FR2460482A1 - Composition et procede de titrage de l'erythropoietine humaine - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LE TITRAGE DE L'ERYTHROPOIETINE HUMAINE. ELLE SE RAPPORTE A UNE COMPOSITION DE TITRAGE DE L'ERYTHROPOIETINE HUMAINE, COMPRENANT ESSENTIELLEMENT DES PARTICULES DE LATEX POLYMERE SYNTHETIQUE ET DE L'ERYTHROPOIETINE HUMAINE REVETANT LES SURFACES DES PARTICULES DE LATEX. LA PRESENCE DE L'ERYTHROPOIETINE HUMAINE DANS L'URINE OU LE SERUM EST DETERMINEE PAR MICROTITRAGE. APPLICATION AU DIAGNOSTIC ET AU TRAITEMENT DES ANEMIES.

Description

La présente invention concerne une composition et un procédé de titrage de

I'érythropolétine humaine,

ainsi qu'un procédé de préparation d'une telle composi-

tion. Plus précisément, l'invention concerne une composition de titrage de l'érythropolétine humaine

dont l'utilisation, contrairement aux analyses biolo-

giques extrêmement compliquées, longues et conteuses

qu'on a utilisées jusqu'à présent, rend possible la déter-

mination (aussi bien quantitative que qualitative)

précise et exacte de l'érythropolétine humaine con-

tenue dans un échantillon d'une humeur, par une ana-

lyse simple mettant en oeuvre un instrument simple.

En outre, l'invention rend possible une analyse étio-

logique précise de patients anémiés ainsi que l'éva-

luation des résultats de traitements thérapeutiques

administrés et la détermination d'un pronostic concer-

nant l'évolution de la maladie. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de cette composition,

et un procédé de titrage de l'érythropolétine humaine.

Plus précisément, l'invention concerne une composition de titrage de l'érythropolétine humaine, comprenant essentiellement des particules d'un latex polymère de synthèse, de préférence de particules d'un latex d'un polymère styrénique de synthèse choisi dans le groupe qui comprend les polymères du styrène, les copolymères du styrène et les produits carboxyles de ces polymères et copolymères, contenant des groupes amino ou non; l'invention concerne aussi un procédé de préparation de cette composition et un procédé de

titrage par mise en oeuvre de cette composition.

La durée de vie des érythrocytes humains est d'environ 120 jours, et 1/120ième de la quantité totale d'érythrocytes est détruit chaque jour dans le système réticulo-endothélial. Simultanément, un même nombre d'érythrocytes est produit afin que le nombre

total reste toujours constant.

Les érythrocytes sont formés par développement et. différenciation des érythroblastes dans la moelle des os, et l'érythropolétine est un facteur qui, par son action sur les cellules souches non différenciées, induit leur différenciation en érythrocytes. La sécré-

tion de l'érythropolétine s'accélère lorsque la pres-

sion partielle de l'oxygène diminue dans les tissus du corps. Ainsi, l'érythropolétine est une hormone des humeurs qui règle le nombre d'érythrocytes produits

dans la moelle des os.

Dans le cas des mammifères, la totalité ou la plus grande partie de cette érythropolétine est formée dans le rein par une glucoprotéine contenant de l'acide sialique dont le poids moléculaire est estimé entre

environ 27 000 et 66 000.

Les affections dans lesquelles le nombre d'érythrocytes humains diminue, c'est-à-dire les anémies,

peuvent être classées sommairement en trois types princi-

paux au point de vue étiologique. Le premier type corres-

pond au fait que les cellules souches qui constituent l'origine des érythrocytes, sont anormales, si bien que

les érythrocytes ne peuvertpas être formés malgré l'ap-

titude normale de l'érythropolétine à provoquer leur production, et il s'agit d'une anémie aplastique. Cette

anomalie des cellules souches peut encore être subdi-

visée selon qu'elle correspond à l'hypoplasie des moelles des os, à une anomalie de la moelle des os elle-même, à une imperfection des sites auxquels les érythrocytes prolifèrent, ou à un déclin de la réactivité vis-à-vis

