ES2758173T3 - Receptor quimérico de antígeno (CAR) con dominios de unión a antígeno para la región constante de receptores de linfocitos T beta - Google Patents

Receptor quimérico de antígeno (CAR) con dominios de unión a antígeno para la región constante de receptores de linfocitos T beta Download PDF

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Abstract

Un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno que se une selectivamente a la región constante de TCR beta 1 (TRBC1) o TRBC2.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor quimérico de antígeno (CAR) con dominios de unión a antígeno para la región constante de receptores de linfocitos T beta
Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a células y agentes útiles en el tratamiento del linfoma o leucemia de linfocitos T.
Antecedentes de la divulgación
Las neoplasias malignas linfoides se pueden dividir en gran medida en aquellas que proceden de linfocitos T o linfocitos B. Las neoplasias malignas de linfocitos T son un grupo de trastornos clínica y biológicamente heterogéneos, que juntos comprenden el 10-20 % de los linfomas no Hodgkin y el 20 % de las leucemias agudas. Los subtipos histológicos más comúnmente identificados son el linfoma periférico de linfocitos T, no especificado (PTCL-NOS); el linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL) y el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL). De todas las Leucemias Linfoblásticas Agudas (LLA), alrededor del 20 % son de un fenotipo de linfocitos T.
Estas afecciones generalmente se comportan de manera agresiva, en comparación, por ejemplo, con neoplasias malignas de linfocitos B, con una supervivencia estimada de 5 años de solo el 30 %. En el caso de linfomas de linfocitos T, están asociados con una alta proporción de pacientes que presentan enfermedad diseminada, puntuación desfavorable del Indicador de Pronóstico Internacional (IPI) y prevalencia de enfermedad extra ganglionar. La quimioterapia sola no suele ser eficaz y menos del 30 % de los pacientes se curan con los tratamientos actuales.
Adicionalmente, a diferencia de las neoplasias malignas de linfocitos B, donde las inmunoterapias, tal como el anticuerpo monoclonal anti-CD20 rituximab, han mejorado drásticamente los resultados, actualmente no existe un agente inmunoterapéutico mínimamente tóxico igualmente eficaz para el tratamiento de las neoplasias malignas de linfocitos T. Una dificultad importante en el desarrollo de la inmunoterapia para los trastornos de linfocitos T es el considerable solapamiento en la expresión de marcadores de linfocitos T clonales y normales, sin un solo antígeno claramente capaz de identificar células clonales (malignas).
El mismo problema existe cuando se dirige a un antígeno de linfocitos pan-B para tratar una neoplasia maligna de linfocitos B. Sin embargo, en este caso, el agotamiento concomitante del compartimento de linfocitos B da como resultado una inmunosupresión relativamente menor que la mayoría de los pacientes tolera fácilmente. Adicionalmente, en las terapias que dan como resultado un agotamiento particularmente a largo plazo del compartimento B normal, su pérdida puede anularse en gran medida por la administración de inmunoglobulina agrupada. La situación es completamente diferente cuando se dirige a neoplasias malignas de linfocitos T. En este caso, el agotamiento concomitante del compartimento de linfocitos T conduce a inmunosupresión grave y toxicidad grave. Adicionalmente, no hay una forma satisfactoria de reducir la pérdida del compartimento de linfocitos T.
La toxicidad se ilustra en parte por los efectos clínicos del anticuerpo monoclonal terapéutico Alemtuzumab. Este agente lisa las células que expresan CD52 y tiene cierta eficacia en las neoplasias malignas de linfocitos T. La utilidad de este agente está muy limitada por una profunda inmunodeficiencia celular, en gran parte debido al agotamiento de los linfocitos T, con un riesgo notablemente elevado de infección.
Por lo tanto, existe la necesidad de un nuevo método para el tratamiento dirigido de neoplasias malignas de linfocitos T que no esté asociado con las desventajas anteriores.
Utilizando el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), ,S. Mathas et al. in PNAS, vol. 106, n.° 14, 7 de abril de 2009, páginas 5831-5836, muestra una variación en la expresión de varios genes asociados a linfocitos T, tal como TRBc I. Savoldo, B. et al en Blood, 2007, páginas. 2620-2630 divulga la construcción de un CD30-CAR que es capaz de destruir tanto a células EBV+ autólogas a través de su receptor natural como dianas EBV-/CD30 a través de sus principales CAR sin restricción por MHC.
Descripción de las figuras
Figura 1: Un diagrama del complejo receptor de linfocitos T ap/CD3. El receptor de linfocitos T se forma a partir de 6 cadenas de proteínas diferentes que deben ensamblarse en el retículo endoplásmico para expresarse sobre la superficie celular. Las cuatro proteínas del complejo CD3 (CD3Z, CD3y, CD3e y CD38) envuelven al receptor de linfocitos T (TCR). Este TCR confiere al complejo la especificidad de un antígeno determinado y está compuesto por dos cadenas: TCRa y TCRp. Cada cadena de TCR tiene un componente variable distal a la membrana y un componente constante proximal a la membrana. Casi todos los linfomas de linfocitos T y muchas leucemias de linfocitos T expresan el complejo TCR/CD3.
Figura 2: La segregación de la región constante de p de los Receptores de linfocitos T (TRBC)-1 y TRBC2 durante el reordenamiento del receptor de linfocitos T. Cada cadena TCR beta se forma a partir de recombinación genómica de unas determinadas regiones variables (V), diversidad (D), unión (J) y constantes (TRBC) de p. El genoma humano contiene dos loci de TRBC muy similares y funcionalmente equivalentes conocidos como TRBC1 y TRBC2. Durante el reordenamiento del gen TCR, una región J se recombina con TRBC1 o TRBC2. Este reordenamiento es permanente. Los linfocitos T expresan muchas copias de un único TCR en su superficie, por lo tanto, cada linfocito T expresará un TCR cuya región constante de cadena p está codificada por TRBC1 o TRBC2.
Figura 3: Alineación de TRBC1 y TRBC2 humanos a nivel de aminoácidos. La cadena constante de TCRp codificada por TRBC1 y TRBC2 difiere en solo 4 diferencias de aminoácidos: K/N en la posición 3 de la TRBC; N/K en la posición 4 de la TRBC; F/Y en la posición 36 de la TRBC; V/E en la posición 135 de la TRBC;
Figura 4: Demostración definitiva de que el anticuerpo JOVI-1 se une a TRBC1 pero no a TRBC2. Se utilizó ingeniería genética de las células para demostrar definitivamente que el anticuerpo monoclonal JOVI-1 reconoce la variante TRBC1 de la cadena constante TCRp. Se generó un casete retroviral tricistrónico. Este codificó las cadenas tanto TCRa como TCRp de un TCR humano que reconoce el antígeno de histocompatibilidad menor HA1, junto con el CD34 humano truncado como un gen marcador adecuado. El HA1 TCR es naturalmente TRBC2. Se generó un segundo casete retroviral que era idéntico al primero, excepto que los 4 restos en la región constante de TCR p que diferencian TRBC1 de TRBC2 se cambiaron a los codificados por TRBC1. Los linfocitos T Jurkat que tienen tanto sus cadenas TCRa como TCRp desactivadas se transdujeron con cualquier vector. Estas células se tiñeron con un anticuerpo pan-TCR/CD3 o con el JOVI-1 monoclonal conjugado junto con anticuerpos contra CD34 y se analizaron en un citómetro de flujo. La fila superior muestra la tinción con un anticuerpo pan-TCR/CD3 frente a CD34 (marcador de transducción), la fila inferior muestra la tinción con JOVI-1 frente a CD34. Las células transducidas demuestran una tinción TCR/CD3 similar pero solo las células TRBC1 positivas se tiñen con JOVI-1. Por lo tanto, JOVI-1 es específico para TRBC1 y además es posible usar un anticuerpo para distinguir TRBC1 y 2 TCR.
FIGURA 5: El mAb JOVI-1 diferencia TRBC1 de TRBC2 al reconocer los restos 3 y 4 de la TRBC. Para determinar con precisión cómo JOVI-1 discrimina TRBC1 de TRBC2, la construcción HA1 TCR TRBC2 detallada anteriormente se mutó para producir dos híbridos TRBC1/2. Se generó una variante adicional para que solo los restos 3 y 4 de la cadena constante de TCRp se cambiaran de los de TRBC2 a los encontrados en TRBC1. Se realizó una variante adicional donde solo se cambió el resto 36 del encontrado en TRBC2 al de TRBC1. Los linfocitos T Jurkat con TCR desactivados se transdujeron con estas nuevas construcciones. Los Jurkat transducidos con TRBC2 y TRBC1 originales descritos en la Figura 4 se usaron como controles. Los linfocitos T Jurkat se tiñeron con JOVI-1 y se analizaron con un citómetro de flujo. La tinción de JOVI-1 se superpone sobre la de los linfocitos T Jurkat con TCR desactivados no transducidos. JOVI-1 tiñó Jurkat que expresaban el TCR TRBC1 pero no el TCR TRBC2. JOVI-1 tiñó el híbrido TRBC1/2 donde los restos 3 y 4 de Tr BC solo eran los de TRBC1. JOVI-1 no tiñó los linfocitos T Jurkat donde el resto 36 de TRBC solo era el de TRBC1.
FIGURA 6: Ejemplo de expresión de TRBC1 de linfocitos T de donante normal. Las células mononucleares de sangre periférica del donante normal se tiñeron con anticuerpos contra CD3, CD4, CD8 y JOVI-1 y se analizaron por citometría de flujo. Las poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ se muestran en el panel superior. Cada una de estas poblaciones se selecciona y la dispersión directa frente a la tinción con JOVI-1 se muestran en los ejes Y y X respectivamente. Estos datos muestran que los compartimientos de CD4+ y CD8+ contienen células que son TRBC1 positivas y negativas. Estos son datos representativos de un donante.
FIGURA 7: Linfocitos T TRBC1+ en varios donantes normales. Se sangraron diez donantes normales y las células mononucleares de sangre periférica se tiñeron como se describe en la figura 4 anterior. Los datos agregados de la proporción de linfocitos T TRBC1 tanto en los compartimientos de CD4 como CD8 se muestran en un gráfico de barras junto con la mediana y el intervalo. Todos los donantes tenían compartimientos TRBC1+ y TRBC1-. Mediana del % de células TRBC1+ = 36 %.
FIGURA 8: Líneas celulares derivadas de neoplasia maligna de linfocitos T teñidas con JOVI-1. Se han derivado varias líneas celulares de neoplasias malignas de linfocitos T. Muchas de estas líneas celulares todavía expresan el TCR. Se seleccionaron Jurkat (una línea celular de leucemia de linfocitos T), HPB-ALL (otra línea celular de leucemia de linfocitos T) y HD-Mar-2 (una línea celular de linfoma de linfocitos T) para el estudio. Al teñir estas líneas celulares con un anticuerpo pan-TCR/CD3, se pudo demostrar que los tres expresan TCR (paneles izquierdos, tinción superpuesta sobre tinción de control de isotipo). A continuación, al teñir con JOVI-1 se pudo determinar que estas líneas de linfocitos T son TRBC1 negativas o positivas. Solo las células Jurkat (TRBC1+) y no las células HPB-ALL o HD-Mar-2 (TRBC2+) se tiñen con JOVI-1, lo que respalda la expresión exclusiva de TRBC1 o 2.
FIGURA 9: Destrucción selectiva de linfocitos T TRBC1 con mAb JOVI-1. Los linfocitos T Jurkat de tipo silvestre (CD34-, TRBC1+) se mezclaron con linfocitos T Jurkat con TCRap desactivado transducidos con TRBC2 expresado conjuntamente con el gen marcador CD34 (CD34+TRBC2 ). Estas células se incubaron con JOVI-1 solo o se incubaron con JOVI-1 y complemento durante 1 hora. Las células se lavaron y se tiñeron para CD34, Anexina V y 7-AAD. Las células se analizaron por citometría de flujo. A continuación se muestra la expresión de CD34 en la población viva tal como se define por la población Anexina- V negativa y 71AAD dim. (a) JOVI-1 solo; (b) JOVI-1 con complemento. Se observa destrucción selectiva de linfocitos T TRBC1 (CD34-).
FIGURA 10: Los linfocitos T policlonales específicos del virus de Epstein Barr (EBV) se pueden dividir en dos poblaciones de TRBC1/2 aproximadamente iguales. Usando métodos bien establecidos, los presentes inventores expandieron selectivamente linfocitos T específicos de EBV de la sangre periférica de un donante normal. La línea posterior tenía un alto grado de selectividad contra linfocitos B autólogos infectados con EBV (auto LCL), y no tenía actividad contra linfocitos T alogénicos infectados con EBV (alo LCL), y no tenía actividad citolítica inespecífica (según lo medido mediante pruebas contra células K562). Tal línea es representativa de la inmunidad contra EBV del donante. (b) Cuando se tiñeron con JOVI-1, estos linfocito T se tipificaron aproximadamente por igual para TRBC1 y TRBC2.
FIGURA 11: Secuencia anotada de VH y VL de JOVI-1. Las regiones hipervariables se indican subrayadas y en negrita.
FIGURA 12: Demostración de que un linfoma periférico de linfocitos T está restringido por TRBC, pero los linfocitos T circulantes normales no lo están. Se extrajeron linfocitos T de sangre periférica de un paciente con células de linfoma de linfocitos T circulantes. Las células mononucleares periféricas se aislaron y se tiñeron con un grupo de anticuerpos que incluía CD5, TCR y JOVI-1. Los linfocitos T normales y malignos podrían diferenciarse en el flujo por la intensidad de expresión de CD5. Los CD5 bright (linfocitos T normales) tenían poblaciones TRBC1 y 2 aproximadamente iguales. Las poblaciones de CD5 intermedios y dim (el tumor) fueron todas TRBC2 positivas. Si este paciente recibiera una terapia dirigida a TRBC2, el linfoma se erradicaría y aproximadamente la mitad de sus linfocitos T se salvarían.
FIGURA 13: Demostración de que VH y VL procedentes de JOVI-1 eran correctas y que pueden plegarse como un fragmento variable de cadena sencilla. El sobrenadante de hibridoma original, el anticuerpo JOVI-1 recombinante y scFv-Fc generados a partir de células 293T transfectadas se usaron para teñir una serie de líneas celulares: Jurkat con TCR desactivados, Jurkat de tipo silvestre, Jurkat con TCR desactivados transducidas con un TCR TRBC1 en un vector que expresa conjuntamente eBFP2; Jurkat con TCR desactivados transducidas con un TCR TRBD2 en un vector que expresa conjuntamente eBFP2. La tinción se analizó por citometría de flujo. Las células unidas tanto al anticuerpo recombinante como a scFv expresaron TRBC2.
