DE60037362T2 - Rückwärtsbestimmung von ABO-Blutgruppen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet reverse Blutgruppenuntersuchung.
  • Die Blutgruppen-Serologie benötigt die Bestimmung der Blutzellenkompatibilität zwischen einem Blutspender und einem Patienten vor einer den Patienten involvierenden Transfusion oder Organtransplantation. Die Blutzellenkompatibilität wird durch das Nichtauftreten einer immunologischen Reaktion zwischen Antikörpern, die in dem Blutserum eines Patienten enthalten sind, und Antigenen, die auf den Blutzellen des Spenders präsentiert werden, bestimmt.
  • Es werden viele verschiedene Blutgruppenantigene auf der Oberfläche der roten Blutzellen aller Individuen gefunden. Diese Antigene, die Produkte geerbter Gene sind, kommen in Kombinationen vor, die wahrscheinlich einmalig zwischen allen Individuen außer eineiigen Zwillingen sind. Die Blutgruppenbestimmung ist normalerweise das Untersuchungsverfahren von roten Blutzellen, um zu bestimmen welche Antigene vorhanden und welche abwesend sind, was normalerweise unter Verwendung von Antikörpern des zu testenden Antigens erfolgt. Zusätzlich, falls ein Individuum nicht ein bestimmtes rotes Zellantigen auf seiner oder ihrer roten Blutzellen aufweist, kann sein oder ihr Serum einen Antikörper zu diesem Antigen enthalten. Ob oder ob nicht der Antikörper in dem Serum vorhanden ist, hängt davon ab, ob das Immunsystem des Individuums vorher durch das spezifische Antigen oder etwas zu dem sehr ähnlichem angeregt wurde und darauf geantwortet hat z. B. wird ein Individuum, dessen rote Blutzellen Typ A, d. h. "A"-Antigene auf den roten Zellen aufweisen, Anti-B-Antikörper in seinem oder ihrem Serum aufweisen. Demzufolge wird, falls so einem Individuum Typ-B-Blut gegeben wird, eine immunologische Reaktion mit möglichen schwerwiegenden klinischen Folgen auftreten.
  • Als ein zusätzlicher Gesichtspunkt sollte beachtet werden, daß der menschliche Körper konstant Antigenen in Pollen, Nahrung, Bakterien und Viren ausgesetzt wird. Einige dieser "natürlichen" Antigene sind scheinbar so ähnlich zu den menschlichen Blutgruppenantigenen, daß sie fast jedes empfindliches Individuum stimulieren, Antikörper zu produzieren. Demzu folge werden bestimmte Antikörper in jedem beliebigen Serum erwartet, in dem roten Zellen das reziproke Antigen fehlt. Das trifft besonders für das AB0-System zu. Demzufolge wird häufig ein zweiter Bestätigungstest mit den Patienten/Spenderseren durchgeführt. Der Test für die erwarteten Antikörper des AB0-Blutgruppensystem in Seren wird "reverse" Blutgruppenbestimmung genannt.
  • Antikörper von dem AB0-Blutgruppensystem sind gewöhnlich Immunglobulin M (IgM). Diese Antikörper weisen zehn Antigen-Bindestellen pro Molekül auf. Der IgM-Antikörper ist groß genug, um sich über den Abstand zwischen den roten Blutzellen zu erstrecken, so dass sich die Zellen beim Zentrifugieren zu einem "Zelle-Antikörper-Zelle-Antikörper"-Gitter zusammenschließen und als Agglutinate zusammengeklumpt bleiben. Wenn z. B. Anti-A zur Blutgruppe A- oder Blutgruppe AB-Zellen zugegeben und die Mischung zentrifugiert wird, bleiben die Zellen beim Resuspendieren in Klumpen erhalten. Mit dem gleichen Antikörper werden Gruppe 0- und B-Zellen als einzelne Zellen resuspendiert. Agglutination, die durch einen Antikörper, wie z. b. ein IgM-Antikörper, verursacht wird, wird als direkte Agglutination bezeichnet.
