FR2579757A1 - Procede de determination de l'hemoglobine dans les matieres fecales - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE DETERMINATION DE L'HEMOGLOBINE DANS LES MATIERES FECALES. ON PROVOQUE L'ADSORPTION PHYSIQUE DE L'HEMOGLOBINE, EVENTUELLEMENT PRESENTE DANS LES MATIERES FECALES A EXAMINER, A LA SURFACE 5, 6 D'UN BATONNET 1 D'ECHANTILLONNAGE, REALISE EN UNE MATIERE HYDROPHOBE A POIDS MOLECULAIRE ELEVE. APRES LAVAGE ET ETIQUETAGE 11 DU BATONNET, ON EFFECTUE UNE DETECTION, A L'AIDE D'HEMOGLOBINE ANTI-HUMAINE MARQUEE PAR UNE ENZYME, ET PAR UNE REACTION DE DETECTION CHIMIQUE. APPLICATION : DEPISTAGE, A UN STADE PRECOCE, D'UNE HEMORRAGIE DU COLON OU DU RECTUM (RISQUE DE CANCER).

Description

I

La présente invention concerne un procédé de déter-

mination qualitative, et éventuellement quantitative, de

l'hémoglobine dans les matières fécales et, plus particu-

lièrement, un procédé de détermination et/ou de dosage capable, sans exiger que les sujets ou patients suivent un régime particulier ou prennent un repas d'épreuve, d'indiquer la possibilité d'existence de régions pathologiques dans l'appareil digestif, et capable d'effectuer, de manière

simple, l'examen et/ou le dosage d'un grand nombre d'échan-

tillons, par exemple dans un cas d'examen ou de dépistage

intéressant un grand nombre de sujets.

On applique un procédé de dosage de l'hémoglobine (sang) dans les matières fécales afin de pouvoir déceler précocement des anomalies comme, par exemple, un (risque

de) cancer, d'ulcère, etc., dans l'appareil digestif.

Pour la détermination de l'hémoglobine dans les matières fécales, on a utilisé jusqu'à présent une détection chimique de sang ou hémorragieocculte dans les matières fécales. Au cours des récentes années, la fréquence du cancer du colon et du rectum a nettement augmenté dans les pays dits développés. Il y a eu en effet un rapprochement des habitudes alimentaires qui a abouti à une augmentation de

la fréquence d'apparition du cancer du colon et du rectum.

C'est pourquoi une détection chimique d'une hémorragie occul-

te, se manifestant par du sang dans les matières fécales,

a été conduite dans une large mesure en raison de sa simpli-

cité et de son faible prix de revient, à titre d'examen de dépistage en masse pour déceler à des stades précoces un cancer de colon ou de rectum. La détection chimique du sang occulte dans les matières fécales est très sensible, de sorte

qu'on peut déceler même une très faible quantité d'hémoglo-

bine. Cependant, la détection chimique antérieure du sang occulte dans les matières fécales n'a aucune spécificité à l'égard de l'hémoglobine humaine, puisque les tests se

fondent sur une réaction colorimétrique avec divers chromo-

gènes à base d'une activité de peroxydase contenue qans l'hémoglobine des érythrocytes. Donc, la réaction se produit

aussi bien avec des peroxydases d'une hémoglobine ou myoglo-

bine d'animaux qui ne sont pas des êtres humains qu'avec les peroxydases de végétaux contenant de la chlorophyle (chou brocoli, radis, chou-fleur, carotte, concombre, potiron, chou, etc.). En outre, les médicaments administrés (fer, cuivre,

iodure de potassium, vitamine C, etc.) influent sur les résul-

tats de ces dosages. Pour augmenter la spécificité à l'égard de l'hémoglobine humaine, les essais ou dosages se heurtent souvent au problème qu'un régime alimentaire

spécial, comme l'abstinence des plats de viande, etc., s'avè-

re nécessaire avant un examen. Dans l'actuel examen de masse, on évite une augmentation des résultats faussement positifs en imposant un régime alimentaire préalable et, en même temps, en utilisant une détection chimique du sang occulte, dans

laquelle on utilise un chromogène ayant une faible sensibi-

lité. Il en résulte cependant le risque inverse d'augmenter les résultats faussement négatifs (c'est-à-dire l'absence de détection d'hémoglobine bien que celle-ci soit réellement

présente).

En outre, lors de la détection chimique, selon l'art antérieur, du sang occulte dans les matières fécales, une hémorragie décelée peut être attribuée à une partie quelconque de l'ensemble de l'appareil digestif, de la cavité buccale jusqu'à l'anus, car aussi bien une hémoglobine de sang frais qu'une hémoglobine décomposée par les enzymes digestives présente une activité de peroxydase. Donc, on n'obtient pas' ainsi une information exacte concernant la région qui est à l'origine d'une hémorragie. Il est ainsi impossible de

satisfaire à la fois les exigences de spécificité et de sensi-

bilité pour bien prouver que l'hémorragie est à attribuer à la région inférieure ou terminale de l'appareil digestif,

et qu'il s'agit par exemple d'un cancer du colon ou du rectum.

