WO2004040311A1 - Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion - Google Patents

Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion Download PDF

Info

Publication number
WO2004040311A1
WO2004040311A1 PCT/EP2003/012011 EP0312011W WO2004040311A1 WO 2004040311 A1 WO2004040311 A1 WO 2004040311A1 EP 0312011 W EP0312011 W EP 0312011W WO 2004040311 A1 WO2004040311 A1 WO 2004040311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carrier
treponema
vdrl
carrier according
cardiolipin
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/012011
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Kintrup
Heike THÜRING-NAHLER
Lilly Kronsteiner
Vera Helbl
Heinz Engel
Ludwig Furtmayr
Original Assignee
Viramed Biotech Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Viramed Biotech Ag filed Critical Viramed Biotech Ag
Priority to EP03809742A priority Critical patent/EP1556697B1/de
Priority to AU2003301694A priority patent/AU2003301694A1/en
Priority to DE50308325T priority patent/DE50308325D1/de
Publication of WO2004040311A1 publication Critical patent/WO2004040311A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for the diagnosis and / or follow-up of a treponema infection and a diagnostic method using the carrier mentioned.
  • Treponema infections can be detected, confirmed and checked in the course of the disease.
  • syphilis can basically run in different stages, which are called primary syphilis, secondary syphilis and tertiary syphilis.
  • Direct detection of the pathogen is only a good diagnostic option in the primary stage.
  • the detection takes place directly from the tissue sample and can be carried out by dark field microscopy, direct immunofluorescence or a Treponema pallidum-specific PCR.
  • Serological methods for antibody detection are possible in all disease stages. They provide information about characteristic antibody constellations that provide information about the need for treatment.
  • Anti-Treponema pallidum-specific antibodies and antibodies against cardiolipin essentially play a role here.
  • Anti-cardiolipin antibodies of the IgG or IgM type can occur in patients with Treponema infections and can be tested with the CMT test (Cardiolipin - microflocculation test, English VDRL test: Veneral Disease Research Laboratories Test) or the RPR test (Rapid Plasma reagin test) or the cardiolipin complement binding reaction test. With these analysis methods, positive signals are observed in the presence of anti-lipoidal antibodies in the sample.
  • the VDRL test can be carried out quantitatively with appropriate sample dilutions, so that a titer in which a clear flocculation just occurs is rated as positive. The test is well suited for follow-up and therapy control, but can also react non-specifically.
  • Anti-Treponema pallidum-specific antibodies can be raised against Treponema pallidum proteins.
  • the detection of these antibodies can be carried out as a screening test, as TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutionations Test), TPPA (Treponema Pallidum Particle Agglutionations Test) or TPLA (Treponema Pallidum Latex Agglutinations Test).
  • the diagnostically relevant proteins from Treponema pallidum include the proteins with molecular weights of 47 kD, 44.5 kD, 37 kD, 17 kD and 15 kD (laboratory and diagnosis, publisher: Lothar Thomas, pages 1234 ff., TH-Books VerlagippombH, Frankfurt Main, 2000; DE19536166; WO8802403; Sambri et al., Ciin. Diagn. Lab. Immunol. 2001 May; 8 (3): 534-9).
  • Treponema pallidum can bind specific antibodies to the antigens and can subsequently be detected by an immunochemical reaction.
  • the detection of these Treponema pallidum-specific antibodies can be used in the format of an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), for example as a search test for syphilis or in the format of immunoblots as a confirmation test for syphilis.
  • Immunoblots are therefore used in the event of unclear findings from the search reactions, as confirmation tests and for monitoring the course.
  • Test methods for the determination of anti-Treponema pallidum-specific IgM antibodies are of particular importance for evaluating the need for treatment. This detection is typically possible with a Tp-IgM-FTA test (fluorescence Treponema antibody absorption test) or a Tp-IgM-Elisa or a Treponema pallidum IgM immunoblot.
  • test format of US3564089 does not allow separate detection of the antibody reaction with the Reiter antigens or the VDRL antigens. Rather, the demonstrated antibody reactivity is the sum of both reactivities. Separate detection of the different antibody reactivities in the patient material, e.g. on the one hand the reactivity with the Treponemen-specific antigens and on the other hand the VDRL antigens, however, has advantages in diagnostics, as will be explained in detail later.