FIGURA 14: CAR basados en JOVI-1 en diferentes formatos. Los CAR generalmente comprenden un dominio de unión, un espaciador, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En este estudio, se generaron c A r que comprenden el scFv de JOVI-1; un espaciador procedente del tallo de CD8, el dominio bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana con mutaciones que eliminan la unión a FcR; o un espaciador procedente de IgG1 humana.
FIGURA 15: Función de CAR basado en JOVI-1. Los linfocitos T de sangre periférica de donante normal se transdujeron con los diferentes CAR descritos anteriormente. Los linfocitos T también se transdujeron con un CAR específico de CD19 como control. Después, estos linfocitos T se sometieron a provocación con células diana: células Jurkat con TCR desactivados y Jurkat de tipo silvestre y Raji (una línea de linfoma de linfocitos B CD19+). Se muestran datos de liberación de cromo de los efectores contra diferentes dianas. Los linfocitos T con CAR de JOVI-1 destruyen células Jurkat pero no a las células Raji o Jurkat con TCR desactivados.
FIGURA 16: Autoeliminación de cultivos de linfocitos T con CAR de JOVI-1. Debido a que los linfocitos T comprenden un número aproximadamente igual de linfocitos T que son TRBC1 o TRBC2 positivos, es posible que después de la introducción de CAR pueda producirse una cierta cantidad de "fratricidio" o autoeliminación del cultivo. Se demostró que este era el caso. En este ejemplo, los linfocitos T con CAR se tiñeron después de la transducción y se analizaron por citometría de flujo. Al comparar transducidos simulados frente a transducidos, se puede observar que la población de linfocitos T pierde linfocitos T TRBC1 positivos.
Figura 17: Investigando la capacidad de clonación de la leucemia de linfocitos T grandes granulares (T-LGL) -Paciente A
Figura 18: Investigando la capacidad de clonación de la leucemia de linfocitos T grandes granulares (T-LGL) -Paciente B
Figura 19: Investigando la capacidad de clonación de la leucemia de linfocitos T grandes granulares (T-LGL) -Paciente C
Figura 20: Investigando la capacidad de clonación de linfoma de linfocitos T policlonales (PCTL) - Paciente D
Figura 21: Estrategias de selección en fagos de péptidos TRBC. A) Dos rondas de selecciones de presentación en fagos en péptidos TRBC inmovilizados directa o indirectamente en una superficie. B) Tres rondas de selecciones de presentación en fagos en fase de solución en péptidos TRBC biotinilados.
Figura 22: Análisis de resultados de fagos policlonales a partir de selecciones de presentación en fagos de péptidos TRBC. Ensayo de unión a TRF usando fagos policlonales de selecciones en fase sólida llevadas a cabo en péptidos TRBC directamente inmovilizados como conjugados BSA/OA (A), selecciones en fase sólida en péptidos TRBC inmovilizados en estreptavidina/neutravidina (B) y de selecciones en fase de solución (C).
Figura 23: Representación esquemática del vector pSANG10-3F. El gen que codifica el anticuerpo de cadena sencilla (scFv) se clona en el sitio NcoI/NotI cadena abajo del promotor T7 y el líder pelB (para la translocación periplásmica). El vector también contiene una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) para la purificación y detección de la etiqueta tri-FLAG.
Figura 24: Exploración primaria para aglutinantes específicos para TRBC1 y TRBC2. Unión de 94 scFv de las selecciones de TRBC1 (A) y TRBC2 (B) a TRBC1 y TRBC2 (0,5 pg/ml) biotinilados inmovilizados sobre placas de 96 pocillos Nunc Maxisorp™ recubiertas con neutravidina (10 pg/ml). La unión de scFv a los péptidos inmovilizados se detectó usando un anticuerpo antiFLAG conjugado con europio.
Figura 25: Unión de sueros de anticuerpos policlonales de conejo número 13174 inmunizado con TRBC1 contra péptidos TRBC1 y TRBC2. (A) Después de la 3a inmunización (B) Después de la 3a inmunización y purificación de anticuerpos específicos de TRBC1.
Figura 26: Unión de sueros de anticuerpos policlonales de conejo número 17363 inmunizado con péptido TRBC2 contra péptidos TRBC1 y TRBC2. (A) Después de la 3a inmunización (B) Después de la 3a inmunización y purificación de anticuerpos específicos de TRBC2.
Figura 27: Unión de sueros de anticuerpos policlonales de conejo número 17364 inmunizado con péptido TRBC2 contra péptidos TRBC1 y TRBC2. (A) Después de la 3a inmunización (B) Después de la 3a inmunización y purificación de anticuerpos específicos de TRBC2.
Sumario de aspectos de la divulgación
Los presentes inventores han ideado un método mediante el cual es posible agotar los linfocitos T malignos en un sujeto, sin afectar una proporción significativa de linfocitos T sanos. En particular, los presentes inventores han desarrollado receptores quiméricos de antígeno (CAR) específicos de TRBC1 y TRBC2 para su uso en el tratamiento de neoplasias malignas de linfocitos T.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno que se une selectivamente a la región constante de TCR beta 1 (TRBC1) o a TRBC2.
En un primer aspecto del primer aspecto de la divulgación, se proporciona un CAR que se une selectivamente a TRBC1. En este aspecto, el CAR puede comprender un dominio de unión a antígeno que tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):
CDR1 de VH: SEQ ID NO: 7;
CDR2 de VH: SEQ ID NO: 8;
CDR3 de VH: SEQ ID NO: 9;
CDR1 de VL: SEQ ID NO: 10;
CDR2 de VL: SEQ ID NO: 11; y
CDR3 de VL: SEQ ID NO: 12.
El CAR puede comprender un dominio de unión a antígeno que comprende una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 2.
El CAR puede comprender un dominio de unión a antígeno que comprende un scFv que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3.
El CAR puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 33, 34 y 35.
El CAR puede comprender una CDR3 de VH y/o una CDR3 de VL de las enumeradas en la Tabla 1. El CAR puede comprender un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende:
(i) la CDR3 de cadena pesada y/o la CDR3 de cadena ligera;
(ii) la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera; o
(iii) la cadena pesada variable (VH) y/o la cadena ligera variable (VL);
de uno de los scFv mostrados como la SEQ ID NO: 13 a 22.
En un segundo aspecto del primer aspecto de la divulgación, se proporciona un CAR que se une selectivamente a TRBC2.
En relación con este aspecto, el CAR puede comprender una CDR3 de VH y/o una CDR3 de VL de las enumeradas en la Tabla 2.
El CAR puede comprender un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende:
(i) la CDR3 de cadena pesada y/o la CDR3 de cadena ligera;
(ii) la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera; o
(iii) la cadena pesada variable (VH) y/o la cadena ligera variable (VL);
de uno de los scFv mostrados como la SEQ ID NO: 23 a 32.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, se proporciona un vector que comprende una secuencia del ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
En un cuarto aspecto, se proporciona una célula que expresa un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La célula puede ser una célula inmunitaria citolítica, tal como un linfocito T o linfocito citolítico natural (NK).
En un quinto aspecto, se proporciona un método para producir una célula según el cuarto aspecto de la invención que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con una secuencia del ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o con un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, se proporciona una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención para su uso en un método para tratar un linfoma o una leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de administrar la célula que comprende el CAR selectivo para TCRB1 o TCRB2 al sujeto, para provocar el agotamiento selectivo de los linfocitos T malignos, junto con los linfocitos T normales que expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos, pero no para provocar el agotamiento de los linfocitos T normales que expresan la TRBC no expresada por los linfocitos T malignos.
El método también puede comprender la etapa de investigar la región constante de TCR beta (TCRB) de un linfocito T maligno del sujeto para determinar si expresa TRBC1 o TRBC2.
También se describe un método para tratar un linfoma o leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de administrar un agente selectivo para TCRB1 o TCRB2 al sujeto, en el que el agente provoca el agotamiento selectivo de los linfocitos T malignos, junto con los linfocitos T normales que expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos, pero no provoca el agotamiento de los linfocitos T normales que expresan la TRBC no expresada por los linfocitos T malignos.
En un primer aspecto del presente aspecto de la divulgación, el agente es un agente selectivo de TCRB1. En un segundo aspecto del presente aspecto de la divulgación, el agente es un agente selectivo de TRBC2.
El método también puede comprender la etapa de investigar la región constante de TCR beta (TRBC) de un linfocito T maligno para determinar si expresa TRBC1 o TRBC2, antes de la etapa de administración.
El agente puede ser un anticuerpo monoclonal agotador o un fragmento del mismo. El agente puede ser un anticuerpo conjugado, que puede comprender una entidad quimioterapéutica.
El agente puede ser un activador de linfocitos T biespecífico. El agente puede ser un receptor quimérico de antígeno (CAR) que expresa linfocitos T. El CAR puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 33, 34 y 35.
El agente puede comprender el anticuerpo JOVI-1 o un fragmento funcional del mismo.
El agente puede comprender un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):
CDR1 de VH: SEQ ID NO: 7;
CDR2 de VH: SEQ ID NO: 8;
CDR3 de VH: SEQ ID NO: 9;
CDR1 de VL: SEQ ID NO: 10;
CDR2 de VL: SEQ ID NO: 11; y
CDR3 de VL: SEQ ID NO: 12.
El agente puede comprender un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 2.
El agente puede comprender un ScFv que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3. El agente puede proporcionarse como una composición farmacéutica.
El linfoma o leucemia de linfocitos T puede seleccionarse entre linfoma periférico de linfocitos T, no especificado (PTCL-NOS); linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de linfocitos T asociado a enteropatía (EATL), linfoma hepatoesplénico de linfocitos T (HSTL), linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma cutáneo de linfocitos T, ALCL cutáneo primario, leucemia prolinfocítica de linfocitos T y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T.
La presente divulgación también proporciona un agente para su uso en el tratamiento de un linfoma o leucemia de linfocitos T de acuerdo con dicho método.
La presente divulgación también proporciona un kit que comprende un agente para su uso como se define anteriormente.
La presente divulgación también proporciona el uso de un agente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma o leucemia de linfocitos T de acuerdo con el método anterior.
La presente divulgación también proporciona un método para diagnosticar un linfoma o leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de determinar el porcentaje de linfocitos T totales en una muestra que son TRBC1 o t RbC2 positivos.
Un porcentaje de linfocitos T TRBC1 o TRBC2 positivos que es mayor de aproximadamente un 80 % puede indicar la presencia de un linfoma o leucemia de linfocitos T.
La muestra puede ser una muestra de sangre periférica o una biopsia.
El agente que se une a la totalidad de los linfocitos T puede unirse a CD3.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona agentes, tales como los receptores quiméricos de antígeno (CAR) que se unen selectivamente a TRBC1 o TRBC2. Tales agentes son útiles en métodos para tratar un linfoma o leucemia de linfocitos T en un sujeto. Las neoplasias malignas de linfocitos T son clonales, por lo que expresan TRBC1 o TRBC2. Al administrar un agente selectivo de TCRB1 o TCRB2 al sujeto, el agente provoca un agotamiento selectivo de los linfocitos T malignos, junto con los linfocitos T normales que expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos, pero no provoca el agotamiento de los linfocitos T normales que expresan la TRBC no expresada por los linfocitos T malignos.
REGIÓN CONSTANTE de TCR p (TRBC)
El receptor de linfocitos T (TCR) se expresa en la superficie de los linfocitos T y es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Cuando el TCR se acopla con el péptido antigénico y el MHC (péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.
El TCR es un heterodímero anclado en la membrana unido por disulfuro que normalmente consiste en las cadenas alfa (a) y beta (p) altamente variables expresadas como parte de un complejo con las moléculas de cadena CD3 invariantes. Los linfocitos T que expresan este receptor se denominan linfocitos T a:p (o ap) (-95 % de linfocitos T totales). Una minoría de linfocitos T expresan un receptor alternativo, formado por cadenas gamma (y) y delta (8) variables, y se denominan linfocitos T y¿ (-5 % de linfocitos T totales).
Cada cadena a y p está compuesta por dos dominios extracelulares: Una región Variable (V) y una región Constante (C), ambas del dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) formando láminas p antiparalelas. La región constante está proximal a la membrana celular, seguida de una región transmembrana y una cola citoplasmática corta, mientras que la región variable se une al complejo péptido/MHC (véase la Figura 1). La región constante del TCR consiste en secuencias de conexión cortas en las que un resto de cisteína forma enlaces disulfuro, que forman un enlace entre las dos cadenas.
Los dominios variables tanto de la cadena a como de la cadena p de TCR tienen tres regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). La región variable de la cadena p también tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4), sin embargo, esta normalmente no entra en contacto con el antígeno y, por lo tanto, no se considera una CDR.
El TCR también comprende hasta cinco cadenas invariantes y, 6, £ (denominadas colectivamente CD3) y Z. Las CD3 y subunidades Z median la señalización de TCR a través de dominios citoplasmáticos específicos que interactúan con el segundo mensajero y las moléculas adaptadoras después del reconocimiento del antígeno por ap o y6. La expresión en la superficie celular del complejo TCR está precedida por el ensamblaje de subunidades por pares en el que desempeñan un papel tanto el dominio transmembrana como el extracelular de TCR a y p y CD3 y y 6.
Por lo tanto, los TCR se componen comúnmente del complejo CD3 y las cadenas TCRa y p, que a su vez se componen de regiones variables y constantes (Figura 1).
El locus (Chr7:q34) que suministra la región constante de p de TCR (TRBC) se ha duplicado en la historia evolutiva para producir dos genes casi idénticos y funcionalmente equivalentes: TRBC1 y TRBC2 (Figura 2), que difieren solo en 4 aminoácidos en el proteína madura producida por cada uno (Figura 3). Cada TCR comprenderá, de manera mutuamente excluyente, TRBC1 o TRBC2 y, como tal, cada linfocito T ap expresará TRBC1 o TRBC2, de una manera mutuamente excluyente.
Los presentes inventores han determinado que, a pesar de la similitud entre la secuencia de TRBC1 y TRBC2, es posible discriminar entre ellos. Los presentes inventores también han determinado que las secuencias de aminoácidos de TRBC1 y TRBC2 pueden discriminarse in situ sobre la superficie de una célula, por ejemplo, un linfocito T.
CÉLULAS MALIGNAS
El término "maligno" se usa en el presente documento de acuerdo con su significado habitual para referirse a una célula que no está autolimitada en su crecimiento, puede ser capaz de invadir tejidos adyacentes y puede propagarse a un tejido distante. Como tal, la expresión "linfocito T maligno" se usa en el presente documento para referirse a un linfocito T expandido clonalmente en el contexto de un linfoma o leucemia.