Les déficiences décrites ci-dessus expliquent qu'un dépistage par examen de masse, par détection chimique du sang occulte dans les rmatières fécales, n'ait pas fait l'objet

d'une pratique biEn établie.

Or, un procédé de détection immunologique du sang occulte dans les matières fécales, en utilisant une réaction anticorps-antigène entre de l'hémoglobine humaine et de l'anti-hémoglobine humaine a récemiment été mis au point par Barrow et Col. (Am. J. Cli. Pathol., 69:342, 1978, mars). La détection immunologique du sang occulte dans les matières

fécales se fonde sur le fait que l'hémoglobine perd la plu-

part de son antigénicité sous l'action d'une enzyme diges-

tive, dans l'appareil digestif, de sorte que l'on obtient non seulement la spécificité à l'égard de l'hémoglobine humaine mais aussi que l'on peut déceler une hémorragie située dans la partie inférieure du circuit gastro-intestinal

et qui conserve son antigénicité.

Cependant, les procédés de dosagE' iii au point jus-

qu'à présent se fondent sur le principe cue la détection immunologique du sang occulte exige le préLèjement d'une quantité fixe de matière fécale, le mélange je cette matière à un milieu aqueux, puis la centrifugation du mélange pour

obtenir le liquide surnageant, que l'on utilise comme échan-

tillon. En outre, dans le procédé à une seule immunodiffu-

sion radiale (dans lequel on provoque la diffusion *d'un

échantillon dans un gel contenant de l'anticorps pour exa-

miner la réaction) et dans le procédé Ouchterlony (dans lequel on injecte de l'anticorps et un échantillon dans un

gel, à des intervalles fixes, tous deux diffusent pour réa-

gir l'un avec l'autre, et l'on examine la réaction), il faut une période de temps relativement longue, par exemple de 24 à 48 heures, pour pouvoir bien juger les résultats. De plus, le procédé de contre-immunoélectrophorèse (dans lequel

on mesure sur un support, en appliquant un courant électri-

que, le produit de la réaction entre un échantillon et un anticorps) a pour inconvénients d'exiger des équipements

spéciaux pour l'analyse et, donc, ce procédé n'est pas par-

venu à être largement utilisé. En outre, ces procédés ne conviennent pas pour un examen de dépistage en masse, qui

suppose la manutention d'un grand nombre d'échantillons.

Pour appliquer cet essai à un examen en masse, il

est nécessaire de prélever une quantité fixe d'un grand nom-

bre d'échantillons de matières fécales, respectivement, de les convoyer vers une pièce d'analyse dans laquelle on les

traite, ces échantillons comportant un élément d'identifica-

tion (ID). Ce mode opératoire implique aussi un inconvénient déplaisant pour la personne effectuant les opérations, par suite de l'odeur peu agréable, du caractère malpropre de certaines manipulations, etc. C'est pourquoi la Demanderesse a effectué des études poussées sur un procédé de dépistage, par examen en masse, d'une hémorragie gastro-intestinale pouvant être un signe de cancer de colon ou du rectum, pour tenter de surmonter les inconvénients précités, associé à la détection chimique antérieure du sang occulte dans les matières fécales et de l'essai de détermination'immunologique de ce sang occulte

dans les matières fécales. On a pu ainsi trouver que l'hémo-

globine des matières fécales peut facilement subir une adsorption physique sur la surface d'une matière à poids

moléculaire élevé, en particulier une résine de matière plas-

tique hydrophobe. En utilisant ce phénomène, il a été possi-

ble de séparer, facilement et avec succès, l'hémoglobine de matière fécale qui s'adsorbe à la surface d'un article en résine de matière plastique (par exemple un bâtonnet

d'échantillonnage). Il a également été trouvé que l'hémoglo-

bine ainsi adsorbée physiquement peut servir pour un dosage immunoenzymatique en vue de déceler l'hémoglobine humaine dans les matières fécales, en utilisant de l'anti-hémoglobine humaine marquée par une enzyme, ce qui permet de déceler, avec une sensibilité élevée, seulement de l'hémoglobine

humaine.

Ainsi, la présente invention fournit un procédé pour déceler de l'hémoglobine dans des matières fécales, selon lequel on provoque une adsorption physique de l'hémoglobine

des matières fécales sur la surface d'un bâtonnet d'échan-

tillonnage réalisé en une matière hydrophobe à poids molécu-

laire élevé, afin de séparer l'hémoglobine des matières

fécales, et de déceler spécifiquement l'hémoglobine en uti-

lisant une anti-hémoglobine humaine marquée par une enzyme.