  • the detection methods known from the prior art which are suitable for serological confirmation, do not allow quantitative determination of the antibodies in the patient sample and no differentiation between different reactivities in the analysis material. They also have the disadvantage that they practically make it impossible to determine whether a Treponema infection is still acute or has already subsided. This is due, among other things, to the fact that antibodies to Treponema antigen can still be detected for a very long time, even if the actual infection - i.e. the presence of pathogens - has already subsided. Furthermore, the tests from the prior art are sometimes cumbersome in terms of the procedure and are therefore unsuitable for routine use and high-throughput technologies.
  • the present invention was based on the technical problem of specifying means and methods which, on the one hand, are as simple to use as possible and furthermore enable a serological monitoring of the actual degree of infection.
  • a carrier for the diagnosis and / or follow-up of a treponema infection which contains at least one immobilized cardiolipin and at least one immobilized treponema-specific antigen.
  • the cardiolipin is used together with lecithin and cholesterol.
  • This combination of cardiolipin, lecithin and cholesterol is also referred to below as the VDRL antigen.
  • the VDRL antigen comprises the constituents mentioned in the following mass ratios cardiolipin: lectihin: cholesterol in the ratios 0.1 to 4.0: 1 to 5.0: 1 to 10.0.
  • the mass ratios are 1 to 3.0 for cardiolipin: 1 to 3 for lecithin: 5 to 10 for cholesterol.
  • the carrier contains several positions with cardiolipin, at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four positions, at which the cardiolipin is present in different concentrations. These concentrations are preferably as follows for the individual positions: 0.10 to 1.00 mg / ml (position 1), 0.05 to 0.50 mg / ml (position 2), 0.02 to 0.2 mg / ml (position 3), 0.01 to 0.1 mg / ml (position 4).
  • the carrier contains several positions with VDRL antigen, at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four positions, at which the VDRL antigen is present in different concentrations.
  • the carrier contains at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four different Treponema-specific antigens, each antigen being immobilized in a different position on the carrier.
  • the Treponema-specific antigens are selected from antigens from Treponema pallidum, preferably these are the 15 kD, 17 kD, 44.5 kD and 47 kD antigens.
  • the carrier contains further controls which are suitable for indicating that the method according to the invention has been carried out correctly.
  • controls include, for example, a serum control, preferably protein A. This control indicates that the test strip has indeed been brought into contact with serum when the method was carried out.
  • control is a so-called cut-off control, which contains, for example, a dilution of purified human immunoglobulin.
  • This control is used for evaluation by a weaker signal than that Cut-off control corresponds to a negative test result, while a stronger signal corresponds to a positive test result.
  • Suitable carrier materials are nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene difluoride), nylon, cellulose acetate, polystyrene, with nitrocellulose being particularly preferred. It has been shown that when nitrocellulose is used, a particularly good signal-background ratio is obtained, in particular for the VDRL signal.
  • controls represent so-called conjugate controls. These controls indicate that the test strip in contact with the corresponding conjugate, which is directed against human IgG or human IgM or human IgA, has been brought into contact is.
  • the carrier is designed as a test strip, in particular in a format which allows use in conventional methods of immunodiagnostics.
  • the carrier is designed as a Western blot.
  • the carrier contains the various reagents in immobilized form.
  • the technical problem mentioned above is also solved by a method for diagnosing and / or monitoring the progress of a Treponema infection, which is characterized in that an above-mentioned carrier is brought into contact with a patient sample and thus the presence of antibodies against a Treponema antigen and / or cardiolipin is determined in the patient sample.
  • the patient sample is preferably a blood, serum, plasma, CSF or synovial fluid sample of the patient to be examined.
  • the procedure corresponds to the usual procedures in the field of immunodiagnostics and is familiar to the person skilled in the art.
  • the carriers are read out (automatically) after performing the test with the evaluation ViraScan ® and evaluated.
  • the carriers are analyzed densitometrically with ViraScan ® .
  • the intensities of the VDRL-IgG and VDRL-IgM bands and the treponemen-specific antigen bands are compared with the cut-off control band intensity, which are also based on the carriers. likes to compare. This allows a quantitative determination of the antibody reactivities.
  • test kit for diagnosing a Treponema infection and / or monitoring the course of a Treponema infection the test kit containing a carrier mentioned at the outset and the further reagents for carrying out the diagnostic method and instructions for use for carrying out the assay.
