡコンジュゲートとして直接固定化したＴＲＢＣペプチドに対して行った固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ａ）、ストレプトアビジン／ニュートラアビジンに固定化したＴＲＢＣペプチドに対する固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｂ）および液相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｃ）。 図２２は、ＴＲＢＣペプチドファージディスプレイ選択からのポリクローナルファージアウトプットの分析を示すグラフである。ＢＳＡ／ＯＡコンジュゲートとして直接固定化したＴＲＢＣペプチドに対して行った固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ａ）、ストレプトアビジン／ニュートラアビジンに固定化したＴＲＢＣペプチドに対する固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｂ）および液相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｃ）。 図２２は、ＴＲＢＣペプチドファージディスプレイ選択からのポリクローナルファージアウトプットの分析を示すグラフである。ＢＳＡ／ＯＡコンジュゲートとして直接固定化したＴＲＢＣペプチドに対して行った固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ａ）、ストレプトアビジン／ニュートラアビジンに固定化したＴＲＢＣペプチドに対する固相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｂ）および液相選択からのポリクローナルファージを使用したＴＲＦ結合アッセイ（Ｃ）。 図２３は、ｐＳＡＮＧ１０−３Ｆベクターの略図である。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を、Ｔ７プロモーターおよびｐｅｌＢリーダー（ペリプラズム移行のため）の下流のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。当該ベクターは、精製およびトリ−ＦＬＡＧタグ検出のためにＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）も含有する。 図２４は、ＴＲＢＣ１特異的結合物質およびＴＲＢＣ２特異的結合物質についての一次スクリーニングを示すグラフである。ＴＲＢＣ１選択（Ａ）およびＴＲＢＣ２選択（Ｂ）からの９４種のｓｃＦｖの、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートに固定化したビオチン化ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２（０．５μｇ／ｍｌ）への結合。ユウロピウムとコンジュゲートした抗ＦＬＡＧ抗体を使用して固定化したペプチドへのｓｃＦｖ結合を検出した。 図２５は、ＴＲＢＣ１を用いて免疫したウサギ＃１３１７４由来のポリクローナル抗体血清の、ＴＲＢＣ１ペプチドおよびＴＲＢＣ２ペプチドに対する結合を示すグラフである。ＴＲＢＣ１特異的抗体の（Ａ）３回目の免疫後（Ｂ）３回目の免疫および精製後。 図２６は、ＴＲＢＣ２ペプチドを用いて免疫したウサギ＃１７３６３由来のポリクローナル抗体血清の、ＴＲＢＣ１ペプチドおよびＴＲＢＣ２ペプチドに対する結合を示すグラフである。ＴＲＢＣ２特異的抗体の（Ａ）３回目の免疫後（Ｂ）３回目の免疫および精製後。 図２７は、ＴＲＢＣ２ペプチドを用いて免疫したウサギ＃１７３６４由来のポリクローナル抗体血清のＴＲＢＣ１ペプチドおよびＴＲＢＣ２ペプチドに対する結合を示すグラフである。ＴＲＢＣ２特異的抗体の（Ａ）３回目の免疫後（Ｂ）３回目の免疫および精製後。

本発明者らは、対象における悪性Ｔ細胞を、顕著な割合の健康なＴ細胞に影響を及ぼすことなく枯渇させることを可能にする方法を考案した。具体的には、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置に使用するためのＴＲＢＣ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴＲＢＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発した。

したがって、第１の態様では、本発明は、ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）またはＴＲＢＣ２に選択的に結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明の第１の態様の第１の実施形態では、ＴＲＢＣ１に選択的に結合するＣＡＲが提供される。この実施形態では、ＣＡＲは、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を有する抗原結合ドメインを含んでよい：
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号７；
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号８；
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号９；
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号１０；
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号１１；および
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号１２。

ＣＡＲは、配列番号１で示される配列を有する可変重鎖（ＶＨ）および配列番号２で示される配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗原結合ドメインを含んでよい。

ＣＡＲは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む抗原結合ドメインを含んでよい。

ＣＡＲは、配列番号３３、３４および３５から選択されるアミノ酸配列を含んでよい。

ＣＡＲは、表１に列挙されているものからのＶＨ ＣＤＲ３および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含んでよい。
ＣＡＲは、
配列番号１３〜２２で示されるｓｃＦｖのうちの１つからの
（ｉ）重鎖ＣＤＲ３および／もしくは軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）可変重鎖（ＶＨ）および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）
を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

本発明の第１の態様の第２の実施形態では、ＴＲＢＣ２に選択的に結合するＣＡＲが提供される。

この実施形態に関連して、ＣＡＲは、表２に列挙されているものからのＶＨ ＣＤＲ３および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含んでよい。

ＣＡＲは、
配列番号２３〜３２で示されるｓｃＦｖのうちの１つからの
（ｉ）重鎖ＣＤＲ３および／もしくは軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）可変重鎖（ＶＨ）および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）
を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。

第３の態様では、本発明の第２の態様にしたがう核酸配列を含むベクターが提供される。

第４の態様では、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを含む細胞が提供される。細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞溶解性免疫細胞であってよい。

第５の態様では、本発明の第４の態様にしたがう細胞を作製するための方法であって、細胞に、本発明の第２の態様にしたがう核酸配列または本発明の第３の態様にしたがうベクターを形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法が提供される。

第６の態様では、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、悪性Ｔ細胞と、その悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇は引き起こすが、その悪性Ｔ細胞では発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇は引き起こさないように、ＴＣＲＢ１またはＴＣＲＢ２選択的ＣＡＲを含む細胞を対象に投与するステップを含む方法において使用するための、本発明の第４の態様にしたがう細胞が提供される。

方法は、対象由来の悪性Ｔ細胞のＴＣＲベータ定常領域（ＴＣＲＢ）を調査して、それがＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するステップも含んでよい。

対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、ＴＣＲＢ１またはＴＣＲＢ２選択的作用因子を対象に投与するステップを含み、当該作用因子により、悪性Ｔ細胞と、その悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇は引き起こされるが、その悪性Ｔ細胞では発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇は引き起こされない方法も提供される。

本発明のこの態様の第１の実施形態では、当該作用因子は、ＴＣＲＢ１選択的作用因子である。本発明のこの態様の第２の実施形態では、当該作用因子は、ＴＲＢＣ２選択的作用因子である。

方法は、投与ステップの前に、悪性Ｔ細胞のＴＣＲベータ定常領域（ＴＲＢＣ）を調査してＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するステップも含んでよい。

当該作用因子は、枯渇性モノクローナル抗体またはその断片であってよい。当該作用因子は、化学療法用実体を含んでよいコンジュゲート化抗体であってよい。

当該作用因子は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）であってよい。当該作用因子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞であってよい。ＣＡＲは、配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでよい。

当該作用因子は、ＪＯＶＩ−１抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）：
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号７；
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号８；
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号９；
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号１０；
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号１１；および
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号１２
を有する抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＳｃＦｖを含んでよい。当該作用因子は、医薬組成物として提供されてもよい。

Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択され得る。

本発明は、そのような方法に従ってＴ細胞リンパ腫または白血病の処置に使用するための作用因子も提供する。

本発明は、上で定義された通りの使用のための作用因子を含むキットも提供する。

本発明は、上記の方法に従ってＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための医薬の製造における作用因子の使用も提供する。

本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法であって、試料中のＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性である総Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法も提供する。

ＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が約８０％を超えることにより、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示すことができる。

試料は、末梢血試料または生検であり得る。

総Ｔ細胞に結合する作用因子はＣＤ３に結合し得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）またはＴＲＢＣ２に選択的に結合する抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
ＴＲＢＣ１に選択的に結合する、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記抗原結合ドメインが、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号７；
ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号８；
ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号９；
ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号１０；
ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号１１；および
ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号１２
を含む可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を有する、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記抗原結合ドメインが、配列番号１で示される配列を有する可変重鎖（ＶＨ）および配列番号２で示される配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記抗原結合ドメインが、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目６）
配列番号４、５および６から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２に記載のＣＡＲ
（項目７）
ＴＲＢＣ２に選択的に結合する、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記項目のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸配列。
（項目９）
項目８に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１０）
項目１〜７のいずれかに記載のＣＡＲを含む細胞。
（項目１１）
項目１０に記載のＴ細胞。
（項目１２）
項目１０または１１に記載の細胞を作製するための方法であって、細胞に、項目８に記載の核酸配列または項目９に記載のベクターを形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法。
（項目１３）
対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法における使用のための項目１０または１１に記載の細胞であって、前記方法は、
前記ＴＣＲＢ１またはＴＣＲＢ２選択的ＣＡＲを含む前記細胞を前記対象に投与して、悪性Ｔ細胞と、前記悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇を引き起こすが、前記悪性Ｔ細胞では発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇を引き起こさないステップを含む、
細胞。
（項目１４）
前記方法が、前記対象由来の悪性Ｔ細胞のＴＣＲベータ定常領域（ＴＣＲＢ）を調査して、それがＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するステップも含む、項目１３に記載の使用のための細胞。
（項目１５）
前記Ｔ細胞リンパ腫または白血病が、特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、項目１３または１４に記載の使用のための細胞。
（項目１６）
対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法であって、前記対象から単離された試料中の、ＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性である総Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法。
（項目１７）
約８０％を超えるＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示す、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記試料が末梢血試料または生検である、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
ＣＤ３に結合する作用因子を使用して前記試料中の総Ｔ細胞を同定するか、または前記試料から総Ｔ細胞を単離する、項目１６〜１８のいずれかに記載の方法。

本発明は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に選択的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの作用因子を提供する。そのような作用因子は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法において有用である。Ｔ細胞悪性腫瘍はクローン性であり、したがって、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する。ＴＣＲＢ１選択的作用因子またはＴＣＲＢ２選択的作用因子を対象に投与することによって、当該作用因子は、悪性Ｔ細胞と、その悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇は引き起こすが、その悪性Ｔ細胞では発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇は引き起こさない。

ＴＣＲβ定常領域（ＴＲＢＣ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球の表面上に発現され、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合すると、関連する酵素、補助受容体、特殊アダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じてＴリンパ球が活性化される。

ＴＣＲは、通常、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるジスルフィド連結した膜係留型ヘテロ二量体である。この受容体を発現するＴ細胞はα：β（またはαβ）Ｔ細胞と称される（総Ｔ細胞の約９５％）。少数のＴ細胞は、可変性のガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖によって形成される代替の受容体を発現し、これらはγδＴ細胞と称される（総Ｔ細胞の約５％）。

各α鎖およびβ鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域で構成され、これらはどちらも、逆平行β−シートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインである。定常領域は細胞膜に対して近位にあり、その後ろに膜貫通領域および短い細胞質尾部があり、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する（図１参照）。ＴＣＲの定常領域は、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それにより２つの鎖間に連結が形成される、短い接続配列からなる。

ＴＣＲ α鎖およびβ鎖の可変ドメインはどちらも３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。β鎖の可変領域は、追加的な領域の超可変性（ＨＶ４）も有するが、これは通常は抗原と接触せず、したがって、ＣＤＲとはみなされない。
ＴＣＲはまた、最大５つの不変鎖γ、δ、ε（集合的にＣＤ３と称される）およびζも含む。ＣＤ３およびζサブユニットは、αβまたはγδによる抗原の認識後に第２のメッセンジャーおよびアダプター分子と相互作用する特異的な細胞質ドメインを通じてＴＣＲシグナル伝達を媒介する。ＴＣＲ複合体の細胞表面発現の前に、サブユニットが対で集合し、そこではＴＣＲαおよびβならびにＣＤ３γおよびδの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの両方が役割を果たす。