L'une des caractéristiques importantes de la présente

invention est donc l'utilisation d'un bâtonnet d'échantil-

lonnage réalisé en une matière hydrophobe à poids molécu-

laire élevé. Des exemples de telles matières à poids molé- culaire élevé sont du polystyrène, du chlorure de polyvinyle, du polyéthylène, du polypropylène, du polycarbonate, des résines acryliques, etc., parmi lesquelles le polystyrène

est particulièrement intéressant.

Pour mettre en oeuvre le procédé de la présente invention, on met le bâtonnet d'échantillonnage en contact avec les matières fécales à examiner, de façon à provoquer l'adsorption physique de l'hémoglobine des matières fécales

sur la surface du bâtonnet d'échantillonnage. Ainsi, de pré-

férence, on lave ce bâtonnet à l'eau pour enlever les

matières fécales. Puis l'on soumet l'échantillon (hémoglo-

bine) fixé par adsorption sur le bâtonnet à une réaction

anticorps-antigène en utilisant de l'anti-hémoglobine humai-

ne marquée par de l'enzyme et une réaction colorimétrique

subséquente pour déterminer l'hémoglobine.

On peut conduire ces réactions sur le bâtonnet d'échantillonnage lui-même ou dans un récipient séparé pour la réaction. Ainsi, on immerge le bâtonnet d'échantillonnage, comportant l'hémoglobine fixée par adsorption physique, dans une solution d'anticorps marquée par une enzyme, ou bien on ajoute goutte à goutte une telle solution sur ce bâtonnet, pour conduire la réaction antigène-anticorps sur le bâtonnet

d'échantillonnage. Puis l'on immerge le bâtonnet d'échantil-

lonnage, comportant l'hémoglobine qui a réagi avec l'anti-

corps marqué par de l'enzyme, dans une solution contenant un substrat pour le développement d'une couleur, ou bien on ajoute une telle solution sur ce bâtonnet, pour réaliser

une réaction colorimétrique. On peut ainsi déceler spécifi-

quement, par une méthode colorimétrique, l'hémoglobine

humaine dans les matières fécales.

Les réac:ions immuno-enzymatiques sont bien connues en pratique. Poutrouver des renseignements généraux à ce sujet, on peut se référer, par exemple, à des brevets tels que le brevet US-A-4 016 043. On connaiît également bien en pratique la réaction calorimétrique pour un dosage de ce genre, et l'on peut citer par exemple le procédé Kind-King (J. Clin. Path. 7 322-326, 1954). Si on le désire, on peut, en plus d'un procédé de réactin immunoenzymatique, conduire également un procédé de détection chimique classique de l'hémoglobine physiquement adsorbée sur le bâtonnet d'échantillonnage. Quand on effectue une telle détection chimique (détection chimique du sang

occulte dans les matières fécales), en plus d'un dosage immu-

no-enzymatique, on peut assurer de manière plus précise la détection de l'hémoglobine dans les matières fécales et, en même temps, il devient possible d'émettre une supposition fondée sur la position de la partie de l'appareil digestif

qui est le siège d'une hémorragie parce que la détection chi-

mique, selon l'art antérieur, du sang occulte dans les matières

fécales peut également s'appliquer à l'hémoglobine physique-

ment adsorbée à la surface de la matière hydrophobe à poids moléculaire élevé. Quand on conduit une détection chimique du sang occulte dans les matières fécales, avec séparation, par adsorption, de l'hémoglobine sur une matière hydrophobe à poids moléculaire élevé, on élimine les interférences dues à des peroxydases végétales et à des médicaments chimiques mais l'on décèle, comme dans l'art antérieur, l'hémoglobine ou la myoglobine d'origine animale (due par exemple à une

ingestion de chair ou de viande).

Lorsque l'on prévoit d'appliquer un tel procédé de détection chimique, il vaut mieux utiliser un tampon acide lors de l'adsorption de l'hémoglobine à la surface d'un bâtonnet d'échantillonnage, car ce tampon acide aura pour effet de modifier la structure chimique de l'hémoglobine de

manière à permettre une adsorption plus facile de cette hémo-

globine à la surface d'une matière hydrophobe à poids molécu-

laire élevé. Ainsi, par exemple, on immerge le bâtonnet d'échantillonnace, avec les matières fécales qu'il porte, dans un tampon Ecide, ou bien on applique ce tampon acide sur le bâtonnet, de façon à provoquer avec plus de certitude

l'adsorption physique de l'hémoglobine, dans un large inter-

valle de concentration, à la surface du bâtonnet d'échantil-

lonnage. Donc, quand on utilise un. tel procédé de détection chimique, il devient possible d'effectuer une détection de

l'hémoglobine, même quand elle est présente à faible concen-

tration dans les matières fécales. Cependant, quand elle

est soumise à l'action d'un tampon acide, l'hémoglobine ris-

que de perdre sa structure ou configuration stéréochimique,

de sorte qu'il vaut mieux parfois ne pas appliquer ce trai-

tement acide quand on prévoit d'effectuer une réaction immu-

no-enzymatique.

