KR102088082B1 - T 세포 수용체 베타 불변 영역에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체(car) - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TCR 베타 불변 영역 1(TRBC1) 또는 TRBC2에 선택적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR); 상기 CAR을 포함하는 상기 T 세포; 및 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병의 치료를 위한 상기 세포의 용도에 관한 것이다.

Description

T 세포 수용체 베타 불변 영역에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR){CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR(CAR) WITH ANTIGEN BINDING DOMAINS TO THE T CELL RECEPTOR BETA CONSTANT REGION}
본 발명은 T 세포 림프종 또는 백혈병의 치료에 유용한 세포 및 제제에 관한 것이다.
림프계 악성종양은 크게 T 세포 또는 B-세포로부터 유래된 것으로 분류될 수 있다. T 세포 악성종양은 비호지킨 림프종의 10-20% 및 급성 백혈병의 20%를 차지하는 임상적으로 그리고 생물학적으로 이질적인 질환군이다. 가장 흔하게 확인된 조직학적 아형은 상세불명의 말초 T 세포 림프종(PTCL-NOS); 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL) 및 역형성 대세포 림프종(ALCL)이다. 모든 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 중에서, 약 20%는 T 세포 표현형이다.
이들 병태는 전형적으로 B-세포 악성종양을 갖는 사례와 비교하여 공격적으로 행동하며, 30%만이 5년 생존하는 것으로 추정된다. T 세포 림프종의 경우, 이들은 파종성 질환(disseminated disease)을 나타내는 환자들의 높은 비율, 좋지 않은 국제 예후 지표(IPI) 스코어 및 림프절외 질환(extra-nodal disease)의 유행과 연관이 있다. 화학요법만으로는 일반적으로 효과적이지 않으며, 30% 미만의 환자들이 현 치료법으로 치유된다.
또한, 항-CD20 단일클론 항체 리툭시맙과 같은 면역요법으로 결과가 극적으로 개선된 B-세포 악성종양과 달리, 효과가 동등하고 독성이 적은, T 세포 악성종양의 치료에 이용가능한 면역치료제는 현재 없다. T 세포 장애를 위한 면역요법을 개발하는데 있어서 중요한 어려움은 클론(악성) 세포를 명확하게 확인할 수 있는 단일 항원이 없다는 것과 더불어, 클론 T 세포 및 정상 T 세포의 마커 발현이 상당히 겹친다는 것이다.
B-세포 악성종양을 치료하기 위해 범-B-세포 항원(pan-B-cell antigen)을 표적화할 때 동일한 문제가 존재한다. 그러나 이 경우에, 수반되는 B-세포 구획의 고갈이 대부분의 환자가 쉽게 견디는 상대적으로 작은 면역억제를 야기한다. 또한, 특히 정상 B-구획의 장기간 고갈을 야기하는 요법에서, 그의 손실은 혼합된 면역글로불린의 투여에 의해 대부분 사라질 수 있다. 상기 상황은 T 세포 악성종양을 표적화할 때와 완전히 상이하다. 여기에서, 수반되는 T 세포 구획의 고갈이 심각한 면역억제 및 심각한 독성을 야기한다. 또한 T 세포 구획의 손실을 완화하는 만족할만한 방법도 없다.
상기 독성은 치료용 단일클론 항체 알렘투주맙의 임상적 효과에 의해 일부 입증된다. 이 제제는 CD52를 발현하는 세포를 용해시키고 T 세포 악성종양에서 상당한 효능을 갖는다. 이 제제의 유용성은, 현저하게 상승된 감염 위험과 함께, 주로 T 세포 고갈로 인한 극심한 세포성 면역결핍에 의해 상당히 제한된다.
따라서, 상기 단점과 관련이 없는, T 세포 악성종양의 새로운 표적화된 치료 방법이 필요하다.
도 1: αβ T 세포 수용체/CD3 복합체의 도식. T 세포 수용체는, 소포체에서 조립되어 세포 표면상에 발현될, 6개의 상이한 단백질 사슬로부터 형성된다. CD3 복합체의 4개의 단백질(CD3ζ, CD3γ, CD3ε 및 CD3δ)은 T 세포 수용체(TCR)를 둘러싼다. 이 TCR은 상기 복합체에 특정 항원의 특이성을 불어넣으며, 2개의 사슬로 구성된다: TCRα 및 TCRβ. 각각의 TCR 사슬은 상기 막의 원위에 있는 가변 요소 및 상기 막의 근위에 있는 불변 요소를 갖는다. 거의 모든 T 세포 림프종과 많은 T 세포 백혈병이 상기 TCR/CD3 복합체를 발현한다.
도 2: T 세포 수용체 재배열 동안 T 세포 수용체 β-불변 영역( TRBC )-1 및 TRBC2의 분리. 각각의 TCR 베타 사슬은 특정한 베타 가변(V), 다양성(D), 접합(J) 및 불변(TRBC) 영역의 게놈 재조합으로부터 형성된다. 인간 게놈은 TRBC1 및 TRBC2로 공지된 2개의 매우 유사하고 기능적으로 동등한 TRBC 좌위(loci)를 함유한다. TCR 유전자 재배열 동안, J-영역은 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나와 재조합한다. 이 재배열은 영구적이다. T 세포는 그들의 표면상에 단일 TCR의 많은 카피를 발현하며, 따라서 각각의 T 세포는 β-사슬 불변 영역이 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 의해 코딩된 TCR을 발현할 것이다.
도 3: 아미노산 수준에서 인간 TRBC1 및 TRBC2의 정렬. TRBC1 및 TRBC2에 의해 코딩된 TCRβ 불변 사슬은 단지 4개의 아미노산 차이로 상이하다: TRBC의 위치 3에서 K / N; TRBC의 위치 4에서 N / K; TRBC의 위치 36에서 F / Y; TRBC의 위치 135에서 V / E;
도 4: JOVI -1 항체가 TRBC1에 결합하나 TRBC2에는 결합하지 않는다는 확정적 입증. 세포의 유전적 조작을 사용하여 JOVI-1 단일클론 항체가 TCRβ 불변 사슬의 TRBC1 변이체를 인식한다는 것을 확정적으로 입증하였다. 트리시스트론(tri-cistronic) 레트로바이러스 카세트를 생성하였다. 이는, 간편한 마커 유전자로서 절단된(truncated) 인간 CD34와 함께, 부조직적합 항원(minor histocompatibility antigen) HA1을 인식하는 인간 TCR의 TCRα 및 TCRβ 사슬 모두를 코딩하였다. HA1 TCR은 선천적으로 TRBC2이다. TRBC1을 TRBC2와 구별하는 TCR β 불변 영역 내의 4개의 잔기가 TRBC1에 의해 코딩된 잔기로 변경된 것을 제외하고 첫 번째 레트로바이러스 카세트와 동일한 두 번째 레트로바이러스 카세트를 생성하였다. TCRα 및 TCRβ 사슬 모두가 넉아웃된 Jurkat T 세포를 하나의 벡터로 형질도입시켰다. 이들 세포를 범-TCR/CD3 항체 또는 CD34에 대한 항체와 함께 접합된 단일클론 JOVI-1을 이용하여 염색하고, 유세포 분석기에서 분석하였다. 상단 열은 범-TCR/CD3 항체 대 CD34(형질도입 마커)를 이용한 염색을 입증하고, 하단 열은 JOVI-1 대 CD34를 이용한 염색을 입증한다. 형질도입된 세포들은 유사한 TCR/CD3 염색을 입증하지만, TRBC1 +ve 세포만은 JOVI-1을 이용하여 염색된다. 그러므로, JOVI-1은 TRBC1에 특이적이고, 나아가 TRBC1 및 2 TCR을 구별하는 항체를 사용하는 것이 가능하다.
도 5: JOVI -1 mAb는 TRBC의 잔기 3 및 4를 인식함으로써 TRBC1을 TRBC2와 구별한다. JOVI-1이 TRBC1을 TRBC2와 어떻게 구별하는지 정확히 결정하기 위하여, 상기 설명된 HA1 TCR TRBC2 작제물(construct)을 돌연변이시켜 2개의 TRBC1/2 혼성체(hybrid)를 만들었다. TCRβ 불변 사슬의 잔기 3과 4만이 TRBC2의 잔기에서 TRBC1에서 발견되는 잔기로 변화되도록 부가적인 변이체를 생성하였다. 잔기 36만이 TRBC2에서 발견되는 잔기에서 TRBC1에서 발견되는 잔기로 변화된 추가 변이체를 제조하였다. TCR 넉아웃 Jurkat T 세포를 이 새로운 작제물로 형질도입시켰다. 도 4에 기술된 원래의 TRBC2 및 TRBC1로 형질도입된 Jurkat를 대조군으로서 사용하였다. Jurkat T 세포를 JOVI-1로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다. JOVI-1의 염색을 형질도입되지 않은 TCR 넉아웃 Jurkat T 세포의 염색 위에 오버레이(overlay)한다. JOVI-1은 TRBC1 TCR을 발현하는 Jurkat를 염색하였지만 TRBC2 TCR을 발현하는 Jurkat를 염색하지 않았다. JOVI-1은 TRBC 잔기 3 및 4만이 TRBC1의 잔기인 TRBC1/2 혼성체를 염색하였다. JOVI-1은 TRBC 잔기 36만이 TRBC1의 잔기인 Jurkat T 세포를 염색하지 않았다.
도 6: TRBC1의 정상 공여자 T 세포 발현의 예. 정상 공여자 말초 혈액 단핵 세포를 CD3, CD4, CD8에 대한 항체 및 JOVI-1로 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단이 상부 패널에 나타나 있다. 이 집단 각각이 게이팅(gating)되고, 전방 산란(forward scatter) 대 JOVI-1 염색이 각각 Y 및 X-축에 나타나 있다. 이들 데이터는 CD4+ 및 CD8+ 구획 모두가 TRBC1 +ve 및 -ve인 세포를 함유한다는 것을 보여준다. 이는 한 명의 공여자로부터의 대표 데이터이다.
도 7: 몇 명의 정상 공여자에서의 TRBC1 + T 세포. 10명의 정상 공여자의 혈액을 채혈하고, 말초 혈액 단핵 세포를 도 4에 기재된 바와 같이 염색하였다. CD4 및 CD8 구획 모두에서의 TRBC1 T 세포의 비율의 집합 데이터(aggregate data)가 중앙값 및 범위와 함께 막대 그래프로 나타나 있다. 모든 공여자는 TRBC1+ 및 TRBC1- 구획을 가지고 있었다. TRBC1+ 세포의 중앙값 % = 36%.
도 8: JOVI -1로 염색된 T 세포 악성종양 유래의 세포주. 몇 가지 세포주가 T 세포 악성종양으로부터 유래되었다. 이들 많은 세포주는 여전히 TCR을 발현한다. 본 발명자들은 연구를 위해 Jurkat(T 세포 백혈병 세포주), HPB-ALL(또 다른 T 세포 백혈병 세포주) 및 HD-Mar-2(T 세포 림프종 세포주)를 선택하였다. 이들 세포주를 범-TCR/CD3 항체로 염색함으로써, 본 발명자들은 3개 모두가 TCR을 발현한다는 것을 입증할 수 있었다(좌측 패널, 아이소타입 대조군 염색 위에 오버레이된 염색). 그 다음, JOVI-1로 염색함으로써, 본 발명자들은 이들 T 세포주가 TRBC1 음성 또는 양성이라는 것을 결정할 수 있었다. Jurkat 세포(TRBC1+)만이 JOVI-1로 염색되고, HPB-ALL 또는 HD-Mar-2(TRBC2+) 세포는 JOVI-1로 염색되지 않았는데, 이는 TRBC1 또는 2 중 어느 하나의 배타적 발현을 뒷받침한다.
도 9: JOVI -1 mAb를 이용한 TRBC1 T 세포의 선택적 사멸. 야생형 Jurkat T 세포(CD34-, TRBC1+)를, CD34 마커 유전자(CD34+TRBC2+)와 공동-발현된 TRBC2로 형질도입된 TCRαβ 넉아웃 Jurkat T 세포와 혼합하였다. 이들 세포를 1시간 동안 JOVI-1 단독과 함께 배양하거나 또는 1시간 동안 JOVI-1 및 보체와 함께 배양하였다. 세포를 세척하고 CD34, 아넥신 V 및 7-AAD에 대해 염색하였다. 세포를 유세포분석에 의해 분석하였다. 아넥신-V 음성 및 71AAD 흐림(dim) 집단에 의해 정의된 바와 같은 살아있는 집단에서의 CD34 발현이 하기에 나타나 있다. (a) JOVI-1 단독; (b) JOVI-1 및 보체. TRBC1 T 세포(CD34-)의 선택적 사멸이 관찰된다.
도 10: 다클론 엡스테인 바 바이러스( EBV ) 특이적 T 세포는 2개의 거의 동일한 TRBC1 /2 집단으로 분열될 수 있다. 잘 확립된 방법을 이용하여, 본 발명자들은 정상 공여자의 말초 혈액으로부터 EBV 특이적 T 세포를 선택적으로 확장시켰다. 후속 세포주는 자가(autologous) EBV 감염된 B-세포(auto LCL)에 대해 높은 정도의 선택성을 가지고 있었고, 동종(allogeneic) EBV 감염된 T 세포(allo LCL)에 대해서는 활성이 없었고, 비-특이적 NK 활성이 없었다(K562 세포에 대해 시험하여 측정된 바와 같음). 상기 세포주는 공여자의 EBV 면역력을 대표한다. (b) JOVI-1로 염색될 때, 이들 T 세포는 TRBC1 및 TRBC2에 대해 거의 동일하게 타이핑하였다.
도 11: JOVI -1 VH 및 VL의 주석이 달린(annotated) 서열. 초가변 영역들이 밑줄쳐 있으며 굵은 글씨로 되어 있다.
도 12: 말초 T 세포 림프종은 TRBC 제한적이지만, 정상 순환 T 세포는 그렇지 않다는 입증. 순환 T 세포 림프종 세포를 갖는 환자로부터 말초 혈액 T 세포를 채취하였다. 말초 단핵 세포를 단리시키고 CD5, TCR 및 JOVI-1을 포함하는 항체 패널로 염색하였다. 정상 및 악성 T 세포는 CD5 발현 세기에 의해 유동 상에서 구별될 수 있었다. CD5 선명함(bright)(정상 T 세포)은 거의 동일한 TRBC1 및 2 집단을 가지고 있었다. CD5 중간(intermediate) 및 흐림(dim) 집단(종양)은 모두 TRBC2 양성이었다. 만약 이 환자가 TRBC2 지향 요법을 받았다면, 림프종이 근절되고 이들의 T 세포의 거의 절반이 해를 입지 않았을 것이다.
도 13: JOVI -1로부터 유래된 VH 및 VL이 정확하였다는 입증 및 이들이 단일-사슬 가변 단편으로서 폴딩될 수 있다는 입증. 형질감염된 293T 세포로부터 생성된 원래의 하이브리도마 상청액, 재조합 JOVI-1 항체 및 scFv-Fc를 사용하여 많은 세포주를 염색하였다: Jurkat TCR 넉아웃, 야생형 Jurkat, eBFP2를 공동발현하는 벡터 내의 TRBC1 TCR로 형질도입된 Jurkat TCR 넉아웃; eBFP2를 공동-발현하는 벡터 내의 TRBD2 TCR로 형질도입된 Jurkat TCR 넉아웃. 염색을 유세포분석에 의해 분석하였다. 재조합 항체 및 scFv 모두는 TRBC2를 발현하는 세포에 결합하였다.
도 14: 상이한 포맷의 JOVI -1 기반의 CAR. CAR은 전형적으로 결합 도메인, 스페이서, 막통과 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 연구에서는, JOVI-1 scFv; CD8 줄기(stalk), FcR 결합을 제거하는 돌연변이를 갖는 인간 IgG1의 힌지-CH2-CH3 도메인 중 어느 하나로부터 유래된 스페이서; 또는 인간 IgG1로부터 유래된 스페이서를 포함하는 CAR을 생성하였다.