La presente invención implica determinar la TRBC de un linfocito T maligno. Esto puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse mediante PCR, transferencia de Western, citometría de flujo o métodos de microscopía fluorescente.
Una vez que se ha determinado la TRBC expresada por un linfocito T maligno, se administra al sujeto el agente selectivo de TRBC1 o TRBC2 apropiado. El "agente selectivo de TRBC apropiado" significa que cuando se determina que el linfocito T maligno expresa TRBC1, se administra un agente selectivo de TRBC1, mientras que cuando se determina que el linfocito T maligno expresa TRBC2, se administra un agente selectivo de TRBC2.
AGENTE SELECTIVO
El agente selectivo se une a TRBC1 o TRBC2 de una manera mutuamente excluyente.
Como se indica anteriormente, cada linfocito T ap expresa un TCR que comprende TRBC1 o TRBC2. En un trastorno clonal de linfocitos T, como un linfoma o leucemia de linfocitos T, los linfocitos T malignos derivados del mismo clon expresarán TRBC1 o TRBC2.
Por lo tanto, la presente divulgación comprende la etapa de administrar un agente selectivo de TRBC1 o TRBC2 al sujeto, en el que el agente provoca el agotamiento selectivo de los linfocitos T malignos, junto con los linfocitos T normales que expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos, pero no provoca el agotamiento significativo de los linfocitos T normales que expresan la TRBC diferente a la de los linfocitos T malignos.
Debido a que el agente selectivo de TRBC no provoca un agotamiento significativo de los linfocitos T normales que expresan la TRBC diferente a la de los linfocitos T malignos, no provoca el agotamiento de todo el compartimento de linfocitos T. La retención de una proporción del compartimento de linfocitos T del sujeto (es decir, linfocitos T que no expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos) da como resultado una toxicidad reducida y una inmunodeficiencia celular y humoral reducida, reduciendo así el riesgo de infección.
La administración de un agente selectivo de TRBC1 de acuerdo con la presente divulgación puede dar como resultado un agotamiento del 5, 10, 20, 50, 75, 90, 95 o 99 %, es decir, reducción en el número de linfocitos T que expresan TRBC1.
La administración de un agente selectivo de TRBC2 de acuerdo con la presente divulgación puede dar como resultado un agotamiento del 5, 10, 20, 50, 75, 90, 95 o 99 %, es decir, reducción en el número de linfocitos T que expresan TRBC2.
Un agente selectivo de TRBC1 puede unirse a TRBC1 con una afinidad al menos 2 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces o 10 veces mayor que a TRBC2. De manera análoga, un agente selectivo de TRBC2 puede unirse a TRBC2 con una afinidad al menos 2 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces o 10 veces mayor que a TRBC1.
Un agente selectivo de TRBC1 provoca el agotamiento de una mayor proporción de linfocitos T que expresan TRBC1 en la población celular que de linfocitos que expresan TRBC2. Por ejemplo, la relación de agotamiento de los linfocitos T que expresan TRBC1 a los linfocitos que expresan TRBC2 puede ser al menos 60 %:40 %, 70 %:30 %, 80 %:20 %, 90 %:10 % o 95 %:5 %. De manera análoga, un agente selectivo de TRBC2 provoca el agotamiento de una mayor proporción de linfocitos T que expresan TRBC2 en la población celular que de linfocitos que expresan TRBC1. Por ejemplo, la relación de agotamiento de los linfocitos T que expresan TRBC2 a los linfocitos que expresan TRBC1 puede ser al menos 60 %:40 %, 70 %: 30 %, 80 %:20 %, 90 %:10 % o 95 %:5 %.
Usando el método de la divulgación, los linfocitos T malignos se eliminan en un sujeto, sin afectar una proporción significativa de linfocitos T sanos. Por "una proporción significativa" se entiende que una proporción suficiente de linfocitos T que expresan la TRBC diferente de la de los linfocitos T malignos sobreviven para mantener la función de los linfocitos T en el sujeto. El agente puede provocar un agotamiento de menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de la población de linfocitos T que expresa la otra TCRB.
El agente selectivo puede ser selectivo para TRBC1 o TRBC2 porque discrimina los restos que se enumeran a continuación:
(i) N de K en la posición 3 de la TRBC;
(ii) K de N en la posición 3 de la TRBC;
(iii) K de N en la posición 4 de la TRBC;
(iv) N de K en la posición 4 de la TRBC;
(v) F de Y en la posición 36 de la TRBC;
(vi) Y de F en la posición 36 de la TRBC;
(vii) V de E en la posición 135 de la TRBC; y/o
(viii) E de V en la posición 135 de la TRBC.
El agente selectivo puede discriminar cualquier combinación de las diferencias anteriores.
ANTICUERPO
El agente usado en el método de la presente divulgación puede ser un anticuerpo monoclonal (mAb) agotador o un fragmento funcional del mismo, o un mimético de anticuerpo.
La expresión 'anticuerpo agotador' se usa en el sentido convencional para referirse a un anticuerpo que se une a un antígeno presente en un linfocito T diana y media la muerte del linfocito T diana. Por lo tanto, la administración de un anticuerpo agotador a un sujeto da como resultado una reducción/disminución en el número de células dentro del sujeto que expresan el antígeno diana.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" significa un polipéptido que tiene un sitio de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad CDR. El anticuerpo puede comprender 3 CDR y tener un sitio de unión a antígeno que es equivalente al de un anticuerpo de un dominio (dAb). El anticuerpo puede comprender 6 CDR y tener un sitio de unión a antígeno que es equivalente al de una molécula de anticuerpo clásica. El resto del polipéptido puede ser cualquier secuencia que proporcione un armazón adecuado para el sitio de unión a antígeno y lo presente de una manera apropiada para que se una al antígeno. El anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina completa o una parte de la misma, tal como un Fab, F(ab)'2, Fv, un fragmento Fv monocatenario (scFv) o un nanocuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo bifuncional. El anticuerpo puede ser no humano, quimérico, humanizado o completamente humano.
Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier fragmento funcional que conserve la especificidad antigénica del anticuerpo completo.
ANTICUERPOS SELECTIVOS DE TRBC1
El agente de la presente invención para SU uso en el método de la presente divulgación puede comprender un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende una o más de las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):
CDR1 de VH: GYTFTGY (SEQ ID NO: 7);
CDR2 de VH: NPYNDD (SEQ ID NO: 8);
CDR3 de VH: GAGYNFDGAYRFFDF (SEQ ID NO: 9);
CDR1 de VL: RSSQRLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 10);
CDR2 de VL: RVSNRFP (SEQ ID NO: 11); y
CDR3 de VL: SQSTHVPYT (SEQ ID NO: 12).
La una o más CDR, cada una de manera independiente, puede o no comprender una o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 7 a 12, siempre que el anticuerpo resultante conserve la capacidad de unirse selectivamente a TRBC1.
Los estudios han demostrado que las CDR L3 y H3 son las principales responsables de las interacciones de alta energía con el antígeno, por lo que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, puede comprender CDR3 de VH y/o CDR3 de VL como se describe anteriormente.
Usando presentación en fagos, se han identificado varios dominios de unión a anticuerpos adicionales que son altamente selectivos para unirse a TRBC1 sobre TRBC2, como se describe en el Ejemplo 12.
El agente puede comprender un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR3) mostradas en la Tabla 1.
SEQ_lD_1 VH de Jovi-1
EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYN
DDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFF
DFWGQGTTLTVSS
SEQ_ID_2 VL de Jovi-1
DWMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRV
SNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
El agente puede comprender un scFv que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID NO: 3. SEQ_ID_3 scFv de Jovi-1
EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYN
DDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFF
DFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDWMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSS
QRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR
VEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
Alternativamente, el agente puede comprender un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende:
(i) la CDR3 de cadena pesada y/o la CDR3 de cadena ligera;
(ii) la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera; o
(iii) la cadena pesada variable (VH) y/o la cadena ligera variable (VL);
de uno de los scFv mostrados como la SEQ ID NO: 13-22.
En las secuencias mostrada como la SEQ ID NO: 13-22, las porciones VH y VL de la secuencia se muestran en negrita y las secuencias de CDR1 y CDR2 para las cadenas pesada y ligera están subrayadas. Las secuencias de CDR3 para VH y VL se dan en la Tabla 1.
SEQ ID NO: 13_(CP_01_E09)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAHNSSSWSFDY
WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSI
SSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFT1SSLQPEDIATY
YCQQYDNLPLTFGGGTKVDIKRTAAA
SEQ ID NO: 14 (CP_01_D12)
EVQLLESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGDTYGFLDN
WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQS
ISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA
TYYCQQFNAYPLTFGGGTKVEIKRTAAA
SEQ ID NO: 15 (CP_01_D10)
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGGSFGAFDIW
GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS
RYL.NWYQQKPGKAPNLUYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY
YCQQYNSYPLTFGGGTKLEIKRTAAA
SEQ ID NO: 16 (CP_01_C08)
EVQLLESGGGAVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAV1SYD
GSNKYYAPSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGYSSSWYLDY
WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQD
ISNYLNWYQQKPGKAPKLUYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIAT
YYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTAAA
SEQ ID NO: 17 (CP_01_C11)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHVWRQAPGQGLEWMGRINP
NSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASGGAGWNWG
QGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTATISCTRSSGSIAS
NYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPFGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEA
DYYCQSHDSSNWFGGGTQLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 18 (CP_01_F03)
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGY7ASSWSQG
LWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVRDRVTITCQASQ
DISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEPIA
TYYCQQYDNLPPTFGGGTKVEIKRTAAA
SEQ ID NO: 19 (CP_01_E07)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGGSGGAFDI
WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQTPHSLSVTPGQPASISCKSSQS
LLYSDGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE
AEDVGVYYCMQSIQLYTFGQGTKVDIKRTAAA
SEQ ID NO: 20 (CP_01_D03)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAAPGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNKQYGMDVWG
QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQSPATLSLAPGERATLSCRASQSVG
SNLAWYQQKPGQAPSLLIYDASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDIAVYY
CQQYHRWPLTFGGGTKVEIKRTAAA
SEQ ID NO: 21 (CP_01_F06)
EVQLLESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDDGAMRYWGQ
GTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLY
SSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQA
EDVAVYYCQQYYDSPYTFGQGTKVD1KRTAAA
SEQ ID NO: 22 (CP_01_F02)
QVQLVESGGGWQPGRPLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYD
GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGYSYADYWG
QGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASD1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQGIR
NDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATY
YCLQHNSYPLTFGGGTKVDIKRTAAA
ESPECÍFICO de TRBC2
Usando presentación en fagos, se han identificado varios dominios de unión a anticuerpos que son altamente selectivos para unirse a TRBC2 sobre TRBC1, como se describe en el Ejemplo 12.
El agente puede comprender un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR3) mostradas en la Tabla 2.
Tabla 2
ID del don Número de VH d Número de VL d ru o de COft 3 CDR3 de Pesada ru o de CDR3CDR3 de Li era Unión a TRBC1 Unión a TRBC2
Figure imgf000015_0001
El agente puede comprender un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende:
(i) la CDR3 de cadena pesada y/o la CDR3 de cadena ligera;
(ii) la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera; o
(iii) la cadena pesada variable (VH) y/o la cadena ligera variable (VL);
de uno de los scFv mostrados como la SEQ ID NO: 23-32.
En las secuencias mostrada como la SEQ ID NO: 23-32, las porciones VH y VL de la secuencia se muestran en negrita y las secuencias de CDR1 y CDR2 para las cadenas pesada y ligera están subrayadas. Las secuencias de CDR3 para VH y VL se dan en la Tabla 2.
SEQ ID NO: 23 (CP_03_E05)
EVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGS
GGSTYYADSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTRSSGAFDIWG
QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIAS
KYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLRTEDEA
DYYCHSYDSNNHSVFGGGTKVTVLGQPAA
SEQ ID NO: 24 (CP_03_D05)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINP
NSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASPRGRGSAFDI
WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQPPSVSVSPGQTATISCSGDQLG
GKYGHWYQKKPGQSPVLVLYQDRKRPAGIPERFSGSSSGNTITLTISGTQAVDEA
DYYCQAWDTNLGGVFGGGTKVTVLGQPAA
SEQ ID NO: 25 (CP_03_H06)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEVWSYISSS GSTIYYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRTEDTAVYYCARARVGGMDVWGQ GTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGS1ASN YVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEAD YYCQSFDADNLHWFGGGTKLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 26 (CP_03_C12)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINP NSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTS1STAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGPIDYWGQ GTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHS DGKTYLYWYLQKPGQPPQLLVYEVSNRFSGVPDKFSGSGSGTDFTLKISRVEAEP VGVYYCMQGIQLPPTFGGGTKVDIKRTAAA
SEQ ID NO: 27 (CP_03_G02)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGIINPSG
GSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSIVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVWNSGSYLGFD
YWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQ
DISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF
ATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKRTAAA
SEQ ID NO: 28 (CP_03_D04)
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYP GSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGFTVPGGAFD IWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPHSVSPSPGKTVTISCTRSSG RIGSNFVQWYQQRPGSSPTTVIYEPPQRPSGVPARFSGSIPSSSNSASLTISGLTTA PEAGYYCQSYPASNVIFGGGTKLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 29 (CP_03_F10)
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINP
NSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFGERYAFDIW
GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASQSELTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSTDV
GAFHFVSWYQHTPGKAPKLLISEVRKRASGVPDRFSGSRSGNTASLTVSGLQSED
EADYFCSAYTGSNYVFGSGTKLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 30 (CP_03_G09)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTY
YRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDQWLANYY
YYGMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASSYELTQPLSVSVALGQTARITC
GGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISKAQ
AGDEADYYCQVWDSNSWVFGGGTKLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 31 (CP_03_F09)
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFASYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINP
SGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSRLRSDDTAVYYCASNRGGSYKSV
GMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPQSVSESPGKTVTISCI
RSSGNFASKYVQWYQQRPGSSPTTVIYENYQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSATLTIS
GLKTEDEADYYCQSYDEVSWFGGGTQLTVLGQPAA
SEQ ID NO: 32 (CP_03_D09)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCEASGYTFTSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNP
NSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVSSYYGMDV
WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGASNFMLTQPLSVSESPGKTVTISCTRSSGSI
ASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEPNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTED
EADYYCQSYNSSNHWVFGGGTKVTVLGQPAA
Las variantes de las secuencias de aminoácidos anteriores también se pueden usar en la presente divulgación siempre que el anticuerpo resultante se una a TRBC1 o TRBC2 y no reaccione de forma cruzada significativamente. Generalmente, tales variantes tienen un alto grado de identidad de secuencia con una de las secuencias especificadas anteriormente.
Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica.
La Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de NCBI está disponible en varias fuentes, incluido el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI, por sus siglas en inglés, Bethesda, Md.) y en Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, blastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en el sitio web de NCBI en Internet. Las variantes del dominio VL o VH o scFv generalmente tienen al menos aproximadamente un 75 %, por ejemplo al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-3, 13-32.
Generalmente, las variantes pueden contener una o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con la secuencia de aminoácidos o del ácido nucleico original. Las sustituciones conservativas son aquellas sustituciones que no afectan o disminuyen sustancialmente la afinidad de un anticuerpo para unirse a TRBC1 o TRBC2. Por ejemplo, un anticuerpo humano que se une específicamente a TRBC1 o TRBC2 puede incluir hasta 1, hasta 2, hasta 5, hasta 10 o hasta 15 sustituciones conservativas en una o ambas VH o VL en comparación con cualquiera de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-3 o 13-32 y conservan la unión específica a TRBC1 o TRBC2.
Los aminoácidos funcionalmente similares que pueden intercambiarse por medio de una sustitución conservativa son bien conocidos por un experto en la materia. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoácidos que se consideran sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS
La preparación de anticuerpos se puede realizar utilizando técnicas de laboratorio convencionales. Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de suero animal o, en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producirse en cultivo celular. La tecnología de ADN recombinante puede usarse para producir los anticuerpos de acuerdo con el procedimiento establecido, en cultivo de células bacterianas o de mamífero.
Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica. En resumen, los anticuerpos monoclonales se producen generalmente fusionando las células de mieloma con las células de bazo de un ratón o conejo que ha sido inmunizado con el antígeno deseado. En el presente documento, el antígeno deseado es el péptido t Rb C1 o TRBC2, o una cadena TCRp que comprende TRBC1 o TRBC2.
Alternativamente, los anticuerpos y las moléculas relacionadas, particularmente scFv, se pueden producir fuera del sistema inmunitario combinando bibliotecas de cadenas VH y VL de manera recombinante. Dichas bibliotecas pueden construirse y explorarse usando tecnología de presentación en fagos como se describe en el Ejemplo 12.
IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS SELECTIVOS DE TRBC1/TRBC2
Los anticuerpos que son selectivos para TRBC1 o TRBC2 pueden identificarse usando métodos que son convencionales en la técnica. Los métodos para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET), bibliotecas de presentación en fagos, exploraciones de dos híbridos de levadura, coinmunoprecipitación, complementación de fluorescencia bimolecular y purificación por afinidad en tándem. Para identificar un anticuerpo que es selectivo para TRBC1 o TRBC2, se evalúa la unión del anticuerpo a cada uno de TRBC1 y TRBC2. Generalmente, esto se evalúa determinando la unión del anticuerpo a cada TRBC por separado. Un anticuerpo que es selectivo se une a TRBC1 o TRBC2 sin una unión significativa al otro TRBC.
MIMÉTICOS DE ANTICUERPOS
El agente puede ser alternativamente una molécula que no procede o no se basa en una inmunoglobulina. Se han desarrollado varias proteínas de repetición diseñadas (DRP, de sus siglas en inglés) "miméticas de anticuerpos" para explotar las capacidades de unión de los polipéptidos que no son anticuerpos.
Las proteínas de repetición, tales como las proteínas de repetición de anquirina o ricas en leucina, son moléculas de unión ubicuas que se producen, a diferencia de los anticuerpos, de forma intra y extracelular. Su arquitectura modular singular presenta unidades estructurales repetitivas (repeticiones), que se apilan juntas para formar dominios de repetición alargados que presentan superficies de unión a la diana variables y modulares. Basándose en esta modularidad, se pueden generar bibliotecas de polipéptidos combinatorias con especificidades de unión altamente diversificadas. Las DARPins (por sus siglas en inglés Designed Ankyrin Repeat Proteins, proteínas de repetición diseñadas de anquirina) son un ejemplo de un mimético de anticuerpo basado en esta tecnología.
Para las Anticalins, la especificidad de unión se obtiene de las lipocalinas, una familia de proteínas que realizan una serie de funciones in vivo asociadas con el transporte fisiológico y el almacenamiento de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una estructura fuerte intrínseca que comprende un barril p altamente conservado que sustenta cuatro bucles en un extremo de la proteína. Estos bucles para la entrada a un compartimento de unión y las diferencias conformacionales en esta parte de la molécula explican la variación en la especificidad de unión entre distintas lipocalinas.
Los Avímeros se desarrollan a partir de una familia grande de dominios de receptores extracelulares humanos mediante cambio de sitio de exones in vitro y la presentación en fagos, generando proteínas multidominio con propiedades de unión e inhibidoras.
Versacuerpos son proteínas pequeñas de 3-5 kDa con > 15 % de cisteínas, que forman un armazón de alta densidad de disulfuros, reemplazando el núcleo hidrófobo presente en la mayoría de las proteínas. El reemplazo de un gran número de aminoácidos hidrófobos, que comprenden el núcleo hidrófobo, por un pequeño número de disulfuros, da como resultado una proteína que es más pequeña, más hidrófila, más resistente a las proteasas y al calor, y que tiene una densidad más baja de epítopos de linfocitos T. Todas estas cuatro propiedades dan como resultado una proteína que tiene una inmunogenicidad considerablemente reducida. Además, pueden fabricarse en E. coli y son altamente solubles y estables.
CONJUGADOS
El anticuerpo o mimético puede ser un conjugado del anticuerpo o mimético y otro agente o anticuerpo, por ejemplo, el conjugado puede ser una entidad detectable o una entidad quimioterapéutica.
La entidad detectable puede ser un resto fluorescente, por ejemplo un péptido fluorescente. Un "péptido fluorescente" se refiere a un polipéptido que, después de la excitación, emite luz a una longitud de onda detectable. Ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen, aunque sin limitación, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), proteína fluorescente verde (GFP), GFP potenciado, proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente azul (BFP) y mCherry.
Se puede usar un agente selectivo de TRBC1 o TRBC2 conjugado con una entidad detectable para determinar la TRBC de un linfocito T maligno.
Una entidad quimioterapéutica como se usa en el presente documento se refiere a una entidad que es destructiva para una célula, es decir, la entidad reduce la viabilidad de la célula. La entidad quimioterapéutica puede ser un fármaco citotóxico. Un agente quimioterapéutico contemplado incluye, sin limitación, agentes alquilantes, nitrosoureas, etileniminas/metilmelamina, alquil sulfonatos, antimetabolitos, análogos de pirimidina, epipodofilotoxinas, enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica, tales como IFNa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino, antracenodionas, urea sustituida, tal como hidroxiurea, derivados de metilhidrazina, incluyendo N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina, supresores adrenocorticales tales como mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas, incluyendo antagonistas de adrenocorticoesteroides, tal como la prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y a acetato de megestrol; estrógenos tales como dietilestilbestrol y equivalentes de etinilestradiol; un antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos que incluyen propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tal como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropina y leuprolida; y antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida.
Un agente selectivo de TRBC conjugado con una entidad quimioterapéutica permite el suministro dirigido de la entidad quimioterapéutica a las células que expresan TRBC1 o TRBC2.
ACOPLADORES A LINFOCITOS T BIESPECÍFICOS
Se ha desarrollado una amplia variedad de moléculas que se basan en el concepto básico de tener dos dominios de unión similares a anticuerpos.
Las moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas son una clase de moléculas de tipo anticuerpo biespecíficas que se han desarrollado, principalmente para su uso como fármacos contra el cáncer. Dirigen el sistema inmunitario del hospedador, más específicamente la actividad citotóxica de los linfocitos T, contra una célula diana, tal como una célula cancerosa. En estas moléculas, un dominio de unión se une a un linfocito T a través del receptor CD3, y el otro a células diana tal como una célula tumoral (a través de una molécula específica del tumor). Debido a que la molécula biespecífica se une tanto a la célula diana como al linfocito T, acerca la célula diana al linfocito T, de modo que el linfocito T puede ejercer su efecto, por ejemplo, un efecto citotóxico en una célula cancerosa. La formación del complejo de linfocito T:Ac biespecífico:célula cancerosa induce la señalización en los linfocitos T que conduce, por ejemplo, a la liberación de mediadores citotóxicos. De manera ideal, el agente solo induce la señalización deseada en presencia de la célula diana, lo que lleva a la destrucción selectiva.
Las moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas se han desarrollado en varios formatos diferentes, pero una de las más comunes es una fusión que consiste en dos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) de diferentes anticuerpos. A veces se les conoce como BiTE (por sus siglas en inglés, Bi-specific T-cell Engagers,Acopladores de linfocitosT biespecíficos).
El agente usado en el método de la presente divulgación puede ser una molécula biespecífica que reconoce selectivamente TRBC1 o TRBC2 y es capaz de activar un linfocito T. Por ejemplo, el agente puede ser un BiTE. El agente utilizado en el método puede comprender:
(i) un primer dominio que se une a TRBC1 o TRBC2; y
(ii) un segundo dominio capaz de activar un linfocito T.
La molécula biespecífica puede comprender un péptido señal para ayudar en su producción. El péptido señal puede hacer que la molécula biespecífica sea secretada por una célula hospedadora, de modo que la molécula biespecífica se pueda recoger del sobrenadante de la célula hospedadora.
El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula. La molécula biespecífica puede tener la fórmula general: Péptido señal - primer dominio - segundo dominio.
LA molécula biespecífica puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el primer dominio con el segundo dominio y separar espacialmente los dos dominios.
La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8. El enlazador puede comprender, como alternativa, una secuencia enlazadora alternativa que tiene longitud y/o propiedades espaciadoras de dominios similares a las de una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8.
La molécula biespecífica puede comprender el, JOVI-1 o un fragmento funcional del mismo, como se define anteriormente.
RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENO (CAR)
Los receptores quiméricos de antígenos (CAR), también conocidos como receptores quiméricos de linfocitos T, receptores de linfocitos T artificiales e inmunorreceptores quiméricos, son receptores genomanipulados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. En un CAR clásico, la especificidad de un anticuerpo monoclonal se injerta en un linfocito T. Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. De esta forma, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos de cáncer para transferencia celular adoptiva. Los estudios clínicos en fase I de este enfoque muestran eficacia.
El dominio de unión diana-antígeno de un CAR se fusiona habitualmente a través de un espaciador y dominio transmembrana a un endodominio, que comprende o se asocia con un dominio de señalización de linfocitos T intracelular. Cuando el CAR une diana-antígeno, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa.
El agente usado en el método de la presente divulgación puede ser un CAR que reconoce selectivamente TRBC1 o TRBC2. El agente puede ser un linfocito T que expresa un CAR que reconoce selectivamente TRBC1 o TRBC2.
El CAR también puede comprender un dominio transmembrana que abarca la membrana. Puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembrana puede proceder de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.
El endodominio es la porción de la CAR implicada en la transmisión de señal. El endodominio comprende o se asocia con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T. Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. El componente de señalización de linfocitos T más habitualmente usado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y puede necesitarse una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, puede usarse c D28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o pueden usarse los tres juntos.
El endodominio del CAR puede comprender el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y CD3-Zeta.
El CAR puede comprender un péptido señal de modo que, cuando el CAR se exprese dentro de una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirija al retículo endoplasmático y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.
El CAR puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a TRBC con el dominio transmembrana y separar espacialmente el dominio de unión a TRBC del endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a TRBC se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión a TRBC.
La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8, o una combinación de los mismos. El enlazador puede comprender, como alternativa, una secuencia enlazadora alternativa que tiene longitud y/o propiedades espaciadoras de dominios similares a una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8.
Se encontró que los CAR que comprenden un espaciador basado en una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8 mostraron el mejor rendimiento contra las células Jurkat (Figura 15). El espaciador puede comprender, por lo tanto, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8 o un espaciador que tiene longitud y/o propiedades espaciadoras de dominios similares a las de una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8.
Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.
El CAR puede comprender el anticuerpo JOVI-1 o un fragmento funcional del mismo, como se define anteriormente.
El CAR puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 33, 34 y 35.
>SEQ_ID_33 CAR de JOVI-1 con espaciador de tallo de CD8
METDTLLLWVLLVWIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHW
VKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAV
YYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDWMTQS
PLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLUYRVSNRFPGV
PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPTTTPA
PRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVWGGVLACYSL
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>SEQ_ID_34 CAR de JOVI-1 con espaciador H-CH2-CH3pvaa
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>SEQ_ID_35 CAR de JOVI-1 con espaciador de bisagra de IgG1
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YYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDWMTQS
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En las secuencias de CAR proporcionadas anteriormente, la una o más de las 6 CDR, cada una de manera independiente, puede o no comprender una o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 7 a 12, siempre que el CAR resultante conserve la capacidad de unirse selectivamente a TRBC1.
Las variantes de las secuencias de aminoácidos anteriores también se pueden usar en la presente divulgación siempre que el CAR resultante se una a TRBC1 o TRBC2 y no reaccione de forma cruzada significativamente. Generalmente, tales variantes tienen un alto grado de identidad de secuencia con una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 33, 34 o 35.
Las variantes del CAR generalmente tienen al menos aproximadamente un 75 %, por ejemplo al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 33, 34 o 35.
ÁCIDO NUCLEICO
La presente divulgación proporciona además un ácido nucleico que codifica un agente tal como un BiTE o CAR del primer aspecto de la divulgación.
La secuencia del ácido nucleico puede codificar un CAR que comprende una de las secuencias de aminoácidos mostradas como la SEQ ID NO: 33, 34 y 35.
Como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimos entre sí.
Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que los expertos pueden, utilizando técnicas de rutina, realizar sustituciones de nucleótidos que no afecten la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos descritos en este caso para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedador particular en el que los polipéptidos deben expresarse.
Los ácidos nucleicos según la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. También pueden ser polinucleótidos que incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Estos incluyen cadenas principales de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3 'y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso como se describe en el presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividad in vivo o la vida útil de los polinucleótidos de interés.
Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleótidos incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, supresión de o adición de un (o más) ácido nucleico a partir de o a la secuencia.
VECTOR
La presente divulgación también proporciona un vector o kit de vectores, que comprende una o más secuencias de los ácidos nucleicos de la divulgación. Tal vector puede usarse para introducir la secuencia o secuencias de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora de modo que exprese un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación.
El vector puede, por ejemplo, ser un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.
El vector puede ser capaz de transfectar o transducir un linfocito T o un linfocito citolítico natural.