  • Treponema pallidum specific antigens 47 kD, 44.5 kD, 17 kD, 15 kD proteins
  • non-Treponema pallidum antigens eg Cardiolipin
  • step-by-step diagnostics for diagnosing syphilis it is thus possible, after a screening test (TPPA, TPHA, TPLA, Tp Elisa), to use the carrier or method according to the invention to perform both the serological confirmation reaction and the analysis to determine the need for treatment also to be able to carry out the serological follow-up.
  • the measurement signal obtained with VDRL antigen is a reliable parameter for the degree of Treponema infection. While the reactivity with the Treponema antigens in the patient sample is relatively independent of the degree of infection (i.e. the severity of the infection), the VDRL signal gives more meaningful values.
  • the intensities of the individual VDRL bands are compared with the intensity of the cut-off control band and evaluated with 0, 1 or 2 Vi- raBlot units, depending on whether the VDRL bands are weaker, equally strong or clear appear stronger than the cut-off control band.
  • the sum of the individual VDRL-ViraBlot units indicates the reactivity of the lipoid antibodies present.
  • the increase in the sum of the VDRL-ViraBlot units correlates with an increase in the reactivity of the lipoid antibodies.
  • a ViraBlot unit means that the value 1 is specified when a signal that is observed with a VDRL band has the same intensity as the signal that is obtained with a cut-off control band.
  • the carrier according to the invention and the method carried out with it allow a differentiation between the antibody classes IgG and IgM which are directed against VDRL. This has particular advantages in diagnosis, e.g. in assessing the need for treatment in children with questionable connective syphilis.
  • Figure 1 shows a carrier according to the invention with VDRL antigens of different concentrations and with four different Treponema pallidum antigens, serum control and cut-off control
  • Figure 2 shows carriers according to the invention for VDRL-IgG follow-up in a patient with syphilis II
  • Figure 3 shows the correlation of VDRL ViraBlot units with the known, conventionally determined VDRL or cardiolipin KBR titer
  • Figure 4 shows IgG and IgM responses of the carriers according to the invention after a reaction with human serum in a Lues II patient with HIV infection
  • Figure 5 shows IgG and IgM responses of the carriers according to the invention after a reaction with human serum in a mother and her child with questionable congenital syphilis
  • Figure 2 shows test strips of the IgG type for VDRL antigen follow-up in a Lues II patient. The tests were carried out every three months, over a period of three months. The treponema-specific antigen bands are clearly recognizable on each of the test strips. In the case of the VDRL antigen bands, the drop in the VDRL-IgG titer in the course of the subsiding infection after therapy can be clearly seen.
  • VDRL ViraBlot units correlate with the known, conventionally determined VDRL or Cardiolipin-KBR Titem. This correlation is shown in Figure 3 below.
  • Figure 4 shows Treponema + VDRL ViraBlot IgG and IgM immune responses to Lues II in an HIV patient.
  • the bands of the treponem specific antigens 47 kD, 44.5 kD, 17 kD and 15 kD are clearly recognizable in the IgG and IgM, respectively.
  • VDRL bands are only clearly visible in the IgM and not in the IgG.
  • VDRL-ViraBlot IgG and IgM antibody findings If you add up the individual ViraBlot units for the VDRL-ViraBlot IgG and IgM antibody findings and evaluate them with the Treponema-specific bands, you can see that, depending on the clinic, the patient either has recently been infected or is still in an active syphilis phase.
  • the application of VDRL antigens and Treponema-specific antigens on a carrier simplifies the test procedure and allows a quick serodiagnostic statement at a glance. Instead of carrying out two tests in a row as before (e.g. VDRL and 19S-lgM-FTA-ABS), these are now integrated in one step.
  • Figure 5 shows the immunoreactivities of VDRL and Treponema-specific antigens in the IgG and IgM immunoassay in a mother and her child with suspected connective syphilis.
  • the bands for the antigens 47 kD, 44.5 kD, 17 kD and 15 kD are clearly recognizable in the IgG in mother and child and in the IgM in mother.
  • the sum of the individual ViraBlot units for the VDRL-ViraBlot IgG and IgM antibody findings in the mother's immune response show a clear reaction for the Lipoid.
  • Treponema-specific IgG and IgM bands together with the VDRL-ViraBlot IgG and IgM antibody findings, thus indicate that the mother was only recently infected with Treponema, or depending on the history, is still in an active infection phase.
  • IgM antibodies are usually not transferred diaplacental to the fetus, there would only be a need for therapy if specific IgM antibodies and / or IgM-VDRL antibodies in the newborn Treponema indicate infection, which is not the case in this example , Therefore, the detection of IgG antibodies in the child in this case suggests that they have been transmitted diaplacental from the mother.
