DE3609980A1

DE3609980A1 - Verfahren zur bestimmung von haemoglobin im stuhl

Info

Publication number: DE3609980A1
Application number: DE19863609980
Authority: DE
Inventors: Shoji Nagaokakyo Okuda; Kiko Kyoto Tanaka; Kazuo Kobe Uchida
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1985-04-02
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1986-10-23
Also published as: KR860008455A; GB2173304A; GB8606689D0; FR2579757A1; JPS61228351A; JPH0564737B2

Description

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft Analydeverfahren für Hämoglobin im Stuhl und insbesondere ein Analyseverfahren, das es ermöglicht, auf pathologische Zonen im Verdauungsorgansystem zu schließen, ohne daß eine Diät, etc. für den Patienten erforderlich ist, und das es ermöglicht, eine große Zahl von Proben, wie bei einer Massenuntersuchung etc., in einfacher Weise zu untersuchen.

Es wurde ein Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin (Blut) im Stuhl entwickelt zum Zwecke der Früherkennung von Anomalien, d.h. Krebs, Geschwüre etc., im Verdauungssystem.

Zur Hämoglobinbestimmung im Stuhl wurde bisher eine chemische Bestimmung des im Stuhl verborgenen Blutes verwendet. Die Häufigkeit des Befalls mit Darmkrebs ist in den letzten Jahren in den Industrieländern stark angestiegen, eine steigende Krebsrate ist mit einer Veränderung der Ernährung in Richtung auf die in westlichen Ländern üblichen Gewohnheiten zu beobachten. Wegen dieses Anstiegs wurde die chemische Erkennung von verborgenem Blut im Stuhl wegen der Einfachheit und der niedrigen Kosten in weitem Maße als Massenuntersuchung zur Erkennung von Darmkrebs im Frühstadium verwendet. Die chemische Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl ist sehr empfindlich, so daß selbst eine geringe Menge Hämoglobin bestimmt werden kann.

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Die chemische Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl nach dem Stand der Technik besitzt jedoch keine Spezifität bezüglich Humanhämoglobin, da die Tests auf einer colorimetrischen Reaktion mit verschiedenen Chromogenen auf Basis der Aktivität der im Erythrocyten-Hämoglobin enthaltenen Peroxidase beruhen. Daher verläuft die Reaktion auch mit Peroxidasen in tierischem Hämoglobin oder Myoglobin oder Chlorophyll enthaltenden Gemüsen (Broccoli, Rettich, Blumenkohl, Karotten, Gurken, Kürbis, Kohl etc.) oder bei nicht menschenähnlichen Tieren.

Zudem werden die Tests durch verabreichte Arzneien beeinträchtigt (Eisen, Kupfer, Kaliumjodid, Vitamin C, etc.). Um die Spezifität gegenüber Humanhämoglobin zu erhöhen, erfordern die Tests somit eine Diät-Kontrolle, wie Verzicht auf Fleischgerichte usw. vor der Untersuchung. Bei der gegenwärtigen Massenuntersuchung wird einem Analysenfehler durch positive Anzeige durch Diät-Kontrolle vorgebeugt, zur gleichen Zeit wird jedoch eine chemische Bestimmung des verborgenen Blutes verwendet, bei der ein Chromogen mit einer geringen Sensitivität eingesetzt wird. Dies führt umgekehrt zu dem Ergebnis, daß die Gefahr einer fehlerhaften Bestimmung durch Negativ-Anzeige wächst (selbst wenn Hämoglobin vorhanden ist, wird es nicht entdeckt).

Weiterhin wird bei der chemischen Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl nach dem Stand der Technik eine Blutung auf dem ganzen Weg durch das Verdauungsorgan von der Mundhöhle bis zum Anus festgestellt, weil sowohl Hämoglobin in frischem Blut als auch durch Verdauurigsenzym zersetztes Hämoglobin Peroxydase-Aktivität zeigen? entsprechend wird keine genaue Information über die Blutungszone erhalten.

Es ist somit unmöglich, beides, eine befriedigende Spezifität und Sensitivität beim Nachweis von Blutungen aus der unteren Region des Verdauungsorganssystems zu erzielen, die z.B. von Mastdarm- oder Dickdarmkrebs stammen.

Wegen der aufgeführten Nachteile haben sich Massenuntersuchungen durch chemische Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl bisher nicht durchgesetzt.