CÉLULA
La presente divulgación también se refiere a una célula, tal como una célula inmunitaria, que comprende un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación.
La célula puede comprender un ácido nucleico o un vector de la presente divulgación.
La célula puede ser un linfocito T o una célula citolítica natural (NK).
Las células T pueden ser células T o linfocitos T que son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y las células citolíticas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular. Hay varios tipos de linfocitos T, tal como se resume a continuación.
Los linfocitos T auxiliares (linfocitos TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunitarios, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria, y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Los linfocitos TH expresan CD4 en su superficie. Los linfocitos TH se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.
Los linfocitos T citolíticos (linfocitos TC o CTL) destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicados en el rechazo de trasplantes. Los CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.
Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno afín, proporcionando así el sistema inmunitario con "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos T de memoria comprenden tres subtipos: linfocitos T de memoria central (linfocitos TCM) y dos tipos de linfocitos T de memoria efectores (linfocitos TEM y linfocitos TEMRA). Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria generalmente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.
Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocido como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo.
Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+: los linfocitos Treg de origen natural y los linfocitos Treg adaptativos.
Los linfocitos Treg de origen natural (también conocidos como linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre los linfocitos T en desarrollo con células dendríticas tanto mieloides (CD11c+) como plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Los linfocitos Treg de origen natural se pueden distinguir de otros linfocitos T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de linfocitos T reguladores, causando la enfermedad autoinmunitaria letal IPEX.
Los linfocitos Treg adaptativos (también conocidos como linfocitos Tr1 o linfocitos Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.
EL linfocito puede ser un linfocito citolítico natural (o linfocito NK). Los linfocitos NK forman parte del sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del MHC. Los linfocitos NK (que pertenecen al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL, por sus siglas en inglés) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T. Se sabe que los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, amígdalas y timo donde después entran en la circulación.
Las células con CAR de la invención pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente. Los linfocitos T o NK que expresan un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención pueden crearse ex vivo ya sea de la propia sangre periférica del paciente (1a parte), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte), o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte).
Alternativamente, Los linfocitos T o NK que expresan un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención pueden proceder de la diferenciación ex vivo de progenitores inducibles a linfocitos T o NK. Alternativamente, se puede usar una línea de linfocitos T que conserva su función lítica y podría actuar como un agente terapéutico.
En todos estos aspectos los linfocitos con CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica los CAR por uno de los muchos medios, incluida la transducción con un vector viral, la transfección con a Dn o ARN. EL linfocito con CAR de la invención puede ser un linfocito T o NK ex vivo de un sujeto. El linfocito T o NK puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los linfocitos T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de ser transducidas con ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención, por ejemplo mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.
Un linfocito T o NK de la invención puede producirse mediante:
(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T o NK de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y
(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o NK con una o más secuencias de los ácidos nucleicos que codifican un CAR de la invención.
Los linfocitos T o NK pueden entonces purificarse, por ejemplo, seleccionarse basándose en la expresión del dominio de unión a antígeno del polipéptido de unión a antígeno.
La presente divulgación también proporciona un kit que comprende un linfocito T o NK que comprende un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de linfocitos que expresan un CAR del primer aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.
LINFOMA Y/O LEUCEMIA DE LINFOCITOS T
La presente invención se refiere a agentes y células para su uso en métodos para tratar un linfoma y/o leucemia de linfocitos T.
Un método para tratar un linfoma y/o leucemia de linfocitos T se relaciona con el uso terapéutico de un agente. En el presente documento, el agente se puede administrar a un sujeto que tenga una enfermedad existente de linfoma y/o leucemia de linfocitos T para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para frenar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.
El método de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento de cualquier linfoma y/o leucemia asociado con la expansión clonal de una célula que expresa un receptor de linfocitos T (TCR) que comprende una región constante p. Como tal, el presente documento divulga un método para tratar una enfermedad que implica linfocitos T malignos que expresan un TCR que comprende una TRBC.
El método de la presente divulgación puede usarse para tratar un linfoma de linfocitos T en el que el linfocito T maligno expresa un TCR que comprende una TRBC. El término "linfoma" se usa, en el presente documento, de acuerdo con su significado convencional para referirse a un cáncer que generalmente se desarrolla en los ganglios linfáticos, pero que también puede afectar al bazo, médula ósea, sangre y otros órganos.
El linfoma generalmente se presenta como un tumor sólido de células linfoides. El síntoma principal asociado con el linfoma es la linfadenopatía, aunque los síntomas secundarios (B) pueden incluir fiebre, sudoración nocturna, pérdida de peso, pérdida de apetito, fatiga, dificultad respiratoria y picazón.
El método de la presente divulgación puede usarse para tratar una leucemia de linfocitos T en la que el linfocito T maligno expresa un TCR que comprende una TRBC. "Leucemia" se usa, en el presente documento, de acuerdo con su significado convencional para referirse a un cáncer de la sangre o de la médula ósea.
La siguiente es una lista ilustrativa, no exhaustiva de enfermedades que pueden tratarse mediante el método de la presente divulgación.
LINFOMA PERIFÉRICO DE LINFOCITOS T
Los linfomas periféricos de linfocitos T son linfomas relativamente poco frecuentes y representan menos del 10 % de todos los linfomas no Hodgkin (LNH). Sin embargo, están asociados con un curso clínico agresivo y las causas y los orígenes celulares precisos de la mayoría de los linfomas de linfocitos T aún no están bien definidos.
El linfoma generalmente se presenta primero como hinchazón en el cuello, axilas o ingle. Se puede producir una inflamación adicional donde se encuentran otros ganglios linfáticos, como en el bazo. En general, los ganglios linfáticos agrandados pueden invadir el espacio de los vasos sanguíneos, los nervios o el estómago, lo que provoca hinchazón de brazos y piernas, hormigueo y entumecimiento, o sensación de estar lleno, respectivamente. Los síntomas del linfoma también incluyen síntomas inespecíficos tales como fiebre, escalofríos, pérdida de peso inexplicable, sudoración nocturna, letargo y picazón.
La clasificación de la OMS utiliza características morfológicas e inmunofenotípicas junto con aspectos clínicos y, en algunos casos, genéticos para delinear una clasificación significativa desde el punto de vista pronóstico y terapéutico para los linfomas periféricos de linfocitos T (Swerdlow et al.; WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. 4a ed.; Lion: IARC Press; 2008). La localización anatómica de los linfocitos T neoplásicos es paralela en parte a sus homólogos y funciones celulares normales propuestos y, como tal, los linfomas de linfocitos T están asociados con los ganglios linfáticos y la sangre periférica. Este enfoque permite una mejor comprensión de algunas de las manifestaciones de los linfomas de linfocitos T, incluida su distribución celular, algunos aspectos de la morfología e incluso los hallazgos clínicos asociados.
El más común de los linfomas de linfocitos T es el linfoma periférico de linfocitos T, no especificado (PTCL-NOS) que comprende el 25 % del total, seguido por el linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL) (18,5 %)
LINFOMA PERIFÉRICO DE LINFOCITOS T, NO ESPECIFICADO (PTCL-NOS)
PTCL-NOS comprende más del 25 % de todos los linfomas periféricos de linfocitos T y linfomas de linfocitos NK/T y es el subtipo más común. Está determinado por un diagnóstico de exclusión, que no corresponde a ninguna de las entidades específicas de linfomas de linfocitos T maduros enumeradas en la o Ms 2008 actual. Como tal, es análogo al linfoma difuso de linfocitos B grandes, no especificado (DLBCL-NOS).
La mayoría de los pacientes son adultos con una mediana de edad de 60 años y una relación hombre/mujer de 2:1. La mayoría de los casos son de origen ganglionar, sin embargo, se producen presentaciones extraganglionares en aproximadamente el 13 % de los pacientes y con mayor frecuencia implican la piel y el tracto gastrointestinal.
El espectro citológico es muy amplio, desde polimorfo a monomorfo. Se han descrito tres variantes definidas morfológicamente, incluida la variante linfoepitelioide (Lennert), la variante de la zona T y la variante folicular. La variante linfoepitelioide de PTCL contiene abundantes histiocitos epitelioides de fondo y es comúnmente positiva para CD8. Esto se ha asociado con un mejor pronóstico. La variante folicular de PTCL-NOs está emergiendo como una entidad clinicopatológica potencialmente distinta.
La mayoría de PTCL-NOS tiene un fenotipo de linfocitos T maduros y la mayoría de los casos son CD4 positivos. El 75 % de los casos muestran pérdida variable de al menos un marcador de linfocitos pan-T (CD3, CD2, CD5 o CD7), siendo CD7 y CD5 regulados negativamente con mayor frecuencia. Se puede expresar CD30 y rara vez CD15, siendo CD15 una característica de pronóstico adverso. La expresión de CD56, aunque poco común, también tiene un impacto pronóstico negativo. Los factores pronósticos patológicos adversos adicionales incluyen una tasa de proliferación superior al 25 % basada en la expresión de KI-67 y la presencia de más del 70 % de células transformadas. El análisis inmunofenotípico de estos linfomas ha ofrecido poca información sobre su biología.
LINFOMA ANGIOINMUNOBLÁSTICO DE LINFOCITOS T (AITL)
El AITL es una enfermedad sistémica caracterizada por un infiltrado polimorfo que implica ganglios linfáticos, vénulas de endotelio alto prominentes (HEV) y expansión perivascular de mallas de células dendríticas foliculares (FDC). El AITL se considera un linfoma de linfocitos T de novo derivado de linfocitos T ap de tipo folicular auxiliar (TFH), que normalmente se encuentran en los centros germinales.
AITL es la segunda entidad más común entre el linfoma periférico de linfocitos T y los linfomas de linfocitos NK/T, comprendiendo aproximadamente el 18,5 % de los casos. Se produce en adultos de mediana edad a adultos mayores, con una mediana de edad de 65 años y una incidencia aproximadamente igual en hombres y mujeres. Clínicamente, los pacientes generalmente tienen enfermedad en estadio avanzado, con linfadenopatía generalizada, hepatoesplenomegalia y síntomas constitucionales prominentes. Comúnmente se presenta erupción cutánea con prurito asociado. Con frecuencia existe hipergammaglobulinemia policlonal, asociada con fenómenos autoinmunitarios.
Se describen tres patrones morfológicos diferentes en AITL. La lesión temprana de AITL (Patrón I) generalmente muestra una arquitectura conservada con folículos hiperplásicos característicos. La proliferación neoplásica se localiza en la periferia de los folículos. En el Patrón II, la arquitectura ganglionar se borra parcialmente con la retención de pocos folículos en regresión. Los senos subcapsulares se conservan e incluso se dilatan. La paracorteza contiene HEV arborizantes y hay una proliferación de FDC más allá del folículo de linfocitos B. Las células neoplásicas son de tamaño pequeño a mediano, con atipia citológica mínima. Con frecuencia tienen citoplasma claro a pálido, y pueden mostrar membranas de linfocitos T distintivas. Suele ser evidente un fondo inflamatorio polimorfo.
Aunque AITL es una neoplasia maligna de linfocitos T, existe una expansión característica de linfocitos B y células plasmáticas, lo que probablemente refleja la función de las células neoplásicas tales como linfocitos TFH. Están presentes tanto los linfocitos B EBV positivos como EBV negativos. Ocasionalmente, los linfocitos B atípicos pueden parecerse morfológica e inmunofenotípicamente a los linfocitos de tipo Hodgkin/Reed-Sternberg, lo que a veces conduce a una confusión diagnóstica con esa entidad. La proliferación de linfocitos B en AITL puede ser extensa y algunos pacientes desarrollan linfomas de linfocitos B grandes difusos EBV positivos secundarios (DLBCL) o, más raramente, tumores de linfocitos B EBV negativos, a menudo con diferenciación plasmocítica.
Los linfocitos T neoplásicos CD4 positivos de AITL muestran una fuerte expresión de CD10 y CD279 (PD-1) y son positivas para CXCL13. CXCL13 conduce a un aumento en el reclutamiento de linfocitos B a los ganglios linfáticos mediante la adhesión HEV, activación de los linfocitos B, diferenciación plasmática y expansión de la malla de FDC, contribuyendo todo a las características morfológicas y clínicas de AITL. La expresión intensa de PD-1 en las células tumorales perifoliculares es particularmente útil para distinguir el Patrón I de AITL de la hiperplasia folicular y paracortical reactiva.
La variante folicular de PTCL-NOS es otra entidad con un fenotipo TFH. En contraposición a AITL, no tiene HEV prominentes ni expansión extrafolicular de mallas de FDC. Las células neoplásicas pueden formar agregados intrafoliculares, imitando el linfoma folicular de linfocitos B, pero también pueden tener un patrón de crecimiento interfolicular o implicar zonas de manto expandidas. Clínicamente, la variante folicular de PTCL-NOS es distinta de AITL, ya que los pacientes presentan con mayor frecuencia enfermedad en estadio temprano con afectación parcial de los ganglios linfáticos y pueden carecer de los síntomas constitucionales asociados con AITL.
LINFOMA ANAPLÁSICO DE CÉLULAS GRANDES(ALCL)
ALCL puede subdividirse como ALCL-'quinasa de linfoma anaplásico' (ALK)+ o ALCL-ALK-.
ALCL-ALK+ es una de las entidades mejor definidas dentro de los linfomas periféricos de linfocitos T, con características "células distintivas" con núcleos en forma de herradura y que expresan ALK y CD30. Representa aproximadamente el 7 % de todos los linfomas periféricos de linfocitos T y linfocitos NK y es más común en las primeras tres décadas de vida. Los pacientes a menudo presentan linfadenopatía, pero la participación de sitios extraganglionares (piel, hueso, tejidos blandos, pulmón, hígado) y síntomas B es común.
ALCL, ALK muestra un amplio espectro morfológico, con 5 patrones diferentes descritos, pero todas las variantes contienen algunas células distintivas. Las células distintivas tienen núcleos excéntricos en forma de herradura o riñón, y una prominente región de Golgi eosinófila perinuclear. Las células tumorales crecen en un patrón cohesivo con predilección por la afectación sinusal. Las células tumorales más pequeñas predominan en la variante de células pequeñas, y en la variante linfohistiocítica abundantes histiocitos enmascaran la presencia de células tumorales, muchas de las cuales son pequeñas.
Por definición, todos los casos muestran positividad para ALK y CD30, con una expresión generalmente más débil en las células tumorales más pequeñas. Con frecuencia hay pérdida de marcadores de linfocitos pan-T, y el 75 % de los casos carece de expresión superficial de CD3.