La détection chimique de l'hémoglobine (ou la détec-

tion chimique du sang occulte dans les matières fécales) est bien connue en pratique. Pour obtenir des détails à ce sujet, on peut se référer, par exemple, à "Rinsho Kensa",

vol. 7, n 2, pages 70-71 (1963).

L'invention sera maintenant décrite plus en détail, à titre illustratif et nullement limitatif, en regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 est une vue de face d'un bâtonnet d'échantillonnage pouvant servir dans la présente invention, la figure 2 est une vue latérale de ce bâtonnet d'échantillonnage,

la figure 3 est une coupe, le long de la ligne A-

A, de la figure 1,

la figure 4 est une vue de face d'un récipient pou-

vant servir en association avec le bâtonnet d'échantillon-

nage, et la figure 5 est un graphique montrant la relation entre la concen:ration de l'hémoglobine (en milligrammes

pour cent grammms de matières fécales) dans diverses matiè-

res fécales essayées, en abscisses, et le poivoir d'absorp-

tion,; ou absorptance,à 492 nm (en ordonnées), que l'on obtient

dans le cas du procédé de détection selon la présente inven-

tion. Pour mettre en oeuvre le procédé de la présente invention, on peut utiliser un bâtonnet d'échantillonnage (réalisé en une matière hydrophobe à poids moléculaire élevé)

ayant n'importe quelle forme ou structure appropriée et com-

portant notamment une surface de prélèvement d'échantillon

pouvant entrer en contact avec les matières fécales à exami-

ner afin de provoquer une adsorption physique, sur cette sur-

face, de l'hémoglobine présente dans les matières fécales.

Un exemple d'un dispositif d'échantillonnage est représenté

sur les figures 1 à 4. On voit sur ces figures que le dispo-

sitif comprend un bâtonnet 1 d'échantillonnage et un réci-

pient 8 destiné à loger un liquide. Le bâtonret 1 comporte un corps 3 dans lequel est ménagée une caviti 7 présentant un filetage interne, le bâtonnet comportant Lne poignée plate

2 sur laquelle on peut appliquer une étiquette 11 d'identifi-

cation du sujet ou du patient. Une tige 4 pait du fond de la cavité 7, s'étend vers l'extérieur et Comporte à une

extrémité une partie 5 destinée à un prélèvement d'échantil-

lon. Il vaut mieux que la partie 5 comporte une surface rugueuse, dans laquelle sont éventuellement ménagées de fines gorges 6, de préférence en réseau, de manière à augmenter la surface de contact avec les matières fécales ou à garantir la rétention de l'échantillon sur cette zone ou la rétention de n'importe quel liquide de traitement que l'on ajoute à

l'échantillon. Il vaut en outre mieux que la partie 5 de pré-

lèvement d'échantillon ait une forme telle, ou soit aplatie de manière, que les deux surfaces puissent servir pour l'échantillonnage. Quand une réaction calorimétrique doit être effectuée sur le bâtonnet d'échantillonnage lui-même, il vaut mieux que ce bâtonnet soit en une matière blanche

afin de faciliter l'examen du résultat dE la réaction colori-

métrique. La structure du bâtonnet d'échantillonnage n'est

pas limitée à celle représentée sur les figures, et ce bâton-

net peut avoir une forme analogue à celle d'une cuiller à un de ses bords ou bien il peut avoir une structure dans laquelle les matières fécales ne sont collectées que sur une

surface du bâtonnet.

Si on le désire, le bâtonnet I d'échantillonnage peut être associé à un récipient 8 cylindrique comportant un filetage 9 pouvant venir en prise avec le filetage interne de la cavité 7 du bâtonnet 1. Le récipient 8 contient un milieu aqueux (par exemple de l'eau désionisée, une solution tampon dans de l'eau distillée, etc.), ce qui permet d'y

conduire la réaction antigène-anticorps effectuée sur l'hémo-

globine adsorbée et/ou la réaction de coloration.

Pour appliquer le procédé de l'invention en utilisant un dispositif tel que celui représenté sur les figures I à 4, on collecte sur la ou les surfaces d'un bâtonnet d'échantillonnage, par exemple comme représenté sur les

figures I à 3, les matières fécales du sujet ou patient.