Andererseits wurde in jüngerer Zeit von Barrow et al (Am.J.Cli.Pathol.,69: 342, 1978, März) ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl unter Verwendung einer Antikörper-Antigen-Reaktion zwischen Human- und Antxhumanhämoglobin entwickelt. Die immunologische Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl ist dadurch charakterisiert, daß Hämoglobin durch die Einwirkung von Verdauungsenzym im Verdauungsorgansystem den größten Teil seiner Antigenizität verliert, so daß nicht nur die Spezifität gegenüber Humanhämoglobin, das die Antigenizität hält, sondern auch eine geringere Gastrointestinal-Blutung, festgestellt werden kann.

Die bisher entwickelten Untersuchungsmethoden basierten jedoch auf dem Prinzip, daß für immunologische Bestimmungen des verborgenen Blutes Arbeitsgänge erforderlich sind, um eine bestimmte Menge Stuhl zu entnehmen, ihn mit einem wässrigen Medium zu mischen, dann die Mischung zu zentrifugieren und die überstehende Lösung als Probe einzusetzen. Außerdem ist bei dem Single-Radial-Immuno-Diffusions-Verfahren

(bei dem die Probe in einem Antikörper enthaltenden Gel verteilt wird, um die Reaktion zu untersuchen) und bei der Ouchterlony-Methode (bei der Antikörper und eine Probe in ein Gel in bestimmten Abständen injiziert werden, beide .verteilt werden, damit sie miteinander reagieren, und die Reaktion untersucht wird) eine relativ lange Zeit von 24 bis 48 Stunden zur Beurteilung der Ergebnisse erforderlich. Das Counter-Immuno-Elektrophorese-Verfahren (bei dem das Reaktionsprodukt zwischen einer Probe und Antikörper auf einem Träger durch Anwendung eines elektrischen Stroms gemessen wird) besitzt den Nachteil, daß spezielle Geräte zur Analyse erforderlich sind, etc., und es wird daher nicht in weitem Umfang angewandt. Außerdem sind diese Verfahren nicht für eine Massenuntersuchung, bei der eine große Anzahl von Proben untersucht werden muß, geeignet.

Um diesen Test bei einer Massenuntersuchung zu verwenden, ist es erforderlich, eine große Zahl von Stuhlproben in einer festgelegten Menge zu nehmen, die - versehen mit einer Kennzeichnung (ID) - zu einem Analysenraum gebracht und dort verarbeitet werden müssen. Dieses Verfahren besitzt auch den Nachteil, daß das mit der Durchführung befasste Personal Unannehmlichkeiten, wie unangenehmem Geruch, Unsauberkeit etc., ausgesetzt ist.

In Anbetracht dieses Standes der Technik wurden umfassende Forschungsarbeiten durchgeführt mit dem Ziel, ein Verfahren zur überprüfung durch Massenuntersuchung auf Gastrointestinal-Blutungen - wie bei Mast- und'Dickdarmkrebs -, das die oben angeführte Nachteile, die mit der chemischen Bestimmung

und der immunologischen Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl nach dem Stand der Technik verbunden sind, nicht aufweist.

Es wurde überraschend gefunden, daß Hämoglobin im Stuhl leicht physikalisch an der Oberfläche eines hochmolekularen Materials, insbesondere eines hydrophoben Kunststoffharzes, physikalisch adsorbiert wird. Unter Ausnutzung dieses Phänomens gelang es, Hämoglobin aus Stuhl leicht auf der Oberfläche eines Kunststoffharzgegenstandes (z.B. eines Probestabes) abzutrennen. Es wurde auch gefunden, daß das auf diesem Weg physikalisch adsorbierte Hämoglobin für einen Enzym-Immuno-Assaye zur Bestimmung von Humanhämoglobin im Stuhl verwendet werden kann, bei dem enzym-markiertes Antihumanhämoglobin verwendet wird, wodurch nur Humanhämoglobin mit einer hohen Sensitivität spezifisch erfasst werden kann.

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Analyse von Hämoglobin im Stuhl zur Verfügung, das die physikalische Adsorption von Hämoglobin im Stuhl auf der Oberfläche eines Probestabes aus einem hydrophoben hochmolekularen Material, um das Hämoglobin aus dem Stuhl abzutrennen, und die spezifische Bestimmung des Hämoglobins mit Hilfe von enzym-gekennzeichnetem Antihumanhämoglobin umfasst.