La expresión de ALK es el resultado de una alteración genética recurrente característica que consiste en un reordenamiento del gen ALK en el cromosoma 2p23 a uno de los muchos genes asociados, lo que da como resultado una expresión de proteína quimérica. El gen asociado más común, que aparece en el 75 % de los casos, es la Nucleofosmina (NPM1) en el cromosoma 5q35, dando como resultado t(2; 5) (p23;q35). La distribución celular de ALK en diferentes variantes de translocación puede variar según el gen asociado.
ALCL-ALK- se incluye como categoría provisional en la clasificación de la OMS de 2008. Se define como un linfoma de linfocitos T CD30 positivo que es morfológicamente indistinguible de ALCL-ALK+ con un patrón de crecimiento cohesivo y presencia de células distintivas, pero que carece de expresión de proteína ALK.
Los pacientes suelen ser adultos entre las edades de 40 y 65 años, en contraste con ALCL-ALK+, que es más común en niños y adultos jóvenes. ALCL-ALK- puede implicar tanto a los ganglios linfáticos como a los tejidos extraganglionares, aunque esto último se ve con menos frecuencia que en ALCL-ALK+. La mayoría de los casos de ALCL-ALK- demuestran el borramiento de la arquitectura de los ganglios linfáticos por láminas de células neoplásicas cohesivas con características típicas "distintivas". Al contrario del ALCL-ALK+, no se reconoce la variante morfológica de células pequeñas.
A diferencia de su homólogo ALK+, ALCL-ALK- muestra una mayor conservación de la expresión del marcador de linfocitos T de superficie, mientras que es menos probable la expresión de marcadores citotóxicos y antígeno de membrana epitelial (EMA). Las firmas de expresión génica y los desequilibrios cromosómicos recurrentes son diferentes en ALCL-ALK- y ALCL-ALK+, confirmando que son entidades distintas a nivel molecular y genético.
ALCL-ALK- es clínicamente distinto tanto de ALCL-ALK+ como de PTCL-NOS, con diferencias significativas en el pronóstico entre estas tres entidades diferentes. La supervivencia general a 5 años de ALCL-ALK- se indica como el 49 %, lo que no es tan bueno como la de ALCL-ALK+ (70 %), pero al mismo tiempo es significativamente mejor que la de PTCL-NOS (32 %).
LINFOMA DE LINFOCITOS T ASOCIADO A ENTEROPATÍA (EATL)
EATL es una neoplasia agresiva que se cree que deriva de los linfocitos T intraepiteliales del intestino. Se reconocen dos tipos morfológicamente, inmunohistoquímicamente y genéticamente distintos de EATL en la clasificación de la OMS de 2008: Tipo I (que representa la mayoría de EATL) y Tipo II (que comprende el 10-20 % de los casos).
El EATL Tipo I generalmente se asocia con enteropatía abierta o clínicamente silenciosa sensible al gluten, y se observa con mayor frecuencia en pacientes de extracción del Norte de Europa debido a la alta prevalencia de enfermedad celíaca en esta población.
Muy frecuentemente, las lesiones de EATL se encuentran en el yeyuno o el íleon (90 % de los casos), con presentaciones raras en duodeno, colon, estómago o áreas fuera del tracto gastrointestinal. Las lesiones intestinales suelen ser multifocales con ulceración de la mucosa. El curso clínico de EATL es agresivo con la mayoría de los pacientes que mueren de enfermedad o complicaciones de la enfermedad dentro de 1 año.
El espectro citológico de EATL Tipo I es amplio, y algunos casos pueden contener células anaplásicas. Hay un fondo inflamatorio polimorfo, que puede complicar el componente neoplásico en algunos casos. La mucosa intestinal en regiones adyacentes al tumor a menudo muestra características de enfermedad celíaca con embotamiento de las vellosidades y un mayor número de linfocitos intraepiteliales (IEL), que pueden representar células precursoras de lesiones.
Por inmunohistoquímica, las células neoplásicas con frecuencia son CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-pF1 y contienen proteínas citotóxicas asociadas a gránulos (TIA-1, granzima B, perforina). CD30 se expresa parcialmente en casi todos los casos. CD103, que es un receptor de migración dirigida de la mucosa, se puede expresar en EATL.
El EATL Tipo II, también conocido como linfoma de linfocitos T intestinal monomórfico CD56+, se define como un tumor intestinal compuesto de linfocitos T monomórficos de tamaño pequeño a mediano que expresan tanto CD8 como CD56. Con frecuencia hay una diseminación lateral del tumor dentro de la mucosa y ausencia de fondo inflamatorio. La mayoría de los casos expresan el TCR y§, sin embargo, hay casos asociados con el TCR ap.
El EATL Tipo II tiene una mayor distribución mundial que el EATL Tipo I y con frecuencia se observa en poblaciones Asiáticas o Hispanas, en quienes la enfermedad celíaca es rara. En individuos de ascendencia Europea EATL, II representa aproximadamente el 20 % de los linfomas intestinales de linfocitos T, con antecedentes de enfermedad celíaca en al menos un subconjunto de casos. El curso clínico es agresivo.
LINFOMA HEPATOESPLÉNICO DE LINFOCITOS T (HSTL)
HSTL es una neoplasia sistémica agresiva generalmente procedente de linfocitos T citotóxicas y§ del sistema inmunitario innato, sin embargo, también puede proceder de linfocitos T ap en casos raros. Es uno de los linfomas de linfocitos T más raros, y generalmente afecta a adolescentes y adultos jóvenes (edad media, 35 años) con un fuerte predominio masculino.
LINFOMA EXTRAGANGLIONAR DE TIPO NASAL DE LINFOCITOS NK/T
El linfoma de linfocitos NK/T-extraganglionar, tipo nasal, es una enfermedad agresiva, a menudo con lesiones destructivas de la línea media y necrosis. La mayoría de los casos son de procedencia de linfocitos NK, pero algunos casos proceden de linfocitos T citotóxicos. Está universalmente asociado con el virus de Epstein-Barr (EBV).
LINFOMA CUTÁNEO DE LINFOCITOS T
El método de la presente divulgación también se puede usar para tratar el linfoma cutáneo de linfocitos T.
El linfoma cutáneo de linfocitos T (CTCL) se caracteriza por la migración de linfocitos T malignos a la piel, lo que hace que aparezcan varias lesiones. Estas lesiones cambian de forma a medida que la enfermedad progresa, generalmente comienzan como lo que parece ser una erupción y eventualmente forman placas y tumores antes de hacer metástasis a otras partes del cuerpo.
Los linfomas cutáneos de linfocitos T incluyen los mencionados en la siguiente lista ilustrativa, no exhaustiva; micosis fungoide, reticulosis pagetoide, síndrome de Sezary, piel flácida granulomatosa, papulosis linfomatoide, pitiriasis liquenoide crónica, linfoma cutáneo de linfocitos T CD30+, linfoma cutáneo secundario de linfocitos grandes CD30+, linfoma cutáneo de linfocitos T grandes CD30- distintos de micosis fungoides, linfoma pleomórfico de linfocitos T, Linfoma de Lennert, linfoma subcutáneo de linfocitos T y linfoma angiocéntrico.
Los signos y síntomas de CTCL varían según la enfermedad específica, de las que los dos tipos más comunes son micosis fungoide y síndrome de Sezary. La micosis fungoide clásica se divide en tres etapas:
Parche (atrófico o no atrófico): Dermatitis no específica, placas en la parte inferior del tronco y las nalgas; prurito mínimo/ausente; Placa: placas intensamente pruriginosas, linfadenopatía; y
Tumor: Propenso a la ulceración
El síndrome de Sezary se define por eritrodermia y leucemia. Los signos y síntomas incluyen piel edematosa, linfadenopatía, hiperqueratosis palmar y/o plantar, alopecia, distrofia ungueal, ectropión y hepatoesplenomegalia.
De todos los linfomas cutáneos primarios, el 65 % son del tipo de linfocitos T. El inmunofenotipo más común es el CD4 positivo. No existe una fisiopatología común para estas enfermedades, ya que el término linfoma cutáneo de linfocitos T abarca una amplia variedad de trastornos.
No se han dilucidado los mecanismos etiológicos primarios para el desarrollo del linfoma cutáneo de linfocitos T (es decir, micosis fungoides). La micosis fungoide puede estar precedida por una enfermedad cutánea inflamatoria crónica mediada por linfocitos T, que en ocasiones puede progresar a un linfoma mortal.
ALCL CUTÁNEO PRIMARIO(C-ALC)
C-ALCL es a menudo indistinguible de ALC-ALK- por la morfología. Se define como un tumor cutáneo de células grandes con morfología anaplásica, pleomórfica o inmunoblástica, con más del 75 % de las células que expresan CD30. Junto con la papulosis linfomatoide (LyP), C-ALCL pertenece al espectro de trastornos linfoproliferativos cutáneos primarios de linfocitos T CD30 positivos, que como grupo comprenden el segundo grupo más común de linfoproliferaciones cutáneas de linfocitos T después de la micosis fungoide.
El perfil de tinción inmunohistoquímica es bastante similar a ALCL-ALK-, con una mayor proporción de casos con tinción positiva para marcadores citotóxicos. Al menos el 75 % de las células tumorales deberían ser positivas para CD30. También se puede expresar CD15, y cuando se produce afectación de ganglios linfáticos, el diferencial con el linfoma de Hodgkin clásico puede ser difícil. Los casos raros de ALCL-ALK+ pueden presentarse con lesiones cutáneas localizadas y pueden parecerse a C-ALCL.
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DE LINFOCITOS T
La leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T (ALL-T) representa aproximadamente el 15 % y el 25 % de la ALL en cohortes pediátricas y de adultos, respectivamente. Los pacientes generalmente tienen un recuento alto de glóbulos blancos y pueden presentar organomegalia, particularmente agrandamiento mediastínico y afectación del SNC.
El método de la presente divulgación puede usarse para tratar T-ALL que se asocia con el linfocito T maligno que expresa un TCR que comprende una TRBC.
LEUCEMIA PROLINFOCÍTICA DE LINFOCITOS T
La leucemia prolinfocítica de linfocitos T (T-PLL) es una leucemia de linfocitos T maduros con comportamiento agresivo y predilección por la afectación de la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, hígado, bazo y piel. T-PLL afecta principalmente a adultos mayores de 30 años. Otros nombres incluyen leucemia linfocítica crónica de linfocitos T, leucemia de linfocitos T de tipo "nudoso" y leucemia prolinfocítica T/leucemia linfocítica de linfocitos T.
En la sangre periférica, T-PLL consiste en linfocitos de tamaño mediano con nucleolos únicos y citoplasma basófilo con ampollas o proyecciones ocasionales. Los núcleos son generalmente de forma redonda a ovalada, y ocasionalmente los pacientes tienen células con un contorno nuclear más irregular que es similar a la forma nuclear cerebriforme que se observa en el síndrome de Sezary. Una variante de células pequeñas comprende el 20 % de todos los casos de T-PLL, y la variante similar a las células de Sezary (cerebriforme) se observa en el 5 % de los casos.
T-PLL tiene el inmunofenotipo de un linfocito T maduro (post-tímico), y las células neoplásicas son generalmente positivas para los antígenos pan-T CD2, CD3 y CD7 y negativas para TdT y CD1a. El inmunofenotipo CD4+/CD8- está presente en el 60 % de los casos, el inmunofenotipo CD4+/CD8+ está presente en el 25 %, y el inmunofenotipo CD4-/CD8 está presente en el 15 % de los casos.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
El método de la presente divulgación puede comprender la etapa de administrar el agente en forma de una composición farmacéutica.
El agente puede administrarse con un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la ruta de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como (o además de) el vehículo, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante y otros agentes transportadores adecuados.
ADMINISTRACIÓN
La administración del agente se puede lograr utilizando cualquiera de una variedad de rutas que hacen que el principio activo esté biodisponible. Por ejemplo, el agente se puede administrar por vía oral o parenteral, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía transcutánea, por vía intramuscular, mediante suministro local, por ejemplo por catéter o stent.
Generalmente, el médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un sujeto individual y variará dependiendo de la edad, el peso y la respuesta del paciente particular. La dosificación es tal que es suficiente para reducir o agotar el número de linfocitos T clonales que expresan TRBC1 o TRBC2.
USO
La presente invención también proporciona un agente para su uso en el tratamiento de un linfoma de linfocitos T de acuerdo con el método de la presente divulgación. El agente puede ser cualquier agente como se define anteriormente. La presente invención también proporciona el uso de un agente como se define anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma de linfocitos T de acuerdo con el método divulgado.
KIT
La presente invención también proporciona un kit que comprende una gente como se define anteriormente para su uso en el tratamiento de un linfoma de linfocitos T de acuerdo con el método de la presente divulgación.
El kit también puede comprender uno o más reactivos adecuados para determinar la TRBC de un linfocito T maligno. Por ejemplo, el kit puede comprender cebadores de PCR o un anticuerpo (anticuerpos) que son específicos para TRBC1 o TRBC2.
MÉTODO PARA DETERMINAR EL LINFOMA Y/O LEUCEMIA DE LINFOCITOS T
La presente invención se refiere además a un método para determinar la presencia de un linfoma o leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de determinar la proporción de linfocitos T en una muestra de un sujeto que son TRBC1 o TRBC2 positivos.
Los linfomas de linfocitos T implican la expansión clonal de linfocitos T malignos individuales. Como tal, la presencia de un linfoma de linfocitos T en un sujeto puede identificarse determinando la proporción de linfocitos T TRBC1 o TRBC2 en una muestra derivada de un paciente.
La muestra puede ser una muestra de sangre periférica, una muestra de linfa o una muestra tomada directamente de un tumor, p.ej., una muestra de biopsia.
La proporción de linfocitos T totales que son TRBC1 o TRBC2 positivos que indica la presencia de un linfoma o leucemia de linfocitos T puede ser, por ejemplo, el 80, 85, 90, 95, 98 o el 99 % de una población total de células. El método puede implicar determinar la infiltración de una población distinta de linfocitos T en una biopsia o una muestra. En el presente documento, la presencia de un linfoma o leucemia de linfocitos T está indicada cuando el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de la población total de linfocitos T en la muestra son TRBC1 o TRBC2.
La totalidad de linfocitos T en una muestra puede identificarse determinando el número de linfocitos en la muestra que expresan CD3, CD4, CD8 y/o CD45. También se puede usar una combinación de estos marcadores.
La proporción de linfocitos T totales en una muestra que expresa TRBC1 o TRBC2 puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, inmunohistoquímica o microscopía fluorescente.