  • In der Transfusionmedizin ist der aus den oben genannten Gründen am häufigsten durchgeführte Test die Bestimmung der AB0-Blugruppe. Gegenwärtiger Stand der Technik ist die getrennte Untersuchung von A, B und manchmal A + B zusammen, Antigenen auf den roten Zellen (Forward-Typ); und Bestätigungs-(Gegenprobe)Untersuchung für Anti-A und Anti-B Antikörper im Serum oder Plasma (Reverse-Typ). Daher werden ein Minimum von vier getrennten Tests, aber nicht weniger als sieben separate Tests (A, B, A + B Antigene von der Probe roter Zellen; Anti-A, Anti-B in der Probe Serum/Plasma mittels A1, A2, B, 0 reagierenden roten Zellen) routinemäßig angewendet. Die Ergebnisse von jedem dieser typisierenden Untersuchungen (Forward- und Reverse-Typ) müssen übereinstimmen. Daher werden alleine in den USA ungefähr 104 Millionen Tests jährlich durchgeführt, um die Blutgruppen in Blutzentren zu bestimmen.
  • Seit dem frühen 19. Jahrhundert war der allgemeine Ansatz, der als die "Landsteiner"-Methode (Landsteiner, Science 73: 405 (1931)) bekannt ist, zusammen mit der Arbeit von Ashby (J. Exp. Med. 29: 267 (1919)) und Coombs (Brit. J. Exp. Pathol. 26: 255 (1945)), die roten Blutzellen eines Patienten in ein Standardlaborteströhrchen zu geben, das einen Blutgruppenantikörper (wie z. B. Anti-A oder Anti-B) enthält, zu mischen, um es einer Antikör per/Antigen-Bindereaktionen zu erlauben stattzufinden, und anschließend zu zentrifugieren. Falls das zu untersuchende Antigen vorhanden ist, wird die Antikörper/Antigen-Bindung stattfinden und zur Agglutination der roten Blutzellen des Patienten führen. Das Teströhrchen wird manuell geschüttelt, um das Zentrifugat der verklumpten Zellen am Boden aufzulockern. Es wird anschließend eine subjektive Bestimmung gemacht, ob oder ob nicht die aufgelockerten Zellen verklumpt sind und bis zu welchem Ausmaß.
  • Während der Mitte des 19. Jahrhunderts wurden Versuche unternommen, diese Technik zu vereinfachen, um die subjektive Natur des Tests zu minimieren und Fehler zu reduzieren. Es wurde erkannt, daß man eine einigermaßen beständige Aufnahme der Kompatibilitätuntersuchungsergebnisse durch Anwendung von benetzbaren, entweder nicht-absorbierenden oder in einigen Fällen absorbierenden, Test-Objektträger oder Test-Karten, die die erforderlichen immunchemischen Reagenzien auf wenigstens einen Teil ihrer Oberfläche aufweisen, bekommen konnte. In diesem Zusammenhang beschreiben U.S. Patent Nr. 2,770,572 , 2,850,430 , 3,074,853 , 3,272,319 , 3,424,558 , 3,502,437 und 3,666,42 und die europäische Patentanmeldung Nr. 0 104 881-A1 ausgewählte Beispiele von solchen Test-Karten und darauf bezogene Apparaturen. Die Vorteile von Blutgruppenbestimmungen auf Mikroplatten schließt leichtere Handhabung einer großen Anzahl von Proben, objektive Messung von Agglutinations-Reaktionen mittels Instrumenten und Computer, die zur Erfassung und Verwaltung der Ergebnisse gekoppelt sind, ein. Eine Anzahl von teueren und zweckbestimmten Systemen mit computerkontrollierter Robotertechnik und spektrophotometrischen Lesesystemen („Readers”) mit einem hohen Durchsatz wurden für die Blutbankautomation eingeführt (Chung, et al., Transfusion 33: 384 (1992)). WO98/21593 offenbart ein Verfahren zur simultaner reverser Typisierung durch Flusszytometrie.