したがって、ＴＣＲは、一般にＣＤ３複合体と、ＴＣＲα鎖およびβ鎖とで構成され可、それが今度は変領域および定常領域で構成される（図１）。

ＴＣＲ β定常領域（ＴＲＢＣ）を供給する遺伝子座（Ｃｈｒ７：ｑ３４）は、進化の歴史の中で複製されて、２つのほぼ同一であり機能的に同等な遺伝子：ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を生じ（図２）、これらは、各遺伝子から生じる成熟タンパク質内の４アミノ酸のみが異なる（図３）。各ＴＣＲは、相互排他的にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを含み、したがって、各αβＴ細胞は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを相互排他的に発現する。

本発明者らは、ＴＲＢＣ１の配列とＴＲＢＣ２の配列は類似しているにもかかわらず、それらを識別することが可能であることを決定した。本発明者らは、ＴＲＢＣ１のアミノ酸配列およびＴＲＢＣ２のアミノ酸配列を、細胞、例えばＴ細胞の表面上でｉｎ ｓｉｔｕで識別することができることも決定した。

悪性細胞
「悪性」という用語は、本明細書では、その標準の意味に従って使用され、その成長が自己限定されず、隣接組織内に侵入することができ、かつ、遠位組織に拡散することができる細胞を指す。そのように、「悪性Ｔ細胞」という用語は、本明細書では、リンパ腫または白血病の状況でクローン的に拡大したＴ細胞を指すために使用される。

本発明の方法は、悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣを決定することを伴う。これは、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。例えば、これは、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法によって決定することができる。

悪性Ｔ細胞によって発現されるＴＲＢＣが決定されたら、適切なＴＲＢＣ１選択的作用因子またはＴＲＢＣ２選択的作用因子を対象に投与する。「適切なＴＲＢＣ選択的作用因子」とは、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ１を発現することが決定された場合にはＴＲＢＣ１選択的作用因子を投与し、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ２を発現することが決定された場合にはＴＲＢＣ２選択的作用因子を投与することを意味する。

選択的作用因子
選択的作用因子は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに相互排他的に結合する。

上記の通り、各αβＴ細胞は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを含むＴＣＲを発現する。Ｔ細胞リンパ腫または白血病などのクローン性Ｔ細胞障害では、同じクローンに由来する悪性Ｔ細胞は全てＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する。

したがって、本方法は、ＴＲＢＣ１選択的作用因子またはＴＲＢＣ２選択的作用因子を対象に投与するステップを含み、当該作用因子により、悪性Ｔ細胞と、その悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇は引き起こされるが、その悪性Ｔ細胞とは他のＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の顕著な枯渇は引き起こされない。

ＴＲＢＣ選択的作用因子により、悪性Ｔ細胞とは他のＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の顕著な枯渇は引き起こされないので、Ｔ細胞コンパートメント全体の枯渇は引き起こされない。対象のＴ細胞コンパートメント（すなわち、悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現しないＴ細胞）の割合を保持することにより、毒性が低下し、細胞性免疫不全および体液性免疫不全が低下し、それにより、感染のリスクが低下する。

本発明の方法に従ってＴＲＢＣ１選択的作用因子を投与することにより、ＴＲＢＣ１を発現するＴ細胞の５％、１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％の枯渇、すなわち、数の減少をもたらすことができる。

本発明の方法に従ってＴＲＢＣ２選択的作用因子を投与することにより、ＴＲＢＣ２を発現するＴ細胞の５％、１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％の枯渇、すなわち、数の減少をもたらすことができる。

ＴＲＢＣ１選択的作用因子は、ＴＲＢＣ２よりも少なくとも２倍、４倍、５倍、７倍または１０倍高い親和性でＴＲＢＣ１に結合し得る。同様に、ＴＲＢＣ２選択的作用因子は、ＴＲＢＣ１よりも少なくとも２倍、４倍、５倍、７倍または１０倍高い親和性でＴＲＢＣ２に結合し得る。

ＴＲＢＣ１選択的作用因子により、細胞集団においてＴＲＢＣ２発現細胞よりも大きな割合のＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞の枯渇が引き起こされる。例えば、ＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞の枯渇とＴＲＢＣ２発現細胞の枯渇との比率は、少なくとも６０％：４０％、７０％：３０％、８０％：２０％、９０％：１０％または９５％：５％である。同様に、ＴＲＢＣ２選択的作用因子により、細胞集団においてＴＲＢＣ２発現細胞よりも大きな割合のＴＲＢＣ１発現Ｔ細胞の枯渇が引き起こされる。例えば、ＴＲＢＣ２発現Ｔ細胞の枯渇とＴＲＢＣ１発現細胞の枯渇との比率は、少なくとも６０％：４０％、７０％：３０％、８０％：２０％、９０％：１０％または９５％：５％である。

本発明の方法を使用すると、対象において、顕著な割合の健康なＴ細胞に影響を及ぼすことなく悪性Ｔ細胞が欠失する。「顕著な割合」とは、対象におけるＴ細胞機能を維持するために、悪性Ｔ細胞とは異なるＴＲＢＣを発現するＴ細胞が十分な割合で生存することを意味する。作用因子により、他のＴＣＲＢを発現するＴ細胞集団の２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満の枯渇が引き起こされ得る。

選択的作用因子は、以下に列挙する残基を識別するので、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに対して選択的であり得る：
（ｉ）ＴＲＢＣの３位におけるＮをＫから識別；
（ｉｉ）ＴＲＢＣの３位におけるＫをＮから識別；
（ｉｉｉ）ＴＲＢＣの４位におけるＫをＮから識別；
（ｉｖ）ＴＲＢＣの４位におけるＮをＫから識別；
（ｖ）ＴＲＢＣの３６位におけるＦをＹから識別；
（ｖｉ）ＴＲＢＣの３６位におけるＹをＦから識別；
（ｖｉｉ）ＴＲＢＣの１３５位におけるＶをＥから識別；および／または
（ｖｉｉｉ）ＴＲＢＣの１３５位におけるＥをＶから識別。

選択的作用因子は、上記の差異の任意の組合せを識別することができる。

抗体
本発明の方法で使用する作用因子は、枯渇性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）もしくはその機能性断片、または抗体模倣物であってよい。

「枯渇性抗体」という用語は、従来の意味で使用され、標的Ｔ細胞上に存在する抗原に結合し、標的Ｔ細胞の死滅を媒介する抗体に関する。したがって、枯渇性抗体を対象に投与することにより、対象内の標的抗原を発現する細胞の数の低下／減少がもたらされる。

本明細書で使用される場合、「抗体」とは、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、ドメイン抗体（ｄＡｂ）のものと同等の抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み、古典的な抗体分子のものと同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りは、抗原結合部位のための適切な足場をもたらし、抗原との結合のために適した様式でこれをディスプレイする任意の配列であってよい。抗体は、免疫グロブリン分子全体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはナノボディなど、それらの一部であってよい。抗体は、二機能性抗体であってよい。抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であってよい。

したがって、抗体は、完全な抗体の抗原特異性を保持する任意の機能性断片であってよい。

ＴＲＢＣ１選択的抗体
本発明の方法で使用するための作用因子は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＶＨ ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＧＹ（配列番号７）；
ＶＨ ＣＤＲ２：ＮＰＹＮＤＤ（配列番号８）；
ＶＨ ＣＤＲ３：ＧＡＧＹＮＦＤＧＡＹＲＦＦＤＦ（配列番号９）；
ＶＬ ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＲＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１０）；
ＶＬ ＣＤＲ２：ＲＶＳＮＲＦＰ（配列番号１１）；および
ＶＬ ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号１２）
のうちの１つまたは複数を含む可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を有する抗体またはその機能性断片を含んでよい。

１つまたは複数のＣＤＲは、各々独立に、得られる抗体がＴＲＢＣ１に選択的に結合する能力を保持するのであれば、配列番号７〜１２で示される配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでもよく含まなくてもよい。

試験により、ＣＤＲ Ｌ３およびＨ３が抗原との高エネルギー相互作用に広く関与することが示されており、したがって、抗体またはその機能性断片は、上に概説されている通りＶＨ ＣＤＲ３および／またはＶＬ ＣＤＲ３を含んでよい。

実施例１２に記載の通り、ファージディスプレイを使用して、ＴＲＢＣ２よりもＴＲＢＣ１に対して高度に選択的ないくつかの追加的な抗体結合ドメインが同定されている。

当該作用因子は、表１に示されている相補性決定領域（ＣＤＲ３）のうちの１つまたは複数を含む可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子がドメイン抗体である場合、３つのＣＤＲ、すなわち、ＶＨ ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３またはＶＬ ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のいずれかを含んでよい。

当該作用因子は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＳｃＦｖを含んでよい。

あるいは、当該作用因子は、
配列番号１３〜２２で示されるｓｃＦｖのうちの１つからの
（ｉ）重鎖ＣＤＲ３および／もしくは軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）可変重鎖（ＶＨ）および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）；
を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

配列番号１３〜２２で示される配列では、配列のＶＨ部分およびＶＬ部分が太字で示されており、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列に下線が引かれている。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３配列は表１に示されている。

ＴＲＢＣ２特異的
実施例１２に記載の通り、ファージディスプレイを使用して、ＴＲＢＣ１よりもＴＲＢＣ２との結合に対して高度に選択的ないくつかの抗体結合ドメインが同定されている。

当該作用因子は、表２に示されている相補性決定領域（ＣＤＲ３）のうちの１つまたは複数を含む可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）を有する抗体またはその機能性断片を含んでよい。

当該作用因子は、
配列番号２３〜３２で示されるｓｃＦｖのうちの１つからの
（ｉ）重鎖ＣＤＲ３および／もしくは軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに／もしくは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）可変重鎖（ＶＨ）および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）；
を含む抗体またはその機能性断片を含んでよい。

配列番号２３〜３２で示される配列では、配列のＶＨ部分およびＶＬ部分が太字で示されており、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列に下線が引かれている。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３配列は表２に示されている。

上記のアミノ酸配列のバリアントも、得られる抗体がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に結合し、顕著に交差反応しないのであれば、本発明において使用することができる。一般には、そのようなバリアントは、上記の配列のうちの１つと高程度の配列同一性を有する。

比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含めたいくつかの供給源から、およびインターネット上で利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性をどのように決定するかについての記載は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。

ＶＬドメインまたはＶＨドメインまたはｓｃＦｖのバリアントは、一般には、配列番号１〜３、１３〜３２で示される配列に対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

一般には、バリアントは、元のアミノ酸配列または核酸配列と比較して１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有し得る。保存的置換とは、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に結合する抗体の親和性に実質的に影響を及ぼさないまたはそれを低下させない置換である。例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に特異的に結合するヒト抗体は、配列番号１〜３または１３〜３２で示される配列のいずれかと比較して、ＶＨまたはＶＬのいずれかまたはその両方の最大１個、最大２個、最大５個、最大１０個、または最大１５個の保存的置換を含んでよく、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に対する特異的な結合を保持する。