Puis l'on insèrE le bâtonnet I d'échantillonnage dans le récipient 8, de manière que la partie 5 du bâtonnet, sur laquelle se trouvent les matières fécales, soit immergée

dans le milieu aqueux présent dans le récipient 8. Le bâton-

net I d'échantillonnage et le récipient 8 peuvent être fixés ensemble à l'aide des filets 7 et 9. Avant d'insérer le bâtonnet I d'échantillonnage dans le récipient 8, on peut

appliquer une étiquette 11 d'identification à la poignée 2.

On peut provoquer l'adsorption physique de l'hémo-

globine des matières fécales échantillonnées en laissant le bâtonnet d'échantillonnage, portant les matières fécales, reposer pendant une période appropriée de temps, par exemple

plusieurs secondes à plusieurs minutes, de préférence envi-

ron 1 minute. De préférence, on conduit l'opération d'adsorp-

tion en présence d'un milieu aqueux, par exemple dans le récipient 8, comme expliqué ci-dessus. Puis l'on retire le bâtonnet d'échantillonnage et on lave à l'eau distilléeoou

désionisée la partie de prélèvement d'échantillon.

Selon le procédé, par exemple, on prélève la matière fécale et l'on assemble le bâtonnet d'échantillonnage avec le récipient puis on laisse cet assemblage reposer dans une pièce appropriée, par exemple des toilettes. On démonte ensuite le récipient, au bout d'une période fixe de temps, et le bâtonnet d échantillonnage peut être transporté seul à titre d'échantillon, vers un endroit o est effectué un dosage subséquent. Ainsi, seule l'hémoglobine est adsorbée sur le bâtonnet d'échantillonnage, qui est alors dépourvu

d'odeurs déplaisantes ou de saletés, ce qui évite à l'opéra-

teur des sensations déplaisantes et rend facile la collecte

et le transport.

Le bâtonnet d'échantillonnage, portant l'hémoglobine

adsorbée, peut être ensuite soumis à un dosage immuno-enzy-

matique et à une détermination ou mesure de l'hémoglobine

humaine. Ces procédés sont connus en eux-mêmes, comme men-

tionné ci-dessus, et l'on peut donc ne présenter qu'une

brève explication, ci-après, pour donner des exemples typi-

ques. A. Préparation du réactif pour dosage immuno-enzymatique: (1) Préparation de l'hémoglobine Aa: On prépare l'hémoglobine A0 à partir de sang humain,

selon, par exemple, la méthode de Williams et col. (Anal.

- Biochem.,54:137, 1973).

(2) Préparation d'hémoglobine anti-humaine (anti-

hémoglobine humaine): On mélange de l'hémoglobine Ao purifiée avec de l'adjuvant complet de Freund et l'on immunise, à l'aide du mélange, des animaux comme des lapins, des chèvres, etc. On collecte le sang sur l'animal immunisé et l'on centrifuge

ce sang pour obtenir de l'anti-sérum. De l'hémoglobine anti-

humaine de lapin est disponible dans le commerce (on peut citer par exemple le produit de Dakopatts, Danemark) et ce

produit sert pour un marquage par enzyme.

(3) Marquage par de l'enzyme: L'anti-sérum est marqué par de l'enzyme selon, par exemple, la méthode de Yoshitake et col. (Immunological Experimental Method XI, pages 3497-3519, 1982, publiée par

The Society of Immunology, Japon), pour pré3arer de l'anti-

corps marqué par de l'enzyme. Dans ce cas, on peut utiliser diverses enzymes comme de la peroxydase, de la phosphatase alcaline, etc.

B. Procédé: -

(1) On lave de façon poussée, à l'eau désionisée ou distillée, la surface d'un bâtonnet d'échantillonnage sur laquelle de l'hémoglobine s'est fixée par adsorption physique.

(2) Après avoi-r ajouté goutte à goutte, sur la sur-

face du bâtonnet d'échantillonnage, le réactif à l'anticorps marqué par une enzyme, ou après avoir immergé ce-bâtonnet d'échantillonnage dans la solution du réactif à l'anticorps

marqué par de l'enzyme, on laisse le tout reposer, par exem-

ple à 20 jusqu'à 40 0 durant 15 à 30 minutes, pour que puis-

se produire une réaction antigène-anticorps.

(3) On lave ensuite de façon poussée, à l'eau désio-

nisée ou distillée, le bâtonnet d'échantillonnage, on lui applique goutte à goutte une solution de substrat (solution pour réaction calorimétrique) contenant, par exemple, de l'acide p-nitrophénylphosphorique ou de la 4aminoantipyrine, ou bien on immerge le bâtonnet d'échantillonnage dans une telle solution de substrat, pour effectuer une réaction colorimétrique. (4) Après achèvement de la réaction colorimétrique,

on observe et cote ou juge le degré de formation de couleur.