de l'érythropolétine. Dans le cas des affections ané-

miques de ce type, le mécanisme du corps qui a tendance à accroître le nombre d'érythrocytes entre en jeu, si bien que la quantité d'érythropolétine prend une valeur extrêmement ou anormalement élevée. Le second type d'anémie est celui des insuffisances rénales chroniques, c'est-à-dire une anémie des affections rénales. Dans ce cas, comme il s'agit d'une affection organique des reins qui produisent l'érythropolétine, celle-ci ne peut pas se former, bien que les cellules souches puissent être normales. En conséquence, le nombre des érythrocytes ne peut pas croître et une anémie apparaît. Dans ce cas, l'humeur ne contient qu'une faible concentration d'éry- thropolétine. Le troisième type d'anémie est celui dans lequel les cellules souches et l'aptitude à la formation d'érythropolétine sont normales, la condition d'anémie devant être attribuée à une déficience en fer, à une hémorragie, à une déficience en vitamine B12, à une hémolyse due à une auto-immunité, etc. Dans ce cas, la

quantité d'érythropolétine a une valeur élevée et pré-

sente une corrélation négative avec la quantité d'hémo-

globine,

Bien que l'anémie elle-même puisse être faci-

lement diagnostiquée par comptage du nombre réel d'éry-

throcytes, par mesure du volume des hématies à l'aide de l'hématocrite ou par mesure de l'hémoglobine, il est

extrêmement important pour l'établissement du déroule-

ment du traitement et pour un pronostic de la maladie que la cause de la condition d'anémie soit diagnostiquée, que cette cause soit une anomalie des cellules souches, une production insuffisante d'érythropolétine provoquée par des affections rénales, ou autre que celles qu'on a citées. Le titrage de l'érythropolétine dans l'humeur

est encore indispensable à cet effet.

Jusqu'à présent, le procédé de titrage utilisé mettait en oeuvre une analyse biologique, suivant une procédure compliquée, longue et coûteuse. Dans cette analyse, la quantité d'érythropoiétine est calculée de la manière suivante. On injecte de l'érythropolétine à des souris polythythémiques ou à des rats privés de nourriture, puis on leur injecte 9Fe. On calcule la quantité d'érythropolétine à partir de la vitesse à laquelle 9Fe se fixe dans les érythrocytes. Bien que ce procédé présente une excellente spécificité,

il a aussi des inconvénients car un grand nombre d'ani-

maux doivent être élevés pendant une longue période, et il met en oeuvre un isotope. En outre, le procédé nécessite beaucoup de travail et un coût élevé. Son

utilisation dans les examens cliniques est ainsi diffi-

cile. On a aussi cherché à réduire ces inconvénients et ces désagréments par mise au point d'un procédé qui comprend le revêtement préalable des érythrocytes par I'érythropolétine humaine, puis la neutralisation de l'antiérythropolétine anticorps avec l'érythropoiétine contenue dans l'échantillon, puis l'utilisation de ces hématies sensibilisées pour l'inhibition de la

réaction d'agglutination antigène-anticorps et l-lutilisa-

tion des résultats obtenus pour le titrage. Cependant, comme ce procédé nécessite le retrait de l'hémagglutinine

non spécifique contenue dans le sérum humain, un trai-

tement d'absorption de 1 'hémagglutinine est nécessaire.

En outre, un test doit inévitablement être utilisé

pour la confirmation de ce retrait.

L'invention repose sur des recherches des-

tinées à remédier à ces inconvénients des procédés con-

nus et concerne un procédé permettant unemesure facile de l'érythropolétine humaine, de façon spécifique, avec

une bonne précision et en un temps relativement court.

Ces recherches ont montré qu'on pouvait facilement for-

mer des particules d'un latex polymère synthétique

ou d'un tel latex à base de styrène, revêtuesd'éry-

thropoiétine humaine purifiée (antigène), et qu'on pouvait titrer facilement et rapidement et avec une

bonne précision l'érythropolétine contenue dans l'hu-

meur par utilisation de ce latex comme échantillon d'analyse, par la réaction d'inhibition passive de

l'agglutination du latex, sans qu'un traitement pré-

alable tel que l'absorption des humeurs, par exemple

un sérum et une urine, sur un support, soit nécessaire.

Plus précisément, comme le latex revêtu d'érythropoiétine (antigène) présente une agglutination

par réaction avec l'antiérythropolétine anticorps, l'ag-

glutination du latex revêtu d'antigène n'a pas lieu lors-

que l'anticorps est neutralisé à l'avance par l'antigène contenu dans l'échantillon. Si l'échantillon ne contient pas un antigène, l'anticorps ne peut pas être neutralisé.

En conséquence, l'agglutination du latex revêtu d'anti-

gène a lieu sous l'action de cet anticorps. On peut ainsi déterminer la présence ou l'absence d'un antigène par la réaction d'inhibition passive de l'agglutination

du latex.