  • the present invention differentiates between anti-VDRL-IgG and anti-VDRL-IgM antibodies. This differentiation enables a better assessment of the need for treatment in a child with questionable connective syphilis.
  • VDRL antigen was produced from a mixture of the individual components cardiolipin, lecithin and cholesterol in ethanol.
  • Cardiolipin was purified from bovine heart (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA), egg lecithin (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA) and cholesterol from wool fat (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, UNITED STATES).
  • the individual components were in purity levels of at least 98% used.
  • the individual components were each in the dry state and were taken up in ethanol (100%).
  • the concentration of cardiolipin was 4 g / l in ethanol (100%), the concentration of lecithin was 100 g / l in ethanol (100%) and the concentration of cholesterol was 25 g / l in ethanol (100%).
  • the individual components were mixed in the order cardiolipin, lecithin and cholesterol in accordance with the desired mixing ratio. The mixture is kept at room temperature in the dark for 12-24 hours before further processing.
  • the mass ratios of cardiolipin: lecithin: cholesterol in the VDRL mixture were in the range from (0.1-4.0): (0.1-5.0): (0.1-10.0). Good results were obtained with a mixture of cardiolipin: lecithin: cholesterol with a mass ratio of 2.0: 1, 4: 9.0.
  • VDRL antigen was gradually prepared in phosphate-buffered saline pH 7.2 in 1.4 to 1000-fold dilutions.
  • Treponema-specific antigen solutions 47 kD protein from Treponema pallidum (Capricom.USA), 44.5 kD protein from Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA), 17 kD protein from Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA) and 15 kD protein from Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA) were used to prepare the Treponema-specific antigen solutions.
  • the antigens were diluted in phosphate-buffered saline pH 7.2. Concentrations between 1 ⁇ g / ml and 200 ⁇ g / ml per antigen were used.
  • Nitrocellulose (Schleicher and Schüll, Dassel, Germany) was used as the solid-phase carrier material.
  • the correspondingly diluted antigens (concentrations: VDRL: 1.40 times, 28.6 times, 55.6 times and 111.1 times dilution of the VDRL antigen solution; 47 kD protein: 60 ⁇ g / ml; 44.5 kD protein: 5 ⁇ g / ml; 17 kD protein: 10 ⁇ g / ml; 15 kD protein: 20 ⁇ g / ml) could be bound by passive adsorption on nitrocellulose as a solid phase carrier material.
  • the antigen solutions were applied with an automatic dispenser with drop sizes from 10.67 nl to 85 nl and flow rates from 0.5 ⁇ l / cm to 5.0 ⁇ l / cm. Blockage of free binding sites
  • Antigen-coated nitrocellulose was treated with a buffer of trishydroxymethylaminomethane (3.25 g / l), sodium chloride (7.51 g / l), Tween 20 (3.83 ml / l), thimerosal (0.02 g / l ), Milk powder (40 g / l), pH 7.5, incubated at 37 ° C for 30 min, then in a buffer of trishydroxymethylaminomethane (3.25 g / l), sodium chloride (7.51 g / l), Tween 20 (3.83 ml / l), thimerosal (0.02 g / l), milk powder (5 g / l), pH 7.5, incubated at 37 ° C. for 30 min and dried.
  • the blocked nitrocellulose was cut into strips (test strips).
  • Serum, plasma, CSF (cerebrospinal fluid) or synovial fluid are suitable as sample fluids.
  • washing buffer consisting of trishydroxymethylaminomethane (3.25 g / l), sodium chloride (7.51 g / l), Tween 20 (3.83 ml / l), thimerosal (0.02 g / l), milk powder (5 g /
  • test strip After incubation with sample liquid, the test strip is washed three times with 1.5 ml wash buffer each and then incubated with anti-human IgG or anti-human IgM or anti-human IgA - alkaline phosphatase conjugate. It is then washed three times for 5 minutes each with 1.5 ml of washing buffer. In a further washing step, it is washed with distilled water for 1 min and then developed with a chromogen / substrate solution (BCIP / NBT). The development is stopped in accordance with the color of a cut-off control by decanting the developing solution and washing three times with 1.5 ml of distilled water in each case.
  • a chromogen / substrate solution BCIP / NBT
  • Staining intensities of the antigen lines on the test strips are compared with the staining intensity of the cut-off control.