도 15: JOVI -1 기반의 CAR의 기능. 정상 공여자 말초 혈액 T 세포를 전술한 상이한 CAR로 형질도입시켰다. T 세포를 또한 대조군으로서 CD19-특이적 CAR로 형질도입시켰다. 그리고 나서, 이들 T 세포를 하기 표적 세포로 자극(challenge)하였다: Jurkat - TCR 넉아웃 및 Jurkat 야생형 및 Raji 세포(CD19+ B-세포 림프종 주). 상이한 표적에 대한 상기 효과기(effector)의 크롬 방출 데이터가 나타나 있다. JOVI-1 CAR T 세포는 Jurkat를 사멸시키지만 Raji 세포 또는 TCR 넉아웃된 Jurkat를 사멸시키지 않는다.
도 16: JOVI -1 CAR T 세포 배양물의 자가- 퍼징 (self-purging). T 세포는 거의 동일한 수의 TRBC1 또는 TRBC2 양성 T 세포를 포함하므로, CAR의 도입 후 배양물의 어느 정도 "동족살해(fratricide)" 또는 자가-퍼징이 일어날 수 있다. 이것이 사실로 입증되었다. 본 실시예에서, 형질도입 후 CAR T 세포를 염색하고 유세포분석에 의해 분석하였다. 거짓(mock)-형질도입 대 형질도입을 비교해볼 때, T 세포 집단이 TRBC1 양성 T 세포를 잃는다는 것을 관찰할 수 있다.
도 17: T 세포 거대 과립 백혈병(T- LGL )의 클론형성능(clonality)의 조사 - 환자 A
도 18: T 세포 거대 과립 백혈병(T- LGL )의 클론형성능의 조사 - 환자 B
도 19: T 세포 거대 과립 백혈병(T- LGL )의 클론형성능의 조사 - 환자 C
도 20: 다클론 T 세포 림프종( PCTL )의 클론형성능의 조사 - 환자 D
도 21: TRBC 펩타이드 파아지 선택 전략. A) 표면에 직접 또는 간접 고정된 TRBC 펩타이드 상에서의 2회의 고상 파아지 디스플레이 선택. B) 바이오티닐화된 TRBC 펩타이드 상에서의 3회의 용액상 파아지 디스플레이 선택.
도 22a~도 22c: TRBC 펩타이드 파아지 디스플레이 선택으로부터의 다클론 파아지 아웃풋(outputs)의 분석. BSA/OA 접합체로서 직접 고정된 TRBC 펩타이드 상에서 수행된 고상 선택(22a), 스트렙타비딘/뉴트라비딘 상에 고정된 TRBC 펩타이드 상에서의 고상 선택(22b) 및 용액상 선택(22c)으로부터의 다클론 파아지를 이용한 TRF 결합.
도 23: pSANG10 -3F 벡터의 도식적 표시. 단일 사슬 항체(scFv)를 인코딩하는 유전자가 T7 프로모터 및 pelB 리더(주변세포질 전좌를 위함)의 다운스트림에 있는 NcoI/NotI 부위에 클로닝된다. 상기 벡터는 또한 정제 및 트리-FLAG 태그 검출을 위해 C-말단 헥사-히스티딘 태그(His6)를 함유한다.
도 24: TRBC1 및 TRBC2 특이적 결합물질에 대한 일차 스크리닝. 뉴트라비딘(10 μg/ml) 코팅된 Nunc Maxisorp™ 96 웰 플레이트 상에 고정된 바이오티닐화된 TRBC1 및 TRBC2(0.5 μg/ml)에 대한 TRBC1(A) 및 TRBC2(B) 선택으로부터의 94개의 scFv의 결합. 상기 고정된 펩타이드에 대한 scFv 결합을 유로퓸에 접합된 항-FLAG 항체를 이용하여 검출하였다.
도 25: TRBC1로 면역화된 토끼 #13174로부터의 다클론 항체 혈청의 TRBC1 및 TRBC2 펩타이드에 대한 결합. (A) TRBC1 특이적 항체의 3차 면역화 후 (B) TRBC1 특이적 항체의 3차 면역화 및 정제 후.
도 26: TRBC2 펩타이드로 면역화된 토끼 #17363으로부터의 다클론 항체 혈청의 TRBC1 및 TRBC2 펩타이드에 대한 결합. (A) TRBC2 특이적 항체의 3차 면역화 후 (B) TRBC2 특이적 항체의 3차 면역화 및 정제 후.
도 27: TRBC2 펩타이드로 면역화된 토끼 #17364로부터의 다클론 항체 혈청의 TRBC1 및 TRBC2 펩타이드에 대한 결합. (A) TRBC2 특이적 항체의 3차 면역화 후 (B) TRBC2 특이적 항체의 3차 면역화 및 정제 후.
발명의 양태의 요약
본 발명자들은 건강한 T 세포의 상당 비율에 영향을 미치지 않으면서, 대상에서 악성 T 세포를 고갈시킬 수 있는 방법을 고안하였다. 특히, 본 발명자들은 T 세포 악성종양의 치료에 사용하기 위해 TRBC1 및 TRBC2-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 개발하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 TCR 베타 불변 영역 1(TRBC1) 또는 TRBC2에 선택적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
본 발명의 제1 양태의 제1 구현예에서, TRBC1에 선택적으로 결합하는 CAR이 제공된다. 이 구현예에서, CAR은 하기 상보성 결정 영역(CDR):
VH CDR1: 서열번호 7;
VH CDR2: 서열번호 8;
VH CDR3: 서열번호 9;
VL CDR1: 서열번호 10;
VL CDR2: 서열번호 11; 및
VL CDR3: 서열번호 12
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 갖는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 1로 표시된 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 2로 표시된 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 scFv를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 33, 34 및 35로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
CAR은 표 1에 열거된 것으로부터 유래된 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 13 내지 22로 표시된 scFv 중 하나로부터 유래된
(i) 중쇄 CDR3 및/또는 경쇄 CDR3;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
(iii) 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)
를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 제2 구현예에서, TRBC2에 선택적으로 결합하는 CAR이 제공된다.
이 구현예와 관련하여, CAR은 표 2에 열거된 것으로부터 유래된 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 23 내지 32로서 표시된 scFv 중 하나로부터 유래된
(i) 중쇄 CDR3 및/또는 경쇄 CDR3;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
(iii) 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)
를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공된다.
제4 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 포함하는 세포가 제공된다. 상기 세포는 세포용해성(cytolytic) 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명의 제2 양태에 따른 핵산 서열 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 벡터로 세포를 형질도입시키거나 형질감염시키는 단계를 포함하는 본 발명의 제4 양태에 따른 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
제6 양태에서, 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 세포가 제공되며, 상기 방법은
TCRB1 또는 TCRB2 선택적 CAR을 포함하는 세포를 대상에게 투여하여, 악성 T 세포에 의해 발현되지 않는 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 고갈은 유발하지 않으면서, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하는 정상 T 세포와 함께, 악성 T 세포의 선택적 고갈을 유발하는 단계
를 포함한다.
상기 방법은 또한, 대상으로부터의 악성 T 세포의 TCR 베타 불변 영역(TCRB)을 조사하여, 상기 악성 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2를 발현하는지 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
TCRB1 또는 TCRB2 선택적 제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 제제는 악성 T 세포에 의해 발현되지 않은 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 고갈은 유발하지 않으면서, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하는 정상 T 세포와 함께, 악성 T 세포의 선택적 고갈을 유발한다.
본 발명의 이러한 양태의 제1 구현예에서, 상기 제제는 TCRB1 선택적 제제이다. 본 발명의 이러한 양태의 제2 구현예에서, 상기 제제는 TRBC2 선택적 제제이다.
상기 방법은 또한, 투여 단계 전에, 악성 T 세포의 TCR 베타 불변 영역(TRBC)을 조사하여, 상기 악성 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2를 발현하는지 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제제는 고갈성(depleting) 단일클론 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 제제는 접합된 항체일 수 있고, 이는 화학요법 독립체(chemotherapeutic entity)를 포함할 수 있다.
상기 제제는 이중특이적 T 세포 관여체(engager)일 수 있다. 상기 제제는 T 세포를 발현하는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 상기 CAR은 서열번호 33, 34 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 제제는 JOVI-1 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
상기 제제는 하기 상보성 결정 영역(CDR):
VH CDR1: 서열번호 7;
VH CDR2: 서열번호 8;
VH CDR3: 서열번호 9;
VL CDR1: 서열번호 10;
VL CDR2: 서열번호 11; 및
VL CDR3: 서열번호 12
을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 갖는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
상기 제제는 서열번호 1로서 표시되는 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 항체 of 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
상기 제제는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ScFv를 포함할 수 있다. 상기 제제는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
T 세포 림프종 또는 백혈병은 상세불명의 말초 T 세포 림프종(PTCL-NOS); 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 역형성 대세포 림프종(ALCL), 장질환 관련 T 세포 림프종(EATL), 간비장 T 세포 림프종(HSTL), 비강형 림프절외 NK/T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, 원발성 피부 ALCL, T 세포 전림프구성 백혈병 및 T 세포 급성 림프모구성 백혈병으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 T 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는데 사용하기 위한 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이 사용하기 위한 제제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 T 세포 림프종 또는 백혈병의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 TRBC1 또는 TRBC2 양성인 샘플 내의 총 T 세포의 백분율을 결정하는 단계를 포함하는, 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병을 진단하는 방법을 제공한다.
약 80%를 초과하는 TRBC1 또는 TRBC2 양성 T 세포의 백분율은 T 세포 림프종 또는 백혈병의 존재를 나타낼 수 있다.
상기 샘플은 말초 혈액 샘플 또는 생검 시료일 수 있다.
총 T 세포에 결합하는 상기 제제는 CD3에 결합할 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 TRBC1 또는 TRBC2에 선택적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 제제를 제공한다. 상기 제제는 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법에서 유용하다. T 세포 악성종양은 클론성이어서, 이들은 TRBC1 또는 TRBC2를 발현한다. TCRB1 또는 TCRB2 선택적 제제를 대상에게 투여함으로써, 상기 제제는, 상기 악성 T 세포에 의해 발현되지 않는 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 고갈은 유발하지 않으면서, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하는 정상 T 세포와 함께, 악성 T 세포의 선택적 고갈을 유발한다.
TCR β 불변 영역(TRBC)
T 세포 수용체(TCR)는 T 림프구의 표면상에서 발현되고 주조직 적합 복합체(MHC) 분자에 결합한 항원을 인식하는 것을 담당한다. TCR이 항원성 펩타이드 및 MHC(펩타이드/MHC)에 관여하는 경우, 연관된 효소, 공-수용체, 특화된 어댑터 분자, 및 활성화되거나 방출된 전사 인자에 의해 매개된 일련의 생화학적 사건을 통해 T 림프구가 활성화된다.
TCR은 불변(invariant) CD3 사슬 분자들과의 복합체의 일부로서 발현되는 고 가변 알파(α) 및 베타(β) 사슬로 일반적으로 구성되는, 디설파이드-연결된 막-고정된 이종이량체이다. 이 수용체를 발현하는 T 세포는 α:β(또는 αβ) T 세포(~95% 총 T 세포)로 지칭된다. 소수의 T 세포가 가변 감마(γ) 및 델타(δ) 사슬에 의해 형성된 대안적인 수용체를 발현하고, 상기 세포는 γδ T 세포(~5% 총 T 세포)로 지칭된다.
각각의 α 및 β 사슬은 2개의 세포외 도메인: 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역으로 구성되고, 면역글로불린 상과(superfamily)(IgSF) 도메인 모두는 역평행 β-시트를 형성한다. 상기 불변 영역은 세포 막의 근위에 있고, 이후에 막통과 영역 및 짧은 세포질 테일이 있는 반면, 상기 가변 영역은 펩타이드/MHC 복합체에 결합한다(도 1 참고). TCR의 불변 영역은, 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하여 상기 2개의 사슬 간에 연결(link)을 형성하는, 짧은 연결 서열로 구성된다.
TCR α-사슬 및 β-사슬 모두의 가변 도메인은 3개의 초가변성 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 상기 β-사슬의 가변 영역은 또한 부가적인 초가변성 구역(HV4)을 가지나, 이는 일반적으로 항원에 접촉하지 않으므로 CDR로 간주되지 않는다.
TCR은 또한 최대 5개의 불변 사슬 γ, δ, ε(CD3로 총칭됨) 및 ζ을 포함한다. 상기 CD3 및 ζ 서브유닛은 αβ 또는 γδ에 의한 항원의 인식 후 제2-메신저 및 어댑터 분자와 상호작용하는 특이적 세포질 도메인을 통한 TCR 신호전달을 매개한다. 상기 TCR 복합체의 세포-표면 발현은 TCR α 및 β 및 CD3 γ 및 δ의 막통과 및 세포외 도메인 모두가 역할을 하는 쌍별 조립(pair-wise assembly) 후에 시작된다.
따라서, TCR은 통상적으로 CD3 복합체 및 TCR α 및 β 사슬로 구성되고, 이는 결국 가변 및 불변 영역으로 구성된다(도 1).
TCR β-불변 영역(TRBC)을 제공하는 좌위(Chr7:q34)는 2개의 거의 동일한 그리고 기능적으로 동등한 유전자를 생산하기 위해 진화 역사에서 복제되었다: TRBC1 및 TRBC2(도 2), 이는 각각에 의해 생산된 성숙한 단백질에서 4개의 아미노산만이 상이함(도 3). 각각의 TCR은, 상호배타적인 방식으로, TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 포함할 것이고, 그와 같이, 각각의 αβ T 세포는, 상호배타적인 방식으로, TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현할 것이다.
본 발명자들은, TRBC1 및 TRBC2의 서열 간의 유사성에도 불구하고, 이들을 구별할 수 있음을 결정하였다. 본 발명자들은 또한 TRBC1 및 TRBC2의 아미노산 서열이 세포, 예를 들어 T 세포의 표면상에서 원위치에 있는 동안 구별될 수 있음을 결정하였다.
악성 세포
용어 '악성(malignant)'은 그의 성장이 스스로 제한되지 않고, 인접 조직 내로 침투할 수 있으며, 먼 조직으로 퍼질 수 있는 세포를 가리키기 위해, 그의 표준 의미에 따라 본원에서 사용된다. 그와 같이, 용어 '악성 T 세포'는 림프종 또는 백혈병의 문맥에서 클론성으로 확장된 T 세포를 가리키기 위해 본원에서 사용된다.
본 발명의 방법은 악성 T 세포의 TRBC를 결정하는 것을 포함한다. 이것은 본 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 그것은 PCR, 웨스턴 블랏, 유세포분석 또는 형광 현미경 방법에 의해 결정될 수 있다.
악성 T 세포에 의해 발현되는 TRBC가 결정되면, 적절한 TRBC1 또는 TRBC2 선택적 제제가 대상에게 투여된다. 상기 '적절한 TRBC 선택적 제제'는 악성 T 세포가 TRBC1을 발현하는 것으로 결정되는 경우 TRBC1 선택적 제제가 투여되고, 반면 악성 T 세포가 TRBC2를 발현하는 것으로 결정되는 경우 TRBC2 선택적 제제가 투여되는 것을 의미한다.
선택적 제제
선택적 제제는 상호배타적인 방식으로 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 결합한다.
상기에 언급한 바와 같이, 각각의 αβ T 세포는 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 포함하는 TCR을 발현한다. 클론성 T 세포 장애, 예컨대 T 세포 림프종 또는 백혈병에서, 동일한 클론으로부터 유래된 악성 T 세포들은 모두 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현할 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 TRBC1 또는 TRBC2 선택적 제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제제는, 악성 T 세포와 다른 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 유의미한 고갈은 유발하지 않으면서, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하는 정상세포와 함께, 악성 세포의 선택적 고갈을 유발한다.
TRBC 선택적 제제는 악성 T 세포와 다른 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 유의미한 고갈을 야기하지 않기 때문에, 전체 T 세포 구획의 고갈을 야기하지 않는다. 대상의 T 세포 구획(즉, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하지 않는 T 세포)의 비율의 유지는 독성 감소 및 세포성 및 체액성 면역결핍 감소를 야기하고, 이에 의해 감염 위험성을 낮춘다.