保存的置換によって交換することができる機能的に類似したアミノ酸は当業者には周知である。以下の６群は、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

抗体の調製
抗体の調製は、標準の実験室技法を使用して実施することができる。抗体は、動物血清から得ることができ、あるいはモノクローナル抗体またはその断片の場合には、細胞培養物中で産生することができる。細菌または哺乳動物細胞培養物において、確立された手順に従って抗体を産生するために組換えＤＮＡ技術を使用することができる。

モノクローナル抗体を産生するための方法は当技術分野で周知である。簡単に述べると、モノクローナル抗体は、一般には、骨髄腫細胞を、所望の抗原を用いて免疫したマウスまたはウサギ由来の脾臓細胞と融合させることによって作製される。本明細書では、所望の抗原はＴＲＢＣ１ペプチドもしくはＴＲＢＣ２ペプチド、またはＴＲＢＣ１もしくはＴＲＢＣ２のいずれかを含むＴＣＲβ鎖である。

あるいは、抗体および関連する分子、特にｓｃＦｖは、ＶＨ鎖のライブラリーとＶＬ鎖のライブラリーを組換え様式で組み合わせることによって免疫系の外で作製することができる。そのようなライブラリーは、実施例１２に記載の通り、ファージディスプレイ技術を使用して構築し、スクリーニングすることができる。

ＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２選択的抗体の同定
ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに対して選択的な抗体は、当技術分野における標準の方法を使用して同定することができる。抗体の結合特異性を決定するための方法としては、これだけに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ファージディスプレイライブラリー、酵母ツーハイブリッド法、免疫共沈降、二分子蛍光補完法およびタンデムアフィニティー精製が挙げられる。

ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに対して選択的な抗体を同定するために、抗体のＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の各々に対する結合を評価した。一般には、これは、抗体の各ＴＲＢＣに対する結合を別々に決定することによって評価する。選択的な抗体は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに、他のＴＲＢＣに顕著に結合することなく結合する。

抗体模倣物
あるいは、作用因子は、免疫グロブリンに由来するものではないまたは免疫グロブリンに基づくものではない分子であってよい。非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するためにいくつもの「抗体模倣」設計反復タンパク質（ＤＲＰ）が開発されてきた。

アンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質などの反復タンパク質は、抗体とは異なり細胞内および細胞外に存在する遍在的な結合分子である。それらの独特のモジュラーアーキテクチャにより反復構造単位（反復）が特徴付けられ、それらが共に積み重なって可変性のモジュラー標的結合表面を提示する伸長した反復ドメインが形成される。このモジュール性に基づいて、高度に多様化した結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質）はこの技術に基づく抗体模倣物の１つの例である。

アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）に関しては、結合特異性は、タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来し、それは、化学的に感受性が高いまたは不溶性の化合物の生理的輸送および貯蔵に関連するｉｎ ｖｉｖｏにおけるある範囲の機能を果たす。リポカリンは、タンパク質の一末端において４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含むロバストな内因性構造を有する。結合ポケットへの入口のためのこれらのループおよび分子のこの部分におけるコンフォメーションの差異が、異なるリポカリン間で結合特異性が変動する原因になっている。

アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーからｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイにより進化させ、結合特性および阻害特性を有する複数ドメインタンパク質を生成したものである。

バーサボディ（ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）は、大多数のタンパク質に存在する疎水性コアを置き換えて、ジスルフィド密度の高い足場を形成するシステインを１５％超有する３〜５ｋＤａの小さなタンパク質である。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸を少数のジスルフィドで置き換えることにより、より小さく、より親水性であり、プロテアーゼおよび熱に対する抵抗性がより高く、Ｔ細胞エピトープの密度がより低いタンパク質がもたらされる。これら４つの性質の全てが、免疫原性が相当に低下したタンパク質をもたらす。それらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて製造することもでき、高度に可溶性かつ安定である。

コンジュゲート
抗体または模倣物は、抗体または模倣物と、別の作用因子または抗体とのコンジュゲートであってよく、例えば、コンジュゲートは、検出可能な実体または化学療法用実体であってよい。

検出可能な実体は、蛍光部分、例えば、蛍光ペプチドであってよい。「蛍光ペプチド」とは、励起後に検出可能な波長で光を放出するポリペプチドを指す。蛍光タンパク質の例としては、これだけに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙが挙げられる。

検出可能な実体とコンジュゲートした選択的ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２作用因子を使用して、悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣを決定することができる。

化学療法用実体とは、本明細書で使用される場合、細胞に対して破壊的である実体を指す、つまり、実体により細胞の生存能力が低下する。化学療法用実体は、細胞傷害性薬物であってよい。企図される化学療法剤としては、これだけに限定することなく、アルキル化剤、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｏｔｏｘｉｎ）、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；ＩＦＮα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの生物学的反応修飾物質；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレアなどの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含めたメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬；プレドニゾンおよび等価物などの副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含めたホルモンおよびアンタゴニスト、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミド；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含めたアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドなどの抗アントロゲン薬；ならびにフルタミドなどの非ステロイド性抗アントロゲン薬が挙げられる。

化学療法用実体とコンジュゲートしたＴＲＢＣ選択的作用因子により、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する細胞に化学療法用実体を標的化送達することが可能になる。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
抗体様結合ドメインを２つ有するという基本概念に基づく多種多様な分子が開発されてきた。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、主に抗がん薬として使用するために開発されてきた二重特異性抗体型分子のクラスである。これらは、宿主の免疫系、より具体的には、Ｔ細胞の細胞傷害活性をがん細胞などの標的細胞に対して方向付ける。これらの分子では、一方の結合ドメインがＴ細胞にＣＤ３受容体を介して結合し、他方が腫瘍細胞などの標的細胞（腫瘍特異的分子を介して）に結合する。二重特異性分子は標的細胞およびＴ細胞の両方に結合するので、それにより標的細胞がＴ細胞と近づき、そうすることで、Ｔ細胞がその効果、例えば、がん細胞に対する細胞傷害効果を発揮することが可能になる。Ｔ細胞：二重特異性Ａｂ：がん細胞複合体の形成により、Ｔ細胞におけるシグナル伝達が誘導され、それにより、例えば、細胞傷害性メディエーターの放出が導かれる。当該作用因子により標的細胞の存在下で所望のシグナル伝達のみが誘導され、選択的な死滅が導かれることが理想的である。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子はいくつもの異なる構成で開発されてきたが、最も一般的なもののうちの１つは、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合物である。これらは、時には、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）として公知である。

本発明の方法で使用する作用因子は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を選択的に認識し、Ｔ細胞を活性化することができる二重特異性分子であってよい。例えば、作用因子は、ＢｉＴＥであってよい。方法において使用する作用因子は、
（ｉ）ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに結合する第１のドメイン；および
（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化することができる第２のドメイン
を含んでよい。

二重特異性分子は、その産生を補助するためにシグナルペプチドを含んでよい。シグナルペプチドにより、二重特異性分子を宿主細胞から分泌させることができ、そうすることで、二重特異性分子を宿主細胞上清から回収することができる。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってよい。二重特異性分子は、一般式：シグナルペプチド−第１のドメイン−第２のドメインを有してよい。

二重特異性分子は、第１のドメインを第２のドメインと接続し、２つのドメインを空間的に分離するためのスペーサー配列を含んでよい。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含んでよい。あるいは、リンカーは、長さおよび／またはドメイン間隔の性質がＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様である代替リンカー配列を含んでよい。

二重特異性分子は、上で定義されたＪＯＶＩ−１またはその機能性断片を含んでよい。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体およびキメラ免疫受容体としても公知であり、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植する、工学的に作製された受容体である。古典的ＣＡＲでは、モノクローナル抗体の特異性がＴ細胞に移植されている。ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入することができる。この方法では、養子細胞移入のための多数のがん特異的Ｔ細胞を生成することができる。この手法の第Ｉ相臨床試験では有効性が示されている。

ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般に、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介して細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むまたはそれと会合するエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）と融合させる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、それを発現するＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。

本発明の方法で使用する作用因子は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を選択的に認識するＣＡＲであってよい。作用因子は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に選択的に認識するＣＡＲを発現するＴ細胞であってよい。

ＣＡＲは、膜にまたがる膜貫通ドメインも含んでよい。ＣＡＲは、疎水性アルファヘリックスを含んでよい。膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性をもたらす、ＣＤ２８に由来するものであってよい。

エンドドメインは、シグナル伝達に関与するＣＡＲの部分である。エンドドメインは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれと会合する。抗原認識後、受容体が密集し、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるＴ細胞シグナル伝達成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３−ゼータのものである。これにより、抗原が結合した後、活性化シグナルがＴ細胞に伝達される。ＣＤ３−ゼータからは完全にコンピテントな活性化シグナルはもたらされず、追加的な共刺激シグナルが必要な場合がある。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するためにキメラＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ゼータと一緒に使用することができる、または３つ全てを一緒に使用することができる。

ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含んでよい。

ＣＡＲは、シグナルペプチドを含んでよく、そうすることで、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の内部で発現すると、新生タンパク質が小胞体、その後、それが発現されている細胞表面に方向付けられる。

ＣＡＲは、ＴＲＢＣ結合ドメインを膜貫通ドメインに接続し、ＴＲＢＣ結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためにスペーサー配列を含んでよい。柔軟なスペーサーにより、ＴＲＢＣ結性ドメインを異なる方向に向かせてＴＲＢＣとの結合を可能とすることが可能になる。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはこれらの組合せを含んでよい。あるいは、リンカーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと長さおよび／またはドメイン間隔の性質が同様である代替リンカー配列を含んでよい。

ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークに基づくスペーサーを含むＣＡＲにより、ジャーカット細胞に対する最良の性能が示される（図１５）ことが見いだされた。したがって、スペーサーはＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含んでもよく、これはＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと長さおよび／またはドメイン間隔の性質が同様であってもよい。

ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフが除去されるように変更することができる。

ＣＡＲは、上で定義されたＪＯＶＩ−１抗体またはその機能性断片を含んでよい。

ＣＡＲは、配列番号３３、３４および３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでよい。

上記のＣＡＲ配列では、６つのＣＤＲのうちの１つまたは複数は、各々独立に、得られるＣＡＲがＴＲＢＣ１に結合する能力を保持するのであれば、配列番号７〜１２で示される配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば置換）を含んでもよく、含まなくてもよい。

上記のアミノ酸配列のバリアントも、得られるＣＡＲがＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２に結合し、顕著に交差反応しないのであれば、本発明において使用することができる。一般には、そのようなバリアントは、配列番号３３、３４または３５で示される配列のうちの１つに対して高程度の配列同一性を有する。

ＣＡＲのバリアントは、一般には、配列番号３３、３４および３５で示される配列のうちの１つに対して少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

核酸
本発明は、ＢｉＴＥまたは本発明の第１の態様のＣＡＲなどの作用因子をコードする核酸をさらに提供する。

核酸配列は、配列番号３３、３４および３５で示されるアミノ酸配列のうちの１つを含むＣＡＲをコードし得る。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であるものとする。

遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードする可能性があることが当業者には理解される。さらに、当業者は、ポリペプチドを発現する任意の特定の宿主生物体のコドン使用を反映するために、常套的な技法を使用して本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることが理解されるべきである。

本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。それは、合成または修飾されたヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつもの異なる型の修飾が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端へのアクリジン鎖またはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書に記載の通り使用するために、当技術分野において利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを修飾できることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性または寿命を増強するために行うことができる。

ヌクレオチド配列と関連した「バリアント」、「相同体」または「誘導体」という用語は、配列からまたは配列への１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変動、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。

ベクター
本発明は、本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むベクター、またはベクターのキットも提供する。そのようなベクターを使用して核酸配列を宿主細胞に導入し、そうすることで宿主細胞に本発明の第１の態様に記載のＣＡＲを発現させることができる。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであってよい。

ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができるものであってよい。

細胞
本発明は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを含む免疫細胞などの細胞にも関する。

細胞は、本発明の核酸またはベクターを含んでよい。

細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってよい。

Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種であるＴ細胞またはＴリンパ球であってよい。これらは、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することにより、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。下に要約されている通り、種々の型のＴ細胞が存在する。

ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟化、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含めた免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる型の免疫応答を促進するような異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含めたいくつかの亜型のうちの１つに分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関係づけられる。ＣＴＬは、表面上にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに付随する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞から分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞を不活性化してアネルギーの状態にすることができ、それにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。

メモリーＴ細胞は、感染が消散した後、長期間存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。これらは、同族抗原に再曝露されると直ちに増大して多数のエフェクターＴ細胞になり、そうすることで、過去の感染に対する「メモリー」による免疫系をもたらす。メモリーＴ細胞は、３つの亜型：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクターメモリーＴ細胞の２つの型（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、一般には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として公知であり、免疫寛容を維持するために極めて重要である。それらの主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫をシャットダウンして免疫反応の終わりに向かわせること、および胸腺における負の選択のプロセスを免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

２種の主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋）との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と称される細胞内分子が存在することにより、他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異により、調節性Ｔ細胞の発生が妨げられ、それにより、致死的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされる可能性がある。

適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じる可能性がある。

細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であってよい。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞により、ウイルス感染細胞からの生得的なシグナルに対する迅速な応答がＭＨＣ非依存的にもたらされる。

ＮＫ細胞（生得的なリンパ系細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆細胞から分化する第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、次いでそこから循環中に入ることが公知である。

本発明のＣＡＲ細胞は、上記の細胞型のいずれであってもよい。

本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（第一者）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況で（第二者）、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）のいずれかからｅｘ ｖｉｖｏで創出することができる。

あるいは、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏにおける分化から誘導されてもよい。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬としての機能を果たし得る不死化Ｔ細胞株を使用することができる。

これらの実施形態の全てにおいて、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含めた多くの手段のうちの１つによってＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。

本発明のＣＡＲ細胞は、対象に由来するｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来するものであってよい。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲをコードする核酸を用いて形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて処理することによって活性化および／または増大させることができる。

本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、
（ｉ）対象または上に列挙されている他の供給源由来のＴ細胞またはＮＫ細胞を含有する試料の単離；および
（ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞へに本発明のＣＡＲをコードする核酸配列の形質導入またはトランスフェクト
によって作製することができる。

次いで、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、精製、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択することができる。

本発明は、本発明の第１の態様にしたがうＣＡＲを含むＴ細胞またはＮＫ細胞を含むキットも提供する。

医薬組成物
本発明は、本発明の第１の態様のＣＡＲを発現する複数の細胞を含有する医薬組成物にも関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい。医薬組成物は、任意選択で、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であってよい。

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための作用因子、細胞および方法に関する。

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、作用因子の処置的使用に関する。本明細書では、疾患に伴う少なくとも１つの症状を和らげる、軽減または改善するため、および／または疾患の進行を遅らせる、軽減または遮断するために、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の現存する疾患を有する対象に作用因子を投与することができる。

本発明の方法は、β定常領域を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のクローン性増大に関連する任意のリンパ腫および／または白血病を処置するために使用することができる。そのように、本発明は、ＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞を伴う疾患を処置する方法に関する。

本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現するＴ細胞リンパ腫を処置するために使用することができる。「リンパ腫」とは、本明細書では、その標準の意味に従って使用され、一般には、リンパ節において発生するが、脾臓、骨髄、血液および他の器官にも影響を及ぼす可能性があるがんを指す。リンパ腫は、一般には、リンパ系細胞の固形腫瘍として存在する。リンパ腫に関連する一次性症状はリンパ節腫脹であるが、二次性（Ｂ）症状として、発熱、寝汗、体重減少、食欲の喪失、疲労、呼吸窮迫およびそう痒を挙げることができる。

本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現するＴ細胞白血病を処置するために使用することができる。「白血病」とは、本明細書では、その標準の意味に従って使用され、血液または骨髄のがんを指す。

以下は、本発明の方法によって処置することができる疾患の例示的な、包括的ではない一覧である。

末梢性Ｔ細胞リンパ腫
末梢性Ｔ細胞リンパ腫は、比較的稀なリンパ腫であり、全ての非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１０％未満を占める。しかし、それらは侵攻性の臨床経過を伴い、大多数のＴ細胞リンパ腫の原因および正確な細胞起源は未だ十分に定義されていない。

リンパ腫は、通常、まず頸部、脇の下または鼠径部の腫脹として現れる。例えば脾臓内など、他のリンパ節が位置する場所に追加的な腫脹が生じる可能性がある。一般に、腫大したリンパ節は、血管、神経、または胃の空間を侵害し、それぞれ腕および脚の膨張、刺痛およびしびれ、または満腹感が生じる可能性がある。リンパ腫の症状としては、発熱、悪寒、不明の体重減少、寝汗、嗜眠、およびそう痒などの非特異的な症状も挙げられる。

ＷＨＯ分類では、末梢性Ｔ細胞リンパ腫に関して予後および治療に意味のあるカテゴリー化を詳細に説明するために、形態的特徴および免疫表現型特徴と、臨床的態様およびいくつかの症例では遺伝学を併せて利用する（Ｓｗｅｒｄｌｏｗら；ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． 第４版；Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００８年）。腫瘍性Ｔ細胞の解剖学的局在化は、一部において、それらの提唱された正常細胞対応物および機能と並行し、そのため、Ｔ細胞リンパ腫はリンパ節および末梢血に関連する。この手法により、細胞分布、形態のいくつかの態様、さらには関連する臨床所見を含めた、Ｔ細胞リンパ腫の顕在化のいくつかをよりよく理解することが可能になる。

最も一般的なＴ細胞リンパ腫は、特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）であり、これが全体の２５％を占め、その次に血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）（１８．５％）が続く。

特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）
ＰＴＣＬ−ＮＯＳは、全ての末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の２５％超を占め、最も一般的な亜型である。これは、除外診断によって決定され、現行のＷＨＯ ２００８に列挙されている特定の成熟Ｔ細胞リンパ腫実体のいずれにも対応しない。そのため、これは、特定不能びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ−ＮＯＳ）と類似している。

大多数の患者は成人であり、年齢の中央値は６０歳であり、男女比は２：１である。大多数の症例は結節起源であるが、患者のおよそ１３％で結節外症状が生じ、最も一般的には皮膚および胃腸管が関与する。

細胞学的スペクトルは非常に広範であり、多形から単一形までにわたる。リンパ類上皮（レンネルト）バリアント、Ｔゾーンバリアントおよび濾胞バリアントを含めた、３つの形態学的に定義されたバリアントが記載されている。ＰＴＣＬのリンパ類上皮バリアントは、豊富なバックグラウンド類上皮細胞組織球を含有し、一般にＣＤ８について陽性である。それは、より良い予後と関連付けられている。ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、潜在的に別個の臨床病理学的実体として出現し始めている。

大多数のＰＴＣＬ−ＮＯＳは成熟Ｔ細胞表現型を有し、大多数の症例はＣＤ４陽性である。症例の７５％で少なくとも１つの汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５またはＣＤ７）の可変性の喪失が示され、ＣＤ７およびＣＤ５は、最もしばしば下方制御される。ＣＤ３０および稀にＣＤ１５が発現する場合があり、ＣＤ１５は有害な予後の特徴である。ＣＤ５６発現も、稀であるが、負の予後の影響を有する。追加的な有害な病理的予後因子としては、ＫＩ−６７発現に基づいて増殖率が２５％を超えること、および形質転換された細胞が７０％超存在することが挙げられる。これらのリンパ腫の免疫表現分析からもたらされるそれらの生物学への洞察はわずかである。

血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）
ＡＩＴＬは、リンパ節が関与する多形浸潤、顕著な高内皮細静脈（ＨＥＶ）および濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）網目構造の血管周囲増大を特徴とする全身性疾患である。ＡＩＴＬは、通常は胚中心において見いだされる、濾胞ヘルパー型のαβＴ細胞（ＴＦＨ）に由来するデノボのＴ細胞リンパ腫と考えられる。

ＡＩＴＬは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の中で２番目に一般的な実体であり、症例の約１８．５％を占める。それは、中年〜高齢の成人において生じ、年齢の中央値は６５歳であり、発生率は男性と女性でほぼ同等である。臨床的に、患者は、通常、全身リンパ節腫脹、肝脾腫および顕著な体質性症状を伴う進行期疾患を有する。そう痒を伴う皮疹が一般に存在する。多くの場合、自己免疫性現象に関連したポリクローナル高ガンマグロブリン血症が存在する。

ＡＩＴＬでは３つの異なる形態的パターンが記載されている。ＡＩＴＬの初期病変（パターンＩ）では、通常、特徴的な過形成性卵胞を伴う保存されたアーキテクチャが示される。腫瘍性増殖が卵胞の末梢に局在している。パターンＩＩでは、結節のアーキテクチャが部分的に消滅し、わずかに退行した卵胞が保持される。被膜下洞は保存され、さらには拡大する。傍皮質は分枝ＨＥＶを含有し、Ｂ細胞卵胞を超えてＦＤＣが増殖する。新生物細胞は小〜中サイズであり、細胞学的な非定型性は最小である。それは、多くの場合、澄明〜ぼんやりした細胞質を有し、はっきりした細胞膜を示し得る。通常は多形炎症性バックグラウンドが明らかである。

ＡＩＴＬはＴ細胞悪性腫瘍であるが、Ｂ細胞および形質細胞が特徴的に増大し、これは、新生物細胞のＴＦＨ細胞としての機能を反映すると思われる。ＥＢＶ陽性Ｂ細胞およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞が両方存在する。場合によって、非定型Ｂ細胞はホジキン／リード・シュテルンベルク様細胞と形態学的におよび免疫表現型的に類似するときがあり、時には、その実体との診断的錯乱が生じる。ＡＩＴＬにおけるＢ細胞増殖は広範囲にわたる可能性があり、一部の患者では二次性ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）またはより稀にＥＢＶ陰性Ｂ細胞腫瘍が発生し、多くの場合、形質細胞性分化を伴う。