La invención se describirá adicionalmente a continuación por medio de Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a poner en práctica la invención y que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Discriminación de las linfocitos que expresan TRBC1 y TRBC2
El anticuerpo JOVI-1 fue previamente divulgado por Viney et al. (Hibridoma; 1992; 11(6); 701-713) y está disponible comercialmente (Abcam, ab5465). Los presentes inventores determinaron que JOVI-1 es capaz de discriminar linfocitos basándose en la expresión específica de TRBC1 o TRBC2.
Los presentes inventores generaron dos vectores plasmídicos que suministran las regiones variables y constantes completas del TCR, que difieren solo en la expresión de TRBC1 o TRBC2. Estos plásmidos se usaron para generar sobrenadante retroviral por transfección transitoria de células 293T. Este sobrenadante se usó para transducir de manera estable los linfocitos T Jurkat con TCR desactivados (una línea celular T-ALL con una mutación en el locus de la cadena beta de TCR que impide la expresión de esta cadena y, por lo tanto, toda el complejo de superficie TCR/CD3). Esto dio como resultado la producción de líneas celulares que eran idénticas además de la expresión de TRBC1 o TRBC2. La tinción de estas líneas celulares reveló la expresión completa del complejo de superficie TCR/CD3 y que únicamente las células que expresan TRBC1 se tiñeron con el anticuerpo JOVI-1 (Figura 4).
Ejemplo 2 - Los linfocitos T CD4+ y CD8+ de donantes normales contienen poblaciones separadas TRBC1-positivas y TRBC1-negativas
Los presentes inventores probaron el anticuerpo JOVI-1 en linfocitos T humanos primarios de donantes normales. Estos análisis revelaron que todos los donantes tenían una proporción tanto de linfocitos T CD4+como y CD8+ que expresaban TRBC1 y una proporción de cada uno que no. Aproximadamente el 20-50 % de los linfocitos T CD4+ y c D8+ normales son TRBC1positivo (Figuras 6 y 7).
Ejemplo 3 - Las líneas clonales de linfocitos T que expresan TCR son TRBC1 positivas o negativas
Las líneas celulares proceden de una población de tumores clonales originales en un paciente. La tinción de las líneas de linfocitos T que expresan TCR revela que los linfocitos T expresan TRBC1 o TRBC2, confirmando esto como un marcador de clonalidad. De las tres líneas de linfocitos T analizadas, las células Jurkat (que se sabe que son TRBC1+) y no las células HPB-ALL o HD-Mar-2 (que se sabe que son TRBC2+) se tiñen con JOVI- 1, lo que respalda la expresión exclusiva de TRBC1 o 2 (Figura 8).
Ejemplo 4 - Los linfocitos T clonales primarios en pacientes con leucemia prolinfocítica T son TRBC1 positivos o negativos
Los linfocitos T clonales extraídos de la sangre periférica de pacientes con leucemia linfocítica T (T-PLL) son uniformemente TRBC1 positivos o TRBC1 negativos.
Ejemplo 5-El efecto de la mutación de los restos que son únicos para TCBC1
Se generaron vectores plasmídicos, que codifican TCR que son idénticos, a excepción de las mutaciones híbridas TRBC1/2 en la región constante de la cadena TCR p. El análisis mostró que JOVI-1 reconoce las diferencias en los restos en las posiciones 3 y 4 de la cadena constante de TCR p, indicando que estos restos son accesibles para el reconocimiento por anticuerpos y son probablemente las mejores dianas para generar agentes que discriminan TRBC1 de TRBC2 o TRBC2 de TRBC1 (Figura 5).
Ejemplo 6: Lisis específica de linfocitos T que expresan TCR TRBC1 pero no TRBC2.
Los linfocitos T Jurkat de tipo silvestre (CD34-, TRBC1+) se mezclaron con linfocitos T Jurkat con TCRap desactivado transducidos con TRBC2 expresado conjuntamente con el gen marcador CD34 (CD34+TRBC2 ). Estas células se incubaron con JOVI-1 solo o se incubaron con JOVI-1 y complemento durante 1 hora. Las células se lavaron y se tiñeron para CD34, Anexina V y 7-AAD. Las células se analizaron por citometría de flujo.
La expresión de CD34 en la población viva tal como se define por la población Anexina- V negativa y 71AAD dim se muestra en la Figura 9. Se observó destrucción selectiva de linfocitos T TRBC1 (CD34-)(Figura 9).
Los linfocitos T Jurkat de tipo silvestre son naturalmente TRBC1+ y no expresan el gen marcador CD34 truncado. Como se describe anteriormente, los presentes inventores obtuvieron una línea Jurkat TRBC2+ transduciendo linfocitos T Jurkat TCRap desactivado con un vector retroviral que codifica un TCR TRBC2 así como el gen marcador CD34 truncado. Estos linfocitos T se mezclaron después. A continuación, los presentes inventores incubaron los linfocitos T con JOVI-1 solo o con JOVI-1 y complemento durante 1 hora. De manera conveniente, los presentes inventores pudieron discriminar las poblaciones TRBC1 y 2 al teñir el gen marcador CD34 y así evitaron no detectar los TCR TRBC1 debido a la internalización de TCR después de una exposición prolongada al mAb anti-TCR. Las células se lavaron y se tiñeron para CD34, Anexina V y 7-AAD. Las células se analizaron por citometría de flujo. Al seleccionar células vivas (es decir, células que eran Anexina V negativas y 7-AAD dim), los presentes inventores pudieron determinar que JOVI-1 destruyó selectivamente los linfocitos T TRBCl en presencia de complemento (Figura 9).
Ejemplo 7 - Los linfocitos T policlonales específicos del virus de Epstein Barr (EBV) se pueden dividir en dos poblaciones de TRBC1/2 aproximadamente iguales.
Los linfocitos T de sangre periférica se extrajeron de un donante de sangre normal. Las células mononucleares se aislaron y la mayoría de las células se criopreservaron. Un pequeño número de células se infectaron con una cepa de laboratorio de EBV (B95-8). Durante algunas semanas, surgió una línea celular inmortalizada infectada con EBV, conocida como línea celular linfoblastoide (LCL). Se sabe que dicha línea celular presenta una gran colección de diferentes antígenos de EBV. Las células mononucleares previamente criopreservadas se descongelaron y se estimularon de forma repetida con esta línea LCL semanalmente durante 4 semanas en presencia de IL2. Este proceso expande selectivamente linfocitos T específicos de EBV a partir de la población mononuclear de sangre periférica. También se sabe que dicho proceso da como resultado una línea policlonal en la que > 90 % de los linfocitos T son específicos de EBV y representan el sistema inmunitario contra e Bv del donante. La especificidad de esta línea se verifica mostrando un alto grado de destrucción de LCL autólogos pero no de LCL alogénicos o células K562 (Figura 10a). Esta línea celular se tiñó con JOVI-1 y se mostró que contenía una mezcla aproximadamente igual de linfocitos T TRBC1 y TRBC2 (Figura 10b).
Por lo tanto, si se administrara un agente terapéutico que agotara el compartimento TRBC1 o TRBC2, quedaría una inmunidad adecuada contra EBV. Debido a que la inmunidad contra el VEB se considera como un sistema modelo para una respuesta inmunitaria, es razonable postular que la inmunidad a otros patógenos se conservaría igualmente.
Ejemplo 8 - Tinción con JOV1 de un linfoma periférico circulante de linfocitos T.
La hipótesis era que los linfomas de linfocitos T, siendo clonales, expresarían receptores de linfocitos T TRBC1 o TRBC2, mientras que los linfocitos T normales que serían policlonales formarían parte de una población de linfocitos T que son una mezcla de los que tienen TRBC1 o TRBC2. Para demostrar esto, se obtuvo una muestra de sangre de un linfoma de linfocitos T de un paciente cuyo linfoma circulaba en sangre periférica. Las células mononucleares periféricas se aislaron y se tiñeron con un grupo de anticuerpos que incluía CD5 y JOVI1. Primero se identificó la población total de linfocitos T (que contiene tanto linfoma como linfocitos T normales). Esta población estaba compuesta por linfocitos T con expresión CD5 normal (bright) y linfocitos T con expresión CD5 intermedia/dim. Los primeros representan linfocitos T normales, mientras que los segundos representan el linfoma. A continuación se investigó la unión de JOVI-1 y los resultados se muestran en la Figura 12.
Las poblaciones de CD5 intermedios y dim (el tumor) fueron todas TRBC2 positivas.
Ejemplo 9 - Elucidación de las secuencias VH/VL de JOVI-1
Usando 5' RACE con cebadores que hibridan con las regiones constantes de CH1 de IgG de ratón y la región constante de kappa de ratón, se aisló una secuencia VH funcional única y una secuencia VL funcional única del JOVI-1 de hibridoma. Las secuencias de VH y VL son la SEQ ID 1 y 2 respectivamente (véase arriba). Una secuencia anotada de VH y VL se muestra en la Figura 11.
Estas secuencias de VH y VL se clonaron de nuevo en marco con la cadena pesada de IgG y la cadena ligera kappa de ratón, respectivamente. Además, las VH y VL se fusionaron para formar un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), este se fusionó con la región bisagra-CH2-CH3 de IgG2a de ratón para crear un scFv-Fv. La secuencia de aminoácidos del scFv se proporciona en la Descripción detallada como la SEQ ID NO: 3. El anticuerpo recombinante y el scFv-Fc recombinante se generaron por transfección en células 293T. Junto con JOVI-1 del hibridoma, se tiñeron las siguientes células: Jurkat con TCR desactivado; Jurkat de tipo silvestre; Jurkat con TCR desactivado transducidas con TRBC1 coexpresada con eBFP2 y Jurkat con TCR desactivado transducidas con TRBC2 coexpresada con eBFP2. Tanto el anticuerpo recombinante como scFv-Fc procedentes de JOVI unido a TRBC2 confirman que se ha identificado la VH/VL correcta, y que VH/VL de JOVI-1 puede plegarse como un scFv. Estos datos de unión se muestran en la Figura 13.
Ejemplo 10 - Función de CAR basado en JOVI-1
El scFv de JOVI-1 se clonó en formatos CAR. Para dilucidar qué longitud del espaciador daría como resultado un CAR óptimo basado en JOVI-1, se generaron CAR de 3a generación con un espaciador de Fc humano, un espaciador de tallo de CD8 humano o con un espaciador derivado de una bisagra de IgG1 (Figura 4). Los linfocitos T humanos primarios de donantes normales se transdujeron con estos CAR y se comparó la destrucción de Jurkat y Jurkat con TCR desactivado. Los CAR con scFv de JOVI-1 que tenían un espaciador de bisagra de IgG1 o un espaciador de tallo de CD8 destruyeron Jurkat, pero no a Jurkat con TCR desactivado (Figura 5), demostrando la especificidad esperada. Debido a que los linfocitos T de donantes normales transducidos con los CAR deberían tener una mezcla de linfocitos T TRB1/2, se esperaba que los cultivos se "autoeliminaran". De hecho, se observó esto. La tinción con JOVI-1 de los cultivos de linfocitos T con CAR que se vuelven 100 % negativas para TRBC2 como se muestra en la Figura 6.
MATERIALES Y MÉTODOS
DEMOSTRACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD DE JOVI-1
Se generó un casete retroviral tricistrónico que codificaba un TCR humano bien caracterizado así como un gen marcador adecuado. Las secuencias de codificación para las cadenas TCRa y p se generaron usando síntesis de genes de novo a partir de oligonucleótidos solapantes. Estas cadenas se conectaron en marco a un péptido 2A para la fiebre aftosa para permitir la coexpresión. El gen marcador CD34 truncado se clonó a partir de ADNc por PCR y se coexpresó con las cadenas de TCR usando una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés). Este casete se introdujo en un vector retroviral. Las variantes de esta construcción se generaron mediante corte y empalme mediante PCR solapante con cebadores que introdujeron las mutaciones deseadas. La veracidad de las construcciones se confirmó mediante secuenciación de Sanger. La línea Jurkat 76 es un derivado bien caracterizado de la línea de linfocitos T Jurkat que tiene las cadenas tanto TCR a como p desactivadas. Esta línea Jurkat se transdujo con los vectores retrovirales anteriores utilizando técnicas convencionales.
TINCIÓN Y ANÁLISIS DE JURKAT, LINFOCITOST DE SANGRE PERIFÉRICA Y LÍNEAS CELULARES
Los Jurkat se obtuvieron de ECACC y se genomanipularon como se detalla anteriormente. También se obtuvieron otras líneas de linfocitos T de ECACC. La sangre periférica fue extraída por venopuntura de donantes normales. La sangre se ficolizó para aislar células mononucleares. Las células se tiñeron con JOVI-1, así como con anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente que reconocen todos los TCR y CD3. En el caso de los linfocitos T modificados, las células se tiñeron con anticuerpos que reconocen CD34. En el caso de células mononucleares de sangre periférica, las células se tiñeron con anticuerpos que reconocen CD4 y CD8. Los anticuerpos se adquirieron conjugados con fluoróforos adecuados para poder obtener señales fluorescentes independientes mientras se analizaban las células con un citómetro de flujo.
DEMOSTRACIÓN DE LISIS ESPECÍFICA DE LINFOCITOS T TRBC1
Los linfocitos T Jurkat de tipo silvestre (TRBC1 - TCR) y los linfocitos T Jurkat TCR KO(knock out, con TCR desactivados) con TCR TRBC2 introducido se mezclaron en una proporción de 1:1. Esta mezcla de Jurkat se incubó después con anticuerpo monoclonal JOVI-1 a 1 pg/ml en ausencia o presencia de complemento. Cuatro horas después, las células se tiñeron con Anexina-V y 7AAD y CD34. De manera conveniente, el gen marcador CD34 puede distinguir entre Jurkat de tipo silvestre (TRBC1) y transgénicos (TRBC2). Las poblaciones de células se analizaron por citometría de flujo. Las células vivas se estudiaron selectivamente seleccionando eventos citométricos de flujo que son negativos para anexina-V e intermedios para 7AAD. De esta forma, se estudió la supervivencia de linfocitos T transgénicos (TRBC2) frente a los de tipo silvestre (TRBC1).
Ejemplo 11 - Investigación de la clonalidad de los trastornos linfoproliferativos de linfocitos T
Cuatro pacientes: tres con trastorno linfoproliferativo de linfocitos granulares grandes de linfocitos T (T-LGL); y uno con linfoma periférico de linfocitos T (PCTL) se evaluaron para confirmar que las células malignas eran uniformemente TRBC1 positivas o negativas.