Eines der wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung eines aus einem hydrophoben hochmolekularen Material hergestellten Probestabes. Beispiele für solche hochmolekularen Materialien sind Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Acrylharze etc., wovon Polystyrol bevorzugt ist.

Bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird der Probestab mit dem zu untersuchenden Stuhl in der Weise in Kontakt gebracht, daß das Hämoglobin im Stuhl physikalisch auf der Oberfläche des Probestabes adsorbiert wird. Dann wird vorzugsweise der Stab mit Wasser gewaschen, um Stuhlreste zu entfernen. Dann wird die Probe (Hämoglobin), die an dem Stab adsorbiert ist, der Antikörper-Antigen-Reaktion unterworfen unter Verwendung eines enzym-gekennzeichneten Antihuman-Hämoglobins und anschließender colorimetrischer Reaktion zur Bestimmung des Hämoglobins.

Diese Reaktionen können an dem Probestab selbst oder in einem separaten Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Dann wird der Probestab mit dem physikalisch adsorbierten Hämoglobin darauf in eine Lösung des enzymmarkierten Antikörpers eingetaucht oder tropfenweise damit versetzt, um die Antigen-Antikörper-Reaktion auf dem Probestab durchzuführen. Anschliessend wird der Probestab mit dem Hämoglobin darauf, wie es nach der Reaktion mit dem enzym-gekennzeichneten Antikörper vorliegt, eingetaucht in oder versetzt mit einer Lösung, die ein Substrat zur Farbbildung durch colorimetrische Reaktion enthält. Danach wird das Humanhämoglobin im Stuhl spezifisch colorimetrisch bestimmt.

Die enzymatische Immuno-Reaktion ist wohlbekannter Stand der Technik. Sie ist allgemein z.B. in der US-PS 4 016 043 beschrieben. Die colorimetrische Reaktion für Analysen dieser Art ist ebenfalls Stand der Technik und z.B. als Kind-King-Methode (J.Clin.Path.T^, 322-326, 1954)" beschrieben.

Wahlweise ist es zusätzlich zu der enzymatischen Immuno-Reaktions-Methode auch möglich, ein konventionelles Verfahren zur chemischen Bestimmung des physikalisch an dem Probestab adsorbierten Hämoglobins durchzuführen. Wenn ein solches Verfahren zur chemischen Bestimmung (chemische Bestimmung des verborgenen Blutes im Stuhl) zusätzlich zu der enzymatischen Immuno-Analyse durchgeführt wird, kann die Bestimmung des Hämoglobins im Stuhl genauer durchgeführt werden, und gleichzeitig wird es möglich, auf die Zone der Blutung im Verdauungssystem zu schließen, da das physikalisch auf der Oberfläche des hydrophoben hochmolekularen Materials adsorbierte Hämoglobin auch zu einer solchen chemischen Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl nach dem Stand der Technik verwendet werden kann. Wenn eine chemische Bestimmung des verborgenen Bluts im Stuhl mit dem Hämoglobin durchgeführt wird, wie es abgetrennt auf einem hydrophoben hochmolekularen Material adsorbiert vorliegt, wird eine überlagerung mit pflanzlichen Peroxidasen und für medizinische Zwecke verwendeten Chemikalien ausgeschlossen, das von Tieren stammende (mit der Nahrung aufgenommenes Fleisch) Hämoglobin oder Myoglobin wird jedoch wie nach dem Stand der Technik erfasst.

Wird das Verfahren der chemischen Bestimmung durchgeführt, so wird vorzugsweise ein saurer Puffer bei dem Arbeitsgang der Hämoglobin-Adsorption auf der Oberfläche des Probestabes verwendet, da Hämoglobin in der chemischen Struktur durch die Einwirkung eines solchen sauren Puffers so verändert wird, daß es leichter auf der Oberfläche eines hydrophoben hochmolekularen Materials adsorbiert wird. So wird bei-

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spielsweise der Probestab mit Stuhl daran eingetaucht in oder versetzt mit einem sauren Puffer, so daß Hämoglobin mit einer größeren Sicherheit über einen weiten Konzentrationsbereich auf der Oberfläche des Probestabes physikalisch adsorbiert wird. Daher wird bei der Verwendung einer solchen chemischen Bestimmungsmethode die Bestimmung von Hämoglobin im Stuhl selbst in einer niedrigen Konzentration möglich. Jedoch verliert das Hämoglobin, wenn es der Einwirkung eines sauren Puffers unterworfen wird, seine Konfiguration (Raumstruktur), so daß die saure Behandlung manchmal für die enzymatische Immuno-Reaktionsmethode nicht bevorzugt ist.