본 발명의 방법에 따른 TRBC1 선택적 제제의 투여는 TRBC1을 발현하는 T 세포의 수의 5, 10, 20, 50, 75, 90, 95 또는 99% 고갈, 즉, 감소를 야기할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 TRBC2 선택적 제제의 투여는 TRBC2를 발현하는 T 세포의 수의 5, 10, 20, 50, 75, 90, 95 또는 99% 고갈, 즉, 감소를 야기할 수 있다.
TRBC1 선택적 제제는 TRBC2보다 적어도 2배, 4배, 5배, 7배 또는 10배 더 큰 친화성으로 TRBC1에 결합한다. 마찬가지로, TRBC2 선택적 제제는 TRBC1보다 적어도 2배, 4배, 5배, 7배 또는 10배 더 큰 친화성으로 TRBC2에 결합할 수 있다.
TRBC1 선택적 제제는 TRBC2-발현 세포보다 세포 집단에서 더 큰 비율의 TRBC1-발현 T 세포의 고갈을 야기한다. 예를 들어, TRBC1-발현 T 세포 대 TRBC2-발현 세포의 고갈의 비는 적어도 60%:40%, 70%:30%, 80%:20%, 90%:10% 또는 95%:5%일 수 있다. 마찬가지로, TRBC2 선택적 제제는 TRBC2-발현 세포보다 세포 집단에서 더 큰 비율의 TRBC1-발현 T 세포의 고갈을 야기한다. 예를 들어, TRBC2-발현 T 세포 대 TRBC1-발현 세포의 고갈의 비는 적어도 60%:40%, 70%:30%, 80%:20%, 90%:10% 또는 95%:5%일 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여, 상당한 비율의 건강한 T 세포에 영향을 미치지 않으면서, 악성 T 세포가 대상에서 고갈된다. "상당한 비율"은 악성 T 세포와 상이한 TRBC를 발현하는 T 세포의 충분한 비율이 대상에서 T 세포 기능을 유지하기 위해 생존한다는 것을 의미한다. 상기 제제는 다른 TRBC를 발현하는 T 세포 집단의 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 고갈을 야기할 수 있다.
선택적 제제는, 하기 열거된 바와 같은 잔기들을 구별할 수 있기 때문에, TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 대해 선택적일 수 있다:
(i) TRBC의 위치 3에서 N과 K;
(ii) TRBC의 위치 3에서 K와 N;
(iii) TRBC의 위치 4에서 K와 N;
(iv) TRBC의 위치 4에서 N과 K;
(v) TRBC의 위치 36에서 F와 Y;
(vi) TRBC의 위치 36에서 Y와 F;
(vii) TRBC의 위치 135에서 V와 E; 및/또는
(viii) TRBC의 위치 135에서 E와 V.
상기 선택적 제제는 상기 차이들의 임의의 조합을 구별할 수 있다.
항체
본 발명의 방법에서 사용되는 제제는 고갈성 단일클론 항체(mAb) 또는 이의 기능적 단편, 또는 항체 모방체(mimetic)일 수 있다.
용어 '고갈성 항체'는 표적 T 세포 상에 존재하는 항원에 결합하고 표적 T 세포의 사멸을 매개하는 항체에 대해 언급하기 위해 종래의 의미로 사용된다. 그러므로, 고갈성 항체를 대상에게 투여하는 것은 표적 항원을 발현하는 대상 내의 세포의 수의 축소/감소를 야기한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 항원 결합 부위를 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 항체는 3개의 CDR을 포함하고 도메인 항체(dAb)의 것과 동등한 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 상기 항체는 6개의 CDR을 포함하고 고전적인 항체 분자의 것과 동등한 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 나머지는 상기 항원 결합 부위를 위한 적합한 골격을 제공하고 항원 결합 부위가 항원에 결합하도록 적절한 방식으로 항원 결합 부위를 디스플레이하는 임의의 서열일 수 있다. 상기 항체는 전체 면역글로불린 분자 또는 이의 부분, 예컨대 Fab, F(ab)'2, Fv, 단일 사슬 Fv(ScFv) 단편 또는 나노바디일 수 있다. 상기 항체는 이중기능성 항체일 수 있다. 상기 항체는 비-인간, 키메라성, 인간화된 또는 완전히 인간일 수 있다.
따라서, 상기 항체는 전체 항체의 항원 특이성을 보유하는 임의의 기능적 단편일 수 있다.
TRBC1-선택적 항체
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 제제는 하기 상보성 결정 영역(CDR):
VH CDR1: GYTFTGY(서열번호 7);
VH CDR2: NPYNDD(서열번호 8);
VH CDR3: GAGYNFDGAYRFFDF(서열번호 9);
VL CDR1: RSSQRLVHSNGNTYLH(서열번호 10);
VL CDR2: RVSNRFP(서열번호 11); 및
VL CDR3: SQSTHVPYT(서열번호 12)
중 하나 이상을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 갖는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
수득된 항체가 TRBC1에 선택적으로 결합하는 능력을 보유한다면, 상기 하나 이상의 CDR은 각각 독립적으로 서열번호 7 내지 12로서 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예컨대, 치환)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
연구들은 CDR L3 및 H3이 일반적으로 항원과의 고에너지 상호작용을 담당한다는 것을 보여왔으며, 따라서 상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 상기에 설명된 바와 같은 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함할 수 있다.
파아지 디스플레이를 이용하여, 실시예 12에 기술된 바와 같이, TRBC2보다 TRBC1에 결합하는데 매우 선택적인 몇 개의 부가적인 항체 결합 도메인들이 확인되어 왔다.
상기 제제는 표 1에 나타난 상보성 결정 영역(CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)를 갖는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
Figure 112016095724121-pct00001
상기 제제가 도메인 항체인 경우, 그것은 3개의 CDR, 즉 VH CDR1-CDR3 또는 VL CDR1-CDR3 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 제제는 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다.
서열번호_1 Jovi-1 VH
EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSS
서열번호_2 Jovi-1 VL
DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
상기 제제는 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 ScFv를 포함할 수 있다.
서열번호_3 Jovi-1 scFv
EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
대안적으로, 상기 제제는
서열번호 13-22로서 표시된 scFv 중 하나로부터 유래된
(i) 중쇄 CDR3 및/또는 경쇄 CDR3;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
(iii) 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)
를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
서열번호 13-22로 표시된 서열에서, 상기 서열의 VH 및 VL 부분은 굵은 글씨로 표시되어 있고, 중쇄 및 경쇄에 대한 CDR1 및 CDR2 서열은 밑줄쳐 있다. VH 및 VL에 대한 CDR3 서열은 표 1에 제시되어 있다.
서열번호 13_(CP_01_E09)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAHNSSSWSFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVDIKRTAAA
서열번호 14(CP_01_D12)
EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGDTYGFLDNWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC RASQSISSWLA WYQQKPGKAPKLLIY KASSLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNAYPLTFGGGTKVEIKRTAAA
서열번호 15(CP_01_D10)
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSSKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGGSFGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISRYLN WYQQKPGKAPNLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKLEIKRTAAA
서열번호 16(CP_01_C08)
EVQLLESGGGAVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYA D SVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGYSSSWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTAAA
서열번호 17(CP_01_C11)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMH WVRQAPGQGLEWMG RINPNSGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASGGAGWNWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTATISC TRSSGSIASNYVQ WYQQRPGSAPTTVIY EDNQRPF GVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSHDSSNVVFGGGTQLTVLGQPAA
서열번호 18(CP_01_F03)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGY?ASSWSQGLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVRDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGGGTKVEIKRTAAA
서열번호 19(CP_01_E07)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGGSGGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQTPHSLSVTPGQPASISC KSSQSLLYSDGKTYLY WYLQKPGQPPQLLIY EVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQLYTFGQGTKVDIKRTAAA
서열번호 20(CP_01_D03)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAPGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNKQYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQSPATLSLAPGERATLSC RASQSVGSNLA WYQQKPGQAPSLLIY DASTRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDIAVYYCQQYHRWPLTFGGGTKVEIKRTAAA
서열번호 21(CP_01_F06)
EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDGAMRYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVLYSSNNKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYDSPYTFGQGTKVDIKRTAAA
서열번호 22(CP_01_F02)
QVQLVESGGGVVQPGRPLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGYSYADYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVDIKRTAAA
TRBC2-특이적
파아지 디스플레이를 이용하여, 실시예 12에 기재된 바와 같이, TRBC1보다 TRBC2에 결합하는데 매우 선택적인 몇 개의 항체 결합 도메인이 확인되어 왔다.
상기 제제는 표 2에 나타난 상보성 결정 영역(CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)을 갖는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
Figure 112016095724121-pct00002
상기 제제는 서열번호 23-32로 표시된 scFv 중 하나로부터 유래된
(i) 중쇄 CDR3 및/또는 경쇄 CDR3;
(ii) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
(iii) 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL)
를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다:
서열번호 23-32로 표시된 서열에서, 상기 서열의 VH 및 VL 부분은 굵은 글씨로 표시되어 있고 중쇄 및 경쇄에 대한 CDR1 및 CDR2 서열은 밑줄쳐 있다. VH 및 VL에 대한 CDR3 서열은 표 2에 제시되어 있다.
서열번호 23(CP_03_E05)
E VQLV E SGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKG RFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTRSSGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISC TRSSGSIASKYVQ WYQQRPGSSPTTVIY EDNQRPS GVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLRTEDEADYYCHSYDSNNHSVFGGGTKVTVLGQPAA
서열번호 24(CP_03_D05)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMH WVRQAPGQGLEWMG RINPNSGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASPRGRGSAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQPPSVSVSPGQTATISC SGDQLGGKYGH WYQKKPGQSPVLVLY QDRKRPA GIPERFSGSSSGNTITLTISGTQAVDEADYYCQAWDTNLGGVFGGGTKVTVLGQPAA
서열번호 25(CP_03_H06)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS DYYMS WIRQAPGKGLEWVS YISSSGSTIYYADSVEG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRTEDTAVYYCARARVGGMDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISC TRSSGSIASNYVQ WYQQRPGSSPTTVIY EDNQRPS GVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSFDADNLHVVFGGGTKLTVLGQPAA
서열번호 26(CP_03_C12)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMH WVRQAPGQGLEWMG WINPNSGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGPIDYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC KSSQSLLHSDGKTYLY WYLQKPGQPPQLLVY EVSNRFS GVPDKFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGIQLPPTFGGGTKVDIKRTAAA
서열번호 27(CP_03_G02)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG IINPSGGSTSYAQKFQG RVTMTRDTSTSIVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVWNSGSYLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKRTAAA
서열번호 28(CP_03_D04)
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGFTVPGGAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSDSPGKTVTISC TRSSGRIGSNFVQ WYQQRPGSSPTTVIY EDDQRPS GVPARFSGSIDSSSNSASLTISGLTTADEAGYYCQSYDASNVIFGGGTKLTVLGQPAA
서열번호 29(CP_03_F10)
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMH WVRQAPGQGLEWMG RINPNSGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGERYAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASQSELTQPPSASGSPGQSVTISC TGTSTDVGAFHFVS WYQHTPGKAPKLLIS EVRKRAS GVPDRFSGSRSGNTASLTVSGLQSEDEADYFCSAYTGSNYVFGSGTKLTVLGQPAA
서열번호 30(CP_03_G09)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS SNSAAWN WIRQSPSRGLEWLG RTYYRSKWYNDYAVSVKS RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDQWLANYYYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQPLSVSVALGQTARITC GGNNIGSKNVH WYQQKPGQAPVLVIY RDNNRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISKAQAGDEADYYCQVWDSNSWVFGGGTKLTVLGQPAA
서열번호 31(CP_03_F09)
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFA SYYMH WVRQAPGQGLEWMG IINPSGGSTSYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSRLRSDDTAVYYCASNRGGSYKSVGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPQSVSESPGKTVTISC TRSSGNFASKYVQ WYQQRPGSSPTTVIY ENYQRPS GVPDRFSGSIDSSSNSATLTISGLKTEDEADYYCQSYDEVSVVFGGGTQLTVLGQPAA
서열번호 32(CP_03_D09)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCEASGYTFT SYAIS WVRQAPGQGLEWMG WMNPNSGNTGYAQKFQG RVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVSSYYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPLSVSESPGKTVTISC TRSSGSIASNYVQ WYQQRPGSAPTTVIY EDNQRPS GVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYNSSNHWVFGGGTKVTVLGQPAA
수득된 항체가 TRBC1 또는 TRBC2에 결합하고 유의미하게 교차반응하지 않으면, 상기 아미노산 서열의 변이체들 역시 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로 그러한 변이체는 상기 명시된 서열 중 하나와 높은 정도의 서열 동일성을 갖는다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 본 기술분야에서 널리 알려져 있다.
NCBI 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool; BLAST)는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용하기 위해, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI, Bethesda, Md.)를 포함하는 그리고 인터넷상의 몇 가지 공급원으로부터 이용가능하다. 이 프로그램을 이용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 인터넷 상의 NCBI 웹사이트 상에서 이용가능하다.
VL 또는 VH 도메인 또는 scFv의 변이체는 전형적으로 서열번호 1-3, 13-32로 제시된 서열과 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
전형적으로 변이체는 원래의 아미노산 또는 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 보존적 치환은 TRBC1 또는 TRBC2에 결합하는 항체의 친화성에 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환이다. 예를 들어, TRBC1 또는 TRBC2에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 서열번호 1-3 또는 13-32로 제시되는 서열 중 어느 것과 비교하여 VH 또는 VL 중 하나 또는 둘 모두에서 최대 1, 최대 2, 최대 5, 최대 10, 또는 최대 15개의 보존적 치환을 포함할 수 있고 TRBC1 또는 TRBC2에 대한 특이적 결합을 보유할 수 있다.
보존적 치환에 의해 교환될 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 널리 알려져 있다. 하기 6개의 그룹이 서로 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예이다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
항체의 제조
항체의 제조는 표준 실험실 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 항체는 동물 혈청으로부터 수득될 수 있거나, 또는, 단일클론 항체 또는 이의 단편의 경우, 세포 배양에서 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술이 박테리아 또는 포유동물 세포 배양에서, 확립된 과정에 따라 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
단일클론 항체의 생산 방법은 본 기술분야에서 널리 알려져 있다. 요약하면, 단일클론 항체는 전형적으로 골수종 세포를 원하는 항원으로 면역화된 마우스 또는 토끼로부터의 비장 세포와 융합함으로써 제조된다. 여기에서, 상기 원하는 항원은 TRBC1 또는 TRBC2 펩타이드이거나, 또는 TRBC1 또는 TRBC2 중 하나를 포함하는 TCRβ 사슬이다.
대안적으로, 항체 및 관련 분자, 특히 scFv는 재조합 방식으로 VH 및 VL 사슬의 라이브러리를 조합함으로써 면역 체계 외부에서 제조될 수 있다. 그러한 라이브러리는 실시예 12에 기재된 바와 같이 파아지-디스플레이 기술을 이용하여 제작되고 스크리닝될 수 있다.
TRBC1/TRBC2 선택적 항체의 확인
TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 대해 선택적인 항체는 본 기술분야에서 표준 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 항체의 결합 특이성을 결정하는 방법은, 비제한적으로, ELISA, 웨스턴 블랏, 면역조직화학, 유세포분석, 포스터 공명 에너지 전달(FRET), 파아지 디스플레이 라이브러리, 효모 2-혼성체 스크린, 공동-면역침전, 2분자 형광 상보성(bimolecular fluorescence complementation) 및 직렬 친화성 정제(tandem affinity purification)를 포함한다.
TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 대해 선택적인 항체를 확인하기 위해, TRBC1 및 TRBC2 각각에 대한 항체의 결합이 평가된다. 전형적으로, 이것은 개별적으로 각 TRBC에 대한 항체의 결합을 결정함으로써 평가된다. 선택적인 항체는 다른 TRBC에 유의미한 결합 없이 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나에 결합한다.
항체 모방체
상기 제제는 대안적으로 면역글로불린으로부터 유래되거나 기반하지 않은 분자일 수 있다. 많은 "항체 모방체" 설계된 반복 단백질(DRP)이 비-항체 폴리펩타이드의 결합능을 이용하기 위해 개발되어 왔다.