ＡＩＴＬの腫瘍性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ１０およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）の強力な発現を示し、そして、ＣＸＣＬ１３について陽性である。ＣＸＣＬ１３により、ＨＥＶへの接着を介したリンパ節へのＢ細胞動員の増加、Ｂ細胞活性化、形質細胞性分化およびＦＤＣ網目構造の増大が導かれ、これらは全て、ＡＩＴＬの形態的特徴および臨床的特徴に寄与する。濾胞周囲の腫瘍細胞における強いＰＤ−１発現が、ＡＩＴＬパターンＩと反応性濾胞および傍皮質過形成との区別に特に役立つ。

ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、ＴＦＨ表現型を有する別の実体である。ＡＩＴＬと対比して、それは、顕著なＨＥＶまたはＦＤＣ網目構造の濾胞外増大を有しない。新生物細胞が、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫を模倣する濾胞内凝集体を形成する可能性があるが、濾胞間の成長パターンを有するまたは外套帯の増大を伴う可能性もある。臨床的に、ＰＴＣＬ−ＮＯＳの濾胞バリアントは、患者が部分的なリンパ節の関与を伴う初期疾患を示す頻度がより多く、そしてＡＩＴＬに関連する体質性症状がない場合があるので、ＡＩＴＬとは別個のものである。

未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）
ＡＬＣＬは、ＡＬＣＬ−「未分化リンパ腫キナーゼ」（ＡＬＫ）＋またはＡＬＣＬ−ＡＬＫ−に細分され得る。

ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の中で最もよく定義された実体の１つであり、蹄鉄形の核を有し、ＡＬＫおよびＣＤ３０を発現する特徴的な「特質細胞」を有する。それは、全ての末梢性Ｔ細胞およびＮＫ−細胞リンパ腫の約７％を占め、人生の最初の３０年で最も一般的なものである。患者は、多くの場合リンパ節腫脹を示すが、結節外の部位（皮膚、骨、軟部組織、肺、肝臓）への関与およびＢ症状が一般的である。

ＡＬＣＬ、ＡＬＫ＋は広い形態スペクトルを示し、５つの異なるパターンが記載されているが、全てのバリアントが何らかの特質細胞を含有する。特質細胞は偏心性の蹄鉄形または腎臓形の核、および顕著な核周囲の好酸性ゴルジ領域を有する。腫瘍細胞は、洞関与に偏好した粘着性パターンで成長する。小細胞バリアントではより小さな腫瘍細胞が優性であり、リンパ組織球性バリアントでは、豊富な組織球により腫瘍細胞の存在が遮蔽され、その多くが小さなものである。

定義によれば、全症例でＡＬＫおよびＣＤ３０陽性が示され、発現は、通常はより小さな腫瘍細胞においてより弱い。多くの場合、汎Ｔ細胞マーカーが欠如し、症例の７５％でＣＤ３の表面発現が欠如している。

ＡＬＫ発現は、キメラタンパク質の発現をもたらす、第２染色体ｐ２３上のＡＬＫ遺伝子の、多くのパートナー遺伝子のうちの１つへの再構成からなる特徴的な再発性遺伝子変更の結果である。症例の７５％において生じる最も一般的なパートナー遺伝子は、第５染色体ｑ３５上のヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）であり、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）をもたらす。異なる転座バリアントにおけるＡＬＫの細胞分布は、パートナー遺伝子に応じて変動し得る。

ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−は、２００８ ＷＨＯ分類に暫定的なカテゴリーとして含まれる。それは、粘着性成長パターンおよび特質細胞の存在を伴い、形態学的にはＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋と区別できないが、ＡＬＫタンパク質の発現を欠くＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ腫と定義される。

患者は、通常、４０歳から６５歳の間の成人であり、これは、小児および若年成人においてより一般的であるＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とは対照的である。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−では、リンパ節および結節外組織のどちらも関与する可能性があるが、後者はＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋において見られるよりも一般的でない。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−の大多数の症例で、典型的な「特質」特徴を有する粘着性新生物細胞のシートによるリンパ節アーキテクチャの消滅が実証される。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とは対照的に、小細胞形態バリアントは認識されていない。

ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−では、そのＡＬＫ＋対応物とは異なり、表面Ｔ細胞マーカー発現のより大きな保存が示されるが、細胞傷害性マーカーおよび上皮膜抗原（ＥＭＡ）の発現は可能性がより低い。遺伝子発現シグネチャおよび再発性染色体不均衡はＡＬＣＬ−ＡＬＫ−とＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋とで異なり、これらが分子レベルおよび遺伝子レベルで別個の実体であることが確認される。

ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−は、ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋およびＰＴＣＬ−ＮＯＳのどちらとも臨床的に別個のものであり、これらの３つの異なる実体で予後に顕著な差がある。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−の５年全生存率は４９％と報告されており、これはＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋の５年全生存率（７０％）ほど良好ではないが、同時に、ＰＴＣＬ−ＮＯＳの５年全生存率（３２％）よりも顕著に良好である。

腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）
ＥＡＴＬは、腸の上皮内Ｔ細胞に由来すると考えられる侵攻性新生物である。２００８
ＷＨＯ分類ではＥＡＴＬの形態学的、免疫組織化学的かつ遺伝学的に別個の型が２種類認識されている：Ｉ型（大多数のＥＡＴＬを表す）およびＩＩ型（症例の１０〜２０％を占める）。

Ｉ型ＥＡＴＬは、通常、顕性または臨床的に無症候性のグルテン過敏性腸症を伴い、北欧人血統の患者において見られることがより多く、これは、この集団ではセリアック症の分布率が高いことに起因する。

最も一般的に、ＥＡＴＬの病変は空腸または回腸において見られ（症例の９０％）、稀に十二指腸、結腸、胃、または胃腸管の外部の領域において現れる。腸の病変は通常は多巣性であり、粘膜の潰瘍形成を伴う。ＥＡＴＬの臨床経過は侵攻性であり、大多数の患者が疾患または疾患の合併症で１年以内に死亡する。

ＥＡＴＬ Ｉ型の細胞学的スペクトルは広範であり、いくつかの症例は未分化の細胞を含有する場合がある。いくつかの症例では、腫瘍性成分を不明瞭にさせ得る多形炎症性バックグラウンドが存在する。腫瘍に隣接する領域内の腸粘膜は、多くの場合、病変性前駆細胞を表し得る絨毛の平滑化および上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数の増加を伴うセリアック症の特徴を示す。

免疫組織化学によると、新生物細胞は、多くの場合、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ７＋ＣＤ５−ＣＤ５６−βＦ１＋であり、細胞傷害性顆粒関連タンパク質（ＴＩＡ−１、グランザイムＢ、パーフォリン）を含有する。ほとんど全ての症例でＣＤ３０が部分的に発現される。粘膜ホーミング受容体であるＣＤ１０３がＥＡＴＬで発現される可能性がある。

ＩＩ型ＥＡＴＬは、単形性ＣＤ５６＋腸Ｔ細胞リンパ腫とも称され、ＣＤ８とＣＤ５６との両方を発現する小〜中型の単形性Ｔ細胞で構成される腸の腫瘍と定義される。多くの場合、粘膜内で腫瘍が側方拡散し、炎症性バックグラウンドは存在しない。大多数の症例でγδＴＣＲが発現されるが、αβＴＣＲを伴う症例もある。

ＩＩ型ＥＡＴＬは、Ｉ型ＥＡＴＬよりも世界的に分布しており、多くの場合、セリアック症が稀であるアジア人またはラテンアメリカ系集団において見られる。ヨーロッパ血統の個体では、ＥＡＴＬ、ＩＩは腸Ｔ細胞リンパ腫の約２０％を表し、症例の少なくともサブセットにおいてセリアック症の病歴を伴う。臨床経過は侵攻性である。

肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）
ＨＳＴＬは、一般に自然免疫系のγδ細胞傷害性Ｔ細胞に由来する侵攻性の全身性新生物であるが、稀な症例ではαβＴ細胞に由来することもあり得る。これは最も稀なＴ細胞リンパ腫の１つであり、一般には、青年および若年成人（年齢の中央値、３５歳）に影響を及ぼし、強力に男性優性である。

節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、侵攻性疾患であり、多くの場合、破壊的な正中病変および壊死を伴う。大多数の症例はＮＫ細胞に由来するが、いくつかの症例は細胞傷害性Ｔ細胞に由来する。これは、普遍的にエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫
本発明の方法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を処置するためにも使用することができる。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、悪性Ｔ細胞の皮膚への遊走を特徴とし、これにより種々の病変が出現する。これらの病変は疾患が進行するにつれて形状が変化し、一般には、発疹と思われるもので始まり、最終的にプラークおよび腫瘍が形成された後、体の他の部分に転移する。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫としては、以下の例示的な、包括的ではない一覧に記載されるものが挙げられる；菌状息肉腫、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０−皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫および血管中心性リンパ腫。

ＣＴＣＬの徴候および症状は、特定の疾患に応じて変動し、そのうち２つの最も一般的な型は菌状息肉腫およびセザリー症候群である。古典的な菌状息肉腫は３つの病期：
斑（萎縮性または非萎縮性）：非特異的皮膚炎、体幹下部および臀部の斑；そう痒が最小／存在しない；
プラーク：強いそう痒性プラーク、リンパ節腫脹；および
腫瘍：潰瘍形成易発性
に分けられる。

セザリー症候群は、紅皮症および白血病によって定義される。徴候および症状としては、浮腫状皮膚、リンパ節腫脹、手掌および／または足底の角質増殖、脱毛症、爪ジストロフィー、外反および肝脾腫が挙げられる。

全ての原発性皮膚リンパ腫の中で、６５％がＴ細胞型である。最も一般的な免疫表現型はＣＤ４陽性である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫という用語には多種多様な障害が包含されるので、これらの疾患には共通の病態生理は存在しない。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）の発生についての一次的な病因機構は解明されていない。菌状息肉腫には、Ｔ細胞媒介性慢性炎症性皮膚疾患が先行する可能性があり、これは、場合によって、致死性リンパ腫に進行する場合がある。

原発性皮膚ＡＬＣＬ（Ｃ−ＡＬＣＬ）
Ｃ−ＡＬＣＬは、多くの場合、形態ではＡＬＣ−ＡＬＫ−と区別できない。これは、細胞の７５％超がＣＤ３０を発現する未分化形態、多形性形態または免疫芽球性形態の大細胞の皮膚腫瘍と定義される。リンパ腫様丘疹症（ＬｙＰ）と共に、Ｃ−ＡＬＣＬは一次皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ球増殖性障害のスペクトルに属し、これは群として、菌状息肉腫の次に２番目に多い皮膚Ｔ細胞リンパ球増殖の群を含む。

免疫組織化学的染色プロファイルは、ＡＬＣＬ−ＡＬＫ−とかなり類似しており、細胞傷害性マーカーについて染色陽性である症例の割合がより大きい。腫瘍細胞の少なくとも７５％がＣＤ３０について陽性のはずである。ＣＤ１５も発現し、そして、リンパ節の関与が生じた場合、古典的なホジキンリンパ腫との弁別が難しい可能性がある。ＡＬＣＬ−ＡＬＫ＋の稀な症例は、局在する皮膚病変を示す可能性があり、そしてＣ−ＡＬＣＬと類似する可能性がある。

Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）は、小児コホートのＡＬＬの約１５％を占め、成人コホートのＡＬＬの約２５％を占める。患者は、通常、高白血球数を有し、そして臓器肥大、特に縦隔肥大およびＣＮＳの関与を示す可能性がある。