  • Es wurden kommerzielle Blutgruppenbestimmungskits mit verbessertem Nachweis von Antigen- und Antikörperreaktionen roter Zellen in besonderen Mikroröhrchen eingeführt, die mit Reagenzien in Gelform gefüllt sind. (Lapierre, et al., Transfusion 30: 109 (1990)). Der Nutzen von Festphasentechniken, um die inhärenten Probleme bei der Verwendung von Hämagglutination als ein Endpunkt für Blutgruppenbestimmung zu verwenden, wurde durch Scott (Transfusion Med. Rev. 5: 60 (1991)) rezensiert. Erst kürzlich berichtete Growe et al. (Transfusion Med. Rev. 10: 44 (1996)) die Einführung und Verwendung einer automatisierten Bestimmung von RBC-Antigen- und Serum-Antikörper-Screening-Verfahren, die nicht nur für Blutzentren sondern auch für Transfusionslaboratorien in Krankenhäusern geeignet sind. In diesen Verfahren müssen mindestens sieben unterschiedliche Wells mit speziellen Bestimmungsreagenzien zur Bestimmung der Blutgruppe einer Probe verwendet werden. All die Verfahren, die für Blutgruppenbestimmung im großen Maßstab verwendet werden, wenden im wesentlichen, auch für die Bestimmung von nur einem Antigen- oder Antikörper-Typ in einem einzelnen Röhrchen/Well, Agglutination-basierte Verfahren an. In den U.S. Patent Nr. 4,550,017 und 4,748,129 wurden auch von getrennt identifizierbaren Reaktionen zur Blutgruppenbestimmung berichtet, die fluoreszenzmakierte Reagenzien verwenden.
  • Gegenwärtige Verfahren verwenden als ein Endpunkt die Agglutination von roten Zellen. Wie bereits oben diskutiert wird dies in Teströhrchen, auf Objektträgeroberflächen, in Mikroplatten und in Säulen-Agglutinationstest durchgeführt. Die letzten zwei Verfahren können manuell oder mittels automatisierter Instrumentation durchgeführt werden. Alle Verfahren benötigen die Trennung von Serum (oder Plasma) von den Zellen um sowohl den Forward- als auch Reverse-Typ durchzuführen.
  • Eine visuelle Nachweistechnologie kann in der hier genannten reversen Blutgruppenbestimmung angewendet werden. So ein Verfahren, das einen Säulenagglutinationstest (CAT) verwendet, kann eine BioVueTM-Kassette (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY) verwenden. Solche Kassetten enthalten Säulen zu denen eine Mikropartikelmatrix zugegeben wurde.
  • CAT kann automatisierte Lesesysteme zum Interpretieren des Agglutinationsergebnisses verwenden. So ein derartiges Lesesystem ist in dem Ortho AutoVueTM (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY) vorhanden, ein vollautomatisiertes System zum Duchführen des CAT. Das Autolesesystem ist ein computerisiertes bildgebendes System, das aus einer CCD (charge coupled device) monochromen Videokamera, eine Bildbearbeitungseinheit und einem IBM-kompatiblen PC besteht. Das Lesesystem erfaßt zunächst ein Bild der Reaktion, das digitalisiert und durch die Bildbearbeitungssoftware verarbeitet wird, um die Reaktionsmerkmale zu extrahieren, die anschließend von dem Reaktions-Klassifizierungsprogramm verwendet werden. Diese Merkmale werden verwendet, um die Reaktionen in negative und positive Klassen zu trennen, und in eine von sieben herkömmlichen Reaktionsklassen oder -stufen zu übersetzen. Es wird eine Unterscheidungsanalyse, eine linearstatistische Mustererkennung, verwendet, um zwischen negativen und schwachen Reaktionen zu unterscheiden.
  • Ein noch anderes Lesesystem, der im CAT verwendet wird, ist das BioVueTM Lesesystem 2 (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY). Dieses Lesesystem weist ein automatisiertes Ladeprogramm für zwölf BioVueTM-Kassetten und eine Halogenlampenquelle und Bildanalysemerkmale auf, die eine Zellenidentifizierung erlauben, die auf RBC-Wellenlänge basiert, und dadurch das Agglutinationsergebnis interpretiert. Die Bilderfassung wird durch eine CCD Kamera und eine digitalisierender Einheit durchgeführt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur simultanen Antiköperuntersuchung in Blut, wie in Anspruch 1 definiert, bereit. Die Erfindung umfaßt auch einen Blutanalysekit, wie in Anspruch 5 definiert.