  • a staining intensity can by scanning (commercial color scanner; program ViraScan ®, Viramed, Planegg, Germany) of entwik- kelten test strips are quantified. From the measured values of the coloring intensities the ratio to the cut-off control calculated (ratio). If the ratio is greater than or equal to one, a correspondingly colored antigen line is considered positive. If the ratio is less than one but greater than or equal to 0.5, the corresponding antigen line is evaluated as borderline. If the ratio is less than 0.5, the corresponding antigen line is evaluated negatively.
  • One or more positive antigen lines of the 47 kD, 44.5 kD, 17 kD or 15 kD proteins indicate the presence of corresponding antibodies in the respective sample examined.
  • One or more positive antigen lines of the applied VDRL dilution levels indicate the presence of anti-cardiolipin antibodies of a corresponding titer.
  • the VDRL titer determined according to the conventional VDRL test method and the quantifiable staining intensity of the VDRL antigen lines on the test strip ( Figure 3).
  • the carrier-bound VDRL is a suitable means for the quantitative, at least semi-quantitative, detection of anti-cardiolipin antibodies and can thus be used to monitor the course of a Treponema infection.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponema-Infektion sowie ein Diagnostik-Verfahren unter Einsatz des genannten Trägers. Erfindungsgemäss wird ein Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponema-Infektion bereitgestellt, der mindestens ein immobilisiertes Cardiolipin und mindestens ein immobilisiertes Treponema-spezifisches Antigen umfasst. Ferner wird ein Verfahren zur Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle unter Verwendung des Trägers bereitgestellt.

Description

Mittel und Verfahren zur Diagnose einer Treponemainfektion
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion sowie ein Diagnostikverfahren unter Einsatz des genannten Trägers. Treponemainfektionen können damit detektiert, bestätigt und im Krankheitsverlauf kontrolliert werden.
Die Klinik der Syphilis kann grundsätzlich in unterschiedlichen Stadien verlaufen, die als Primärsyphilis, Sekundärsyphilis und Tertiärsyphilis bezeichnet werden.
Ein direkter Erregernachweis ist lediglich im Primärstadium eine gute Diagnosemöglichkeit. Der Nachweis erfolgt hierbei direkt aus der Gewebeprobe und kann durch Dunkelfeldmikroskopie, direkte Immunfluoreszenz oder eine Treponema pallidum spezifische PCR durchgeführt werden.
Serologische Verfahren zum Antikörpernachweis sind in allen Krankheitsstadien gut möglich. Sie geben Aufschluss über charakteristische Antikörperkonstellationen, die Informationen über die Behandlungsbedürftigkeit geben.
Im wesentlichen spielen dabei anti-Treponema pallidum-spezifische Antikörper und Antikörper gegen Cardiolipin eine Rolle.
Anti-Cardiolipin-Antikörper vom IgG- oder IgM-Typ können bei Patienten mit Treponema Infektionen vorkommen und können mit dem CMT - Test (Cardiolipin - Mikroflockungs - Test, englisch VDRL Test: Veneral Disease Research Laboratories Test) oder dem RPR - Test (Rapid Plasma Reagin-Test) oder dem Cardiolipin Komplement-bindungs- reaktions-Test nachgewiesen werden. Bei diesen Analyseverfahren werden positive Signale beim Vorhandensein von anti-lipoidalen Antikörpern in der Probe beobachtet. Der VDRL Test kann bei entsprechenden Probenverdünnungen quantitativ durchgeführt werden, so dass ein Titer, bei dem eine deutliche Flockung gerade noch auftritt, als positiv gewertet wird. Der Test eignet sich gut zur Verlaufskontrolle und Therapiekontrolle, kann aber auch unspezifisch reagieren. Kreuzreaktionen treten unter anderem bei Autoimmunerkrankungen auf, wie zum Beispiel beim Anti-Phospholipid-Syndrom oder beim Systemischen Lupus Erythematodes. Anti-Treponema-pallidum-spezifische Antikörper können gegen Proteine aus Treponema pallidum gebildet werden. Der Nachweis dieser Antikörper kann als Suchtest, als TPHA (Treponema Pallidum Hämagglutionations Test), TPPA (Treponema Pallidum Partikel Agglutionations Test) oder TPLA (Treponema Pallidum Latex Agglutinations Test) durchgeführt werden.