15'^. Die chemische Bestimmungsmethode für Hämoglobin (oder chemische Bestimmung des verborgenen Blutes im Stuhl) ist wohlbekannter Stand der Technik. Für Einzelheiten hierzu wird z.B. auf "Rinsho Kensa", Bd.7, Nr.2, Seiten 70-71 (1963) verwiesen.

Die Erfindung wird im folgenden weiter erläutert, wobei teilweise auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird:

5 Figur 1 stellt eine Frontansicht des Probestabes dar, der erfindungsgemäß verwendet werden kann.

Figur 2 ist eine Seitenansicht des Probestabes.

Figur 3 stellt einen Querschnitt entlang der Linie A-A der Figur 1 dar.

Figur 4 stellt eine Frontansicht des Gefäßes dar, das gemeinsam mit dem Probestab verwendet werden kann und

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Figur 5 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen den Hämoglobin-Konzentrationen in verschiedenen untersuchten Stuhlproben und den Extinktionen bei 492 nm, die bei der erfindungsgemässen Bestimmung erhalten wurden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein Probestab (hergestellt aus einem hydrophoben hochmolekularen Material) einer beliebigen Form oder Konstruktion verwendet werden, sofern er eine Oberfläche zur Probeaufnahme besitzt, die mit dem zu untersuchenden Stuhl zur physikalischen Adsorption des Hämoglobins im Stuhl auf der Oberfläche in Kontakt treten kann. Ein Beispiel für eine Probevorrichtung ist in den Figuren 1 bis 4 dargestellt. Entsprechend der Darstellung umfasst die Vorrichtung einen Probestab 1 und ein Flüssigkeitsgefäß 8. Der Probestab 1 besitzt einen Körper 3, der eine mit einem inneren Gewinde versehene Aussparung 7 aufweist und einen flachen Griff 2, auf dem ein Kennzeichnungsschild (ID) 11 für den Gegenstand der Untersuchung (oder den Patienten) angebracht werden kann. Am Boden der Aussparung 7 ist ein Stab 4 vorgesehen, der nach außen ragt und einen probeaufnehnehmenden Teil 5 am Ende aufweist. Vorzugsweise besitzt der die Probe aufnehmende Teil 5 eine rauhe oder grobkörnige Oberfläche ader ist mit feinen Rillen 6 versehen, vorzugsweise in gitterartiger Form, um die Kontaktfläche mit dem Stuhl zu erhöhen oder um die Zurückhaltung der Probe oder einer darauf gegebenen Flüssigkeit zur Behandlung zu gewährleisten. Es ist ferner bevorzugt, daß der die Probe nehmende Teil 5 so geformt oder abgeflacht ist, daß beide Oberflächen

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zur Probenahme verwendet werden können. Wenn die colorimetrische Reaktion auf dem Probestab selbst durchgeführt werden soll, besteht der Probestab vorzugsweise aus einem weißen Material, um die Prüfung des Ergebnisses der colorimetrischen Reaktion zu erleichtern. Die Struktur des Probestabes ist nicht auf die gezeigte Form begrenzt, sie kann selbstverständlich am Ende auch eine löffelähnliche Form aufweisen oder eine Struktur, bei der Stuhl lediglich auf einer Oberfläche gesammelt wird.

Der Probestab 1 kann mit einem zylindrischen Gefäß 8 verbunden sein, das mit einem Gewinde 9 versehen ist, das eine Verbindung mit dem Gewinde der Aussparung, 7 des Probestabes 1 ermöglicht. In dem Gefäß 8 ist ein wässriges Medium enthalten (z.B. entionisiertes Wasser, Pufferlösung in destilliertem Wasser), so daß die Antigen-Antikörper-Reaktion des Hämoglobins und/oder die Einfärbungsreaktion darin durchgeführt werden können.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methode unter Verwendung einer Vorrichtung wie in den Figuren 1 bis 4 dargestellt, wird der zu untersuchende Stuhl des Untersuchungsobjektes (oder Patienten) auf der oder den Oberflächen des Probestabes - wie z.B. in den Figuren 1 bis 3 dargestellt - gesammelt. Dann wird der Probestab 1 in das Gefäß 8 eingesetzt, so daß der probenehmende Teil 5 mit dem Stuhl daran in das wässrige Medium in dem Gefäß 8 eintaucht. Der Probestab 1 und das Gefäß 8 können mittels der Gewinde 7 und 9 miteinander verbunden werden. Vor dem Einsetzen des Pröbestabes 1 in das Gefäß kann ein ID-Etikett 11 auf dem Griff 2 angebracht werden.