Ainsi, la quantité d'érythropolétine peut être facilement titrée par une opération comprenant l'addition

de quantitésprédéterminéEsde l'anticorps à des échantil-

lons de dilutiorsprogressivEs, afin que l'érythropolétine

contenue dans l'échantillon soit neutralisée, puis l'ad-

dition du latex revêtu d'antigène et l'observation de la

configuration formée par la réaction d'agglutination en-

tre le latex et l'anticorps qui n'a pas été neutralisé.

On n'a encore jamais considéré l'utilisation d'une composition du type décrit, pour le titrage de

l'érythropolétine humaine, une telle composition compre-

nant essentiellement des particules d'un latex polymère de synthèse et de l'érythropolétine humaine revêtant

la surface des particules de latex.

On constate en outre selon l'invention que cette composition réagit avec une antiérythropolétine anticorps qui a été ajoutée à l'échantillon d'analyse et ne réagit absolument pas avec d'autres anticorps qui

peuvent être présents dans l'échantillon ou les protéi-

nes du plasma. Comme les particules de latex non revê-

tues ne réagissent pas du tout avec une antiérythro-

polétine anticorps, d'autres anticorps ou les protéines du plasma, on suppose que l'érythropolétine est liée aux particules de latex selon l'invention comme un

antigène. On constate ainsi que l'analyse de l'érythro-

polétine humaine peut être effectuée,selon l'invention, facilement et avec une excellente précision, sans que

l'échantillon d'analyse ait à subir des traitements pré-

alables ou des tests de confirmation de l'efficacité de

tels traitements, le titrage mettant en oeuvre des ins-

truments et des opérations simples et comprenant la dis-

position d'une humeur et d'une solution diluée de celle-

ci par exemple dans une cavité d'une plaque de micro-

analyse, l'addition d'une antiérythropolétine anticorps préparée pour être utilisée au cours d'une immunisation, puis l'addition goutte à goutte de la composition selon

l'inyention.

Ainsi, l'invention concerne une composition permettant un excellent titrage de l'érythropolétine humaine ainsi qu'un procédé de titrage mettant en oeuvre cette composition; elle concerne aussi un procédé de

préparation de la composition.

On peut utiliser diverses particules de latex

de synthèse pour la formation de la composition de ti-

trage de l'érythropolétine humaine selon l'invention.

Des exemples de polymères ou copolymères qui forment

de tels latex sont le polystyrène, le polystyrène car-

boxylé, le polystyrène carboxylé contenant des groupes amino, le polyvinyltoluène, les copolymères de styrène et de butadiène, carboxylés ou non, les copolymères de

styrène et de divinylbenzène, les copolymères de vinyl-

toluène et de tertiobutylstyrène, les polyesters, l'acide polyacrylique, l'acide polyméthacrylique, le polyacrylonitrile, les copolymères d'acrylonitrile, de butadiène et de styrène, les copolymères d'acétate de vinyle et d'acrylate, la polyvinylpyrrolidone

et les copolymères de chlorure de vinyle et d'acrylate.

Des particules avantageuses de latex polymère

synthétique sont des particules de latex polymère syn-

thétique à base de styrène, choisis dans le groupe qui comprend les polymères du styrène, les copolymères du styrène, par exemple un copolymère du styrène avec

un monomère choisi dans le groupe qui comprend le chlo-

rostyrène, le méthacrylate de méthyle et le chlorure de vinylidène, et les produits formés de ces polymères

ou copolymères carboxylés et contenant ou non des grou-

pes amino. Ces particules de latex polymères synthéti-

ques peuvent être utilisées après traitement préalable de leur surface par un agent tensioactif non-ionique. Par exemple, il est avantageux que ces particules soient utilisées après adsorption d'un agent tensioactif à base d'oxyde d'éthylène, par mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet japonais n 9716/76 mise à l'inspection publique le 26 janvier 1976. Des

exemples d'agents tensioactifs non-ioniques convena-

bles à base d'oxyde d'éthylène sont un copolymère sé-

quencé d'oxyde d'éthylène et de polyoxypropylèneglycol, les éthers alkyliques du polyoxyéthylène et les éthers

alkylaryliques du polyoxyéthylène.