On peut ainsi, par application du procédé, soumettre une grande quantité d'échantillons à une détection dont le

résultat est obtenu en une heure environ.

Le dosage de l'hémoglobine dans des matières fécales, en se fondant sur un procédé de dosage immuno-enzymatique, a été décrit ci-dessus. Quand, en plus du procédé ci-dessus, on veut réaliser une détection chimique de sang occulte, on peut déceler de manière encore plus précise l'hémoglobine dans les matières fécales. Il vaut alors mieux utiliser un bâtonnet 1 d'échantillonnage, tel que représenté sur les figures 1 à 3, et utiliser une surface de 3la partie 5 de prélèvement d'échantillon pour le dosage immunoenzymatique

et l'autre surface pour la détection chimicue.

L'invention sera maintenant expliqLée plus en détail, à l'aide des exemples suivants fournis à tltre illustratif

et nullement limitatif de l'invention.

EXEMPLE 1

On administre à un lapin, une fois par semaine, une injection d'immunisation, comportant 0,5 mg d'antigène

(hémoglobine A purifiée) mélangé à 2,5 ml d'adjuvant com-

o

plet de Freund. On répète cinq fois cette injection d'immu-

nisation. Le cinquième jour suivant l'injection finale, on collecte du sang sur le lapin, on centrifuge ce sang pour

obtenir de l'anti-sérum (anti-hémoglobine humaine ou hémo-

globine anti-humaine) et l'on conserve ce sang à l'état

congelé à -80OC.

On prépare ensuite, avec de l'hémoglobine anti-

humaine, obtenue comme décrit ci-dessus et une phosphatase alcaline, de l'hémoglobine anti-humaine marquée par de la phosphatase alcaline(et qui contient 0,2 % d'albumine de bovin et 0,5 mM de chlorure de magnésium), pour constituer

un réactif qui est de l'anticorps marqué par de l'enzyme.

On provoque une adsorption d'hémoglobine, sur un bâtonnet d'échantillonnage tel que celui représenté sur les figures I à 3, en mettant ce bâtonnet en contact, durant

I minute, avec des matières fécales contenant de l'hémo-

globine.On lave ensuite de façon poussée, à l'eau désionisée, le bâtonnet d'échantillonnage que l'on transfère dans un petit tube à essai dans lequel on a placé 0,3 ml de réactif à l'anticorps mErqué par de l'enzyme. On effectue à 37 C, durant 30 minutes, la réaction antigène-anticorps. Puis on lave à l'eau déEsionisée le bâtonnet d'échantillonnage et on le place dans un petit tube à essai contenant 0,5 ml d'une solution de substrat à la diéthanolamine (pH 10,5) contenant 40 mM d'acide pnitrophénylphosphorique et 0,5 mM de chlorLre de magnésium. On fait incuber à 37C durant 5 à 10 minutes, on ajoute ensuite 0,5 ml de NaOH 1N

pour arrêter la réaction.

On observe, et juge à l'oeil nu, le degré de for-

mation de couleur (du jaune dans ce cas).

L'examen de divers échantillons a permis de noter que ceux montrant une concentration d'hémoglobine égale ou supérieure à 0,5 mg/dl sont nettement discernables comme étant positifs et, pour une concentration élevée, il se

produit une formation de couleur, donnant une réaction forte-

ment positive, pour une concentration égale ou supérieure à 300 mg/dl, ou pour la région atteignant la concentration

en hémoglobine du sang entier.

EXEMPLE DE REFERENCE

Dans I ml de tampon "Bicine" (pH 8,5; produit fabriqué par Nakarai Chemicals, Ltd., Japon), contenant 1 mM de MgC12.6 H20, on dissout 10 mg de phosphatase alcaline (produit proposé par Boehlinger). On ajoute à la solution mg de periodate de potassium et l'on agite durant 2 heures à 37C. On fait passer cette solution sur une colonne (1,5 x 50 cm) de "Sephadex G-25" (produit fabriqué par

Pharmacia), tamponnée (mise en équilibre) à j'aide d'un tam-

pon de carbonate 0,1 M (pH 9,5) contenant 1 nM de MgCl2.6H20, et l'on collecte la fraction contenant la prttéine. A la

fraction protéin.que, on ajoute 10 mg d'h'éoclobine anti-

humaine de lapin (produit mis dans le comnErte par Dakopatts, Danemark) et l'on fait réagir sous agitation le mélange à 4 C durant 24 heures. On fait passer la sjlution résultante sur une colonne (1,5 x 75 cm) de "Sephadex G--200" (produit offert par Pharmacia), tamponnée ou mise no équilibre avec du tampon de carbonate 0,1M (pH 9,5) contenant lmM de MgG12.6H20, et 1 on collecte la fraction d'anticorps marquée

par l'enzyme.