  • 1 ist eine schematische Darstellung eines visuellen Nachweises der reversen Untersuchung eines B-Serums in einem CAT-System. Markiertes Reagenzien aus A und B-Zellen werden mit B-Serum gemischt, was zu braunen Agglutinaten führt, die im Anschluß einer Zentrifugation oben auf der Gel-Säule des CAT-Systems erhalten werden; nicht-reagiertes markiertes Reagenz aus B-Zellen wird unten an der Säule erhalten.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine reverse AB0-Blutgruppenbestimmung beschrieben. Die Erfindung kann mit der Säulenagglutinationstest(CAT)-Reaktion und den Trennungsbehältern angewendet werden, die in Kassettenform durch Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, New York, unter dem Handelsnamen BIOVUETM hergestellt und verkauft werden. Die Ergebnisse können durch die beiden oben beschriebenen Systeme, das computerisierte Bildsystem AutoVueTM Autolesesystem oder dem BioVueTM Leser 2 bestimmt werden.
  • Die Reagenzien aus roten Blutzellen (RBCs), die üblicherweise für die reverse Bestimmung verwendet werden, weisen auf ihrer Oberfläche entweder A1, A2, B oder keine AB0-Antigene (Typ A1, Typ A2, Typ B, Typ 0) auf. Diese Zellen sind zum Nachweisen von bereits gebildeten Antikörpern nützlich, die Agglutination mit dem Reagenz RBCs verursachen würden.
  • Die Verfahren der gegenwärtigen Erfindung ermöglichen den visuellen Nachweis einer reversen Blutgruppenbestimmung.
  • Visuelles Nachweissystem
  • Die Fähigkeit die Farbe einer roten Zelle zu ändern, würde es erlauben, eine simultane Untersuchung von zwei Zellpopulationen visuell oder spektrophotometrisch (durch Absorption oder Reflektion) durchzuführen, d. h. ohne die Notwendigkeit eine Fluoreszenz nachzuweisen. Es wird z. B. erwartet, daß rote Zellen die Zyanid oder Azid ausgesetzt werden, ihre Farbe von hellem Rot zu Braun wechseln. Rote Agglutinate könnten anschließend visuell von braunen Agglutinaten unterschieden werden. Während die Modifizierung der intrinsischen Farbe des roten Zellhämoglobins durch diese Ausführungsform in Erwägung gezogen wird, könnten einfaches Anfügen oder ein anderweitige Assoziierung von Chromophoren an die roten Zellen anderweitig nachweisbar ihre spektralen Eigenschaften ändern.
  • 1 stellt eine reverse Bestimmung dar, die das Säulenagglutinationsverfahren verwendet, wobei die Reagenzien aus A- und B-Zellen getrennt markiert werden. Das Probenserum wird gemäß den Herstellerangaben oben auf die Säule gegeben und das Röhrchen wird entsprechend inkubiert und zentrifugiert. Das Reagenz aus A-Zellen agglutiniert mit vorhandenem Anti-A-Antikörper während das Reagenz aus B-Zellen zum Boden der Säule läuft, was anzeigt, daß das Probenserum Typ B war.
  • Die Reagenzien aus RBCs (Affirmgen A1 und B Zellen, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ) wurden mit Natriumazid (NaN3) bei einer Endkonzentration von 0,2% behandelt. Das NaN3 reduziert das Eisen im Hämoglobin, was zu einem Farbwechsel von typischem Rot zu einem tiefen Braun oder einer kastanienbraunen Farbe führt. Nichtbehandelte Zellen aus der gleichen Affirmagen-Charge dienten als Kontrolle. Die nichtbehandelte Kontrolle und die behandelten Testzellen wurden unabhängig voneinander mit Gruppe B Seren in einer BioVueTM reverse Kassette gemäß den Herstellerangaben untersucht (10 μl 3–5% rote Zellen und 40 μl Serum; anschließend fünf Minuten in einer BioVue-Zentrifuge gemäß den Herstellerangaben zentrifugiert). Von den B-Seren wird erwartet mit A1-Zellen aber nicht mit den B-Zellen zu agglutinieren. Es wurden keine Unterschiede in der Agglutination von nichtbehan delten versus behandelten Zellen beobachtet, außer daß die nichtbehandelten Zellen Rot waren und die behandelten Zellen Braun. Siehe Beispiel 1 und Tabelle 1. Die automatisierte Bestimmung von Agglutinationsergebnissen mittels der beschriebenen visuellen Nachweissysteme kann durch die Verwendung der beiden oben beschriebnen System, die computerisierten Bildsysteme AutoVueTM Autoleser oder das BioVueTM Leser 2, durchgeführt werden.