Se recogió sangre completa o médula ósea de pacientes con desórdenes linfoproliferativos-T. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por centrifugación en gradiente de Ficoll. Las PBMC recién obtenidas se sedimentaron y se tiñeron durante 20 minutos con anticuerpos conjugados previamente apropiados. Las células se lavaron después y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato para el análisis citométrico de flujo inmediato en BD LSR Fortessa II. Los linfocitos vivos se identificaron por las propiedades FSc/SSc y la incapacidad de captar un tinte discriminador de células muertas. Los linfocitos T se identificaron mediante tinción con anticuerpo anti-TCR alfa/beta. Las poblaciones de linfocitos T tumorales y normales se identificaron usando tinciones de superficie celular apropiadas para cada muestra, basándose en el inmunofenotipo previamente identificado por análisis de laboratorio clínico.
Los resultados se muestran en las Figuras 18 a 21.
En el paciente A (T-LGL, Figura 18), los linfocitos T normales eran CD7bright y contenían células CD4/CD8 mixtas, y una población mixta de linfocitos TRBC1 o TRBC1-. Por el contrario, los linfocitos malignos fueron CD7- o CD7dim, fueron uniformemente CD8+CD4- y fueron uniformemente TRBC1-.
En el paciente B (T-LGL, Figura 19), los linfocitos malignos se identificaron por CD4-, CD8+, CD7+ CD57+ y clonalmente fueron TRBC1- (panel resaltado). Los linfocitos T CD4+CD8- y CD4-CD8+ normales contenían poblaciones TRBC1+ y TRBC1-.
En el paciente C (T-LGL, Figura 20), las poblaciones normales de linfocitos T CD4+ y CD8+ fueron 30-40 % TRBC1+. Los linfocitos malignos se identificaron por CD4-, CD8+, CD7+ CD57+ y clonalmente fueron TRBC1 (panel resaltado, téngase en cuenta que el 84 % de los linfocitos son TRBC1-, el 16 % restante es probable que estén contaminando los linfocitos T 'normales'). Los linfocitos T CD4+CD8- y CD4-CD8+ normales contenían poblaciones TRBC1+ y TRBC1-.
En el paciente D (PTCL-NOS, Figura 21), los linfocitos malignos en la médula ósea, identificados basándose en FSChigh CD5dim CD4dim, eran TRBC1+ uniformemente, mientras que los linfocitos T CD4+CD8- y CD4-CD8+ contenían poblaciones TRBC1+ y TRBC1-.
Ejemplo 12 - Generación de anticuerpos monoclonales humanos que distinguen entre las dos isoformas del dominio constante de la cadena p de receptores de linfocitos T utilizando la presentación en fagos
Para generar anticuerpos que distinguieran entre TRBC2 y TRBC1, se sintetizaron fragmentos de péptidos que cubrían la región de diferencia entre las dos isoformas de TRBC. De las cuatro diferencias de aminoácidos entre TRBC2 y TRBC1, dos se encuentran al comienzo de los dominios constantes. Los péptidos (véase a continuación) que representan estas regiones se sintetizaron y usaron para la generación de anticuerpos.
TRBC2 VLEDLKNVFPPEVAV (SEQ ID NO: 36)
TRBC1 VLEDLNKVFPPEVAV (SEQ ID NO: 37)
Estos péptidos se prepararon en formas biotiniladas, no biotiniladas y modificadas con cisteína (mediante la adición de una cisteína C terminal). Las formas modificadas con cisteína de TRBC1 y TRBC2 se conjugaron posteriormente con albúmina de suero bovino modificado (Imm-Link BSA, Innova 462-001) u ovoalbúmina (Imm-Link Ovalbumin, Innova 461-001) de acuerdo con las condiciones recomendadas por los fabricantes.
Resultados
Selecciones por presentación en fagos de anticuerpos
Se construyó una biblioteca de presentación en fagos humana y las selecciones por fagos se llevaron a cabo como se describe en (Schofield et al., 2007 Genome Biol 8, R254). Para identificar los anticuerpos específicos de TRBC1 y TRBC2 a partir de la biblioteca de anticuerpos, se llevaron a cabo múltiples rondas de selecciones por presentación en fagos. Se usaron dos estrategias de selección por fagos en paralelo para maximizar la posibilidad de generar un gran grupo de aglutinantes específicos. Estas estrategias se conocen como selecciones en fase sólida y en fase de solución (Figura 21). En las selecciones en fase sólida, se permite que los anticuerpos de los fagos se unan al antígeno diana inmovilizado en una superficie sólida (Schofield et al., 2007, como anteriormente). En las selecciones en fase de solución, los anticuerpos de los fagos se unen al antígeno biotinilado en solución y el complejo de anticuerpo de fago-antígeno es capturado por perlas paramagnéticas recubiertas por estreptavidina o neutravidina. Dentro de la estrategia de selección en fase sólida, se emplearon dos enfoques diferentes de inmovilización o presentación de antígeno. Usando el primer enfoque, los péptidos TRBC conjugados con albúmina de suero bovino (BSA) u ovoalbúmina (OA) se inmovilizaron en inmunotubos Maxisorp™ mediante adsorción directa. Usando el segundo enfoque, los péptidos TRBC biotinilados se inmovilizaron indirectamente en tubos de inmunotubos Maxisorp™ que se recubrieron previamente con estreptavidina o neutravidina.
Para seleccionar anticuerpos que son específicos para el péptido deseado, todas las selecciones se llevaron a cabo en presencia de un exceso del péptido opuesto. Por ejemplo, todas las selecciones de TRBC1 se llevaron a cabo en presencia de un exceso molar de 10 veces de TRBC2 no biotinilado. Este método se conoce como "desactivación" y se esperaba que agotara los anticuerpos que reconocen epítopos compartidos en ambos péptidos TRBC ya que estos se unen preferentemente al exceso de TRBC2 en solución. Para evitar el enriquecimiento de los clones de anticuerpos que se unen a la proteína portadora (BSA u OA) o al compañero de inmovilización (estreptavidina o neutravidina de Thermo fisher scientific), se emplearon dos estrategias en combinación.
La primera estrategia fue cambiar el compañero de conjugación o inmovilización entre rondas de selección. Para los péptidos inmovilizados directamente, se realizó la primera ronda de selecciones sobre BSA-péptido y para la segunda ronda, el conjugado OA-péptido. De manera similar, los péptidos TRBC biotinilados se inmovilizaron en estreptavidina para la ronda 1 y se usó neutravidina para la inmovilización en la ronda 2.
La segunda estrategia fue agotar la biblioteca de fagos de cualquier aglutinante para el compañero de conjugación/inmovilización realizando una 'desactivación' en la ronda 1. Para péptidos directamente inmovilizados, la desactivación se realizó llevando a cabo la etapa de unión fago-péptido en presencia de un exceso molar de 10 veces de BSA libre en solución. En el caso de péptidos biotinilados inmovilizados en estreptavidina, la biblioteca de fagos se incubó previamente con perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Las perlas se eliminaron antes de la adición del fago a los tubos de antígenos, limitando así los aglutinantes de estreptavidina de entrada en la selección. Las diferentes condiciones de selección utilizadas se resumen en la figura 21. Véase la Tabla 3 para obtener información detallada sobre las condiciones de selección.
El fago policlonal preparado a partir del resultado de la selección de la ronda 2 se probó en ELISA usando diversas presentaciones de los péptidos o las proteínas de soporte. Esto incluía péptidos TRBC directamente inmovilizados como conjugados con BSA u OA o péptidos biotinilados inmovilizados indirectamente en estreptavidina o neutravidina. Las proteínas de control incluidas fueron estreptavidina, neutravidina, BSA y un antígeno irrelevante. La unión a los fagos se detectó usando un anticuerpo anti-M13 de ratón (GE healthcare) seguido de un anticuerpo anti-Fc de ratón marcado con Europio (Perkin Elmers) usando fluorescencia resuelta en el tiempo (Figura 22). Este resultado demostró la unión preferencial de las poblaciones de fagos policlonales al péptido TRBC respectivo (en comparación con el péptido TRBC opuesto). Por ejemplo, el fago policlonal preparado a partir de selecciones de TRBC1 mostró una señal de unión a TRBC1 significativamente mayor que a TRBC2 y viceversa. Hubo una unión limitada o nula a los compañeros de inmovilización o conjugación y al antígeno irrelevante.
Subclonación de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) y exploración monoclonal
Las poblaciones de scFv de los resultados de selección de la ronda 2 y ronda 3 se subclonaron en el vector de expresión pSANG10-3F y se transformaron en células E. coli BL21 (DE3). Se recogieron 1128 transformantes individuales (564 clones/péptido TRBC) en placas de cultivo de 12 x 96 pocillos (94 clones/placa) y se indujo la expresión de anticuerpos usando medios de autoinducción. Los anticuerpos monoclonales recombinantes secretados en el sobrenadante del cultivo después de la inducción durante la noche se probaron para la unión a TRBC1 y TRBC2 biotinilados inmovilizados en placas de 96 pocillos Nunc Maxisorp™ recubiertas con neutravidina. De los 564 clones seleccionados de las selecciones TRBC1, se encontró que 255 clones eran específicos para TRBC1 (> 10000 unidades TRF para TRBC1 y <1000 unidades TRF para TRBC2). Se identificaron 138 aglutinantes específicos de TRBC2 (> 10000 unidades t Rf para TRBC2 y <2000 unidades Tr F para TRBC1) a partir de los 564 clones explorados de las selecciones de TRBC2. La figura 24 muestra un perfil de unión representativo de una única placa de 96 pocillos que surge de la selección en TRBC1 (figura 24A) o TRBC2 (figura 24B). Los detalles de los aglutinantes específicos generados usando diferentes condiciones de selección se resumen en la Tabla 5.
Se recogieron 142 y 138 aglutinantes específicos de las selecciones de TRBC1 y TRBC2 respectivamente para análisis de secuencia y caracterización adicional. Las secuencias de clones seleccionados por cherry se generaron mediante secuenciación de Sanger utilizando el kit de secuenciación de ciclo BigDye® terminator v3.1 (Life technologies). Se analizaron las secuencias de ADN para determinar la secuencia de la proteína y se identificaron las CDR de los dominios VH y VL. El análisis de las regiones CDR3 de VH y VL identificó 74 clones únicos TRBC1 y 42 únicos TRBC2 (donde único se define como cualquier combinación de secuencia de CDR3 de VH y CDR3 de VL). Los clones específicos de TRBC1 y sus secuencias de CDR3 de VH y CDR3 de VL se resumen en la Tabla 1 anterior. Los clones específicos de TRBC2 y sus secuencias de CDR3 de VH y CDR3 de VL se resumen en la Tabla 2 anterior.
Tabla 3A. Detalles de selecciones de TRBC en fase sólida
Figure imgf000034_0001
__________________________________________ (continuación)
Selecciones en fase sólida
Número Ronda 1 Ronda 2 Antígeno de de Concentración antígenos antígenos de selección rondas de antígeno Inmovilización
Figure imgf000035_0001
desactivaci
Figure imgf000035_0002
desactivación Perlas de Perlas de Perlas de estreptavidina estreptavidina, neutravidina, Bio-TRBC1 (Ronda 1), Neutravidina TRBC2 TRBC2 (Ronda 1 y 3 pg/ml (Ronda 2 ) (30 pg/ml) (30 pg/ml)
Perlas de Perlas de Perlas de estreptavidina estreptavidina, neutravidina, Bio-TRBC2 (Ronda 1), Neutravidina TRBC1 TRBC1 (Ronda 1 y
Figure imgf000035_0003
Figure imgf000035_0004
3 pg/ml
Figure imgf000035_0005
(Ronda 2 ) (30 pg/ml) (30 pg/ml)
Tabla 3B. Detalles de selecciones de TRBC en fase de solución
Figure imgf000035_0006
___________
Tabla 4: Números de los resultados de la selección
Figure imgf000035_0007
Tabla 5: Detalles de la ex loración monoclonal
Figure imgf000035_0008

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno que se une selectivamente a la región constante de TCR beta 1 (TRBC1) o TRBC2.
2. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, que se une selectivamente a TRBC1.
3. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el dominio de unión a antígeno tiene una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que comprende las siguientes regiones determinantes de la complementariedad (CDR):
CDR1 de VH: SEQ ID NO: 7;
CDR2 de VH: SEQ ID NO: 8;
CDR3 de VH: SEQ ID NO: 9;
CDR1 de VL: SEQ ID NO: 10;
CDR2 de VL: SEQ ID NO: 11; y
CDR3 de VL: SEQ ID NO: 12.
4. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el dominio de unión a antígeno comprende una cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 2.
5. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
6. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, que se une selectivamente a TRBC2.
7. Una secuencia del ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
8. Un vector que comprende una secuencia del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una célula que comprende un CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. Un linfocito T de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Un método para producir una célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula ex vivo con una secuencia del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 8.
12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 para su uso en un método para tratar un linfoma o una leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de administrar la célula que comprende el CAR selectivo para TCRB1 o TCRB2 al sujeto, para provocar el agotamiento selectivo de los linfocitos T malignos, junto con los linfocitos T normales que expresan la misma TRBC que los linfocitos T malignos, pero no para provocar el agotamiento de los linfocitos T normales que expresan la TRBC no expresada por los linfocitos T malignos.
13. Una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el método también comprende la etapa de investigar la región constante de TCR beta (TCRB) de un linfocito T maligno del sujeto para determinar si expresa TRBC1 o TRBC2.
14. Una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en la que el linfoma o leucemia de linfocitos T se selecciona de linfoma periférico de linfocitos T, no especificado (PTCL-NOS); linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de linfocitos T asociado a enteropatía (EATL), linfoma hepatoesplénico de linfocitos T (HSTL), linfoma de linfocitos NK/T extraganglionar de tipo nasal, linfoma cutáneo de linfocitos T, ALCL cutáneo primario, leucemia prolinfocítica de linfocitos T y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T.
15. Un método para diagnosticar un linfoma o leucemia de linfocitos T en un sujeto que comprende la etapa de determinar el porcentaje de linfocitos T totales en una muestra aislada del sujeto que son TRBC1 o TRBC2 positivos.
16. Un método para seleccionar una terapia adecuada para tratar a un sujeto que padece linfoma o leucemia de linfocitos T que comprende:
i) determinar si un linfocito T maligno del sujeto expresa TRBC1 o TRBC2; y
ii) seleccionar una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 basándose en la expresión de TRBC1 o TRBC2 de dicho linfocito T maligno.
17. Un método para seleccionar un sujeto que padece linfoma o leucemia de linfocitos T para recibir una terapia basada en una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende:
i) determinar si un linfocito T maligno del sujeto expresa TRBC1 o TRBC2; y
ii) seleccionar dicho sujeto para recibir una terapia basada en una célula para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 basándose en la expresión de TRBC1 o TRBC2 de dicho linfocito T maligno.
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