EXEMPLE 2

1. Echantillonnage:

On insère un bâton d'échantillonnage, tel que repré-

senté sur la figure 1, dans des matières fécales à examiner et l'on retire ensuite le bâton. On répète l'opération en dix endroits différents,environ, du même échantillon de

matières fécales. Pour tracer et vérifier une courbe, on uti-

lise différentes matières fécales-échantillons auxquelles

on a ajouté de l'hémoglobine en différentes concentrations.

On lave ensuite à l'eau distillée chaque bâtonnet d'échantil-

lonnage, sur lecuel l'hémoglobine s'est fixée par adsorption, pour enlever pai Lavage les matières fécales déposées, et l'on essuie légirement le bâtonnet avec un papier de soie mou.

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2. Réaction avec de l'anticorps marqué par de l'enzyme: Dans 1,0 ml d'une solution physiologique saline tamponnée (pH 7,3, contenant I mM de MgCl2. 6H20) et contenant

0,2 % de sérum-albumine de bovin, on ajqute 2 pg de l'anti-

corps marqué par de l'enzyme, tel que préparé dans l'exemple

de référence. On immerge, durant 15 minutes à 37'C, le bâton-

net d'échantillonnage dans la solution, pour provoquer une réaction. Puis l'on retire le bâtonnet d'échantillonnage et

on le lave bien à l'eau distillée.

* 3. Réaction colorimétrique: On immerge ensuite le bâtonnet d'écFantillonnage dans 1,0 ml d'une solution de substrat (que]'on prépare par dissolution de 0,215 g de phényl phosphate dE sodium et de 0,09 g de 4-aminoantiyrine dans du tampon de carbonate 0,05 M à pH 10,5, de manière à obtenir 200 ml de solution) durant 15 minutes à 37 C pour provoquer une réaction. On retire le bâtonnet et l'on ajoute à la solution 1,0 ml d'une solution de développement de couleur (préparée en dissolvant 0,38 g de periodate de potassium et 2,6 g d'acide borique dans 200 ml d'eau) pour une réaction colorimétrique à la température ambiante durant 10 minutes. Après la réaction, on mesure l'absorptance à 492 nm. On conduit la réactiqn colorimétrique

en se fondant sur la méthode de Kind-King (J. Clin. Path.

7 322-326, 1954).

4. Résultat: - On a reporté sur la figure 5 annexée les résultats obtenus. Cette figure montre la relation entre le coefficient

d'absorption ou pbsorptance à 492 nm (en ordonnées) et la con-

centration de l'hémoglobine (en milligrammes pour cent grammes de matières fécales), en abscisses, dans les Jiverses matières

fécales soumises à des essais.

EXEMPLE 3

De la même façon qu'à l'exemple 1, an collecte des

matières fécales sur les deux surfaces d'ui bâtonnet d'échan-

tillonnage et l'on provoque l'adsorption pnhysique, sur les deux surfaces du bâtonnet d'échantillonnage, de l'hémoglobine pendant une période de 30 secondes en présence d'une solution

1M de citrate à titre de solution tampon.

Après lavage poussé, à l'eau désionisée, du bâtonnet

d'échantillonnage, on applique goutte à goutte sur une sur-

face un réactif, contenant du chlorhydrate d'ortho-tolidine et du peroxyde d'hydrogène dans une solution tampon d'acétate 1M, pour la détection chimique du sang occulte. On laisse

reposer environ 10 minutes, ce qui provque une réaction colo-

rimétrique (bleue dans ce cas) et l'on en juge le résultat

à l'oeil nu. Il résulte de l'expérience que l'on note l'obten-

tion d'un résultat positif, dans la réaction colorimétrique, quand l'hémoglobine est présente en une concentration égale

ou supérieure à I mg/dl.

Immédiatement après achèvement de la détection

chimique du sang occulte, on retourne le bâtonnet d'échantil-

lonnage et l'on applique sur l'ancienne surface arrière,

devenue surface supérieure, une goutte du réactif à l'anti-

corps marqué par une enzyme, que l'on a utilisé à l'exemple 1. On laisse l'échantillon reposer durant 30 minutes à 20

à 40 C.

Après avoir lavé de façon poussée à l'eau désionisée le bâtonnet d'échantillonnage, on applique goutte à 'goutte,

sur l'ancienne surface arrière de ce bâtonnet, devenue sur-

face supérieure, c'est-à-dire la surface destinée à la réac-

tion immuno-enzymatique, une solution de substrat, utilisée

à l'exemple 1. On évalue 5 minutes après la réaction colori-

métrique (jaune).