안키린 또는 류신-풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 항체와 달리, 세포내에 그리고 세포외에 존재하는 유비쿼터스 결합 분자이다. 이들의 독특한 모듈식 구조(modular architecture)는 반복성 구조 단위(반복)를 특징으로 하며, 이는 함께 쌓여 가변 및 모듈식 표적-결합 표면을 디스플레이하는 연장된 반복 도메인을 형성한다. 이 모듈성에 기초하여, 매우 다양한 결합 특이성을 갖는 폴리펩타이드의 조합 라이브러리가 생성될 수 있다. DARPin(설계된 안키린 반복 단백질)은 이 기술에 기초한 항체 모방체의 한 가지 예이다.
안티칼린의 경우, 결합 특이성은 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 생리학적 전달 및 저장과 연관된 다양한 생체내 기능을 수행하는 단백질의 집단인, 리포칼린으로부터 유래된다. 리포칼린은 상기 단백질의 하나의 말단에 있는 4개의 루프를 지지하는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 탄탄한 고유의 구조를 갖는다. 결합 포켓으로의 진입을 위한 이들 루프 및 상기 분자의 이 부분에서 형태적 차이가 상이한 리포칼린 간의 결합 특이성에서의 변화를 설명한다.
아비머(avimer)는 시험관내 엑손 셔플링(shuffling) 및 파아지 디스플레이에 의해 인간의 세포외 수용체 도메인의 거대한 집단으로부터 진화되어, 결합 및 억제 특성을 갖는 다중-도메인 단백질을 생성한다.
베라바디(versabody)는 높은 디설파이드 밀도 골격을 형성하는 >15% 시스테인을 갖는 3-5kDa의 작은 단백질이며, 대부분의 단백질에 존재하는 소수성 코어를 대체한다. 소수성 코어를 포함하는, 상당히 많은 수의 소수성 아미노산을 적은 수의 디설파이드로 대체하는 것은, 더 작고, 더 친화성이고, 프로테아제 및 열에 더 내성이며, 더 낮은 밀도의 T 세포 에피토프를 갖는 단백질을 야기한다. 이러한 4개의 특성 모두는 상당히 감소된 면역원성을 갖는 단백질을 야기한다. 이들은 또한 대장균에서 제작될 수 있고, 매우 가용성이며 안정하다.
접합체
항체 또는 모방체는 항체 또는 모방체 및 또 다른 제제 또는 항체의 접합체일 수 있고, 예를 들어 상기 접합체는 검출가능한 독립체 또는 화학요법 독립체일 수 있다.
상기 검출가능한 독립체는 형광성 모이어티, 예를 들어 형광성 펩타이드일 수 있다. "형광성 펩타이드"는, 여기(excitation) 후 검출가능한 파장에서 빛을 발하는 폴리펩타이드를 가리킨다. 형광성 단백질의 예는, 비제한적으로, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 알로피코시아닌(APC), 녹색 형광성 단백질(GFP), 향상된 GFP, 적색 형광성 단백질(RFP), 청색 형광성 단백질(BFP) 및 mCherry를 포함한다.
검출가능한 독립체에 접합된 선택적 TRBC1 또는 TRBC2 제제는 악성 T 세포의 TRBC를 결정하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 화학요법 독립체는 세포에게 유해한 독립체, 즉 세포의 생존율을 감소시키는 독립체를 가리킨다. 화학요법 독립체는 세포독성 약물일 수 있다. 고려된 화학요법 제제는, 비제한적으로, 알킬화제, 니트로우레아, 에틸렌이민/메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 항대사성물질, 피리딘 유사체, 에피포도필로톡신, 효소, 예컨대 L-아스파라기나아제; 생물학적 반응 변형제, 예컨대 IFNα, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 백금 배위 착물, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴, 안트라센디온, 치환된 우레아, 예컨대 하이드록시우레아, 메틸하이드라진 유도체, 예컨대 N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카바진, 부신피질 억제제, 예컨대 미토탄(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티마이드; 호르몬 및 길항제, 예컨대 부신피질스페로이드 길항제, 예컨대 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티마이드; 프로게스틴, 예컨대 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜; 안드로겐, 예컨대 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물; 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드; 및 비-스테로이드성 항안드로겐, 예컨대 플루타미드를 포함한다.
화학요법 독립체에 접합된 TRBC 선택적 제제는 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현하는 세포에게 상기 화학요법 독립체의 표적화된 전달을 가능하게 한다.
이중-특이적 T 세포 관여체(engager)
2개의 항체-유사 결합 도메인을 갖는 기본 개념에 기초한 광범위한 분자들이 개발되어 왔다.
이중특이적 T 세포 관여 분자는, 주로 항암 약물로서 사용하기 위해 개발되어 온 이중특이적 항체-유형 분자의 부류이다. 이들은 숙주의 면역 체계, 더욱 구체적으로 암세포와 같은 표적 세포에 대한 T 세포의 세포독성 활성을 지향한다. 이들 분자에서, 하나의 결합 도메인은 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 결합 도메인은 종양 세포와 같은 표적 세포에 결합한다(종양 특이적 분자를 통해). 이중특이적 분자는 표적 세포 및 T 세포 모두에 결합하므로, 이중특이적 분자는 표적 세포를 T 세포와 근접하게 하여, T 세포가 그의 효과, 예를 들어, 암세포에 대한 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. T 세포:이중특이적 Ab:암세포 복합체의 형성은 T 세포에서 신호전달을 유도하여, 예를 들어, 세포독성 매개자의 방출을 야기한다. 이상적으로, 상기 제제만이 표적 세포의 존재시 원하는 신호전달을 유도하여, 선택적 사멸을 야기한다.
이중특이적 T 세포 관여 분자들이 많은 상이한 포맷으로 개발되어 왔지만, 가장 흔한 것 중 하나는 상이한 항체의 2개의 단일-사슬 가변 단편(scFv)으로 이루어진 융합이다. 이들은 종종 BiTE(이중특이적 T 세포 관여체)로서 알려져 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 제제는 TRBC1 또는 TRBC2를 선택적으로 인식하고 T 세포를 활성화시킬 수 있는 이중특이적 분자일 수 있다. 예를 들어 상기 제제는 BiTE일 수 있다. 상기 방법에서 사용되는 상기 제제는
(i) TRBC1 또는 TRBC2 중 하나에 결합하는 제1 도메인; 및
(ii) T 세포를 활성화시킬 수 있는 제2 도메인
을 포함할 수 있다:
이중특이적 분자는 그의 생산을 돕는 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 이중특이적 분자가 숙주 세포에 의해 분비되도록 할 수 있으며, 이로써 이중특이적 분자가 숙주 세포 상청액으로부터 수확될 수 있다.
신호 펩타이드는 상기 분자의 아미노 말단에 있을 수 있다. 상기 이중특이적 분자는 하기 일반식을 가질 수 있다: 신호 펩타이드 - 제1 도메인 - 제2 도메인.
상기 이중특이적 분자는 제1 도메인을 제2 도메인과 연결하고 상기 2개의 도메인을 공간적으로 분리시키는 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
상기 스페이서 서열은, 예를 들어, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기(stalk)를 포함할 수 있다. 상기 링커는 대안적으로 IgG1 힌지 또는 CD8 줄기와 유사한 길이 및/또는 도메인 스페이싱 특성을 갖는 대안적인 링커 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중특이적 분자는, 상기 정의한 바와 같이, JOVI-1, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 T 세포 수용체, 인공 T 세포 수용체 및 키메라 면역수용체로도 알려진 키메라 항원 수용체(CAR)는 조작된 수용체이며, 이는 면역 효과기 세포 상에 임의적인 특이성을 접목한다. 고전적인 CAR에서, 단일클론 항체의 특이성이 T 세포 상에 접목된다. CAR-인코딩 핵산은, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 이용하여 T 세포로 옮겨질 수 있다. 이러한 방식으로, 상당히 많은 암-특이적 T 세포들이 입양 세포 전이(adoptive cell transfer)를 위해 생성될 수 있다. 이러한 접근법의 I상 임상 연구는 효능을 나타낸다.
CAR의 표적-항원 결합 도메인은 흔히 스페이서 및 막통과 도메인을 통해 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하거나 연관된 엔도도메인에 융합된다. CAR이 표적-항원에 결합할 때, 이것은 그것이 발현되는 T 세포에 활성화 신호의 전달을 야기한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 제제는 TRBC1 또는 TRBC2를 선택적으로 인식하는 CAR일 수 있다. 상기 제제는 TRBC1 또는 TRBC2를 선택적으로 인식하는 CAR을 발현하는 T 세포일 수 있다.
상기 CAR은 또한 막에 걸쳐있는 막통과 도메인을 포함할 수 있다. 그것은 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 상기 막통과 도메인은 CD28로부터 유래될 수 있고, 이는 우수한 수용체 안정성을 제공한다.
엔도도메인은 신호 전달에 관여하는 CAR의 부분이다. 상기 엔도도메인은 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하거나 이와 연관된다. 항원 인식 후, 수용체들이 밀집하고 신호가 세포에 전달된다. 가장 흔히 사용되는 T 세포 신호전달 요소는 3 ITAM을 함유하는 CD3-제타의 요소이다. 이것은 항원이 결합된 후 T 세포에게 활성화 신호를 전달한다. CD3-제타는 완전히 능숙한 활성화 신호를 제공하지 않을 수 있고, 부가적인 공동-자극 신호전달이 필요할 수 있다. 예를 들어, 키메라 CD28 및 OX40은 증식성 / 생존 신호를 전달하기 위해 CD3-제타와 함께 사용될 수 있거나, 또는 3개 모두는 함께 사용될 수 있다.
CAR의 엔도도메인은 CD28 엔도도메인 및 OX40 및 CD3-제타 엔도도메인을 포함할 수 있다.
CAR은 신호 펩타이드를 포함할 수 있어서, CAR이 세포, 예컨대 T 세포 내에서 발현될 때, 초기(nascent) 단백질이 소포체로 보내지고, 이후 세포 표면으로 보내져, 그 곳에서 발현된다.
CAR은 TRBC-결합 도메인을 막통과 도메인과 연결하고 TRBC-결합 도메인을 엔도도메인과 공간적으로 분리하는 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 유연성(flexible) 스페이서는 TRBC 결합을 가능하게 하기 위해 TRBC-결합 도메인을 상이한 방향으로 지향하게 한다.
상기 스페이서 서열은, 예를 들어, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 링커는 대안적으로 IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기와 유사한 길이 및/또는 도메인 스페이싱 특성을 갖는 대안적인 링커 서열을 포함할 수 있다.
IgG1 힌지 또는 CD8 줄기에 기반한 스페이서를 포함하는 CAR이 Jurkat 세포에 대해 최상의 성능을 나타낸 것으로 나타났다(도 15). 따라서, 상기 스페이서는 IgG1 힌지 또는 CD8 줄기 또는 IgG1 힌지 또는 CD8 줄기와 유사한 길이 및/또는 도메인 스페이싱 특성을 갖는 스페이서를 포함할 수 있다.
인간 IgG1 스페이서는 Fc 결합 모티프를 제거하기 위해 변이될 수 있다.
CAR는, 상기에 정의된 바와 같이, JOVI-1 항체, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
CAR은 서열번호 33, 34 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
>서열번호_33 CD8 줄기 스페이서를 갖는 JOVI-1 CAR
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>서열번호_34 H-CH2-CH3pvaa 스페이서를 갖는 JOVI-1 CAR
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>서열번호_35 IgG1 힌지 스페이서를 갖는 JOVI-1 CAR
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상기 제시된 CAR 서열에서, 수득한 CAR이 TRBC1에 결합하는 능력을 보유하면, 상기 6개 CDR 중 하나 이상은 각각 독립적으로 서열번호 7 내지 12로서 제시된 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예컨대, 치환)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
상기 아미노산 서열의 변이체는, 수득된 CAR이 TRBC1 또는 TRBC2에 결합하고 유의미하게 교차반응하지 않으면, 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로 상기 변이체는 서열번호 33, 34 또는 35로서 제시된 서열 중 하나와 높은 정도의 서열 동일성을 갖는다.
CAR의 변이체는 전형적으로 서열번호 33, 34 및 35로서 제시된 서열 중 하나와 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
핵산
본 발명은 본 발명의 제1 양태의 BiTE 또는 CAR과 같은 제제를 인코딩하는 핵산을 추가적으로 제공한다.
상기 핵산 서열은 서열번호 33, 34 및 35로 표시된 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 CAR을 인코딩할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", 및 "핵산"은 서로 동의어인 것으로 의도된다.
많은 상이한 폴리뉴클레오타이드 및 핵산이 유전적 코드의 축퇴성의 결과로서 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있음이 숙련가에 의해 이해될 것이다. 또한, 숙련가가 일상적인 기술을 이용하여, 폴리펩타이드가 발현될 어느 특정한 숙주 유기체의 코돈 용법을 반영하기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환을 수행할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일-가닥이거나 이중-가닥일 수 있다. 이들은 또한 이들 내에 합성 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 많은 상이한 유형의 변형이 본 기술분야에서 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본, 상기 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리라이신 사슬의 부가를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 용도의 목적을 위해, 상기 폴리뉴클레오타이드가 본 기술분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 그러한 변형은 관심있는 폴리뉴클레오타이드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
뉴클레오타이드 서열과 관련하여 용어 "변이체", "동족체" 또는 "유도체"는 상기 서열로부터 또는 상기 서열에 대한 하나의(또는 하나 이상의) 핵산의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 또는 부가를 포함한다.
벡터
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 서열(들)을 포함하는, 벡터, 또는 벡터의 키트를 제공한다. 그러한 벡터는, 상기 벡터가 본 발명의 제1 양태에 따라 CAR을 발현하도록, 상기 핵산 서열(들)을 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다.
상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포손 기반의 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
상기 벡터는 T 세포 또는 NK 세포를 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있다.
세포
본 발명은 또한 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 포함하는, 세포, 예컨대 면역 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 세포는 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포일 수 있다.
T 세포는 세포-매개성 면역에서 중추적인 역할을 하는 림프구의 유형인 T 세포 또는 T 림프구일 수 있다. 이들은 세포 표면상에 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해, 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다. 하기에 요약된 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 있다.
헬퍼 T 세포(TH 세포)는 B 세포의 혈장 세포 및 기억 B 세포로의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는, 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 돕는다. TH 세포는 그들의 표면상에 CD4를 발현한다. TH 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면상에서 MHC 계열 II 분자에 의해 이들에게 펩타이드 항원이 제시될 때 활성화된다. 이들 세포는 TH1, TH2, TH3, TH17, Th9, 또는 TFH를 포함하는 몇 가지 아형 중 하나로 분화될 수 있고, 이는 상이한 유형의 면역 반응을 용이하게 하는 상이한 사이토카인을 분비한다.
세포용해성(Cytolytic) T 세포(TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루되어 있다. CTL은 그들의 표면에 CD8을 발현한다. 이들 세포는, 모든 제핵된 세포의 표면 상에 존재하는, MHC 계열 I과 연관된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다. IL-10, 아데노신 및 조절성 T 세포에 의해 분비된 다른 분자를 통해, CD8+ 세포는 무반응 상태(anergic state)로 불활성화될 수 있고, 이는 실험적 자가면역 뇌척수염과 같은 자가면역 질환을 예방한다.
기억 T 세포는 감염이 치유된 후 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 하위집단이다. 이들은 이들의 동족 항원에 재노출시 상당한 수의 효과기 T 세포로 빠르게 확장하여, 면역 체계에 과거 감염에 대한 "기억"을 제공한다. 기억 T 세포는 3개의 아형을 포함한다: 중심 기억 T 세포(TCM 세포) 및 2가지 유형의 효과기 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포). 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 중 하나일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO을 발현한다.
이전에 억제자 T 세포로서 알려진, 조절성 T 세포(Treg 세포)는 면역학적 내성의 유지에 있어 매우 중요하다. 이들의 주요 역할은 면역 반응의 종결 쪽으로 T 세포-매개성 면역을 정지시키는 것 및 흉선에서 음성 선택(negative selectiion)의 과정을 회피한 자가-반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
CD4+ Treg 세포의 2가지 주요 계열이 기술되어 왔다 ― 자연적으로 존재하는 Treg 세포 및 적응성 Treg 세포.