Les particules de latex polymère synthétique utiliséesselon l'invention ont de préférence un diamètre particulaire moyen compris entre 0,01 et 10 microns, et de préférence entre 0,1 et 1 micron. Il est avantageux

que les particules utilisées aient des dimensions com-

prises dans une plage relativement étroite, par exemple de 0,2 - 0,005 micron afin que la reproductibilité des

résultats de mesuressoit améliorée.La densité des par-

ticules de latex est de préférence d'environ 0,9 à

1,4 et très avantageusement d'environ 1,1 à 1,3. Lors-

que l'analyse est effectuée par mise en oeuvre d'une réaction d'agglutination sur une lamelle de verre, les particules de latex utilisées peuvent avoir une densité comprise dans une plage très large. Lors de la mise en oeuvre d'un procédé de microtitrage, il est préférable que les particules de latex aient une

densité au moins égale à 1,1.

L'érythropolétine humaine utilisée selon

l'invention pour la formation de la composition compre-

nant les particules de latex polymère synthétique et l'érythropoiétine humaine revêtant la surface de ces particules de latex se trouve dans des humeurs

telles que le sang et l'urine. Bien qu'on puisse utili-

ser aussi bien le sang que l'urine comme matière pre-

mière pour la mise en oeuvre de l'invention, l'urine

convient particulièrement bien car il s'agit d'une ex-

crétion et' elle est ainsi facilement disponible. Comme l'indique l'article the Journal of Biological Chemistry, Vol. 252, 5558-5564 (1977), on peut utiliser pour la préparation de l'érythropolétine à partir des matières premières précitées, tous les procédés connus

tels que la précipitation par l'éthanol, la précipita-

tion par l'acétone, la précipitation par l'acide tanni-

que, la précipitation par l'oxyde de lithium, le relar-

gage par le sulfate d'ammonium, la filtration sur un gel, la chromatographie sur diéthylaminoéthylcellulose,

la chromatographie sur gel de polyacrylamide et l'ad-

sorption et la dissociation sur du kaolin.

Comme l'érythropolétine peut supporter un chauffage à 1000C par exemple pendant 15 min, on peut aussi la soumettre à un traitement thermique à 801000C environ par exemple pendant 10 à 15 min environ, avant

sa purification, afin que la plus grande partie des au-

tres protéines qui peuvent être présentes simultanément

soit modifiée par le chauffage. L'érythropoiétine utili-

sée selon l'invention peut avoir été obtenue par l'un quelconque des moyens indiqués précédemment ou par une combinaison de ces moyens. Cependant, il est avantageux qu'il s'agisse d'une protéine unique très pure, car des réactions secondaires peuvent avoir lieu lorsque

la pureté est faible.

On peut obtenir un anticorps par utilisation d'érythropoiétine purifiée ainsi obtenue comme antigène et par immunisation, de manière habituelle, d'animaux ayant l'aptitude de former l'anticorps, par exemple

une chèvre, un lapin ou un cochon d'Inde par inocula-

tion de l'érythropolétine à ces animaux dont on pré-

lève ensuite le sang. Dans ce cas, on peut utiliser un

animal quelconque dans la mesure o il permet une obten-

tion facile de l'anticorps. Le type d'animal à utiliser

n'est par ailleurs pas limité.

La composition de titrage de l'érythropolétine humaine selon l'invention peut être préparée par une opération simple. Par exemple, on peut l'obtenir par mise en contact des particules de latex et de l'antigène (érythropolétine) dans de l'eau, un soluté physiologique ou l'une des diverses solutions tampons de pH compris entre 5,5 et 10 et de préférence entre 6,4 et 7,6, à une température comprise entre environ 4 et 40C, pendant un temps compris entre 30 min et 24 h environ, sous agitation douce, la concentration du latex étant de préférence comprise entre 0,05 et 3 % et celle de

l'antigène entre 50 et 1000 miu/cm3 (milliunités immuno-

chimiques par centimètre cube).

La solution tampon utilisée peut êtrepar

exemple une solution tamponnée de phosphate, par exem-

ple une solution tampon M/60 de phosphate (pH = 7,2) contenant NaCl. 0,15 M (cette solution étant désignée dans la suite du présent mémoire, sous forme condensée, par l'abréviation STP) et une solution saline tamponnée par la glycine. Le cas échéant, on peut avantageusement ajouter à la solution d'antigène 0,01 à 0,1 % environ d'une protéine telle que l'albumine de sérum bovin

(désignée dans la suite du présent mémoire par l'abré-

viation ASB) afin que l'agglutination non spécifique soit évitée. Après la réaction de revêtement, le mélange réactionnel est lavé avec un solvant aqueux. L'antigène

non adsorbé sur les particules de latex peut être to-

talement retiré par lavage des particules par exemple avec les solutions tamponnées précitées. Il est encore recommandé que le latex soit mis en suspension dans un diluant afin que la partie des particules de latex qui

n'est pas revêtue d'antigène soit saturée de protéine.

