DE4421891C2

DE4421891C2 - Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene

Info

Publication number: DE4421891C2
Application number: DE19944421891
Authority: DE
Inventors: Helmut Prof Dr Med Feucht; Stephan Dr Med Lederer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2014-06-24
Also published as: DE4421891A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum fluo reszenzspektroskopischen Nachweis von komplementaktivie renden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene.

Neben den gutuntersuchten zellulären Immunmechanismen bei dem komplexen Vorgang der Transplantatabstoßung bei Trans plantatempfängern spielen die humoralen Faktoren eine wei tere wichtige Rolle. Bei der Bestimmung dieser Faktoren ist der Nachweis der Fähigkeit zur Aktivierung der klassischen Komplementkaskade gegebenenfalls vorhandener Immuno globulin G (IgG)-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene von Bedeutung.

Das vorhandene immunologische Risiko potentieller Trans plantatempfänger wird derzeit aufgrund bereits abgestoßener Transplantate und durch das Vorhandensein lymphocytotoxischer Antikörper abgeschätzt. Das dabei angewendete Verfahren ("panel-reactivity", Terasaki et al. Nature 204, 998 (1964)) beruht auf einer komplementabhängigen Lyse von Lymphocyten. Die lysierten Zellen werden über ein Farbstoffsubstrat sichtbar gemacht. Aufgrund der Verwendung peripherer Lymphocyten als Zielzellen ist die "panel-reactivity" für die sichere Erkennung von Antikörpern gegen B-Lymphocyten und somit den darauf exprimierten MHC-Klasse II Antigenen, zu denen auch die HLA-DR-Antigene gehören, nicht geeignet.

In der Transplantationsmedizin werden unmittelbar vor einer Transplantation spenderspezifische Antikörper im Empfänger serum mittels des "Crossmatch Tests" detektiert. Dabei werden spenderlymphocyten mit Empfängerserum inkubiert und im positiven Fall eine komplementabhängige Lyse beobachtet.

Das US-Patent 4,314,026 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der komplementabhängigen Cytotoxizität, die durch anti-HLA-Antikörper vermittelt wird, worin die Cytotoxizität durch Messung der Abnahme intrazellulären ATP′s nach Zugabe von Komplement zu anti-HLA überzogenen Zielzellen bestimmt wird.

Das US-Patent 4,657,852 offenbart einen HLA-DR- Bestimmungstest, der auf Lymphocytotoxizität beruht und worin eine Probe mit HLA-DR-Antiserum, einem monoklonalen Antikörper gegen T-Zellen und Komplement inkubiert wird und der DR-Typ basierend auf der resultierenden Cytotoxizität, gemessen durch die Fluoreszenz der B-Zellen, die die Inkubation überlebt haben, bestimmt wird.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches und schnelles Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen HLA-DR- Antigene nachgewiesen werden können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfah ren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikör pern gegen HLA-DR-Antigene, wobei man HLA-DR-Antigene mit Patientenserum, einer Kom plementquelle und mit einem gegen eine Komplementkomponente gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper inkubiert und fluoreszenzspektroskopisch untersucht.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten HLA-DR-Anti gene können in reiner, isolierter Form eingesetzt werden. Bevorzugt werden die HLA-DR-Antigene auf definierten Ziel zellen exprimiert, wobei sich insbesondere EBV- transformierte lymphoblastoide Zellinien eignen. Die HLA- DR-Spezifität kann dabei beispielsweise durch DNA- Typisierung ermittelt werden.

Als Komplementquelle eignet sich jedes Material, das die notwendigen Substrate für die klassische Komplementkaskade enthält und dabei nicht mit HLA-DR-Antigenen reagiert. Bei spielsweise kann Humanserum eingesetzt werden, welches zu vor auf Alloantikörper gegen HLA-DR-Antigene oder, bei der Verwendung EBV-transformierter lymphoblastoider Zellinien, auf Alloantikörper gegen diese Zellinien untersucht wurde.

Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird mit fluoreszenzmar kierten Antikörpern inkubiert, die gegen eine Komplement komponente gerichtet sind. Als Komplementkomponente kann jedes stabile Spaltprodukt aus der klassischen Komplement kaskade gewählt werden. Insbesondere eignet sich beispiels weise das C4c-Fragment. Erfindungsgemäß können alle be kannten Fluoreszenzmarkierungen für Antikörper verwendet werden. Beispielsweise eignen sich Phycoerythrin(PE)- markierte oder Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-markierte Antikörper. Bevorzugt werden FITC-markierte antihuman C4c- Antikörper.

Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der vorberei teten Probe kann neben herkömmlichen fluoreszenzspektro skopischen Methoden beispielsweise mittels der Durchfluß zytometrie erfolgen. Hierzu eignet sich insbesondere das FACScan-Fließzytometer der Fa. Becton Dickinson.

In einer bevorzugten Form kann das erfindungsgemäße Ver fahren zur gleichzeitigen Bestimmung und Differenzierung von komplementaktivierenden und nicht-komplementaktivieren den IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene eingesetzt wer den. Hierzu wird die Probe zusätzlich mit einem weiteren gegen IgG-Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper inkubiert. Hierbei können ebenfalls alle für Antikörper bekannten Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden, allerdings muß diese Fluoreszenzmarkierung Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, als der gegen die Komplementkomponente gerichtete Antikörper. Bevorzugt werden Mischungen aus PE-markierten und FITC-markierten Antikörpern eingesetzt. Besonders bevorzugt wird eine Mischung aus FITC-markierten antihuman C4c-Antikörpern und PE-markierten F(ab′)₂-antihuman IgG-Antikörpern.

Zur Differenzierung von komplementaktivierenden und nicht komplementaktivierenden Antikörpern erfolgt die fluores zenzspektroskopische Untersuchung gleichzeitig oder nach einander bei den beiden Wellenlängen, bei denen die fluo reszenzmarkierten Antikörper Licht emittieren. Wird auf beiden Wellenlängen ein Signal erfaßt, so liegen im Serum des Patienten komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene vor. Wird nur auf der Wellenlänge des Lichts, das der gegen IgG gerichtete Antikörper emittiert, ein Signal erfaßt, so liegen im Serum des Patienten nicht komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene vor. Wird nur auf der Wellenlänge des Lichts, das der gegen die Komplementkomponente gerichtete Antikörper emittiert, ein Signal erfaßt, so besitzt das Serum eine komplement aktivierende Kapazität in Abwesenheit von IgG-Antikörpern. In diesem Fall müssen andere Antikörperklassen in Betracht gezogen werden.

Bevorzugt werden beide Wellenlängen gleichzeitig mittels einer zweifarben-zytometrischen Analyse detektiert. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, Proben des Patienten in kurzer Zeit auf das Vorhandensein gegebenenfalls komple mentaktivierender IgG-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene zu untersuchen.

Die einzelnen Substrate können erfindungsgemäß gleichzeitig als Mischung, als Mischungen bestimmter Substrate oder ge trennt nacheinander inkubiert werden. Bevorzugt werden dabei zunächst die HLA-DR-Antigene mit Patientenserum und anschließend mit der Komplementquelle inkubiert und ab schließend mit dem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder einer Mischung aus den beiden fluoreszenzmarkierten Anti körpern inkubiert.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der humoralen Risikofaktoren bei Trans plantatempfängern, insbesondere Nierentransplantatempfän gern. Hierzu wird das oben beschriebene Verfahren vor der Transplantation mit dem Serum des potentiellen Transplan tatempfängers ausgeführt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Testkit zur Bestimmung von humoralen Risikofaktoren bei Transplantat empfängern, insbesondere Nierentransplantatempfängern. Die ses Testkit enthält die oben beschriebenen HLA-DR-Antigene, eine Komplementquelle und einen gegen eine Komplementkompo nente gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper. Gegebe nenfalls kann ein weiterer gegen IgG gerichteter Antikör per, der eine Fluoreszenzmarkierung trägt, die Licht einer anderen Wellenlänge emittiert, als der gegen die Komple mentkomponente gerichtete Antikörper, enthalten sein.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfin dung näher illustrieren.

Beispiele 1. Allgemeines Verfahren

Zellen von elf verschiedenen EBV-transformierten lympho blastoiden Zellinien (siehe Tabelle 1), deren HLA-DR-Spezi fitäten durch DNA-Typisierung ermittelt worden waren, wur den auf 2 × 10⁶ Zellen/ml in einem Nährmedium suspendiert. Das Nährmedium bestand aus RPMI 1640 (Biochrom), das mit 100 × nicht-essentieller Aminosäuren, 100 mM Natrium pyruvat, 200 mM L-Glutamin, 20 U/ml Penicillin/Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum versetzt worden war.

Tabelle 1

Als Zielzellen verwendete lymhoblastoide Zellinien*

Jeweils 2 × 10⁵ Zellen wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht. Die Zel len wurde zweimal mit einer Pufferlösung aus 1% Rinder serum Albumin (Paesel und Lorey) und 0,1% Natriumazid in PBS durch wiederholtes kaltes Zentrifugieren von 200 µl Zellsuspension bei 800 Upm (Umdrehungen pro min) für je 1 min gewaschen. Der Puffer wurde nach jedem Zentrifugationsschritt abgegossen und erneut aufgefüllt.