Die physikalische Adsorption des Hämoglobins in den Stuhlproben kann dadurch bewirkt werden, daß man den Probestab mit dem Stuhl daran für einen geeigneten Zeitraum von z.B. einigen Sekunden bis einigen Minuten, vorzugsweise etwa 1 Minute, stehen läßt. Vorzugsweise wird der Adsorptionsvorgang in Gegenwart eines wässrigen Mediums, z.B. in dem Gefäß 8 wie oben erläutert, durchgeführt. Danach wird der Probestab herausgenommen und der probeaufnehmende Teil mit destilliertem oder ehtionisiertem Wasser gewaschen.

Entsprechend dem Verfahren wird beispielsweise eine Stuhlprobe genommen und ein mit einem Probestab versehenes Gefäß wird in einem Waschbecken stehen gelassen. Dann wird nach einer bestimmten Zeit der Probestab von dem Gefäß getrennt und der Stab allein kann nun als Probe zu einem Platz transportiert werden, wo die nachfolgende Analyse durchgeführt wird. So ist nur Hämoglobin an dem Probestab adsorbiert, der frei von unangenehmen Gerüchen oder Schmutz ist, so daß das Sammeln und der Transport der Proben leicht sind und die mit der Handhabung betrauten Personen nicht beeinträchtigt werden.

Dann wird der Probestab mit dem daran adsorbierten Hämoglobin einem Enzym-Immuno-Assay und einer Bestimmung (Messung) des Human-Hämoglobins unterworfen. Diese Methoden sind als solche - wie oben erwähnt bekannt und daher wird im folgenden lediglich eine kurze Erläuterung für ein typisches Beispiel gegeben.

A. Herstellung des Reagens für den Enζym-Immuno-Assay:

(1) Herstellung von Hämoglobin A : 5

Hämoglobin A wird aus menschlichem Blut in Übereinstimmung mit beispielsweise dem Verfahren von Williams et al (Anal. Biochem., 54: 137, 1973) hergestellt.
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(2) Herstellung von Antihuman-Hämoglobin:

Gereinigtes Hämoglobin A wird mit Freund ¹S vollständigem Adjuvans gemischt und Tiere wie Kaninchen, Ziegen, etc. werden mit der

Mischung immunisiert. Von den immunisierten Tieren wird Blut gesammelt und zentrifugiert, um Antiserum zu erhalten. Antihuman-Hämoglobin von Kaninchen ist im Handel erhältlich (z.B.

Produkt von DAKOPATTS, Dänemark) und wird zur

Enzym-Kennzeichnung verwendet.

(3) Kennzeichnung mit Enzym:

Antiserum wird mit Enzym gekennzeichnet nach

beispielsweise der Methode von Yoshitake et al (Immunological Experimental Method XI, Seiten 3497-3519, 1982, veröffentlicht von The Society of Immunology, Japan) zur Herstellung eines enzymgekennzeichneten Antikörpers. In diesem

Fall können verschiedene Enzyme wie Peroxi,dase, Alkaliphosphatase, etc. verwendet werden.

B. Verfahren:

(1) Die Oberfläche eines Probestabes, auf dem Hämoglobin physikalisch adsorbiert ist, wird sorgfältig mit entionisiertem oder destillier

tem Wasser gewaschen.

(2) Nachdem das enzymgekennzeichnete Antikörper-Reagens tropfenweise auf die Oberfläche gegeben oder der Probestab in das enzymgekenn

zeichnete Antikörper-Reagens eingetaucht wurde, wird das System beispielsweise bei 20 bis 40⁰C für 15 bis 30 Minuten stehen gelassen, um die Antigen-Antikörper-Reaktion durchzuführen.

(3) Dann wird der Probestab gründlich mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gewaschen, eine Substratlösung (colorimetrische Reaktionslösung) , die beispielsweise p-Nitrophenylphos- phorsäure oder 4-Aminoantipyrin enthält, w,ird

tropfenweise .dazu gegeben oder der Probestab wird in eine solche Substratlösung eingetaucht, um die colorimetrische Reaktion durchzuführen.