자연적으로 존재하는 Treg 세포(CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로도 알려짐)는 흉선에서 발생하며 TSLP로 활성화된 골수성(CD11c+) 및 형질세포양(plasmacytoid)(CD123+) 수지상 세포 모두와의 발달하는 T 세포 사이의 상호작용과 연관되어 왔다. 자연적으로 존재하는 Treg 세포는 FoxP3로 불리는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별될 수 있다. FOXP3 유전자의 돌연변이는 조절성 T 세포 발달을 방지하여, 치명적인 자가면역 질환 IPEX를 야기할 수 있다.
적응성 Treg 세포(Tr1 세포 또는 Th3 세포로도 알려짐)는 정상 면역 반응 동안 비롯될 수 있다.
상기 세포는 자연 살해 세포(또는 NK 세포)일 수 있다. NK 세포는 선천성 면역 체계의 일부를 형성한다. NK 세포는 MHC 독립적 방식으로 바이러스로 감염된 세포로부터의 선천성 신호에 대한 빠른 반응을 제공한다.
NK 세포(선천성 림프계 세포의 군에 속함)는 거대 과립 림프구(LGL)로서 정의되며 B 및 T 림프구를 생성하는 공통의 림프계 선조(progenitor)로부터 분화된 3 종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화하고 성숙하는 것으로 알려져 있고, 이곳에서 이후에 이들은 순환내로 들어간다.
본 발명의 CAR 세포는 상기 언급한 세포 유형 중 어느 것일 수 있다.
본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 발현하는 T 또는 NK 세포는 환자 자신의 말초 혈액로부터(1st party), 또는 공여자 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포 이식편의 환경에서(2nd party), 또는 관련없는 공여자로부터의 말초 혈액으로부터(3rd party) 생체외에서 만들어질 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 발현하는 T 또는 NK 세포는 유도성 선조 세포 또는 배아 선조 세포의 T 또는 NK 세포로의 생체외 분화로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 그의 용균 기능을 보유하고 치료제로서 작용할 수 있는 불멸화된 T 세포주가 사용될 수 있다.
이러한 모든 구현예에서, CAR 세포는 바이러스 벡터를 이용한 형질도입, DNA 또는 RNA를 이용한 형질감염을 포함하는 많은 수단 중 하나에 의해 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA을 도입함으로써 생성된다.
본 발명의 CAR 세포는 대상으로부터의 생체외 T 또는 NK 세포일 수 있다. 상기 T 또는 NK 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플로부터 유래될 수 있다. T 또는 NK 세포는, 예를 들어 항-CD3 단일클론 항체를 이용한 처리에 의해, 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질도입되기 전에 활성화되고/거나 확장될 수 있다 .
본 발명의 T 또는 NK 세포는
(i) 대상 또는 상기 열거된 다른 공급원으로부터 T 또는 NK 세포-함유 샘플의 단리; 및
(ii) 본 발명의 CAR을 인코딩하는 핵산 서열(들)로 T 또는 NK 세포의 형질도입 또는 형질감염
에 의해 제조될 수 있다:
그리고 나서, 상기 T 또는 NK 세포는 정제될 수 있고, 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드의 항원 결합 도메인의 발현에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR을 포함하는 T 또는 NK 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 제1 양태의 CAR을 발현하는 복수의 세포를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 부가적으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 약제학적으로 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 임의로 포함할 수 있다. 그러한 제형은, 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태일 수 있다.
T 세포 림프종 및/또는 백혈병
본 발명은 T 세포 림프종 및/또는 백혈병을 치료하기 위한 제제, 세포 및 방법에 관한 것이다.
T 세포 림프종 및/또는 백혈병을 치료하는 방법은 제제의 치료적 용도에 관한 것이다. 여기에서, 상기 제제는 상기 질환과 연관된 적어도 하나의 증상을 줄이거나, 감소시키거나 또는 개선하기 위하여, 및/또는 상기 질환의 진행을 늦추거나, 감소시키거나 또는 차단하기 위하여, T 세포 림프종 및/또는 백혈병의 질환을 현재 앓고 있는 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 β 불변 영역을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 세포의 클론 확장과 연관된 어느 림프종 및/또는 백혈병의 치료를 위해 사용될 수 있다. 그와 같이, 본 발명은 TRBC를 포함하는 TCR을 발현하는 악성 T 세포를 수반하는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 악성 T 세포가 TRBC를 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다. '림프종'은 전형적으로 림프절에서 생기지만, 비장, 골수, 혈액 및 다른 장기에도 영향을 미칠 수 있는 암을 가리키기 위해 그의 표준 의미에 따라 본원에서 사용된다. 림프종은 전형적으로 림프계 세포의 고형 종양으로서 나타난다. 이차(B) 증상이 열병, 도한, 체중 감소, 식욕 상실, 피로, 호흡 장애 및 가려움을 포함할 수 있음에도 불구하고, 림프종과 연관한 일차 증상은 림프절종대(lymphadenopathy)이다.
본 발명의 방법은 악성 T 세포가 TRBC를 포함하는 TCR을 발현하는 T 세포 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. '백혈병'은 혈액 또는 골수의 암을 가리키기 위해 그의 표준 의미에 따라 본원에서 사용된다.
하기는 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 질환의 예시적인, 비포괄적인 목록이다.
말초 T 세포 림프종
말초 T 세포 림프종은 상대적으로 희귀한 림프종이며 모든 비-호지킨 림프종(NHL)의 10% 미만을 차지한다. 그러나 이들은 공격적인 임상 경로와 연관되며, 대부분의 T 세포 림프종의 원인 및 정확한 세포 기원은 여전히 잘 확인되지 않고 있다.
림프종은 일반적으로 처음에는 목, 겨드랑이 또는 사타구니에서 팽윤으로서 나타난다. 다른 림프절이 예컨대 비장에 위치하는 경우 추가적인 팽윤이 일어날 수 있다. 일반적으로, 확대된 림프절은 혈관, 신경, 또는 위의 공간을 침입하여, 각각 팽윤된 팔과 다리, 따끔함 및 무감각, 또는 배부른 느낌을 야기할 수 있다. 림프종 증상은 또한 비특이적 증상, 예컨대 열병, 오한, 원인불명의 체중 감소, 도한, 무기력, 및 가려움을 포함한다.
말초 T 세포 림프종을 위한 예후적으로 그리고 치료적으로 의미있는 분류를 기술하기 위하여, WHO 분류는 임상적 측면 및 일부 경우 유전학과 함께 형태학적 및 면역표현형 특색을 이용한다(Swerdlow et　al.;　WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. 4th ed.; Lyon: IARC Press; 2008). 신생 T 세포의 해부학적 국소화는 이들의 제안된 정상 세포 상대방 및 기능과 일부 유사하며, 그와 같이 T 세포 림프종은 림프절 및 말초 혈액과 연관된다. 이러한 접근법은 이들의 세포 분포, 형태학의 일부 측면 및 나아가 연관된 임상학적 발견을 포함하는, T 세포 림프종의 징후 중 일부를 더 잘 이해할 수 있게 한다.
T 세포 림프종의 가장 흔한 것은 전체적으로 25%를 차지하는 상세불명의 말초 T 세포 림프종(PTCL-NOS)이며, 그 다음으로 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL)(18.5%)이다
상세불명의 말초 T 세포 림프종(PTCL-NOS)
PTCL-NOS는 모든 말초 T 세포 림프종 및 NK/T 세포 림프종의 25%를 넘게 차지하며 가장 흔한 아형이다. 그것은 배제 진단(diagnosis of exclusion)에 의해 결정되며, 현재 WHO 2008에 열거된 특이적 성숙한 T 세포 림프종 독립체 중 어느 것에도 상응하지 않는다. 그와 같이, 그것은 상세불명의 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL-NOS)과 유사하다.
대부분의 환자는 60세의 평균 연령을 갖는 성인이고 남성 대 여성 비는 2:1이다. 대부분의 사례는 림프절 기원이지만, 림프절외 표시가 환자의 거의 13%에서 일어나고 가장 흔하게는 피부 및 위장관을 포함한다.
상기 세포학적 스펙트럼은 다형성에서 단형성까지 매우 다양하다. 세 가지 형태학적으로 규명된 변이체가 기술되어 왔으며, 이들은 림프상피모양(lymphoepithelioid(Lennert)) 변이체, T-영역 변이체 및 여포성(follicular) 변이체를 포함한다. PTCL의 림프상피모양 변이체는 풍부한 백그라운드 유상피조직구(epithelioid histiocyte)를 함유하고 CD8에 대해 일반적으로 양성이다. 그것은 더 좋은 예후와 연관되어 왔다. PTCL-NOS의 여포성 변이체는 잠재적으로 구별되는 임상병리학적 독립체로서 떠오르고 있다.
대다수의 PTCL-NOS는 성숙한 T 세포 표현형을 가지며 대부분의 사례는 CD4-양성이다. 사례 중 75%는 적어도 하나의 범 T 세포 마커(CD3, CD2, CD5 또는 CD7)의 다양한 손실을 나타내며, CD7 및 CD5가 가장 자주 하향조절된다. CD30 및 드물게 CD15가 발현될 수 있고, CD15가 부정적인 예후 특징이다. CD56 발현은, 흔하지 않음에도 불구하고, 음성 예후 영향을 갖는다. 부가적인 부정적인 병리학적 예후 인자는 KI-67 발현에 기초한 25%를 초과하는 증식률, 및 70%를 초과하는 형질전환된 세포의 존재를 포함한다. 이들 림프종의 면역표현형 분석은 이들의 생물학에 대한 통찰력을 거의 제공하지 못하였다.
혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL)
AITL은 림프절을 수반하는 다형성 침윤, 두드러진 고 내피 세정맥(high endothelial venule; HEV) 및 여포 수지상 세포(follicular dendritic cell; FDC) 망사(meshwork)의 혈관주위 팽창을 특징으로 하는 전신성 질환이다. AITL은 일반적으로 배 중심(germinal centre)에서 발견되는, 여포성 헬퍼 유형(TFH)의 αβ T 세포로부터 유래된 드노보(de-novo) T 세포 림프종으로서 간주된다.
AITL은 말초 T 세포 림프종 및 NK/T 세포 림프종 중에서 두 번째로 가장 흔한 독립체이며, 사례의 약 18.5%를 차지한다. 그것은 중년부터 노인까지 발생하며, 평균 연령은 65세이고, 남성과 여성에서 거의 동일하게 발병한다. 임상적으로, 환자는 일반적으로 전신적 림프절종대(lymphadenopathy), 간비장비대(hepatosplenomegaly) 및 두드러진 체질 증상과 함께, 진전된 병기 질환을 갖는다. 관련된 소양증과 함께 피부 발진이 흔히 존재한다. 종종 자가면역 현상과 연관된 다클론 고감마글로불린혈증이 있다.
3가지 상이한 형태학적 패턴이 AITL에서 기술된다. AITL의 초기 병변(패턴 I)은 일반적으로 특징적인 과형성 여포를 갖는 보존된 구조를 나타낸다. 상기 신생 증식은 여포의 주변부(periphery)에 국소화된다. 패턴 II에서, 림프절 구조는 적은 퇴화된 여포의 보유로 부분적으로 사라진다. 피막하동(subcapsular sinus)은 보존되고 심지어 팽창된다. 부피질(paracortex)은 분지(arborizing) HEV를 함유하고, B-세포 여포를 넘어 FDC의 증식이 존재한다. 신생 세포는 크기가 작거나 중간이며 세포학적 이형성(cytologic atypia)을 갖는다. 이들은 종종 맑거나 창백한 세포질을 가지며, 구별되는 T 세포막을 나타낼 수 있다. 다형성 염증성 배경이 일반적으로 명백하다.
AITL은 T 세포 악성종양임에도 불구하고, B-세포 및 혈장 세포의 특징적인 팽창이 있으며, 이는 아마도 TFH 세포로서 신생 세포의 기능을 반영한다. EBV-양성 및 EBV-음성 B-세포 모두가 존재한다. 가끔, 비전형적인 B-세포는 형태학적으로 그리고 면역표현형적으로 호지킨(Hodgkin)/리드-스턴버그(Reed-Sternberg)-유사 세포와 유사할 수 있으며, 이는 종종 상기 독립체와 진단상의 혼동을 야기한다. AITL에서 B-세포 증식은 광범위할 수 있고, 일부 환자는 종종 형질세포 분화(plasmacytic differentiation)와 함께, 2차 EBV-양성 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 또는 - 더 드물게는 - EBV-음성 B-세포 종양이 생긴다.
AITL의 신생 CD4-양성 T 세포는 CD10 및 CD279(PD-1)의 강한 발현을 나타내고 CXCL13에 대해 양성이다. CXCL13은 HEV에의 부착을 통한 림프절로의 증가된 B-세포 동원, B-세포 활성화, 형질세포 분화 및 FDC 망상의 확장을 야기하여, 이들 모두는 AITL의 형태적 및 임상적 특징에 기여한다. 여포주위의 종양 세포에서의 강한 PD-1-발현은 AITL 패턴 I을 반응성 여포성 및 부피질성 림프과형성과 구별하는데 특히 도움이 된다.
PTCL-NOS의 여포성 변이체는 TFH 표현형을 갖는 또 다른 독립체이다. AITL과 대조적으로, 그것은 두드러진 HEV 또는 FDC 망상의 여포외 팽창을 가지지 않는다. 신생 세포는 B-세포 여포체성 림프종을 모방하는 여포내 응집체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 여포내 성장 패턴을 가질 수 있거나 확장된 맨틀 영역을 포함할 수 있다. 임상적으로, PTCL-NOS의 여포성 변이체는 환자들이 부분적인 림프절 침습(involvement)을 갖는 초기 병기 질환을 더 자주 나타내므로 AITL과 구별되며, AITL과 연관된 체질 증상이 부족할 수 있다.
역형성 대세포 림프종(ALCL)
ALCL은 ALCL-'역형성 림프종 키나아제'(ALK)+ 또는 ALCL-ALK-로서 하위분류될 수 있다.
ALCL-ALK+는 말초 T 세포 림프종 내에서 가장 잘 규명된 독립체 중 하나로서, 특징적인 "특징(hallmark) 세포"가 말편자형(horseshoe-shaped) 핵을 갖고 ALK 및 CD30을 발현한다. 그것은 모든 말초 T 세포 및 NK-세포 림프종의 약 7%를 차지하며 생애 중 첫 30년에 가장 흔하다. 환자는 종종 림프절종대를 나타내지만, 림프절외 부위(피부, 뼈, 연조직, 폐, 간)의 침습 및 B 증상이 흔하다.
ALCL, ALK+는 광범위한 형태학적 스펙트럼을 나타내고, 5개의 상이한 패턴이 기술되었지만, 모든 변이체들은 일부 특징 세포를 함유한다. 특징 세포는 기이한 말편자형 또는 신장-모양의 핵, 및 돌출된 핵주위 호산성 골지 영역을 갖는다. 상기 종양 세포는 부비강 침범을 편애하는 응집력있는 패턴으로 성장한다. 더 작은 종양 세포가 작은 세포 변이체에서 우세하며, 림프조직구성(lymphohistiocytic) 변이체에서 풍부한 조직구(histiocyte)가 종양 세포(많은 종양 세포는 작음)의 존재를 이의 많은 것은 작음)의 존재를 가린다.
정의상, 모든 사례는 ALK 및 CD30 양성을 나타내며, 발현은 일반적으로 더 작은 종양 세포에서 더 약하다. 종종 범-T 세포 마커의 손실이 있으며, 사례의 75%는 CD3의 표면 발현이 부족하다.
ALK 발현은 많은 파트너 유전자 중 하나에 대한 염색체 2p23 상의 ALK 유전자의 재배열로 구성된 특징적인 반복되는 유전적 변이의 결과이며, 이는 키메라 다백질의 발현을 야기한다. 사례의 75%에서 일어나는, 가장 흔한 파트너 유전자는 염색체 5q35 상의 뉴클레오포스민(Nucleophosmin; NPM1)이며, 이는 t(2;5)(p23;q35)을 야기한다. 상이한 전좌 변이체에서 ALK의 세포 분포는 상기 파트너 유전자에 따라 달라질 수 있다.