Zur Anlagerung der Alloantikörper an die Zielzellen wurden anschließend 40 µl unverdünntes Patientenserum zugegeben und 45 min bei 4°C inkubiert. Während dieser und aller nachfolgenden Inkubationsperioden wurden die Mikrotiter platten in einem Schüttler bewegt. Anschließend wurden nicht-bindende Immunglobuline durch mindestens vier Wasch schritte entfernt. Als Komplementquelle wurde frisches Humanserum, das nicht gegen lymphoblastoide Zellinien reagiert, zu jeder Probe zugegeben. Um eine optimale Aktivierung der klassischen Komplementkaskade zu erreichen, wurden 50 µl eines Serums verwendet, das 1 : 6 in einer Ca²⁺ und Mg²⁺ Ionen enthaltenden 1,5 M Tris/aqua dest. Lösung, pH 7,4, (Biomol) verdünnt worden war. Es wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert und viermal gewaschen.

Anschließend wurde mit 40 µl einer Mischung aus gleichen Volumenteilen PE-markierter F(ab′)₂-antihuman IgG-Antikör per (1 : 100 verdünnt) und FITC-markierter antihuman C4c- Antikörper (1 : 50 verdünnt) inkubiert. Nach 45 min bei 4°C wurden die Zellen dreimal gewaschen, in 200 µl Puffer resuspendiert und bis zur fließzytometrischen Analyse im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt.

Die fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen wurden mit einem FACScan-Fließcytometer der Fa. Becton Dickinson, das mit einem luftgekühlten Argonlaser (488 nm) ausgerüstet war, durchgeführt. Die rote (PE)-Fluoreszenz wurde über einen 585/42 nm Filter und die grüne Fluoreszenz (FITC) über einen 530/30 nm Filter gemessen. Die spektrale Überlappung der FITC- und PE-Signale wurde kompensiert. Von jeder Probe wurden 10⁴ Zellen untersucht. Für jede verwen dete DR-spezifische, EBV-transformierte Zellinie wurde die Signalintensität und der Untergrund für beide Signale mit tels einer Palette von 50 Normalkontrollsera bestimmt. Damit kann jedes Serum eines Patienten, das ein positives Fluoreszenzsignal liefert, eindeutig identifiziert werden.

2. Inhibitionsexperiment

Zur spezifischen Inhibierung der klassischen Komplementak tivierung wurden ausgewählte Proben der Komplementquelle sowie Testseren durch Hitzebehandlung bei 56°C (30 min) vor der Inkubation mit den HLA-DR-Antigenen inaktiviert. Bei der anschließend fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung konnte kein Signal des gegen die Komplementkomponente gerichteten Antikörpers detektiert werden. Das Signal des gegen IgG gerichteten Antikörpers blieb unverändert.

In einem zweiten Experiment wurde in ausgewählten Fällen gleichzeitig mit den PE-markierten F(ab′)₂-antihuman IgG- Antikörpern 20 µl einer Humanimmunoglobulin-Lösung (Polyglobin^TR, 50 mg/ml) zugegeben. Dieses führte zu einer signifikanten Verringerung des durch den gegen IgG gerichteten Antikörper hervorgerufenen Signals. Das Signal durch den gegen eine Komplementkomponente gerichteten Anti körper blieb unverändert. Dieses Experiment zeigt, daß die drei möglichen, oben beschriebenen Fälle (Vorliegen komple mentaktivierender IgG-Antikörper, nicht-komplementaktivie render IgG-Antikörper und Komplementaktivierung ohne Vor liegen von IgG-Antikörpern) durch das erfindungsgemäße Verfahren in seiner bevorzugten Ausführungsform eindeutig unterschieden werden können.

3. Plateletabsorption

Um zu zeigen, daß die gemessenen Signale nicht auf anti- Klasse I reaktive Antikörper zurückzuführen sind, wurden diese in 27 Sera mit bekannter Reaktivität gegen DR4 (BOLETH) durch Absorption an Platelets entfernt. Dazu wurden 6 mg lyophilisierter Platelets von verschiedenen Spendern in 250 µl Patientenserum suspendiert. Nach 15 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen bei 2000 Upm (10 min) zentrifugiert. Diese Proben wurden dann wie unter 1. beschrieben weiter untersucht. Bei 26 Proben wurde die Reaktivität gegenüber DR4-Antigenen nicht vermindert. Nur bei einer Probe trat eine Signalschwächung auf, was auf das Vorhandensein möglicher anti-MHC-Klasse I Antikörper hinweist. Diese Probe zeigte gleichzeitig eine Aktivität im Mikrocytotoxizitätstest (Panel-Reaktivität).