(4) Nach Beendigung der Farbreaktion wird der Grad der Farbbildung beobachtet und beurteilt.

Nach diesem Verfahren kann eine große Probemenge innerhalb einer Stunde bestimmt werden.

Die Analyse für Hämoglobin im Stuhl, die auf der Enzym-Immuno -Ana Iy se beruht, wurde oben beschrieben. Wenn eine üblicherweise durchgeführte chemische Bestimmung von verborgenem Blut'zusätzlich zu der oben beschriebenen Methode durchgeführt wird, kann Hämoglobin im Stuhl noch

genauer bestimmt werden. In einem solchen Fall wird vorzugsweise ein Probestab 1 - wie in den Figuren 1 bis 3 dargestellt - benutzt und eine Oberfläche auf dem probenehmenden Teil 5 für Enzym-Immuno-Analyse-Verfahren und die andere Oberfläche für das Verfahren zur chemischen Bestimmung verwendet.

Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert, die lediglich zur Verdeutlichung¹ beschrieben sind und keine Limitierung des Anwendungsbereichs der Erfindung darstellen.

Beispiel 1

Gereinigtes Hämoglobin A wurde mit Freund¹s vollständigem Adjuvans gemischt und damit Kaninchen einmal pro Woche immunisiert. Die Menge des für jede Immunisierung benutzten Antigens betrug 0,5 mg, die vor der Anwendung mit 2,5 ml von Freund's vollständigem Adjuvans gemischt wurden. Die Immunisierung wurde fünfmal wiederholt. Am fünften Tag nach der letzten Immunisierung wurde Blut gesammelt und zentrifugiert, um Antisera (Antihuman-Hämoglobin) zu erhalten; die Lagerung erfolgte bei -8O⁰C in gefrorenem Zustand.

Als nächstes wurde unter Verwendung des oben zubereiteten Antihuman-Hämoglobins unter Verwendung von Alkaliphosphatase gekennzeichnetem Antihuman-Hämoglobin (enthaltend 0,2 % Rinderalbumin und 0,5 mM Magnesiumchlorid) hergestellt als enzymgekennzeichnetes Antikörper-Reagens.

Hämoglobin wurde an einem Probestab - wie in den Figuren 1 bis 3 dargestellt - durch Kontaktieren des Stabes mit hämoglobinhaltigem Stuhl für eine Minute adsorbiert. Der Probestab wurde gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen und in ein kleines Teströhrchen überführt, das 0,3 ml des enzym-gekennzeichneten Antikörper-Reagens¹ enthielt. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde 30 Minuten bei 37⁰C durchgeführt. Anschließend wurde der Probestab mit entionisiertem Wasser gewaschen und in ein kleines Teströhrchen gestellt, das 0,5 ml einer Diethanolaminsubstratlösung (pH 10,5) mit 40 mM p-Nitrophenylphosphorsäure und 0,5 mM Magnesiumchlorid enthielt. Die Inkubation wurde 5 bis 10 Minuten bei 37⁰C durchgeführt. Zum Abbruch der Reaktion wurden 0,5 ml IN NaOH zugegeben.

Der Grad der Farbbildung (in diesem Falle gelb) wurde mit dem bloßen Auge beobachtet und beurteilt.

Als Ergebnis der Beurteilung verschiedener Proben wurde festgestellt, daß Proben, die Hämoglobin-Konzentrationen von 0,5 mg/dl oder mehr aufweisen, als deutlich positiv erkannt werden und bei hohen Konzentrationen von 300 mg/dl oder mehr oder über das Gebiet, das die Hämoglobin-Konzentration im gesamten Blut erreicht, die Farbbildung stark positiv ist.

Vergleichsbeispiel

In 1 ml Bicin-Puffer (pH 8,5, Produkt der Nakarai Chemicals, Ltd., Japan) der 1 mM MgCl₃.6H₃O enthält, wurden 10 mg Alkaliphosphatase (Produkt von Boehringer) gelöst. Der Lösung wurden 20 mg Kaliumperjodat zugesetzt und 2 Stunden bei 37⁰C gerührt. Diese Lösung

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wurde auf eine Kolonne (1,5 χ 50 cm) von Sephadex G-25 (Produkt von Pharmacia) gegeben, die mit 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,5), der 1 mM MgCl₃.6H₃O enthielt, gepuffert war, und die Proteinfraktion wurde gesammelt. Der Proteinfraktion wurden 10 mg Kaninchen-Antihuman-Hämoglobin (Handelsprodukt von Dakopatts, Dänemark) zugegeben und die Mischung wurde bei 4⁰C 24 Stunden unter Rühren zur Reaktion gebracht. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne (1,5 χ 75 cm) von Sephadex G-200 (Produkt der Pharmacia) gegeben, die mit 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,5) der 1 mM MgCl-.6H_0 enthielt, gepuffert war, und die enzymgekennzeichnete Antikörperfraktion wurde gesammelt.