Dans ce procédé également, on peut nettement déceler un résultat positif quand la concentration de l'hémoglobine

est égale ou supérieure à 0,5 mg/dl. On note que la forma-

tion de couleur est fortement positive aux concentrations élevées, dans la totalité de la région des concentrations égales ou supérieures à 300 mg/dl, ou quand in atteint la

concentration de l'hémoglobine dans le sang entier.

Dans diverses expériences de mise ei oeuvre de ce procédé, on incorpore à des matières fécales provenant de personnes normales et en bonne santé (ma:ièxes dépourvues d'hémoglobine) c.e l'hémoglobine qui a suui Lne réaction de digestion par de la pepsine et de la trypsine, pour examiner

la réactivité. On observe un résultat positif, donc une réac-

tivité positive, dans la détection chimique du sang occulte,

et un résultat négatif dans la réaction immuno-enzymatique.

On incorpore ensuite, aux mêmes matières fécales, du sang frais pour établir les conditions de coloration dans le cas

d'un séjour dans le colon à 37 à 40OC, et l'on décèle l'hémo-

globine dans ces matières fécales. Les résultats sont posi-

tifs aussi bien pour la détection chimique du sang occulte

que pour la réaction immunoenzymatique.

On voit donc bien qu'en décelant, à l'aide d'une réaction immunoenzymatique ainsi que par une détection chimique du sang occulte, de l'hémoglobine dans les matières fécales, on peut obtenir une indication précieuse permettant de supposer l'existence d'une source d'hémoglobine, due à

un saignement, dans la partie supérieure ou la partie infé-

rieure du tube digestif.

Comme décrit en détail ci-dessus, le procédé proposé pour la détermination et le dosage de l'hémoglobine dans des matières fécales, par adsorption de l'hémoglobine des

matières fécales à la surface d'une matière à poids molécu-

laire élevé de l.a présente invention et réaction immuno-

enzymatique, pe:rmet d'éliminer les inconvénients? à savoir les difficultés tenant à la spécificité et à la sensibilité, de la détection chimique, largement utilisée dans le passé pour trouver du sang occulte dans les matières fécales, et

l'on peut extrêmement simplifier la mise en oeuvre en compa-

raison d'autres procédés de dosage utilisan: le principe

d'une réaction immunologique classique, ce qui permet d'amé-

liorer grandement l'utilisation en pratique du dosage à base d'une réaction immunologique. D'un point de vue clinique, la présente invention est utile, notamment ?n raison de l'augmentation récente des cas constatés, Fpur effectuer un essai de dépistage en vue de déceler à Eon stade précoce un cancer du cclon ou du rectum, ou un;roLble analogue, puisque ce dosE.ge ne permet de déceler mne hémorragie que

dans la partie inférieure de l'appareil cirestif. La pré-

sente invention est également avantageuse du fait que l'opé-

ration de collecte d'échantillons est nette et proprecar l'on utilise l'adsorption de l'hémoglobine sur une matière à poids moléculaire élevé. J De plus, en effectuant une réaction immunoenzymati- que ainsi qu'une détection chimique du sang occulte des matières fécales, on peut plus précisément déceler ce sang occulte des matières fécales et, en même temps, on peut, en cas de résultat positif dans l'essai, mieux situer la partie du tube digestif dans laquelle une hémorragie est supposée

se produire, ce qui est important du point de vue clinique.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'inven-

tion, de nombreuses modifications peuvent être apportées aux détails décrits et représentés, du procédé de détection de

l'hémoglobine dans des matières fécales.

257975;

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour déterminer l'hémoglobine dans des

matières fécales, caractérisé en ce qu'on provoque l'adsorp-

tion physique de l'hémoglobine des matières fécales sur la surface (5,6) d'un bâtonnet (1) d'échantillonnage réalisé en une matière hydrophobe à poids moléculaire élevé, afin de séparer l'hémbglobine des matières fécales et de déceler

spécifiquement l'hémoglobine à l'aide d'une hémoglobine anti-

humaine marquée par une enzyme.

2. Procédé de détermination de l'hémoglobine dans les matières fécales selon la revendication 1, caractérisé en ce que, en plus de la réaction immuno-enzymatique de

détection de l'hémoglobine, on conduit une réaction de détec-

tion chimique du sang occulte.

-15

3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2,

caractérisé en ce que la matière hydrophobe à poids molécu-

laire élevé est choisie parmi du polystyrène, du chlorure

de polyvinyle,-du polyéthylène, du polypropylène, du polycar-

bonate et-des résines acryliques.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications

précédentes, caractérisé en ce que le bâtonnet (1) d'échan-

tillonnage comporte une partie (5) de prélèvement d'échantil-

lon possédant une surface rugueuse ou comportant de fines

gorges (6).