4. Fließcytometrische Untersuchung mit DR3-Transfectanten

Um den Einfluß natürlich vorkommender anti-Maus-Antikörper zu reduzieren, wurden ausgewählte Sera mit einer Reaktivi tät gegen LCL 9022, was auf das Vorhandensein von Alloanti körpern gegen DR3 hinweist, zunächst gegen nicht transfektierte Mausfibroblasten absorbiert. Als HLA-DR- Antigenquelle wurden dann mit human DR3 transfektierte Mausfibroblasten verwendet. 5 × 10⁵ nicht transfizierte Mausfibroblasten wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit 500 µl Humantestserum in 1,5 ml Mikrotubes (Eppendorf) resuspendiert und im ersten Schritt 60 min bei 37°C und im zweiten Schritt 120 min bei 4°C inkubiert. Die erhaltenen Überstände wurden 20 min bei 10⁴ Upm zentrifugiert und nach Zusatz von FITC-markierten F(ab′)₂-rabbit-antihuman IgG- Antikörpern (Dianova) fluoreszenzspektroskopisch unter sucht. Die Signalintensität normaler Kontrollseren nahm da bei stark ab, wohingegen die Signalintensität von Seren mit spezifischer Reaktivität gegen DR3 erhalten blieb. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Meßergebnisse tatsächlich auf dem Vorhandensein von Antikörpern gegen HLA-DR Antigene beruhen.

5. Vergleich mit "Panel-Reaktivität"

Zum Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Mikrocytotoxizitätstest, der von der Eurotransplant Orga nisation vorgeschrieben wird, wurden die Seren von 20 zu fällig ausgewählten Patienten nach beiden Methoden unter sucht. Die "Panel-Reaktivität" wurde mit 50 verschiedenen Lymphocytproben bestimmt. Tabelle 2 gibt das Ergebnis der Tests nach beiden Methoden wieder. Es zeigt sich, daß bei insgesamt acht Patienten nach dem erfindungsgemäßen Ver fahren ein positives Ergebnis erzielt wurde, wogegen der Mikrocytotoxizitätstest mit peripheren Lymphocyten nur bei zwei Patienten das Vorhandensein lymphocytotoxischer Anti körper anzeigt. Nur ein Patient reagierte in beiden Tests. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert damit bei der Be stimmung humoraler Risikofaktoren bei Transplantatempfän gern ein zuverlässigeres und differenzierteres Ergebnis als das bislang verwendete Verfahren.

Reaktivität gegenüber HLA-DR-Antigenen und Lymphocyten von Sera 20 potentieller Transplantat-Empfänger
Verfahren
Anzahl Patienten
HLA-DR neg.
12
HLa-DR pos. @	IgG + C4c	2
IgG	4
C4c	2
"Panel" Lympocyten neg.	18
"Panel" Lympocyten pos.	2

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG- Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene, wobei man HLA-DR-Antigene mit Patientenserum und einer Komplementquelle und mit einem gegen eine Komplementkomponente gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper inkubiert und fluoreszenzspektroskopisch untersucht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, angewandt zur Differenzierung von komplementaktivierenden und nicht-komplementaktivie renden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiterer gegen IgG gerichteter Antikörper zugesetzt wird, der eine Fluoreszenzmarkie rung trägt, die Licht einer anderen Wellenlänge emit tiert, als der gegen die Komplementkomponente gerichtete Antikörper.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge kennzeichnet, daß Zellinien, vorzugsweise EBV-transfor mierte lymphoblastoide Zellinien, als Träger der HLA-DR- Antigene eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komplementkomponente das Spalt produkt C4c der Komplementkaskade ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Be stimmung von humoralen Risikofaktoren bei Transplantat empfängern, insbesondere Nierentransplantatempfängern.

6. Testkit zur Bestimmung von humoralen Risikofaktoren bei Transplantatempfängern, insbesondere Nierentransplantat empfängern, enthaltend HLA-DR-Antigene, eine Komplement quelle, einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen eine Komplementkomponente und gegebenenfalls einen wei teren gegen IgG gerichteten Antikörper, der eine Fluoreszenzmarkierung trägt, die Licht einer anderen Wellenlänge emittiert als der gegen die Komplement komponente gerichtete Antikörper.