Beispiel 2

1. Probenahme:

Ein Probestab - wie in Figur 1 dargestellt - wurde in den zu untersuchenden Stuhl getaucht und herausgezogen. Dieser Vorgang wurde mit etwa zehn verschiedenen Anteilen der gleichen Stuhlprobe wiederholt. Es wurden verschiedene Stuhlproben, denen Hämoglobin in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben worden war, verwendet. Anschließend wurde jeder Probestab, an dem Hämoglobin adsorbiert war, mit destilliertem Wasser gewaschen, um Stuhlablagerungen zu entfernen, und leicht mit einem weichen Papier abgewischt.

2. Reaktion mit enzymgekennzeichneten'Antikörper:

Zu 1,0 ml einer physiologischen Puffersalzlösung (pH 7,3, enthaltend 1 mM MgCl₂.6H₃O), die 0,2 % Rinderalbuminserum enthielt, wurden 2 iig des wie in dem Vergleichsbeispiel hergestellten enzymgekennzeichneten

Ag

Antikörpers gegeben. Der Probestab wurde zur Reaktion für 15 Minuten bei 37⁰C in die Lösung eingetaucht. Danach wurde der Probestab herausgenommen und gut mit destilliertem Wasser gespült.
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3. Colorimetrische Reaktion:

Dann wurde der Probestab in 1,0 ml einer Substratlösung eingetaucht (hergestellt durch Auflösen von 0,215 g Phenylphosphat 2Na und 0,09 g 4-Aminoantipyrin in 0,05 M Carbonatpuffer des pH 10,5 zur Herstellung von 200 ml Lösung) zur Reaktion für 15 Minuten bei 37⁰C. Nach Herausnahme des Pröbestabes wurde die Lösung mit 1,0 ml einer Farbentwicklungslösung ver-

setzt (hergestellt durch Auflösung von 0,38 g Kaliumperjodat und 2,6 g Borsäure in 200 ml Wasser) für die colorimetrische Reaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach der Reaktion wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Die colorimetrische Reaktion wurde auf der Grundlage der Kind-King-Methode (J.Clin.Path. 2, 322-326, 1954) durchgeführt.

4. Ergebnis:

Die Ergebnisse sind in Figur 5 dargestellt, die die Beziehung zwischen den Extinktionswerten und den Hämoglobinkonzentrationen in den verschiedenen untersuchten Stuhlproben zeigt.

Beispiel 3

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurden Stuhlproben auf beiden Oberflächen des Probestabes gesammelt und Hämoglobin für einen Zeitraum von 30 Sekunden in Gegenwart von einer IM Citratlösung als Puffer auf beiden Oberflächen des Probestabes physikalisch adsorbiert.

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Nachdem der Probestab gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurde, wurde ein Reagens zur chemischen Bestimmung von verborgenem Blut, das o-Tolidinhydrochlorid und Wasserstoffperoxid in einer IM Acetatpufferlösung enthielt, tropfenweise auf eine Oberfläche gegeben. Nach Stehenlassen für etwa 10 Minuten wurde eine colorimetrische Reaktion (blau in diesem Fall) durchgeführt und mit dem bloßen Auge beurteilt. Als Ergebnis des Versuchs wurde festgestellt, daß ein positives Ergebnis bei der colorimetrischen Reaktion mit Hämoglobin von 1 mg/dl oder mehr erhalten wird.

Unmittelbar nach Beendigung der chemischen Bestimmung des verborgenen Blutes wurde die Rückseite des Probestabes umgedreht und ein Tropfen des in Beispiel 1 verwendeten enzym-gekennzeichneten Antikörper-Reagens wurde hierzu zugegeben. Die Probe wurde bei 20 bis 4O⁰C für 30 Minuten stehengelassen.
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Nachdem der Probestab gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurde, wurde die in Beispiel 1 verwendete Substratlösung tropfenweise auf die genannte rückseitige Oberfläche des Probestabes, d.h. die Oberfläche für die enzymatische Immunreaktion gegeben. Die colorimetrische Reaktion (gelb) wurde 5 Minuten danach bewertet.