Le diluant est du type obtenu par addition d'environ 0,1 % de la solution ASB à une solution de chlorure de sodium tamponnéepar la glycine ou par un phosphate, à laquelle on a ajouté en outre 0,01 à 0,5 %

d'azothydrure de sodium NaN3.

Le latex revêtu d'antigène ainsi obtenu peut être conservé au réfrigérateur en suspension dans un diluant, à une concentration d'environ 0,25 % en poids

par exemple, ou il peut être lyoohilisé. Au cours de la lyo-

philisation, divers aminoacides, notamment la glycine et le glutamate de sodium, et/ou du dextranne, en

quantité de 0,2 à 2 % en poids dans le cas des amino-

acides et de 0,3 à 3 % en poids dans le-cas du dextran-

ne, peuvent être ajoutés au diluant sous forme d'agents stabilisants, et le latex revêtu d'antigène peut alors être congelé rapidement dans l'azote ou l'air liquide puis lyophilisé. La période de préservation est encore prolongée par lyophilisation, et le latex revêtu

d'antigène lyophilisé peut habituellement être conser-

vé de façon stable pendant deux ans environ et plus.

Comme le latex revêtu d'antigène selon l'in-

vention est agglutiné par l'antiérythropolétine anti-

corps, un anticorps est d'abord ajouté à une humeur humaine ou à une solution diluée de celle-ci, et l'anticorps est neutralisé par l'antigène présent dans

l'humeur ou sa solution diluée. Ensuite, le latex re-

vêtu d'antigène est ajouté au mélange afin qu'il puisse réagir avec l'anticorps restant, et les configurations

d'agglutination sont alors lues.

L'invention concerne aussi un procédé de ti-

trage de l'érythropoîétine humaine par utilisation de la réaction précitée. Ce procédé comprend l'nalyse qualitative ou quantitative de l'érythropoiétine humaine présente dans l'urine ou le sérum humain, à l'aide d'une composition contenant des particules de latex polymère de synthèse et de l'érythropoiétine humaine revêtant

la surface des particules de latex.

Au cours de l'analyse, on peut utiliser des procédés connus et, par exemple, on peut facilement déterminer la concentration de l'érythropoiétine humaine il dans le sérum ou l'urine par microtitrage. Selon ce procédé, une quantité donnée d'un diluant du type

illustratif indiqué précédemment, est versée par par-

ties sur une plaque de microanalyse, et une quantité donnée d'échantillon d'analyse tel que le sérum ou l'urine, est alors introduite dans la première cavité de la plaque puis est diluée successivement avec un appareil de dilution. D'autre part, on prépare une

série de dilutions de la même manière avec une éry-

thropolétine de référence, ayant des concentrations

connues. On ajoute alors une quantité donnée d'anti-

corps à tous les échantillons et à la série de dilu-

tions, et on maintient les échantillons à température ambiante pendant 15 à 20 min afin de neutraliser l'anticorps. L'opération est suivie d'une addition et d'un mélange d'une quantité donnée de latex revêtu d'antigène. Après une période déterminée de repos à

température ambiante, on observe le virage de l'agglu-

tination. On peut déterminer la quantité absolue d'éry-

thropolétine par comparaion avec la série de dilutions

d'érythropolétine de référence.

La composition de titrage de l'érythropolétine humaine selon l'invention, sous forme d'un latex ou d'un produit séché, présente les avantagesconsidérables suivants. Plus précisément, un anticorps du support ne risque pas d'être présent. En fait, on ne l'a pas découvert. En conséquence, l'humeur à tester n'a pas à subir un traitement préalable, quel qu'il soit, et un test de confirmation du résultat d'un tel traitement préalable n'est donc pas nécessaire. Les opérations de

titrage comprennent simplement la disposition de l'hu-

meur ou de sa solution diluée dans une cavité d'une plaque de microanalyse, l'addition goutte à goutte d'un anticorps, puis l'addition goutte à goutte du latex

revêtu d'antigène. Ainsi, la détermination de l'érythro-

polétine peut être réalisée très facilement au cours d'une opération simple et aucune technique spéciale n'est nécessaire. De plus, comme l'antigène est d'un type qui a subi une purification, il est extrêmement spécifique. En outre, la sensibilité du test est tout