  • Das nachfolgende Beispiel wird nur zum Zweck der Illustration und nicht zur Limitierung des Bereichs der Erfindung bereitgestellt.
  • Beispiel 1
  • Teil A – Herstellung von gefärbten roten Zellen
  • Kommerzielle Zubereitungen von Gruppe A1 und B rote Zellen (Affirmagen) wurden von Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Raritan, NJ) erhalten. Es wurden zwei 1 mL Aliquote von A1-RBCs von der Ampulle entfernt und in ein separates Röhrchen plaziert. Ein Aliquot wurde mit 20 μl 10%igem NaN3 (Mallinckrodt, Paris, KY) gemischt. Das andere Aliquot wurde nicht behandelt und diente als Kontrolle. Jedes Röhrchen wurde gedeckelt und die Inhalte wurden für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Übernachtbehandlung erschienen die NaN3-behandelten RBC in der Farbe Braun während die nichtbehandelten Kontrollzellen Rot blieben.
  • Teil B – Reverse BioVue-Säulenuntersuchung – Doppelsäulentest (kein Teil der Erfindung)
  • Natriumazid-behandelte Zellen wurden in einer Standard-BioVue reverse Kassette unter Verwendung von 10 μl A1-Zellen plus 40 μl Gruppe B Seren in einer Säule und 10 μl B-Zellen plus 40 μl Gruppe B Serum in einer unterschiedlichen Säule (Säulen 3 und 4 in Tabelle 1) untersucht. Die Kontrollzellen, nichtbehandelte A1- und B-Zellen wurden in Säule 1 bzw. 2 untersucht. Im Anschluß an einer Zentrifugation gemäß den Herstellerangaben wurden agglutinierte A1-Zellen sowohl nichtbehandelte Kontrollzellen (Säule 1) als auch behandelte Testzellen (Säule 3) oben auf der "bead"-Säule erhalten, was die Anwesenheit von Anti-A in den Gruppen B Seren anzeigt. Es wurden nicht-agglutinierte B Zellen, sowohl nichtbehandelte Kon trollzellen (Säule 2) als auch behandelte Testzellen (Säule 4) am Boden der Säule erhalten, was die Abwesenheit von Anti-B anzeigt. Die nichtbehandelten Kontrollzellen waren in ihrer Erscheinung Rot und die behandelten Testzellen erschienen Braun. Die Ergebnisse zeigten an, daß die Behandlung der A1 und B Zellen nicht ihre Fähigkeit in der "bead"-Säule zu agglutinieren beeinflußt.
  • Teil C – Reverse BioVue Säulenuntersuchung – einzelner Säulentest
  • Im Teil B wurden A1- und B-Zellen in einzelnen Säulen untersucht, um die reverse Gruppe der Probe zu bestimmen. Als nächstes kombinierten wir in einer Säule 10 μl A1 nichtbehandelte Zellen (rot) und 10 μl B behandelte Zellen (braun) mit 40 μl Gruppe B Seren. Im Anschluß an einer Zentrifugation wurden zwei unterschiedliche Zellpopulationen erhalten. Agglutinierte (A1) Zellen wurden oben auf der "bead"-Säule erhalten und nicht-agglutinierte braune (B) Zellen wurden am Boden der Säule (Säule 5 in Tabelle 1) erhalten. Die Ergebnisse zeigen an, daß die korrekte reverse Gruppe in einer Säule (ein Test) anstelle von den normalen zwei Säulen bestimmt werden konnte. Umgekehrt wurden 10 μl behandelte A1-Zellen und 10 μl nichtbehandelte B Zellen gemäß dem hier beschriebenen Teil B untersucht und die Ergebnisse waren geeignet, agglutinierte braune (A1) Zellen und nicht-agglutinierte rote (B) Zellen (Säule 6 in Tabelle 1) nachzuweisen.