Auch bei diesem Verfahren ist ein positives Ergebnis mit Hämoglobin-Konzentrationen von 0,5 mg/dl oder mehr klar zu erkennen; es wird festgestellt, daß bei hohen Konzentrationen die Farbbildung stark positiv ist über die gesamten Regionen von 30 0 mg/dl oder mehr oder die die Hämoglobin-Konzentration im gesamten Blut erreicht.

Bei verschiedenen Versuchen nach dieser Methode wurde Hämoglobin, das eine Verdauungsreaktion mit Pepsin und Trypsin durchlaufen hatte, zu dem Stuhl von normalen gesunden Personen (frei von Hämoglobin) gegeben, um die Reaktivität zu untersuchen. Die Reaktivität war positiv bei der chemischen Bestimmung von verborgenem Blut und negativ bei der enzymatischen Immunreaktion. Als nächstes wurde frisches Blut zu den gleichen Stuhlproben zugegeben, um die Farbbedingungen im Dickdarm bei 37 bis 40⁰C festzusetzen und hier wurde Hämoglobin festgestellt. Die Ergebnisse waren sowohl bei der chemischen Bestimmung von verborgenem Blut als auch bei der enzymatischen Immunreaktion positiv.

Somit wurde festgestellt, daß durch Bestimmung des Hämoglobins in Stuhlproben unter Verwendung der enzymatischen Immunreaktion zusammen mit der chemischen Bestimmung von verborgenem Blut auf eine Hämoglobinquelle entweder in dem oberen Teil oder in dem unteren Teil des Verdauungsorgansystems geschlossen werden kann.

Wie oben ausführlich beschrieben, können entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Hämoglobin-Bestimmung in Stuhl durch Adsorption des Hämoglobins in Stuhl an der Oberfläche des hochmolekularen Materials auf Basis einer enzymatischen Immunreaktion Nachteile der weithin verwendeten chemischen Bestimmung von verborgenem Blut in Stuhl gelöst werden, d.h. Nachteile sowohl bezüglich der Spezifität und, Sensitivität und die Handhabbarkeit kann extrem vereinfacht werden, ,.verglichen mit anderen Bestimmungsmethoden, die das Prinzip der konventionellen immunolo-

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gischen Reaktion verwenden, so daß die praktische Verwendung der Analyse auf Basis der immunologischen Reaktion wesentlich verbessert wird. Weiterhin ist vom klinischen Standpunkt die vorliegende Erfindung als screening Test zur Erkennung von Mast- und Dickdarmkrebs etc. von Nutzen, insbesondere im Frühstadium, da auch nur geringere gastrointestinale Blutungen erkannt werden können. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin vorteilhaft dadurch, daß der Arbeitsgang des Sammelns der Proben sauber ist durch Verwendung der Adsorption von Hämoglobin an das hochmolekulare Material.

Des weiteren kann durch Durchführung der enzymatischen Immunreaktion zusammen mit der chemischen Bestimmung von verborgenem Blut im Stuhl das verborgene Blut im Stuhl genauer und gleichzeitig bestimmt werden. Vom klinischen Standpunkt betrachtet, setzt das Verfahren in die Lage, auf den blutenden Teil in dem Gastrointestinal-Organ zu schließen. '

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Analyse von Hämoglobin in Stuhl, das die physikalische Adsorption des Hämoglobins im Stuhl an der Oberfläche eines aus einem hydrophoben hochmolekularen Material hergestellten Probestabes zur Abtrennung des Hämoglobins und die spezifische Hämoglobinbestimmung mit enzymgekennzeichnetem Antihuman-Hämoglobin umfasst.

2. Verfahren zur Analyse von Hämoglobin in Stuhl

nach Anspruch 1, bei dem zusätzlich zu der enzymatischen Immunreaktion zur Bestimmung des Hämoglobins eine chemische Bestimmung von verborgenem Blut durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das *"

hydrophobe hochmolekulare Material ausgewählt /

wird aus der Gruppe von Polystyrol, Polyvinyl- ¹^

Chlorid, Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat und Acrylharzen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Probestab einen probenehmenden Teil aufweist, der eine rauhe grobe Oberfläche oder feine Rillen aufweist.