ALCL-ALK-는 2008 WHO 분류에서 예비적 카테고리로서 포함된다. 그것은 응집력있는 성장 패턴 및 특징 세포의 존재를 가지나 ALK 단백질 발현이 부족한, ALCL-ALK+와 형태학적으로 구별될 수 없는 CD30 양성 T 세포 림프종으로서 정의된다.
환자는 일반적으로, 어린이 및 젊은 성인에서 더 흔한 ALCL-ALK+와 대조적으로, 40 내지 65세의 연령의 성인다. ALCL-ALK-는 림프절 및 림프절외 조직 모두를 수반할 수 있고, 후자가 ALCL-ALK+보다 덜 흔하게 나타냄에도 그러하다. ALCL-ALK-의 모든 사례는 전형적인 "특징" 특색을 갖는 응집력있는 신생 세포의 시트에 의한 림프절 구조의 말소(effacement)를 입증한다. ALCL-ALK+와 대조적으로, 작은 세포 형태학적 변이체는 인식되지 않는다.
그의 ALK+ 상대방과는 달리, ALCL-ALK-는 표면 T 세포 마커 발현의 더 큰 보존을 나타내는 반면, 세포독성 마커 및 내피 막 항원(EMA)의 발현은 덜 나타낼 가능성이 있다. 유전자 발현 서명(signature) 및 반복되는 염색체 불균형은 ALCL-ALK- 및 ALCL-ALK+에서 상이하며, 이는 이들이 분자적 및 유전적 수준에서 구별되는 독립체라는 것을 확인시켜 준다.
ALCL-ALK-는 이들 3가지 상이한 독립체 사이에서 예후에서의 유의미한 차이와 함께, ALCL-ALK+ 및 PTCL-NOS 모두와 임상적으로 구별된다. ALCL-ALK-의 5년 총 생존은 49%로 보고되며, 이는 ALCL-ALK+(70%)만큼 좋지 않지만, 동시에 그것은 PTCL- NOS(32%)보다 유의미하게 더 좋다.
장질환 관련 T 세포 림프종(EATL)　
EATL은 장의 상피내 T 세포로부터 유래된 것으로 여겨진 공격적인 신생물이다. EATL의 2개의 형태학적으로, 면역조직학적으로 그리고 유전적으로 구별되는 유형이 2008 WHO 분류에서 인식된다: 유형 I(EATL의 대부분에 해당함) 및 유형 II(사례의 10-20%를 차지함).
유형 I EATL은 일반적으로 현성(overt) 또는 임상적으로 침묵인 글루텐-민감성 장질환과 연관되며, 북유럽 출신의 환자에서 더 자주 관찰되며, 이 집단에서의 소아지방변증(celiac disease)의 높은 확산으로 인해 그러하다.
가장 흔하게는, EATL의 병변은 공장(jejunum) 또는 회장(ileum)(사례의 90%)에서 발견되며, 드물게 십이지장, 결장, 위, 또는 위장관 외부의 영역에서 나타난다. 장 병변은 일반적으로 점막 궤양형성과 함께 다병소성(multifocal)이다. EATL의 임상 경과는 공격적이며, 대부분의 환자는 1년 이내에 질병 또는 질병의 합병증으로 인해 죽는다.
EATL 유형 I의 세포학적 스펙트럼은 넓고, 일부 사례는 역형성 세포를 함유할 수 있다. 다형성의 염증성 배경이 존재하며, 이는 일부 사례에서 신생 성분을 잘 보이지 않게 할 수 있다. 종양에 인접한 영역에서의 장 점막은 병변의 전구체 세포를 대표할 수 있는, 융모(villi)의 둔화 및 상피내 림프구(IEL)의 증가된 수를 갖는 소아지방변증의 특징을 종종 나타낸다.
면역조직화학에 의해, 신생 세포는 종종 CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-βF1+이며, 세포독성 과립-연관된 단백질(TIA-1, granzyme B, perforin)을 함유한다. CD30은 거의 모든 사례에서 부분적으로 발현된다. 점막 호밍(homing) 수용체인 CD103이 EATL에서 발현될 수 있다.
단형성 CD56+ 장 T 세포 림프종으로도 지칭되는 유형 II EATL은, CD8 및 CD56 모두를 발현하는 작은 크기 내지 중간 크기의 단형성 T 세포로 구성된 장 종양으로서 정의된다. 종종 점막 내에 종양의 측면 확산(lateral spread), 및 염증성 배경의 부재가 있다. 대부분의 사례는 γδ TCR을 발현하나, αβ TCR과 연관된 사례가 있다.
유형 II EATL은 유형 I EATL보다 더 광범위한 분포를 가지며 시아 또는 라틴 아메리카 집단에서 종종 관찰되고, 이 집단에서 소아지방변증은 드물다. 유럽 혈통의 개인에서, EATL II는, 사례의 적어도 하위집단에서 소아지방변증의 이력과 함께, 장 T 세포 림프종의 20%에 해당한다. 임상 경과는 공격적이다.
간비장 T 세포 림프종(HSTL)　
HSTL은 일반적으로 선천성 면역 체계의 γδ 세포독성 T 세포로부터 유래된 공격적인 전신성 신생물이나, 그것은 또한 드문 사례에서 αβ T 세포로부터 유래될 수 있다. 그것은 가장 드문 T 세포 림프종 중 하나이며, 전형적으로 청소년 및 젊은 성인(평균 연령, 35세)에게 영향을 미치고, 강한 남성 우세를 갖는다.
비강형 림프절외 NK/T 세포 림프종
비강형 림프절외 NK/T 세포 림프종은 종종 파괴성 중앙선 병변(destructive midline lesion) 및 괴사를 갖는, 공격적인 질환이다. 대부분의 사례는 NK-세포 유래이지만, 일부 사례는 세포독성 T 세포로부터 유래된다. 그것은 보편적으로 엡스타인-바 바이러스(EBV)와 연관된다.
피부 T 세포 림프종
본 발명의 방법은 또한 피부 T 세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다.
피부 T 세포 림프종(CTCL)은 악성 T 세포의 피부로의 이동을 특징으로 하며, 이는 다양한 병변이 나타나게 한다. 이러한 병변은 질환이 진행함에 따라 모양이 변하며, 전형적으로 발진으로 보이는 것으로서 시작하여 몸의 다른 부분으로 전이하기 전에 결국 플라크 및 종양을 형성한다.
피부 T 세포 림프종은 하기 예시적인, 비-포괄적인 목록에서 언급된 것을 포함한다; 균상식육종(mycosis fungoides), 파제트병모양 망상증(pagetoid reticulosis), 세자리 증후군(Sezary syndrome), 육아종 이완 피부(granulomatous slack skin), 림프종모양 구진증(lymphomatoid papulosis), 만성 태선양 비강진(pityriasis lichenoides chronica), CD30+ 피부 T 세포 림프종, 2차 피부 CD30+ 거대 세포 림프종, 비-균상 식육종 CD30- 피부 거대 T 세포 림프종, 다형성 T 세포 림프종, 레너트(Lennert) 림프종, 피하 T 세포 림프종 및 혈관중심성 림프종.
CTCL의 징후 및 증상은 특정 질환에 따라 다양하며, 이들 중 가장 흔한 2가지 유형은 균상식육종 및 세자리 증후군이다. 고전적인 균상식육종은 3개의 병기로 나뉜다:
반점(Patch)(위축성(atrophic) 또는 비위축성): 비특이적 피부염, 하부 체간 및 엉덩이 위에 반점; 최소/부재 소양증;
플라크: 강하게 소양증을 일으키는 플라크, 림프절종대; 및
종양: 궤양형성하기 쉬움
세자리 증후군은 홍피증(erythroderma) 및 백혈병에 의해 정의된다. 징후 및 증상은 부종성 피부(edematous skin), 림프절종대(lymphadenopathy), 손바닥 및/또는 발바닥 과각화증(hyperkeratosis), 탈모증(alopecia), 조갑 이영양증(nail dystrophy), 안검외반(ectropion) 및 간비장비대(hepatosplenomegaly)를 포함한다.
모든 일차 피부 림프종 중에서, 65%는 T 세포 유형의 것이다. 가장 흔한 면역표현형은 CD4 양성이다. 용어 피부 T 세포 림프종은 광범위한 장애를 포괄하므로, 이들 질환에 대한 공통의 병리생리학은 없다.
피부 T 세포 림프종(즉, 균상식육종)의 발달을 위한 일차적인 병인론적 기전은 밝혀져 있지 않다. 균상식육종은 가끔 치명적인 림프종으로 진행할 수 있는 T 세포-매개성 만성 염증 피부 질환 이후에 시작될 수 있다.
원발성 피부 ALCL(C-ALCL)　
C-ALCL은 종종 형태학에 의해 ALC-ALK-과 구별가능하다. 그것은 역형성, 다형성 또는 면역모세포성 형태를 갖는 거대 세포의 피부 종양으로서 정의되며, 75%를 초과하는 세포들이 CD30을 발현한다. 림프종모양 구진증(Lyp)과 함께, C-ALCL은 원발성 피부 CD30-양성 T 세포 림프증식성 장애의 스펙트럼에 속하며, 이는 하나의 군으로서, 균상식육종 후 피부 T 세포 림프증식의 두 번째 가장 흔한 군을 차지한다.
면역조직화학 염색 프로파일은 ALCL-ALK-와 상당히 유사하며, 사례의 더 큰 비율이 세포독성 마커에 대해 양성을 염색한다. 종양 세포의 적어도 75%는 CD30에 대해 양성이어야 한다. CD15가 또한 발현될 수 있고, 림프절 침범이 일어날 때, 고전적인 호지킨 림프종과의 구별이 어려울 수 있다. ALCL-ALK+의 드문 사례는 피부 병변을 나타낼 수 있고, 이는 C-ALCL과 유사할 수 있다.
T 세포 급성 림프모구성 백혈병
T 세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL)은 소아 및 성인 코호트(cohort)에서 각각 ALL의 약 15% 및 25%를 차지한다. 환자는 일반적으로 높은 백혈구 세포수를 가지며, 장기비대(organomegaly), 특히 종격 확대(mediastinal enlargement) 및 CNS 침범을 나타낼 수 있다.
본 발명의 방법은 TRBC를 포함하는 TCR을 발현하는 악성 T 세포와 연관된 T-ALL을 치료하는데 사용될 수 있다.
T 세포 전림프구성 백혈병
T 세포-전림프구성 백혈병(T-PLL)은 공격적인 행동 및 혈액, 골수, 림프절, 간, 비장, 및 피부 침범에 대한 편애를 갖는 성숙한 T 세포 백혈병이다. T-PLL은 일차적으로 30세가 넘는 성인에게 영향을 미친다. 다른 이름은 T 세포 만성 림프구성(lymphocytic) 백혈병, "울퉁불퉁한(knobby)" 유형의 T 세포 백혈병, 및 T-전림프구성 백혈병/T 세포 림프구성 백혈병을 포함한다.
말초 혈액에서, T-PLL은 단일 핵을 갖는 중간 크기의 림프구 및 가끔 수포(bleb) 또는 돌기(projection)를 갖는 호염기성 세포질(basophilic cytoplasm)로 구성된다. 상기 핵은 일반적으로 둥글거나 타원형 모양이고, 가끔 환자는 세자리 증후군에서 관찰되는 대뇌모양(cerebriform) 핵 모양과 유사한 더 불규칙한 핵 경계(irregular nuclear outline)을 갖는 세포를 갖는다. 작은 세포 변이체는 모든 T-PLL 사례의 20%를 차지하고, 세자리 세포-유사(대뇌모양) 변이체가 사례의 5%에서 관찰된다.
T-PLL은 성숙한(후 흉선(post-thymic)) T-림프구의 면역표현형을 가지며, 신생 세포는 전형적으로 범-T 항원 CD2, CD3, 및 CD7에 대해 양성이고 TdT 및 CD1a에 대해 음성이다. 상기 면역표현형 CD4+/CD8-는 사례의 60%에서 존재하고, CD4+/CD8+ 면역표현형은 25%에서 존재하며, CD4-/CD8+ 면역표현형은 사례의 15%에서 존재한다.
약제학적 조성물
본 발명의 방법은 상기 제제를 약제학적 조성물의 형태로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제와 함께 투여될 수 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서(또는 이들 외에도) 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들), 및 다른 담체 제제를 포함할 수 있다.
투여
상기 제제의 투여는 활성 성분을 생체이용가능하게 만드는 다양한 경로를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 경구 및 비경구 경로에 의해, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 경피로, 근육내로, 국소 전달을 통해, 예를 들어 카테터 또는 스텐트에 의해 투여될 수 있다.
전형적으로, 의사는 각 환자에게 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이고, 그것은 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 상기 투여량은 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현하는 클론 T 세포의 수를 감소시키거나 고갈시키는데 충분한 복용량이다.
용도
본 발명은 또한 제1 양태의 방법에 따라 T 세포 림프종을 치료하는데 사용하기 위한 제제를 제공한다. 상기 제제는 상기 정의된 바와 같은 임의의 제제일 수 있다.
본 발명은 또한 제1 양태의 방법에 따라 T 세포 림프종의 치료를 위한 약제의 제조에서의 상기 정의된 바와 같은 제제의 용도에 관한 것이다.
키트
본 발명은 제1 양태의 방법에 따라 T 세포 림프종의 치료에서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 제제를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
상기 키트는 또한 악성 T 세포의 TRBC를 결정하는데 적합한 시약(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 PCR 프라이머 또는 TRBC1 또는 TRBC2 중 하나에 대해 특이적인 항체(항체들)을 포함할 수 있다.
T 세포 림프종 및/또는 백혈병을 결정하는 방법
본 발명은 추가로 TRBC1 또는 TRBC2 양성인 대상으로부터의 샘플 내의 T 세포의 비율을 결정하는 단계를 포함하는, 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다.
T 세포 림프종은 개별적인 악성 T 세포의 클론 확장을 수반한다. 그와 같이, 대상에서 T 세포 림프종의 존재는 환자로부터 유래된 샘플에서 TRBC1 또는 TRBC2 T 세포 중 어느 하나의 비율을 결정함으로써 확인될 수 있다.
상기 샘플은 말초 혈액 샘플, 림프 샘플 또는 종양으로부터 직접 수득한 샘플, 예컨대 생검 샘플일 수 있다.
T 세포 림프종 또는 백혈병의 존재를 나타내는 TRBC1 또는 TRBC2 양성인 총 T 세포의 비율은, 예를 들어 세포의 총 집단의 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%일 수 있다.
상기 방법은 생검 시료 또는 샘플에서 T 세포의 구별되는 집단에 의해 침윤을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 여기에서, T 세포 림프종 또는 백혈병의 존재는 샘플 내의 T 세포의 총 집단의 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%가 TRBC1 또는 TRBC2인 경우에 나타난다.
샘플 내의 총 T 세포는 CD3, CD4, CD8 및/또는 CD45를 발현하는 샘플 내의 세포의 수를 결정함으로써 확인될 수 있다. 이들 마커의 조합이 또한 사용될 수 있다.
TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현하는 샘플 내의 총 T 세포의 비율은 본 기술분야에서 알려진 방법, 예를 들어 유세포분석, 면역조직화학 또는 형광 현미경을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명은 실시예에 의해 추가적으로 설명될 것이며, 이는 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자가 본 발명을 수행하는 것을 돕고자 하는 것이며 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 - TRBC1 및 TRBC2 -발현 세포의 구별
JOVI-1 항체는 앞서 Viney et al.(Hybridoma; 1992; 11(6); 701-713)에 의해 개시되었으며 상업적으로 이용가능하다(Abcam, ab5465). 본 발명자들은 JOVI-1이 TRBC1 또는 TRBC2의 특이적 발현에 기초하여 세포를 구별할 수 있다는 것을 결정하였다.
본 발명자들은 TRBC1 또는 TRBC2의 발현만이 다른, TCR의 완전한 가변 및 불변 영역을 제공하는 2개의 플라스미드 벡터를 생성하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 레트로바이러스 상청액을 생성하였다. 이 상청액을 사용하여 Jurkat TCR-넉아웃 T 세포(TCR 베타 사슬의 발현을 방지하고, 이로써 전체 표면 TCR/CD3 복합체의 발현을 방지하는, TCR 베타 사슬 좌위에 돌연변이를 갖는 T-ALL 세포주)를 안정적으로 형질도입하였다. 이는 TRBC1 또는 TRBC2의 발현 외엔 동일한 세포주의 생산을 야기하였다. 이들 세포주의 염색은 표면 TCR/CD3 복합체의 완전한 발현을 밝혀내었고, TRBC1을 발현하는 세포만이 JOVI-1 항체로 염색되었음을 밝혀내었다(도 4).