  • Die Ergebnisse der hier beschriebenen Teile B und C werden in Tabelle 1 gezeigt. Siehe 1. Tabelle 1 Visueller Nachweis und Unterscheidung von 2 unterschiedlichen Zellpopulationen
    BioVue reverse Säulennummer
    1* 2* 3* 4* 5 6
    RBC (jeweils 10 μl) A1 nichtbehandelt B nichtbehandelt A1 behandelt B behandelt A1 nichtbehandelt + B behandelt A1 behandelt + B nicht behandelt
    Beobachtete Reaktion im Anschluß an Zentrifugation 4+ 0 4+ 0 3–4+ gemischt 3–4+ gemischt
    Beschreibung Rote Zelen oben auf der "bead"-Säule Rote Zellen am Boden der "bead"-Säule Braune Zellen oben auf der "bead"-Säule Braune Zellen am Boden der "bead"-Säule Rote Zellen oben auf und braune Zellen am Boden der "bead"-Säule. Einige Zellen verstreut in der Säule. Braune Zellen oben auf und rote Zellen am Boden der "bead"-Säule. Einige Zellen versträut in der Säule
    • Beachte: Alle Säulen enthielten 40 μl B-Seren zusätzlich zu den angezeigten roten Zellen.
    • Nichtbehandelt, nichtbehandelte Kontrollzellen
    • Behandelt, NaN3, behandelte Zellen
    • * kein Teil der Erfindung

Claims (5)

  1. Verfahren zum Analysieren einer reversen AB0-Gruppe in einem reversen Test, umfassend: (a) Vermischen einer Blutprobe mit einem ersten Reagenz roter Blutzellen, die A-Antigen tragen, und mit einem zweiten Reagenz roter Blutzellen, die B-Antigen tragen, wobei das Vermischen in einer einzelnen Säule durchgeführt wird, wobei eines von dem ersten oder zweiten Reagenz roter Blutzellen unterscheidbar gefärbt ist; (b) Inkubieren der Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, damit Agglutination stattfindet; (c) Unterwerfen der inkubierten Mischung in der einzelnen Säule einer optischen Analyse, um Agglutination des ersten und/oder zweiten Reagenz roter Blutzellen oder Fehlen davon zu bestimmen; und (d) Analysieren der optischen Analyse der Agglutination, um die reverse AB0-Gruppe zu bestimmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Säule, die der optischen Analyse unterworfen wird, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Röhren- und Säulen-Agglutinationstechnologie.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säulen-Agglutinationstechnologie ein Säulen-Agglutinationstest-Reaktions- und Trennungsgefäß in Kassettenform ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Blutprobe Serum oder Plasma ist.
  5. Blutanalyse-Agglutinationstest-Kit zum Durchführen einer reversen AB0-Blutgruppe in einer einzelnen Säule, umfassend: (a) Einen Behälter, der darin einen ersten Bestand eines Reagenz roter Blutzellen, die Gruppe-A-Antigen tragen, und einen zweiten Bestand eines Reagenz roter Blutzellen, die Gruppe-B-Antigen tragen, aufweist, wobei eines von dem ersten oder zweiten Bestand der Reagenzien roter Blutzellen unterscheidbar gefärbt ist; (b) Reaktionsmittel zum Durchführen der reversen AB0-Blutgruppe, wobei die Reaktionsmittel aus einem Säulen-Agglutination-Reaktionsgefäß bestehen; und (c) Anweisungen zum Durchführen der reversen ABO-Blutgruppe in einer einzelnen Säule, wobei die einzelne Säule einer optischen Analyse zum Nachweisen und Identifizieren des Antikörpers unterworfen wird.
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