à fait satisfaisante pour l'analyse de l'humeur hu-

maine. Il est aussi possible d'analyser simultanément un certain nombre d'échantillons qualitativement et quantitativement. La détermination de la concentration de

l'érythropoiétine dans l'humeur qui a dû être effec-

tuée jusquâ présent par mise en oeuvre d'un procédé extrêmement compliqué d'analyse biologique, peut être effectuée facilement, en une courte péricde et par des opérations simples, lors de l'utilisation du latex revêtu d'antigène selon l'invention. Une analyse étiologique précise des patients anémiés peut donc

être effectuée, de même qu'une évaluation des ré-

sultats du traitement appliqué et la détermination d'un

pronostic d'évolution de la maladie. En outre, le pro-

cédé selon l'invention peut être utilisé pour la me-

sure de la concentration de l'érythropolétine au cours

de sa production à partir de l'urine par exemple.

Comme le latex revêtu d'antigène ne réagit qu'avec l'érythropoiétine anticorps et ne réagit pas du tout avec les anticorps autres que celui-ci ou avec les protéines du plasma, et comme un latex non revêtu

ne réagit pas du tout avec l'antiérythropolétine anti-

corps, les anticorps autres que celui-ci et les pro-

téines du plasma, on peut considérer que l'érythropoié-

tine est liée à ce latex revêtu.

D'autres caractéristiques et avantages de

l'invention ressortiront mieux de la description qui

va suivre d'exemples de préparation et de mise en

oeuvre de l'invention, donnés à titre purement illus-

tratif et non limitatif.

Exemple de préparation nol

Préparation de l'érythropolétine.

On ajoute du phénol (0,1 %) à l'urine d'un patient anémié et, après addition de quatre fois son volume d'éthanol, on laisse le mélange reposer une nuit

au réfrigérateur. On lui fait alors subir une centrifu-

gation pendant 30 min, à 3000 tr/min, et on collecte le sédiment qu'on dissout ensuite dans un soluté phy- siologique; on fait ensuite subir une dialyse à la solution obtenue, pendant une nuit, en présence d'un

soluté physiologique. On ajoute alors la solution ob-

tenue, par parties,dans de petits tubes à essai qui sont plongés dans l'eau bouillante pendant 15 min avant

centrifugation à grande vitesse. On fait subir au li-

quide qui surnage ainsi obtenu une adsorption et une dissociation sur du kaolin. Plus précisément, on

ajoute du kaolin lavé cinq fois dans un soluté physio-

logique (kaolin à lavage acide de Fisher Scientific Company) à raison de 10 % et., après réglage du pH à

4,8, on agite doucement le mélange pendant 24 h à 40C.

On sépare le kaolin par centrifugation à 3000 tr/min, on l'extrait et on le lave avec une solution tampon

d'acétate de pH égal à 4,8. On le met alors en sus-

pension dans NH4OH 1M, on agite doucement pendant 1 h à température ambiante, et on centrifuge à 3000 tr/min

pendant 30 min, avant séparation du liquide qui surnage.

On répète trois fois l'opération et on combine alors

* les liquides qui surnagent. On fait subir à l'échan-

tillon une dialyse en présence d'une solution contenant NaH2PO4 0,029 M et NaCl 0,029 M.Ensuite, on ajoute l'échantillon à de la diéthylaminoéthylcellulose qui a été mise en équilibre avec une solution contenant NaH2PO4 0,029 M et NaCl 0,029 M, et on agite doucement

à température ambiante pendant 1 h afin qu'il s'adsorbe.

On séparer alors la diéthylaminoéthylcellulose par cen-

trifugation à 2000 tr/min, on la lave deux fois dans la solution précitée, et on lui fait subir trois fois une élution dans une solution contenant Na HPO4 0,05 M et NaCl 0,15 M. On concentre alors l'éluat avec un

gel "Lyphogel" (marque de fabrique d'un gel de poly-

acrylamide fabriqué par Gelman Instrument Co., Etats-Unis d'Amérique) et on lui fait subir une filtration sur un gel "Sephadex G-100" (marque de fabrique d'un dextranne lié fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals, AB, Suède), avant séparation de la partie active. On fait alors su-

bir à nouveau une précipitation par l'éthanol et on la-

ve la matière précipitée à l'éthanol. Après dissolution

dans un soluté physiologique, on lui fait subir une dia-

lyse en présence d'un soluté physiologique, afin qu'un

échantillon d'érythropolétine soit obtenu.

Exemple de préparation n02

Préparation d'érythropolétine anticorps.