실시예 2 - 정상 공여자 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 별개의 TRBC1 -양성 및 TRBC1-음성 집단을 함유한다
본 발명자들은 정상 공여자의 일차 인간 T 세포 상에서 JOVI-1 항체를 시험하였다. 이러한 분석은 모든 공여자가 TRBC1을 발현한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 부분과 TRBC1을 발현하지 않은 각각의 일부분을 가지고 있었음을 밝혀내었다. 정상 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 약 20-50%는 TRBC1 +ve이다(도 6 및 7).
실시예 3 - TCR를 발현하는 클론 T 세포주는 TRBC1 양성 또는 음성이다
세포주는 환자에서 원래의 클론 종양 집단으로부터 유래된다. TCR을 발현하는 T 세포주의 염색은 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2 중 어느 하나를 발현한다는 것을 밝히며, 이것을 클론형성능의 마커로서 확인시켜준다. 시험된 3개의 T 세포주 중에서, Jurkat 세포(TRBC1+인 것으로 알려짐)는 JOVI-1로 염색되고, HPB-ALL 또는 HD-Mar-2(TRBC2+인 것으로 알려짐) 세포는 JOVI-1로 염색되지 않으며, 이는 TRBC1 또는 2 중 어느 하나의 배타적인 발현을 뒷받침한다(도 8).
실시예 4 - T- 전림프구성 백혈병을 갖는 환자에서 일차 클론 T 세포는 TRBC1 양성 또는 음성이다
T-전림프구성 백혈병(T-PLL)을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 추출된 클론 T 세포는 균일하게 TRBC1 양성 또는 TRBC1 음성이다.
실시예 5 - TCBC1에 독특한 잔기들의 돌연변이의 효과
TCR β 사슬 불변 영역 내의 혼성체 TRBC1/2 돌연변이를 제외하고 동일한 TCR을 코딩하는 플라스미드 벡터를 생성하였다. 분석은 JOVI-1이 TCR β 불변 사슬의 위치 3 및 4에 있는 잔기들의 차이를 인식한다는 것을 보여주었고, 이는 이들 잔기가 항체 인식에 접근가능하고, 아마도 TRBC1을 TRBC2와 구별하거나 TRBC2를 TRBC1과 구별하는 제제를 생성하는 최상의 표적이라는 것을 가리킨다(도 5).
실시예 6 - TRBC2이 아닌 TRBC1 TCR 발현 T 세포의 특이적 용해.
야생형 Jurkat T 세포(CD34-, TRBC1+)를 CD34 마커 유전자와 함께 공동-발현된 TRBC2(CD34+TRBC2+)로 형질도입된 TCRαβ 넉아웃 Jurkat T 세포와 혼합하였다. 이들 세포를 1시간 동안 JOVI-1 단독과 함께 배양하거나 또는 JOVI-1 및 보체와 함께 배양하였다. 세포를 세척하고 CD34, 아넥신 V 및 7-AAD에 대해 염색하였다. 세포를 유세포분석에 의해 분석하였다.
아넥신-V 음성 및 71AAD 흐림 집단에 의해 정의된 바와 같은 살아있는 집단에서의 CD34 발현이 도 9에 나타나 있다. TRBC1 T 세포(CD34-)의 선택적 사멸이 관찰되었다(도 9).
야생형 Jurkat T 세포는 천연적으로 TRBC1+이며 절단된 CD34 마커 유전자를 발현하지 않는다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 TCRαβ 넉아웃 Jurkat T 세포를 TRBC2 TCR 뿐만 아니라 절단된 CD34 마커 유전자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입함으로써 TRBC2+ Jurkat 주를 유도하였다. 그리고 나서, 이들 T 세포를 함께 혼합하였다. 다음으로, 본 발명자들은 T 세포를 1시간 동안 JOVI-1 단독과 함께 또는 JOVI-1 및 보체와 함께 배양하였다. 간편하게, 본 발명자들은 CD34 마커 유전자에 대해 염색함으로써 TRBC1 및 2 집단을 구별할 수 있었고, 이에 따라 항-TCR mAb에 대한 연장된 노출 후 TCR 내재화(internalization)로 인해 TRBC1 TCR의 검출 실패를 피하였다. 세포를 세척하고 CD34, 아넥신 V 및 7-AAD에 대해 염색하였다. 상기 세포를 유세포분석에 의해 분석하였다. 생세포(즉, 아넥신 V 음성 및 7-AAD 흐림인 세포)에 대해 게이팅(gating)함으로써, 본 발명자들은 TRBC1 T 세포가 보체의 존재시 JOVI-1에 의해 선택적으로 사멸되었음을 결정할 수 있었다(도 9).
실시예 7 - 다클론 엡스테인 바 바이러스( EBV ) 특이적 T 세포는 2개의 거의 동일한 TRBC1 /2 집단으로 분열될 수 있다.
말초 혈액 T 세포를 정상 혈액 공여자로부터 추출하였다. 단핵 세포를 단리하고, 상기 세포 대부분을 동결보관하였다. 소수의 세포를 sEBV(B95-8)의 실험실 균주로 감염시켰다. 몇 주 후, 림프모구성 세포주(LCL)로 알려진 불멸화된 EBV 감염된 세포주가 출현하였다. 상기 세포주는 상이한 EBV 항원의 거대 집합을 나타내는 것으로 알려져 있다. 앞서 동결보관된 단핵 세포를 해동시키고 IL2의 존재하에 4주 동안 매주 이 LCL 주로 반복하여 자극하였다. 이 과정은 말초 혈액 단핵 집단으로부터 EBV 특이적 T 세포를 선택적으로 확장시킨다. 상기 과정은 다클론 주를 야기하고, 여기서 T 세포의 >90%가 EBV 특이적이고 공여자의 EBV 면역 체계를 대표한다는 것이 또한 알려져 있다. 이 세포주의 특이성은 동종 LCL 또는 K562 세포가 아닌, 자가 LCL의 높은 정도의 사멸을 나타냄으로써 확인된다(도 10a). 그리고 나서, 이 세포주를 JOVI-1로 염색하였고, 이 세포주는 TRBC1 및 TRBC2 T 세포의 거의 동일한 혼합물을 함유하는 것으로 나타났다(도 10b).
따라서, 만약 치료제가 투여되어 TRBC1 또는 TRBC2 구획 중 하나가 고갈되면, 충분한 EBV 면역력이 유지될 것이다. EBV 면역력은 면역 반응을 위한 모델 시스템으로서 간주되므로, 다른 병원체에 대한 면역력이 동일하게 보존될 것이라고 상정하는 것이 합리적이다.
실시예 8 - 순환 말초 T 세포 림프종의 JOV1 염색.
가설은 클론성 T 세포 림프종이 TRB1 또는 TRBC2 T 세포 수용체 중 하나를 발현할 것이고, 반면 다클론성 정상 T 세포는 TRBC1 또는 TRBC2을 갖는 것의 혼합물인 T 세포의 집단을 포함할 것이라는 것이었다. 이를 입증하기 위해, 림프종이 말초 혈액에서 순환하고 있었던 환자로부터의 T 세포 림프종의 혈액 샘플을 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포를 단리하고 CD5 및 JOVI1을 포함한 항체의 패널로 염색하였다. 총 T 세포 집단(림프종 및 정상 T 세포 모두를 함유하는 집단)이 먼저 확인되었다. 이 집단은 정상(bright) CD5 발현을 갖는 T 세포 및 중간/흐린 CD5 발현을 갖는 T 세포로 구성되었다. 전자는 정상 T 세포를 대표하는데 반해, 후자는 w림프종을 대표한다. 다음으로 JOVI-1 결합을 조사하였고, 결과가 도 12에 나타나 있다.
CD5 중간 및 흐린 집단(종양)은 모든 TRBC2 양성이었다.
실시예 9 - JOVI -1의 VH / VL 서열의 해명
마우스 IgG CH1의 불변 영역 및 마우스 카파의 불변 영역에 어닐링하는 프라이머를 이용한 5' RACE를 이용하여, 본 발명자들은 하이브리도마 JOVI-1로부터 단일 기능적 VH 서열 및 단일 기능적 VL 서열을 단리하였다. 상기 VH 및 VL의 서열은 각각 서열번호 1 및 2이다(상기 참고). VH 및 VL의 주석이 달린 서열이 도 11에 나타나 있다.
이들 VH 및 VL 서열을 각각 마우스 IgG 중쇄 및 카파 경쇄와 틀에 맞춰(in frame) 다시 클로닝하였다. 또한, 상기 VH 및 VL을 융합하여 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 형성하였고, 이를 IgG2a의 힌지-CH2-CH3 영역에 융합하여 scFv-Fv를 생성하였다. 상기 scFv의 아미노산 서열이 서열번호 3으로 상세한 설명에 제시되어 있다. 재조합 항체 및 재조합 scFv-Fc를 293T 세포 내로 형질감염시켜 생성하였다. 하이브리도마로부터의 JOVI-1과 함께, 하기 세포를 염색하였다: TCR이 넉아웃된 Jurkat; 야생형 Jurkat; eBFP2와 공동-발현된 TRBC1으로 형질도입된 Jurkat TCR 넉아웃 및 eBFP2와 공동-발현된 TRBC2로 형질도입된 Jurkat TCR 넉아웃. JOVI으로부터 유래된 재조합 항체 및 scFv-Fc 모두는 TRBC2에 결합하였고, 이는 본 발명자가 정확한 VH/VL을 확인하였다는 것과, JOVI-1 VH/VL이 scFv로서 폴딩될 수 있음을 확인시켜 준다. 이 결합 데이터가 도 13에 나타나 있다.
실시예 10 - JOVI -1 기반의 CAR의 기능
상기 JOVI-1 scFv를 CAR 포맷 내로 클로닝하였다. 어떤 스페이서 길이가 최적의 JOVI-1 기반의 CAR을 야기할지 해명하기 위하여, 인간 Fc 스페이서, 인간 CD8 줄기 스페이서 또는 IgG1 힌지로부터 유래된 스페이서 중 하나를 이용하여 3세대 CAR을 생성하였다(도 4). 정상 공여자로부터의 일차 인간 T 세포를 이들 CAR로 형질도입시키고, Jurkat 및 TCR이 넉아웃된 Jurkat의 사멸을 비교하였다. IgG1 힌지 스페이서 또는 CD8 줄기 스페이서 중 어느 하나를 가진 JOVI-1 scFv를 갖는 CAR은 Jurkat를 사멸시켰지만, TCR 넉아웃을 갖는 Jurkat는 사멸시키지 않았고(도 5), 이는 예상된 특이성을 입증한다. CAR로 형질도입된 정상 공여자 T 세포가 TRB1/2 T 세포의 혼합물을 가질 것이므로, 상기 배양물이 "자가-퍼징"할 것으로 예상되었다. 실제로, 이것이 관찰되었다. 100% TRBC2 음성이 된 CAR T 세포의 JOVI-1 염색이 도 6에 나타나 있다.
물질 & 방법
JOVI-1의 특이성의 입증
잘 규명된 인간 TCR 뿐만 아니라 간편한 마커 유전자를 코딩하는 트리시스트론(tri-cistronic) 레트로바이러스 카세트를 생성하였다. TCRα 및 β 사슬에 대한 코딩 서열을 중첩하는 올리고뉴클레오타이드로부터 드-노보(de-novo) 유전자 합성을 이용하여 생성하였다. 이들 사슬을 틀에 맞게 수족구병 2A 펩타이드에 연결하여 공동-발현시켰다. 절단된 CD34 마커 유전자를 PCR에 의해 cDNA로부터 클로닝하고 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 이용하여 TCR 사슬과 함께 공동-발현하였다. 이 카세트를 레트로바이러스 벡터 내로 도입하였다. 이 작제물의 변이체를 원하는 돌연변이를 도입하는 프라이머를 이용한 오버랩 PCR에 의한 스플라이스에 의해 생성하였다. 상기 작제물의 진실성(veracity)을 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인하였다. Jurkat 76 주는 TCR α 및 β 사슬 모두가 넉아웃된 잘 규명된 Jurkat T 세포주의 유도체이다. 이 Jurkat 주를 표준 기술을 이용하여 상기 레트로바이러스 벡터로 형질도입시켰다.
JURKAT, 말초 혈액 T 세포 및 세포주의 염색 및 분석
Jurkat를 ECACC로부터 수득하여 상기 설명된 바와 같이 조작하였다. 다른 T 세포주를 또한 ECACC로부터 수득하였다. 정상 공여자로부터 정맥천자에 의해 말초 혈액을 채혈하였다. 혈액을 피콜(ficoll)하여 단핵 세포를 단리하였다. 세포를 JOVI-1 뿐만 아니라 모든 TCR 및 CD3을 인식하는 상업적으로 이용가능한 단일클론 항체로 염색하였다. 조작된 T 세포의 경우, 세포를 CD34를 인식하는 항체로 염색하였다. 말초 혈액 단핵 세포의 경우, 세포를 CD4 및 CD8을 인식하는 항체로 염색하였다. 유세포분석기로 세포를 분석하는 동안 독립적인 형광 신호가 얻어질 수 있도록 적합한 형광체로 접합된 상기 항체를 구입하였다.
TRBC1 T 세포의 특이적 용해의 입증
야생형 Jurkat T 세포(TRBC1 - TCR), 및 TRBC2 TCR이 도입된 Jurkat T 세포 TCR KO를 1:1의 비율로 함께 혼합하였다. 그리고 나서, 상기 Jurkat의 혼합물을 보체의 부재 또는 존재하에 1ug/ml의 JOVI-1 단일클론 항체와 함께 배양하였다. 4시간 후, 세포를 아넥신-V 및 7AAD 및 CD34로 염색하였다. 간편하게, 마커 유전자 CD34는 야생형(TRBC1) 및 형질전환(TRBC2) Jurkat 사이를 구별할 수 있다. 세포 집단을 유세포분석에 의해 분석하였다. 아넥신-V에 대해 음성이고 7AAD에 대해 흐린 유세포분석 사건에서의 게이팅(gating)에 의해 생세포를 선택적으로 연구하였다. 이러한 방식으로, 형질전환(TRBC2) 대 야생형(TRBC1) T 세포의 생존을 연구하였다.
실시예 11 - T 세포 림프증식성 장애의 클론형성능의 조사
4명의 환자: T 세포 거대 과립 림프구 림프증식성 장애(T-LGL)를 갖는 3명; 및 말초 T 세포 림프종(PCTL)을 갖는 1명을 시험하여 악성 세포가 균일하게 TRBC1 양성 또는 음성이었음을 확인하였다.
전혈 또는 골수를 T-림프증식성 장애를 갖는 환자로부터 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜 구배 원심분리에 의해 수득하였다. 신선하게 수득된 PBMC를 펠렛화하고 적절한 미리-접합된 항체로 20분간 염색하였다. 그리고 나서, 상기 세포를 세척하고 BD LSR Fortessa II 상에서 즉각적인 유세포 분석을 위해 인산완충염수에 재현탁하였다. FSc/SSc 특성 및 죽은 세포 구별 염료의 흡수 실패에 의해 생 림프구를 확인하였다. T 세포를 항-TCR 알파/베타 항체로 염색하여 확인하였다. 앞서 임상 실험실 분석에 의해 확인된 면역표현형에 기초하여, 각 샘플에 대한 적절한 세포 표면 염색을 이용하여 종양 및 정상 T 세포 집단을 확인하였다.
상기 결과가 도 18 내지 21에 나타나 있다.
환자 A(T-LGL, 도 18)에서, 정상 T 세포는 CD7선명함이었고, 혼합된 CD4/CD8 세포, 및 TRBC1 또는 TRBC1- 세포의 혼합 집단을 함유하였다. 대조적으로, 악성 세포는 CD7- 또는 CD7흐림이었고, 균일하게 CD8+CD4-였으며, 균일하게 TRBC1-였다.