本発明の方法は、ＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞に関連するＴ−ＡＬＬを処置するために使用することができる。

Ｔ細胞前リンパ球性白血病
Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）は、侵攻性の挙動ならびに血液、骨髄、リンパ節、肝臓、脾臓、および皮膚の関与への偏好を伴う成熟Ｔ細胞白血病である。Ｔ−ＰＬＬは、主に３０歳を超える成人に影響を及ぼす。他の名称として、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病、「こぶ状」型Ｔ細胞白血病、およびＴ前リンパ球性白血病／Ｔ細胞リンパ球性白血病が挙げられる。

末梢血では、Ｔ−ＰＬＬは、場合によってブレブまたは突起を伴う単一の核小体および好塩基性細胞質を有する中型リンパ球からなる。核は、通常、丸形から卵形の形状であり、患者は場合によって、セザリー症候群において見られる大脳様核形状と同様の、核の輪郭がより不規則な細胞を有する。小細胞バリアントは全てのＴ−ＰＬＬ症例の２０％を占め、セザリー細胞様（大脳様）バリアントは症例の５％に見られる。

Ｔ−ＰＬＬは成熟（胸腺後）Ｔリンパ球の免疫表現型を有し、新生物細胞は、一般には汎Ｔ抗原ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ７について陽性であり、ＴｄＴおよびＣＤ１ａについては陰性である。免疫表現型ＣＤ４＋／ＣＤ８−は症例の６０％に存在し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋免疫表現型は２５％に存在し、ＣＤ４−／ＣＤ８＋免疫表現型は症例の１５％に存在する。

医薬組成物
本発明の方法は、当該作用因子を医薬組成物の形態で投与するステップを含み得る。

作用因子は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントと共に投与することができる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準の薬務に関して選択される。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適切な結合物質、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、および他の担体剤を含んでよい。

投与
当該作用因子の投与は、活性成分が生物により利用可能になるような種々の経路のいずれかを使用して実現することができる。例えば、当該作用因子は、経口経路および非経口経路によって、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、筋肉内に、局所送達によって、例えばカテーテルまたはステントによって投与することができる。

一般には、個々の対象に最も適した実際の投与量は医師により決定され、投与量は、特定の患者の年齢、体重および応答によって変動する。投与量は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現するクローン性Ｔ細胞の数を減少または枯渇させるために十分であるようなものである。

使用
本発明は、第１の態様の方法に従ったＴ細胞リンパ腫の処置において使用するための作用因子も提供する。作用因子は上で定義された任意の作用因子であってよい。

本発明は、第１の態様の方法に従ったＴ細胞リンパ腫の処置のための医薬の製造における、上で定義された作用因子の使用にも関する。

キット
本発明は、第１の態様の方法に従ったＴ細胞リンパ腫の処置において使用するための、上で定義された作用因子を含むキットをさらに提供する。

キットは、悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣを決定するために適した試薬も含んでよい。例えば、キットは、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかに特異的なＰＣＲプライマーまたは抗体を含んでよい。

Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を決定するための方法
本発明は、さらに、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病の存在を決定するための方法であって、対象由来の試料中のＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性のいずれかであるＴ細胞の割合を決定するステップを含む方法に関する。

Ｔ細胞リンパ腫は、個々の悪性Ｔ細胞のクローン性増大を伴う。そのため、患者由来の試料中のＴＲＢＣ１ Ｔ細胞またはＴＲＢＣ２ Ｔ細胞のいずれかの割合を決定することによって、対象におけるＴ細胞リンパ腫の存在を同定することができる。

試料は、末梢血試料、リンパ液試料または腫瘍から直接取得した試料、例えば、生検試料であってよい。

Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示す、ＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ２陽性である総Ｔ細胞の割合は、例えば、総細胞集団の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％であってよい。

方法は、生検材料または試料中の別個のＴ細胞集団による浸潤を決定するステップを伴ってよい。本明細書では、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在は、試料中のＴ細胞の総集団の８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかである場合に示される。

試料中の総Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８および／またはＣＤ４５を発現する試料中の細胞の数を決定することによって同定することができる。これらのマーカーの組合せも使用することができる。

ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する試料中の総Ｔ細胞の割合は、当技術分野で公知の方法、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学または蛍光顕微鏡を使用して決定することができる。

ここで本発明を実施例によってさらに記載し、これは、当業者が本発明を実行するのを補助するのに役立つように意味付けられ、いかなる形でも本発明の範囲の限定を意図するものではない。

（実施例１）
ＴＲＢＣ１発現細胞およびＴＲＢＣ２発現細胞の識別
ＪＯＶＩ−１抗体はＶｉｎｅｙら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ；１９９２年；１１巻（６号）；７０１〜７１３頁）によって以前に開示されており、市販されている（Ａｂｃａｍ、ａｂ５４６５）。本発明者らは、ＪＯＶＩ−１により、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の特異的な発現に基づいて細胞を識別することができることを決定した。

本発明者らは、ＴＣＲの完全な可変領域および定常領域を供給し、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかの発現においてのみが異なる２種のプラスミドベクターを生成した。これらのプラスミドを使用して、２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることによってレトロウイルス上清を生成した。この上清を使用して、ジャーカットＴＣＲノックアウトＴ細胞（ＴＣＲベータ鎖遺伝子座に、この鎖の発現を妨げ、それにより、表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体全体の発現を妨げる変異を有するＴ−ＡＬＬ細胞株）に安定的に形質導入した。この結果、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかの発現以外は同一である細胞株が生じた。これらの細胞株の染色により、表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の完全な発現、およびＴＲＢＣ１を発現する細胞のみがＪＯＶＩ−１抗体で染色されることが明らかになった（図４）。

（実施例２）
正常なドナーＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、別々のＴＲＢＣ１陽性集団およびＴＲＢＣ１陰性集団を含有する
本発明者らは、ＪＯＶＩ−１抗体を正常ドナーの初代ヒトＴ細胞に対して試験した。これらの分析により、全てのドナーが、ある割合のＴＲＢＣ１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方とある割合のＴＲＢＣ１を発現しないそれぞれを有することが明らかになった。正常なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のおよそ２０〜５０％がＴＲＢＣ１＋ｖｅである（図６および７）。

（実施例３）
ＴＣＲを発現するクローン性Ｔ細胞株は、ＴＲＢＣ１陽性または陰性である
細胞株は、患者における元のクローン性腫瘍集団に由来するものである。ＴＣＲを発現するＴ細胞株の染色により、Ｔ細胞がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現することが示され、これがクローン性のマーカーとして確認される。試験した３つのＴ細胞株のうち、ジャーカット細胞（ＴＲＢＣ１＋であることが分かっている）はＪＯＶＩ−１で染色され、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞またはＨＤ−Ｍａｒ−２細胞（ＴＲＢＣ２＋であることが分かっている）はＪＯＶＩ−１で染色されず、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかが排他的に発現されることが支持される（図８）。

（実施例４）
Ｔ前リンパ球性白血病の患者における初代クローン性Ｔ細胞はＴＲＢＣ１陽性または陰性である
Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）の患者の末梢血から抽出したクローン性Ｔ細胞は、均一にＴＲＢＣ１陽性またはＴＲＢＣ１陰性のいずれかである。

（実施例５）
ＴＣＢＣ１に独特の残基の変異の影響
ＴＣＲβ鎖定常領域におけるハイブリッドＴＲＢＣ１／２変異以外は同一である、ＴＣＲをコードするプラスミドベクターを生成した。分析から、ＪＯＶＩ−１がＴＣＲβ定常鎖の３位および４位の残基の差異を認識することが示され、これらの残基が抗体認識に利用可能なものであり、ＴＲＢＣ１をＴＲＢＣ２から、またはＴＲＢＣ２をＴＲＢＣ１から識別する作用因子を生成するための最良の標的であり得ることが示された（図５）。

（実施例６）
ＴＲＢＣ１ ＴＣＲ発現Ｔ細胞は特異的に溶解されるがＴＲＢＣ２ ＴＣＲ発現Ｔ細胞は特異的に溶解されない。
野生型ジャーカットＴ細胞（ＣＤ３４−、ＴＲＢＣ１＋）を、ＣＤ３４マーカー遺伝子と同時発現させたＴＲＢＣ２を用いて形質導入したＴＣＲαβノックアウトジャーカットＴ細胞（ＣＤ３４＋ＴＲＢＣ２＋）と混合した。これらの細胞を、１時間にわたり、ＪＯＶＩ−１のみと一緒に、またはＪＯＶＩ−１および補体と一緒にインキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ３４、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤについて染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。

アネキシン−Ｖ陰性および７１ＡＡＤ暗集団によって定義される生集団におけるＣＤ３４発現が図９に示されている。ＴＲＢＣ１ Ｔ細胞（ＣＤ３４−）の選択的な死滅が観察された（図９）。

野生型ジャーカットＴ細胞は、天然にＴＲＢＣ１＋であり、切断型ＣＤ３４マーカー遺伝子を発現しない。上記の通り、本発明者らは、ＴＣＲαβノックアウトジャーカットＴ細胞に、ＴＲＢＣ２ ＴＣＲならびに切断型ＣＤ３４マーカー遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを用いて形質導入することによってＴＲＢＣ２＋ジャーカット株を誘導した。次いで、これらのＴ細胞を混合した。次に、本発明者らは、Ｔ細胞を、１時間にわたり、ＪＯＶＩ−１のみと一緒に、またはＪＯＶＩ−１および補体と一緒にインキュベートした。都合よく、本発明者らは、ＣＤ３４マーカー遺伝子について染色することによってＴＲＢＣ１集団とＴＲＢＣ２集団とを識別することができ、そうすることで、抗ＴＣＲ
ｍＡｂへの長期曝露後のＴＣＲ内部移行に起因するＴＲＢＣ１ ＴＣＲの検出失敗を回避した。細胞を洗浄し、ＣＤ３４、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤについて染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。生細胞（すなわち、アネキシンＶ陰性および７−ＡＡＤ暗である細胞）に関してゲーティングすることにより、本発明者らは、ＴＲＢＣ１ Ｔ細胞が補体の存在下でＪＯＶＩ−１によって選択的に死滅することを決定することができた（図９）。

（実施例７）
ポリクローナルエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞は２つのほぼ同等のＴＲＢＣ１／２集団に分割することができる。
正常血液ドナーから末梢血Ｔ細胞を採取した。単核細胞を単離し、細胞の大部分を凍結保存した。少数の細胞にＥＢＶの実験室株（Ｂ９５−８）を感染させた。数週間を越えて、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）として公知の不死化ＥＢＶ感染細胞株が現れた。そのような細胞株は、異なるＥＢＶ抗原の大きな集合を示すことが公知である。予め凍結保存しておいた単核細胞を解凍し、このＬＣＬ株を用い、ＩＬ２の存在下で週に１回、４週間にわたって繰り返し刺激した。このプロセスにより、末梢血単核集団からＥＢＶ特異的Ｔ細胞が選択的に増大する。そのようなプロセスにより、Ｔ細胞の９０％超がＥＢＶ特異的であり、ドナーのＥＢＶ免疫系を表すポリクローナル株がもたらされることも公知である。この株の特異性は、自己由来ＬＣＬは高程度に死滅するが同種異系ＬＣＬまたはＫ５６２細胞は死滅しないことが示されることによって確認される（図１０ａ）。次いで、この細胞株をＪＯＶＩ−１で染色し、ＴＲＢＣ１ Ｔ細胞およびＴＲＢＣ２ Ｔ細胞のほぼ同等の混合物を含有することが示された（図１０ｂ）。