On utilise comme antigène pour l'immunisation,

un échantillon préparé de la manière décrite précédem-

ment, mais sans le chauffage indiqué. Après mélange de cet antigène avec un adjuvant incomplet de Freund, on l'introduit trois fois par injectionsous-cutanée dans des lapins de 2 à 3 kg, à des intervalles de 7 jours,

et on l'introduit ensuite une fois par injection intra-

musculaire. Trois semaines plus tard, on introduit l'échantillon en solution dans un soluté physiologique

par injection intraveineuse. Une semaine après l'injec-

tion finale, on prélève le sang entier au niveau de la carotide, et on sépare le sérum de manière habituelle puis on le chauffe à 560C pendant 30 min. On le conserve

à 40C après addition de 0,1 % d'azothydrure de sodium.

On confirme le fait que l'antisérum obtenu est un anti-

corps unique, car il forme une bande unique avec un antigène, par mise en oeuvre de la méthode d'Ouchtalony

aussi bien que par immunoélectrophorèse.

Exemple 1

Préparation d'un latex revêtu d'érythropolétine (antigène). On disperse un latex de polystyrène "SDL 59" (densité de 1,18, diamètre particulaire de 0,9 micron, fabriqué par Takeda Chemical Industry Company) dans un mélange de 1 volume de solution tampon au phosphate 1/15M (pH = 7,2) et de 3 volumes d'un soluté physiologique (désigné par l'abréviation STP), de manière que la

concentration des particules devienne égale à 0,25 %.

On ajoute à la suspension formée et en quantité égale de l'érythropolétine diluée par la solution STP de ma- nière qu'elle corresponde à une concentration de

250 miu/cm3. On conserve le mélange résultant à tempé-

rature ambiante pendant 3 h, puis on le centrifuge afin de séparer les particules de latex qu'on lave alors avec la solution STP puis avec un diluant; on met alors les

particules en suspension dans un diluant, à une concen-

tration de 0,25 %, afin qu'il se forme un latex revêtu

d'antigène. Bien que ce latex revêtu d'antigène s'ag-

glutine avec une antiérythropolétine anticorps sur

une plaque de microanalyse, il ne présente pas d'agglu-

tination lors de l'addition des anticorps de l'albumine

humaine, de l'immuno-globuline G humaine, de la trans-

férine humaine, de l'haptoglobine humaine et de la micro-

globuline 2 humaine. En outre, l'agglutination n'a pas lieu lorsque le latex revêtu d'antigène est ajouté

après neutralisation de l'antiérythropolétine anti-

corps par l'addition d'érythropolétine. De plus,

l'agglutination n'a pas lieu malgré l'addition de l'anti-

érythropoiétine anticorps,dans des conditions identiques,

à un latex qui n'a pas été revêtu d'érythropolétine.

Il se confirme ainsi que le latex revêtu d'antigène

réagit spécifiquement avec l'antiérythropoiétine anti-

corps et s'agglutine.

Le diluant utilisé est obtenu par addition de la solution ASB à un soluté physiologique tamponné au phosphate 1/60 M (pH = 7,2) à une concentration de

0,1 %.

Exemple 2

Lyophilisation du latex revêtu d'antigène. -

On met en suspension le latex revêtu d'anti-

gène préparé dans l'exemple 1, dans un diluant contenant 0,5 % en poids de glycine et 0,7 % en poids de dextranne (de poids moléculaire compris entre 200 000 et 300 000, fabriqué par Wako Jyunyaku Co) à une concentration de 2,5 %. Apres congélation rapide dans l'azote liquide,

on le lyophilise.

Exemple 3

Titrage de l'érythropolétine.

On verse un diluant, en quantité égale à

0,025 cm3, dans chaque cavité d'une plaque de micro-

analyse en V. On ajoute 0,025 cm3 dans la première

cavité. D'autre part, on ajoute 75 miu/cm3 d'érythro-

polétine de référence à la première cavité d'une autre rangée, et on dilue progressivement par un procédé de dilution en série d'un facteur 2, avec un appareil convenable de dilution. On mélange alors dans toutes

les cavités 0,025 cm3 d'une antiérythropolétine anti-

corps diluée préalablement par l'érythropolétine de référence afin que la sixième cavité corresponde au virage. On conserve les mélanges à température ambiante pendant 30 min, et on ajoute alors à chaque cavité

0,05 cm3 du latex revêtu d'antigène obtenu dans l'exem-

ple 1. On mélange alors soigneusement les solutions obtenues dans un micromélangeur et on laisse reposer

à température ambiante pendant 10 h au moins. On dé-

termine alors le virage de l'inhibition de l'agglutina-

tion, et on calcule la concentration d'érythropolétine

par comparaison avec l'érythropoiétine de référence.