환자 B(T-LGL, 도 19)에서, 악성 세포를 CD4-, CD8+, CD7+ CD57+에 의해 확인하였고, 이들은 클론성으로 TRBC1-(강조된 패널)였다. 정상 CD4+CD8- 및 CD4-CD8+ T 세포는 TRBC1+ 및 TRBC1- 집단을 함유하였다.
환자 C(T-LGL, 도 20)에서, 정상 CD4+ 및 CD8+ T- 세포 집단은 30-40% TRBC1+였다. 악성 세포를 CD4-, CD8+, CD7+ CD57+에 의해 확인하였고, 이들은 클론으로 TRBC1+였다(강조된 패널, 세포의 84%가 TRBC1이고 - 나머지 16%가 오염시키는 '정상' T 세포일 가능성이 있다는 점에 유의). 정상 CD4+CD8- 및 CD4-CD8+ T 세포는 TRBC1+ 및 TRBC1- 집단을 함유하였다.
환자 D(PTCL-NOS, 도 21)에서, FSC높음(high) CD5흐림 CD4흐림에 기초하여 확인된 골수 내의 악성 세포는 균일하게 TRBC1+인 반면, CD4+CD8- 및 CD4-CD8+ T 세포는 TRBC1+ 및 TRBC1- 집단 모두를 함유하였다.
실시예 12 - 파아지 디스플레이를 이용한 T 세포 수용체 β 사슬 불변 도메인의 2개의 아형 간을 구별하는 단일클론 인간 항체의 생성
TRBC2 및 TRBC1 간을 구별하는 항체를 생성하기 위하여, 상기 2개의 TRBC 아형 간의 차이 영역을 커버링하는 펩타이드 단편들을 합성하였다. TRBC2 및 TRBC1 간의 4개의 아미노산 차이 중에서, 2개는 불변 도메인의 시작에서 발견된다. 이들 영역을 대표하는 펩타이드(하기 참고)를 합성하였고, 항체 생성을 위해 사용하였다.
TRBC2 VLEDLKNVFPPEVAV(서열번호 36)
TRBC1 VLEDLNKVFPPEVAV(서열번호 37)
이들 펩타이드를 바이오티닐화된, 비-바이오티닐화된 및 시스테인 변형된 형태(C 말단 시스테인의 부가에 의해)로 제조하였다. 이후, 상기 TRBC1 및 TRBC2의 시스테인 변형된 형태를 제조사의 권장 조건에 따라 변형된 소 혈청 알부민(Imm-Link BSA, Innova 462-001) 또는 난백알부민(Imm-Link Ovalbumin, Innova 461-001)에 접합하였다.
결과
항체 파아지 디스플레이 선택
인간 파아지 디스플레이 라이브러리를 제작하였고(Schofield et al., 2007 Genome Biol 8, R254)에 기재된 바와 같이 파아지 선택을 수행하였다. 상기 항체 라이브러리로부터 TRBC1 및 TRBC2 특이적 항체를 확인하기 위해, 여러 차례의 파아지 디스플레이 선택을 수행하였다. 2개의 파아지 선택 전략을 동시에 사용하여 특이적 결합제의 거대한 패널을 생성할 가능성을 최대화하였다. 이러한 전략은 고상 및 용액상 선택으로 알려져 있다(도 21). 고상 선택에서는, 파아지 항체가 고체 표면 상에 고정된 표적 항원에 결합한다(Schofield et al., 2007, 상기와 같음). 용액상 선택에서는, 파아지 항체가 용액에서 바이오티닐화된 항원에 결합한 다음, 파아지 항체-항원 복합체가 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 코팅된 상자성 비드에 의해 캡처된다. 고상 선택 전략 내에서, 2개의 상이한 고정화 또는 항원 제시 접근법을 이용하였다. 상기 첫 번째 접근법을 이용하여, 소 혈청 알부민(BSA) 또는 난백알부민(OA)에 접합된 TRBC 펩타이드를 직접 흡착을 통해 Maxisorp™ 면역튜브 상에 고정시켰다. 두 번째 접근법을 이용하여, 바이오티닐화된 TRBC 펩타이드를 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘으로 미리 코팅된 Maxisorp™ 면역튜브 튜브 상에 간접 고정시켰다.
원하는 펩타이드에 특이적인 항체를 선택하기 위해, 과량의 대립하는 펩타이드의 존재하에 모든 선택을 수행하였다. 예를 들어, 모든 TRBC1 선택은 10배 몰 과량의 비-바이오티닐화된 TRBC2의 존재하에 수행하였다. 이 방법은 '선택해제(deselection)'로서 알려져 있으며, 항체들이 우선적으로 용액 중의 과량의 TRBC2에 결합함에 따라 두 TRBC 펩타이드 상의 공유된 에피토프를 인식하는 항체를 고갈시키는 것으로 예상되었다. 담체 단백질(BSA 또는 OA) 또는 고정 파트너(Thermo fisher scientific사로부터의 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘)에 결합하는 항체 클론을 농축하는 것을 피하기 위해 두 가지 전략을 조합하여 사용하였다.
첫 번째 전략은 선택의 라운드 사이에 접합 또는 고정 파트너를 바꾸는 것이었다. 직접 고정된 펩타이드의 경우, 선택 1라운드를 BSA-펩타이드 상에서 수행하였고, 라운드-2의 경우 OA-펩타이드 접합체를 사용하였다. 유사하게, 바이오티닐화된 TRBC 펩타이드를 라운드-1 동안 스트렙타비딘 상에 고정시켰고 뉴트라비딘을 라운드-2에서 고정을 위해 사용하였다.
두 번째 전략은 라운드-1에서 '선택해제'를 수행함으로써 접합/고정 파트너에 대한 임의의 결합제의 파아지 라이브러리를 고갈시키는 것이었다. 직접 고정된 펩타이드의 경우, 용액 중의 10배 과몰량의 유리 BSA의 존재하에 파아지-펩타이드 결합 단계를 수행함으로써 '선택해제'를 수행하였다. 스트렙타비딘 상에 고정된 바이오티닐화된 펩타이드의 경우, 상기 파아지 라이브러리를 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드와 함께 전배양하였다. 상기 비드를 파아지를 항원 튜브에 부가하기 전에 제거하여 스트렙타비딘 결합제가 선택 내로 진입하는 것을 제한하였다. 사용된 상이한 선택 조건이 도 21에 요약되어 있다. 선택 조건에 대한 상세한 정보를 위해 표 3을 참고한다.
라운드-2 선택 아웃풋으로부터 다클론 파아지를 펩타이드 또는 지지 단백질의 다양한 제시를 이용하여 ELISA에서 시험하였다. 이는 BSA 또는 OA 접합체로서 직접 고정된 TRBC 펩타이드 또는 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 상에 간접 고정된 바이오티닐화된 펩타이드를 포함하였다. 포함된 대조군 단백질은 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, BSA 및 무관한 항원이었다. 파아지 결합을 시간 분해 형광을 이용하여 마우스 항-M13 항체(GE healthcare) 후 유로퓸으로 표지된 항-마우스 Fc 항체(Perkin Elmers)를 이용하여 검출하였다(도 22a~도22c). 이 결과는 각각의 TRBC 펩타이드에 대한 다클론 파아지 집단의 우선적 결합을 입증하였다 (대립하는 TRBC 펩타이드와 비교하여). 예를 들어, TRBC1 선택으로부터 제조된 다클론 파아지는 TRBC2보다 TRBC1에 대해 유의미하게 더 높은 결합 신호를 나타내었고, 그 반대도 마찬가지였다. 상기 고정 또는 접합 파트너 및 무관한 항원에 대해 제한적인 결합이 있거나 또는 결합이 없었다.
단일 사슬 항체( scFv ) 서브- 클로닝 및 단일클론 스크리닝
라운드-2 및 라운드-3 선택 아웃풋으로부터의 scFv 집단을 pSANG10-3F 발현 벡터 내로 서브클로닝하고 E.coli BL21(DE3) 세포 내로 형질전환시켰다. 1128개의 개별적인 형질전환체(564 클론/TRBC 펩타이드)를 12 x 96 웰 배양 플레이트(94 클론/플레이트) 내로 픽킹(picking)하고 자가유도 배지를 이용하여 항체 발현을 유도하였다. 밤샘 유도 후 배양 상청액 내로 분비된 재조합 단일클론 항체를 뉴트라비딘 코팅된 Nunc Maxisorp™ 96 웰 플레이트 상에 고정된 바이오티닐화된 TRBC1 및 TRBC2에 대한 결합에 대해 시험하였다. TRBC1 선택으로부터 스크리닝된 564개의 클론 중에서, 255개의 클론은 TRBC1에 대해 특이적인 것으로 확인되었다(TRBC1에 대해 >10000 TRF 단위 및 TRBC2에 대해 <1000 TRF). 138 TRBC2 특이적 결합제(TRBC2에 대해 >10000 TRF 단위 및 TRBC1에 대해 <2000 TRF 단위)가 TRBC2 선택으로부터 스크리닝된 564개의 클론으로부터 확인되었다. 도 24는 TRBC1(도 24A) 또는 TRBC2(도 24B) 중 어느 하나에 대한 선택으로부터 비롯되는 단일 96 웰 플레이트로부터의 대표적인 결합 프로파일을 보여준다. 상이한 선택 조건을 이용하여 생성된 특이적 결합제의 세부사항이 표 5에 요약되어 있다.
서열 분석 및 추가 규명을 위해 142개 및 138개 특이적 결합제를 각각 TRBC1 및 TRBC2 선택으로부터 픽킹하였다. 선별된 클론의 서열을 BigDye® 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트(Life technologies)를 이용하여 생거 시퀀싱에 의해 생성하였다. DNA 서열을 분석하여 단백질 서열을 결정하고, VH 및 VL 도메인의 CDR을 확인하였다. VH 및 VL CDR3 영역의 분석은 74개의 독특한 TRBC1 및 42개의 독특한 TRBC2 클론(여기서 독특함은 VH CDR3 및 VL CDR3 서열의 임의의 조합으로서 정의됨)을 확인하였다. TRBC1-특이적 클론 및 이들의 VH CDR3 및 VL CDR3 서열이 상기 표 1에 요약되어 있다. TRBC2-특이적 클론 및 이들의 VH CDR3 및 VL CDR3 서열이 상기 표 2에 요약되어 있다.
[표 3A]
Figure 112016095724121-pct00003
[표 3B]
Figure 112016095724121-pct00004
Figure 112016095724121-pct00005
Figure 112016095724121-pct00006
실시예 13 - 토끼의 펩타이드 면역화를 통한 TRBC 다클론 항체 생산
TRBC2 및 TRBC1 간을 구별하는 항체를 생성하기 위해, 상기 2개의 TRBC 아형 간의 구별의 원칙 지역을 커버하는 2개의 펩타이드를 합성하고, 이를 토끼의 면역화를 위해 사용하였다. 하기 펩타이드 서열을 사용하였다:
TRBC1: VLEDLNKVFPPEVAVC(서열번호 38)
TRBC2: VLEDLKNVFPPEVAVC(서열번호 39).
15 mg의 TRBC1 및 TRBC2 펩타이드를 합성하였다. 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin)을 상기 펩타이드 상에 존재하는 C 말단 시스테인을 통해 TRBC1 및 TRBC2 펩타이드에 접합하였다. 각 펩타이드의 경우, 2마리의 뉴 잉글랜드 토끼를 KLH 접합된 TRBC1 또는 TRBC2 펩타이드로 총 3회 면역화시켰다. 3차 면역화 후, 토끼를 희생시키고 채혈하고, 정제를 위해 혈청을 수집하였다. 상기 토끼로부터 수득된 조 혈청을 면역화를 위해 사용된 펩타이드와 커플링된 가교된 비드된 아가로스 수지 컬럼을 통과시켜 상기 펩타이드의 공통 분절 및 TRBC 아형 특이적 에피토프에 특이적인 항체를 수집하였다. 그리고 나서, 초기에 정제된 상청액을 대체 펩타이드가 고정된 컬럼을 통해 추가 정제하여, 상기 펩타이드의 공통 분절에 특이적인 항체를 제거하였다.
ELISA 설정
코팅 항원(들): A：펩타이드 TRBC1
B：펩타이드 TRBC2
코팅 농도: 4ug/ml, 100 μl/웰
코팅 버퍼: 인산완충 염수, pH7.4
이차 항체: 항-토끼 IgG(H&L)(GOAT) 항체 퍼옥시다아제 접합
상기 결과가 도 25 및 26에 나타나 있다. 이 방법에 의해 TRBC1 또는 TRBC2-특이적 항체를 포함하는 다클론 혈청을 제조할 수 있다.
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Claims (19)

  1. TCR 베타 불변 영역 1(TRBC1) 또는 TRBC2에 선택적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서, TRBC1에 선택적으로 결합하는 CAR.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 하기 상보성 결정 영역(CDR):
    VH CDR1: 서열번호 7;
    VH CDR2: 서열번호 8;
    VH CDR3: 서열번호 9;
    VL CDR1: 서열번호 10;
    VL CDR2: 서열번호 11; 및
    VL CDR3: 서열번호 12
    를 포함하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 갖는 것인 CAR.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 서열번호 1로서 표시된 서열을 갖는 가변 중쇄(VH) 및 서열번호 2로서 표시된 서열을 갖는 가변 경쇄(VL)를 포함하는 것인 CAR.
  5. 제2항에 있어서, 서열번호 4, 5 및 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CAR.
  6. 제1항에 있어서, TRBC2에 선택적으로 결합하는 CAR.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 CAR을 인코딩하는 핵산.
  8. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 세포.
  10. 제9항에 따른 T 세포.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 CAR을 인코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터로 세포를 생체외 형질도입하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 CAR를 포함하는 세포의 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서, 대상에서 T 세포 림프종 또는 백혈병을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 세포로서, 상기 방법은
    TCRB1 또는 TCRB2 선택적 CAR을 포함하는 세포를 대상에게 투여하여, 악성 T 세포와 동일한 TRBC를 발현하는 정상 T 세포와 함께, 악성 T 세포의 선택적 고갈을 유발하지만, 악성 T 세포에 의해 발현되지 않는 TRBC를 발현하는 정상 T 세포의 고갈은 유발하지 않는 단계
    를 포함하는 것인 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 또한 상기 대상으로부터의 악성 T 세포의 TCR 베타 불변 영역(TCRB)을 조사하여, 상기 악성 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2를 발현하는지 결정하는 단계를 포함하는 것인 세포.
  14. 제12항에 있어서, 상기 T 세포 림프종 또는 백혈병은 상세불명의 말초 T 세포 림프종(PTCL-NOS); 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AITL), 역형성 대세포 림프종(ALCL), 장질환 관련 T 세포 림프종(EATL), 간비장 T 세포 림프종(HSTL), 비강형 림프절외 NK/T 세포 림프종, 피부 T 세포 림프종, 원발성 피부 ALCL, T 세포 전림프구성 백혈병 및 T 세포 급성 림프모구성 백혈병으로부터 선택되는 것인 세포.
  15. 대상으로부터 단리된 샘플에서 TRBC1 또는 TRBC2 양성인 총 T 세포의 백분율을 결정하는 단계를 포함하는, 대상에서의 T 세포 림프종 또는 백혈병의 진단에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. i) T 세포 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 대상으로부터의 악성 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2를 발현하는지 확인하는 단계; 및
    ii) 상기 악성 T 세포의 TRBC1 또는 TRBC2 발현에 기초하여 제12항의 세포를 선택하는 단계
    를 포함하는, T 세포 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 대상을 치료하기에 적합한 치료법의 선택에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. i) T 세포 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 대상으로부터의 악성 T 세포가 TRBC1 또는 TRBC2를 발현하는지 확인하는 단계; 및
    ii) 상기 악성 T 세포의 TRBC1 또는 TRBC2 발현에 기초하여, 제12항의 세포에 기초한 치료법을 제공받을 대상의 선택에 사용하기 위한 정보를 제공하는 단계
    를 포함하는, 제12항의 세포에 기초한 치료법을 제공받을, T 세포 림프종 또는 백혈병을 앓고 있는 대상의 선택에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
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