したがって、ＴＲＢＣ１コンパートメントまたはＴＲＢＣ２コンパートメントのいずれかを枯渇させる治療剤を投与すると、適切なＥＢＶ免疫が残る。ＥＢＶ免疫は免疫応答のモデル系とみなされるので、他の病原体に対するその免疫も同等に保存されると仮定することは妥当である。

（実施例８）
循環末梢性Ｔ細胞リンパ腫のＪＯＶ１染色。
仮説は、クローン性であるＴ細胞リンパ腫は、ＴＲＢ１ Ｔ細胞受容体またはＴＲＢＣ２ Ｔ細胞受容体のいずれかを発現するが、ポリクローナルである正常Ｔ細胞は、ＴＲＢＣ１を有するものとＴＲＢＣ２を有するものの混合物であるＴ細胞集団で構成されるというものであった。これを実証するために、リンパ腫が末梢血中を循環している患者からＴ細胞リンパ腫の血液試料を得た。末梢血単核細胞を単離し、ＣＤ５およびＪＯＶＩ１を含む抗体のパネルを用いて染色した。Ｔ細胞の総集団（リンパ腫および正常Ｔ細胞の両方を含有する）を最初に同定した。この集団は、正常（明るい）ＣＤ５発現を有するＴ細胞および中間／暗いＣＤ５発現を有するＴ細胞で構成されていた。前者は正常Ｔ細胞を代表し、後者はリンパ腫を代表する。次にＪＯＶＩ−１結合を調査し、図１２に結果が示されている。

ＣＤ５中間集団およびＣＤ５暗集団（腫瘍）は全てＴＲＢＣ２陽性であった。

（実施例９）
ＪＯＶＩ−１のＶＨ／ＶＬ配列の解明
マウスＩｇＧ ＣＨ１の定常領域およびマウスカッパの定常領域にアニーリングするプライマーを用いた５’ＲＡＣＥを使用して、本発明者らは、ハイブリドーマＪＯＶＩ−１から単一の機能性ＶＨ配列および単一の機能性ＶＬ配列を単離した。ＶＨおよびＶＬの配列はそれぞれ配列番号１および２である（上記を参照されたい）。ＶＨおよびＶＬのアノテートされた配列が図１１に示されている。

これらのＶＨ配列およびＶＬ配列をそれぞれマウスＩｇＧ重鎖およびカッパ軽鎖とインフレームでクローニングし戻した。さらに、ＶＨおよびＶＬを融合して単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を形成し、これをマウスＩｇＧ２ａのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域と融合してｓｃＦｖ−Ｆｖを創出した。ｓｃＦｖのアミノ酸配列は発明の詳細な説明で配列番号３として示されている。組換え抗体および組換えｓｃＦｖ−Ｆｃを２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションによって生成した。ハイブリドーマ由来のＪＯＶＩ−１と一緒に、以下の細胞を染色した：ＴＣＲがノックアウトされたジャーカット；野生型ジャーカット；ｅＢＦＰ２と共発現させたＴＲＢＣ１を形質導入したＴＣＲノックアウトジャーカットおよびｅＢＦＰ２と共発現させたＴＲＢＣ２を形質導入したＴＣＲノックアウトジャーカット。組換え抗体およびＪＯＶＩに由来するｓｃＦｖ−ＦｃはどちらもＴＲＢＣ２に結合し、本発明者らが正確なＶＨ／ＶＬを同定し、そしてＪＯＶＩ−１ ＶＨ／ＶＬをｓｃＦｖとしてフォールディングさせることができることを確認した。この結合データが図１３に示されている。

（実施例１０）
ＪＯＶＩ−１に基づくＣＡＲの機能
ＪＯＶＩ−１ ｓｃＦｖをＣＡＲ構成にクローニングした。いずれのスペーサー長により最適なＪＯＶＩ−１に基づくＣＡＲがもたらされるかを解明するために、ヒトＦｃスペーサー、ヒトＣＤ８ストークスペーサーまたはＩｇＧ１ヒンジに由来するスペーサーのいずれかを用いて第３世代ＣＡＲを生成した（図４）。正常ドナー由来の初代ヒトＴ細胞にこれらのＣＡＲを形質導入し、ジャーカットおよびＴＣＲがノックアウトされたジャーカットの死滅を比較した。ＩｇＧ１ヒンジスペーサーまたはＣＤ８ストークスペーサーのいずれかを有するＪＯＶＩ−１ ｓｃＦｖを有するＣＡＲにより、ジャーカットは死滅したが、ＴＣＲがノックアウトされたジャーカットは死滅せず（図５）、これにより、予測された特異性が実証された。ＣＡＲを形質導入した正常ドナーＴ細胞はＴＲＢ１／２ Ｔ細胞の混合物を有するはずであるので、培養物が「自己パージ」することが予測された。実際に、これが観察された。１００％ＴＲＢＣ２陰性になったＣＡＲ Ｔ細胞培養物のＪＯＶＩ−１染色が図６に示されている。

材料および方法
ＪＯＶＩ−１の特異性の実証
よく特徴付けられたヒトＴＣＲならびに都合のよいマーカー遺伝子をコードするトリシストロン性レトロウイルスカセットを生成した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖のコード配列を、デノボ遺伝子合成を使用してオーバーラッピングオリゴヌクレオチドから生成した。これらの鎖を口蹄疫２Ａペプチドとインフレームで接続して共発現を可能にした。切断型ＣＤ３４マーカー遺伝子をＰＣＲによってｃＤＮＡからクローニングし、内部リボソーム進入配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）を使用してＴＣＲ鎖と共発現させた。このカセットをレトロウイルスベクターに導入した。この構築物のバリアントを、所望の変異を導入するプライマーを用いたオーバーラップＰＣＲによってスプライシングすることによって生成した。構築物の正確さを、サンガー配列決定によって確認した。ジャーカット７６株は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方がノックアウトされた、ジャーカットＴ細胞株のよく特徴付けられた誘導体である。このジャーカット株に上記のレトロウイルスベクターを用いて、標準の技法を使用して形質導入した。

ジャーカット、末梢血Ｔ細胞および細胞株の染色および分析
ジャーカットをＥＣＡＣＣから得、上記の通り操作した。他のＴ細胞株もＥＣＡＣＣから得た。正常ドナーから静脈穿刺によって末梢血を採取した。血液をフィコール処理して単核細胞を単離した。細胞をＪＯＶＩ−１ならびに全てのＴＣＲおよびＣＤ３を認識する市販のモノクローナル抗体で染色した。操作したＴ細胞の場合には、細胞を、ＣＤ３４を認識する抗体で染色した。末梢血単核細胞の場合には、細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８を認識する抗体で染色した。抗体は、適切なフルオロフォアとコンジュゲートした状態で購入し、そうすることで、フローサイトメーターを用いた細胞の分析中に独立した蛍光シグナルを得ることができた。

ＴＲＢＣ１ Ｔ細胞の特異的な溶解の実証
野生型ジャーカットＴ細胞（ＴＲＢＣ１−ＴＣＲ）、およびＴＲＢＣ２ ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞ＴＣＲ ＫＯを１：１の比率で混合した。次いで、このジャーカットの混合物を１ｕｇ／ｍｌのＪＯＶＩ−１モノクローナル抗体と一緒に、補体の不在下または存在下でインキュベートした。４時間後、細胞をアネキシン−Ｖおよび７ＡＡＤおよびＣＤ３４で染色した。都合よく、マーカー遺伝子ＣＤ３４により、野生型（ＴＲＢＣ１）ジャーカットとトランスジェニック（ＴＲＢＣ２）ジャーカットとを区別することができる。細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。生細胞を、アネキシン−Ｖ陰性かつ７ＡＡＤ暗であるフローサイトメトリー事象に関してゲーティングすることによって選択的に試験した。このように、トランスジェニック（ＴＲＢＣ２）Ｔ細胞の生存と野生型（ＴＲＢＣ１）Ｔ細胞の生存を試験した。

（実施例１１）
Ｔ細胞リンパ球増殖性障害のクローン性の調査
悪性細胞が均一にＴＲＢＣ１陽性または陰性のいずれかであることを確認するために、４名の患者：Ｔ細胞大型顆粒リンパ球増殖性障害（Ｔ−ＬＧＬ）３名；および末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＣＴＬ）１名を試験した。

Ｔリンパ球増殖性障害の患者から全血または骨髄を収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配遠心分離によって得た。新しく得たＰＢＭＣをペレット化し、適切な予めコンジュゲートした抗体を用いて２０分にわたって染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩでの即時フローサイトメトリー分析のためにリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。生リンパ球をＦＳｃ／ＳＳｃ性質および死細胞識別色素を取り込めないことによって同定した。抗ＴＣＲアルファ／ベータ抗体を用いて染色することによってＴ細胞を同定した。各試料について、適切な細胞表面染色を使用し、臨床検査室分析によって予め同定された免疫表現型に基づいて、腫瘍Ｔ細胞集団および正常Ｔ細胞集団を同定した。

結果が図１８〜２１に示されている。

患者Ａ（Ｔ−ＬＧＬ、図１８）では、正常Ｔ細胞はＣＤ７明であり、混合ＣＤ４／ＣＤ８細胞、そしてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ１−細胞の混合集団を含有した。対照的に、悪性細胞はＣＤ７−またはＣＤ７暗であり、均一にＣＤ８＋ＣＤ４−であり、均一にＴＲＢＣ１−であった。

患者Ｂ（Ｔ−ＬＧＬ、図１９）では、悪性細胞はＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＣＤ７＋、ＣＤ５７＋により同定され、クローン性にＴＲＢＣ１−であった（強調表示されているパネル）。正常なＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞およびＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＢＣ１＋集団およびＴＲＢＣ１−集団を含有した。

患者Ｃ（Ｔ−ＬＧＬ、図２０）では、正常なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団は３０〜４０％ＴＲＢＣ１＋であった。悪性細胞はＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＣＤ７＋、ＣＤ５７＋によって同定され、クローン性にＴＲＢＣ１＋であった（強調表示されているパネル、細胞の８４％がＴＲＢＣ１−であり残りの１６％には「正常」Ｔ細胞が混入している可能性があることに留意されたい）。正常ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞およびＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＲＢＣ１＋集団およびＴＲＢＣ１−集団を含有した。

患者Ｄ（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、図２１）では、ＦＳＣ高 ＣＤ５暗 ＣＤ４暗に基づいて同定された骨髄における悪性細胞は均一にＴＲＢＣ１＋であったが、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞およびＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＲＢＣ１＋集団とＴＲＢＣ１−集団との両方を含有した。

（実施例１２）
ファージディスプレイを使用した、Ｔ細胞受容体β鎖定常ドメインの２つのアイソフォームを区別するモノクローナルヒト抗体の生成
ＴＲＢＣ２ペプチドとＴＲＢＣ１ペプチドとを区別する抗体を生成するために、２つのＴＲＢＣアイソフォームの間の領域の差異を包含する断片を合成した。ＴＲＢＣ２とＴＲＢＣ１との間の４つのアミノ酸の差異のうち、２つは定常ドメインの始めに見いだされる。これらの領域を表すペプチド（以下を参照されたい）を合成し、抗体生成のために使用した。