Les résultats obtenus par détermination de la concentration de l'érythropolétine présente dans un sérum huamin par ce procédé figurent dans le tableau

qui suit.

Titrage de l'érythropolétine du sérum (valeur de l'inhibition de l'agglutination) no Solution de référence 75 miu/cm3 Adulte sain (homme de 27 ans) " (homme de 46 ans) Anémie aplastique (femme de 18 ans) " (homme de 24 ans) Anémie hypoferrique (femme de 51 ans) Insuffisance rénale chronique (homme de 47 ans) " (homme de 39 ans) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 miu/cm3

_ _ - - + + + ++ +

- - + + + + + + + 37,5

- - - + + + + + + 75

- - - - - - -_ - - - + 2400

- - - - - - - - - - + + 1200

- - - + + + + 300

- + + + + + + + + +

- - - + + + + + + +

-: non agglutinée +: agglutinée N 0% o co 1% -4

+ + 2,3

+ + 9,3

Exemple 4

On ajoute un diluant au latex revêtu d'anti-

gène obtenu dans l'exemple 2 afin que la concentration des particules de latex soit égale à 0,25 %, et on effectue l'opération de l'exemple 3 afin de titrer l'érythropoiétine contenue dans le sérum. Les résultats

obtenus sont les mêmes que dans l'exemple 3.

Comme l'indiquent les résultats qui précèdent, l'érythropoiétine du sang a une concentration élevée

dans le cas de l'anémie hypoferrique et une valeur anor-

lament élevée dans le cas de l'anémie aplastique, mais une valeur anormalement basse dans le cas de l'anémie

rénale. On peut donc dire que le titrage de l'érythro-

polétine des patients anémiés est extrêmement utile pour le diagnostic de la cause de l'anémie de ces

patients ainsi que pour la détermination de l'impor-

tance de la maladie.

L'utilisation du latex revêtu d'antigène se-

lon l'invention rend possible la détermination très facile de la concentration de l'érythropolétine avec une quantité extrêmement faible d'échantillon et en outre sans que l'échantillon ait à subir un traitement préalable quelconque. On peut donc considérer que le procédéde l'invention convient particulièrement bien

aux diagnostics cliniques.

Claims (7)

REVEND ICAT IONS

1. Composition destinée au titrage de leêrythro-

polétine humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend

essentiellement des particules de latex polymère synthé-

tique et de l'érythropolétine humaine revêtant les sur-

faces des particules de latex.

2. Composition selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que le diamètre particulaire moyen des par-

ticules de latex est compris entre 0,01 et 10 microns.

3. Composition selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que la densité des particules de latex est

comprise entre 0,9 et 1,4.

4. Composition selon la revendication 1, caracté-

risée en ce qu'elle contient un agent stabilisant choisi

dans le groupe qui comprend les aminoacides et le dex-

tranne.

5. Composition selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que les particules de latex polymère synthé-

tique sont des particules d'un latex polymère synthétique à base de styrène, choisi dans le groupe qui comprend les latex des polymères de styrène, des copolymères de styrène, des produits carboxylés de ces polymères et

copolymères, et des produits carboxylés de ces poly-

mères et copolymères, contenant en outre des groupes

amino.

6. Composition selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que les particules de latex polymère synthé-

tique à base de styrène ont un diamètre particulaire moyen compris entre 0,01 et 10 microns et une densité comprise entre 0,9 et 1,4, les particules de latex étant choisies dans le groupe comprenant les latex des polymères de styrène, des copolymères de styrène, des produits carboxylés de ces polymères et copolymères,

et des produits carboxylés de ces polymères et copoly-

mères contenant en outre des groupes amino, ladite com-

position comprenant en outre de l'érythropoiétine hu-

maine revêtant les surfaces des particules de latex

et un agent stabilisant choisi dans le groupe qui com-

prend la glycine à une concentration comprise entre

0,2 et 2 % en poids, et le dextranne à une concentra-

tion comprise entre 0,3 et 3 % en poids.

7. - Procédé de titrage de l'êrythropolétine humaine présente dans l'urine ou le sérum humain, par microtitrage, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'une composition comprenant essentiellement des particules de latex polymère synthétique et de l'érythropoiétine humaine

revêtant les surfaces des particules de latex.