これらのペプチドを、ビオチン化した形態、ビオチン化していない形態、システイン修飾した形態（Ｃ末端システインを付加することによる）で調製した。システイン修飾した形態のＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２は、その後、改変ウシ血清アルブミン（Ｉｍｍ−Ｌｉｎｋ ＢＳＡ、Ｉｎｎｏｖａ ４６２−００１）またはオボアルブミン（Ｉｍｍ−Ｌｉｎｋ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｉｎｎｏｖａ ４６１−００１）と、製造者により推奨される条件に従ってコンジュゲートした。

結果
抗体ファージディスプレイ選択
ヒトファージディスプレイライブラリーを構築し、（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ８巻、Ｒ２５４頁）に記載の通りファージ選択を行った。抗体ライブラリーからＴＲＢＣ１特異的抗体およびＴＲＢＣ２特異的抗体を同定するために、複数のラウンドのファージディスプレイ選択を行った。２つのファージ選択戦略を並行して使用して、特異的な結合物質の大きなパネルが生成する機会を最大限にした。これらの戦略は、固相選択および液相選択として公知である（図２１）。固相選択では、ファージ抗体を、固体表面に固定化した標的抗原に結合させる（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７年、上記の通り）。液相選択では、ファージ抗体を溶液中のビオチン化した抗原に結合させ、次いで、ファージ抗体−抗原複合体をストレプトアビジンまたはニュートラアビジンでコーティングした常磁性ビーズによって捕捉する。固相選択戦略の中で、２つの異なる固定化または抗原提示手法を用いた。第１の手法を使用する場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはオボアルブミン（ＯＡ）とコンジュゲートしたＴＲＢＣペプチドをＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ上に直接吸着によって固定化した。第２の手法を使用する場合、ビオチン化ＴＲＢＣペプチドを、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンで予めコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅチューブ上に間接的に固定化した。

所望のペプチドに特異的な抗体を選択するために、全ての選択を、過剰な対立するペプチドの存在下で行った。例えば、全てのＴＲＢＣ１選択を、１０倍モル過剰のビオチン化していないＴＲＢＣ２の存在下で行った。この方法は、「選択解除」として公知であり、両方のＴＲＢＣペプチドに共有されるエピトープを認識する抗体が溶液中の過剰なＴＲＢＣ２に優先的に結合するので、これらの抗体が枯渇することが予測された。担体タンパク質（ＢＳＡもしくはＯＡ）または固定化パートナー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのストレプトアビジンまたはニュートラアビジン）に結合する抗体クローンが濃縮されるのを回避するために、２つの戦略を組み合わせて用いた。

第１の戦略は、コンジュゲーションまたは固定化パートナーを選択のラウンド間で切り換えることであった。直接固定化したペプチドについては、選択の第１のラウンドをＢＳＡ−ペプチドで行い、ラウンド２についてはＯＡ−ペプチドコンジュゲートを使用した。同様に、ラウンド１についてはビオチン化ＴＲＢＣペプチドをストレプトアビジンに固定化し、ラウンド２における固定化にはニュートラアビジンを使用した。

第２の戦略は、ラウンド１において「選択解除」を実施することによって、コンジュゲーション／固定化パートナーに対する任意の結合物質のファージライブラリーを枯渇させることであった。直接固定化したペプチドについて、１０倍モル過剰の溶液中遊離ＢＳＡの存在下でファージ−ペプチド結合ステップを実行することによって「選択解除」を実施した。ストレプトアビジンに固定化したビオチン化したペプチドの場合には、ファージライブラリーを、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビーズと一緒にプレインキュベートした。ビーズを取り出した後、ファージを抗原チューブに添加し、それにより、ストレプトアビジン結合物質の選択への進入を制限した。使用した異なる選択条件が図２１に要約されている。選択条件に関する詳細な情報については表３を参照されたい。

ラウンド２選択アウトプットから調製したポリクローナルファージを、ペプチドまたは支持タンパク質の種々の提示を使用してＥＬＩＳＡで試験した。これには、ＢＳＡもしくはＯＡコンジュゲートのいずれかとして直接固定化したＴＲＢＣペプチドまたはストレプトアビジンもしくはニュートラアビジンに間接的に固定化したビオチン化したペプチドを含めた。含めた対照タンパク質は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＢＳＡおよび無関連の抗原であった。マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、その後、ユウロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒｓ）で標識した抗マウスＦｃ抗体を使用して、時間分解蛍光を使用してファージ結合を検出した（図２２）。この結果により、ポリクローナルファージ集団がそれぞれのＴＲＢＣペプチドに優先的に結合する（対立するＴＲＢＣペプチドと比較して）ことが実証された。例えば、ＴＲＢＣ１選択から調製されたポリクローナルファージでは、ＴＲＢＣ１に対してＴＲＢＣ２よりも顕著に高い結合シグナルが示され、逆もまた同じであった。固定化またはコンジュゲーションパートナーおよび無関連の抗原に対しては結合が限定されたまたは結合しなかった。

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）サブクローニングおよびモノクローナルスクリーニング
ラウンド２およびラウンド３選択アウトプットからのｓｃＦｖ集団をｐＳＡＮＧ１０−３Ｆ発現ベクターにサブクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞へと形質転換した。１１２８種の個々の形質転換体（５６４クローン／ＴＲＢＣペプチド）を選び取って１２×９６ウェル培養プレート（９４クローン／プレート）に入れ、自己誘導培地を使用して抗体発現を誘導した。一晩の誘導後に培養上清中に分泌された組換えモノクローナル抗体を、ニュートラアビジンでコーティングされたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートに固定化したビオチン化ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２への結合について試験した。ＴＲＢＣ１選択からスクリーニングされた５６４クローンのうち、２５５クローンが、ＴＲＢＣ１に特異的であることが見いだされた（ＴＲＢＣ１に対して＞１００００ＴＲＦ単位およびＴＲＢＣ２に対して＜１０００ＴＲＦ単位）。ＴＲＢＣ２選択からスクリーニングされた５６４クローンから、１３８種のＴＲＢＣ２特異的結合物質（ＴＲＢＣ２に対して＞１００００ＴＲＦ単位およびＴＲＢＣ１に対して＜２０００ＴＲＦ単位）が同定された。図２４に、ＴＲＢＣ１（図２４Ａ）またはＴＲＢＣ２（図２４Ｂ）のいずれかに対する選択から生じた単一の９６ウェルプレートからの代表的な結合プロファイルが示されている。異なる選択条件を使用して生成した特異的な結合物質の詳細が表５に要約されている。

配列解析およびさらなる特徴付けのために、ＴＲＢＣ１選択およびＴＲＢＣ２選択から、それぞれ１４２種および１３８種の特異的な結合物質を選び取った。入念に選び取ったクローンの配列を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してサンガー配列決定によって生成した。ＤＮＡ配列を分析してタンパク質配列を決定し、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲを同定した。ＶＨ ＣＤＲ３領域およびＶＬ ＣＤＲ３領域の分析により、７４種の独特のＴＲＢＣ１クローンおよび４２種の独特のＴＲＢＣ２クローンが同定された（独特とは、ＶＨ ＣＤＲ３配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列のいずれかの組合せと定義される）。ＴＲＢＣ１特異的クローンならびにそれらのＶＨ
ＣＤＲ３配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列が上の表１に要約されている。ＴＲＢＣ２特異的クローンおよびそれらのＶＨ ＣＤＲ３配列およびＶＬ ＣＤＲ３配列が上の表２に要約されている。

（実施例１３）
ウサギのペプチド免疫化によるＴＲＢＣポリクローナル抗体の産生
ＴＲＢＣ２とＴＲＢＣ１とを区別する抗体を生成するために、２つのＴＲＢＣアイソフォーム間を区別する原理領域を包含する２つのペプチドを合成し、ウサギを免疫化するために使用した。以下のペプチド配列を使用した：

ＴＲＢＣ１ペプチドおよびＴＲＢＣ２ペプチド１５ｍｇを合成した。キーホールリンペットヘモシアニンをＴＲＢＣ１ペプチドおよびＴＲＢＣ２ペプチドと、ペプチド上に存在するＣ末端システインを介してコンジュゲートした。各ペプチドについてニューイングランドウサギ２匹を、ＫＬＨコンジュゲートＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２ペプチドを用いて合計３回免疫化した。３回目の免疫化後、ウサギを屠殺し、採血し、精製のために血清を収集した。ウサギから得た粗血清を、免疫化のために使用したペプチドをカップリングした、架橋したビーズアガロース樹脂カラムを通過させて、ペプチドの共通セグメントおよびＴＲＢＣアイソフォーム特異的エピトープに特異的な抗体を収集した。次いで、最初に精製された上清を、代替ペプチドを固定化したカラムをさらに通して精製して、ペプチドの共通セグメントに特異的な抗体を除去した。
ＥＬＩＳＡの設定
コーティング抗原：Ａ：ペプチドＴＲＢＣ１
Ｂ：ペプチドＴＲＢＣ２
コーティング濃度： ４ｕｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル
コーティング緩衝液： リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４
二次抗体：ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ヤギ）抗体

結果が図２５および２６に示されている。この方法により、ＴＲＢＣ１特異的抗体またはＴＲＢＣ２特異的抗体を含むポリクローナル血清を作製することが可能である。

Claims (16)

1. ＴＣＲベータ定常領域１（ＴＲＢＣ１）またはＴＲＢＣ２に選択的に結合する作用因子。
2. ＴＲＢＣ１に選択的に結合する、請求項１に記載の作用因子。
3. ＴＲＢＣ２に選択的に結合する、請求項１に記載の作用因子。
4. 枯渇性モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の作用因子。
5. コンジュゲート化抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の作用因子。
6. 化学療法用実体を含む、請求項５に記載の作用因子。
7. 前記化学療法用実体が、細胞傷害性薬物である、請求項６に記載の作用因子。
8. 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の作用因子。
9. 対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための医薬の製造における請求項１〜８のいずれかに記載の作用因子の使用。
10. 前記作用因子が、悪性Ｔ細胞と、該悪性Ｔ細胞と同じＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞との選択的な枯渇は引き起こすが、該悪性Ｔ細胞では発現されないＴＲＢＣを発現する正常Ｔ細胞の枯渇は引き起こさない、請求項９に記載の使用。
11. 処置が、前記対象由来の悪性Ｔ細胞のＴＣＲベータ定常領域（ＴＣＲＢ）を調査して、それがＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するかどうかを決定するステップも含む、請求項９または１０に記載の使用。
12. 前記Ｔ細胞リンパ腫または白血病が、特定不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項９または１１に記載の使用。
13. 対象におけるＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを発現する細胞に化学療法用実体を標的化送達するための医薬の製造における請求項６または７に記載の作用因子の使用。
14. 請求項８に記載のＢｉＴＥをコードする核酸。
15. 請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
16. 請求項１〜８のいずれかに記載の作用因子と、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントとを含む、医薬組成物。