Die diagnostisch relevanten Proteine aus Treponema pallidum umfassen unter anderem die Proteine mit Molekulargewichten von 47 kD, 44,5 kD, 37 kD, 17 kD und 15 kD (Labor und Diagnose, Herausgeber: Lothar Thomas, Seiten 1234 ff., TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt Main, 2000; DE19536166; WO8802403; Sambri et al., Ciin. Diagn. Lab. Immunol. 2001 May;8(3):534-9). In unterschiedlichen marktgängigen Testen (Inno- lia Syphilis, Innogenetics, Belgien; Treponema Marblot, MarDx, USA; Treponema Re- comblot, Mikrogen, Deutschland) werden Kombinationen aus diesen Proteinen auf fest- phasigen Trägermaterialien immobilisiert. Während der Inkubation der Probe mit dem beschichteten Trägermaterial können Treponema pallidum spezifische Antikörper an die Antigene binden und nachfolgend durch eine immunochemische Reaktion nachgewiesen werden. Der Nachweis dieser Treponema pallidum spezifischen Antikörper kann im Format eines ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) zum Beispiel als Suchtest für Syphilis eingesetzt werden oder im Format von Immunoblots als Bestätigungstest für Syphilis.
Immunoblots werden daher bei unklaren Befunden aus den Suchreaktionen, als Bestätigungstests und zur Verlaufskontrolle eingesetzt.
Zur Bewertung der Behandlungsbedürftigkeit sind vor allem Testverfahren zur Bestimmung von anti-Treponema-pallidum-spezifischen IgM-Antikörpern von Bedeutung. Typischerweise ist dieser Nachweis mit einem Tp-IgM-FTA Test (Fluoreszenz Treponema Antikörper-Absorptions-Test) oder einem Tp-IgM-Elisa oder einem Treponema pallidum IgM Immunoblot möglich.
Zur serologischen Verlaufskontrolle und Therapiekontrolle sind vornehmlich Verfahren indiziert, die eine zumindest semiquantitative Bestimmung von anti-Cardiolipin- Antikörpem beinhalten.
In US 3,564,089 wird die Kombination von Reiter Treponemen und VDRL-Antigenen in einem Test verwendet, um entsprechende Antikörper im Patientenmaterial nachzuwei- sen. Dieser Nachweis von Antikörpern, die gegen Antigene der Reiter-Treponemen gerichtet sind, ist hingegen nicht geeignet, um spezifisch auch diejenigen Antikörper nachzuweisen, die gegen den eigentlichen Erreger der Syphilis (Treponema pallidum) gerichtet sind.
Das Testformat der US3564089 ermöglicht keine getrennte Detektion der Antikörperreaktion mit den Reiter-Antigenen bzw. den VDRL-Antigenen. Vielmehr ist die nachgewiesene Antikörperreaktivität die Summe beider Reaktivitäten. Eine separate Detektion der verschiedenen Antikörperreaktivitäten in dem Patientenmaterial, wie z.B. einerseits die Reaktivität mit den Treponemen-spezifischen Antigenen und andererseits dem VDRL- Antigenen, hat jedoch Vorteile in der Diagnostik, wie an späterer Stelle noch ausführlich erläutert wird.
Die aus dem Stand der Technik bekannten zur serologischen Bestätigung geeigneten Nachweisverfahren erlauben keine quantitative Bestimmung der Antikörper in der Patientenprobe und keine Unterscheidung zwischen verschiedenen Reaktivitäten im Analysenmaterial. Ferner haben sie den Nachteil, dass sie es praktisch nicht ermöglichen, zu bestimmen, ob eine Treponemainfektion noch akut oder bereits abgeklungen ist. Dies beruht unter anderem darauf, dass Antikörper gegen Treponemaantigen noch sehr lange nachweisbar sind, selbst wenn die eigentliche Infektion - das heißt das Vorliegen von Erregem - bereits abgeklungen ist. Ferner sind die Tests aus dem Stand der Technik teilweise umständlich von der Verfahrensführung und somit für den Routinebereich und Hochdurchsatztechnologien ungeeignet.
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren anzugeben, die einerseits möglichst einfach zu handhaben sind und ferner eine serologische Verlaufskontrolle des tatsächlichen Infektionsgrads ermöglichen.
Das vorliegende Problem wird gelöst durch einen Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, der mindestens ein immobilisiertes Cardiolipin und mindestens ein immobilisiertes Treponema-spezifisches Antigen enthält.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Cardiolipin zusammen mit Lecithin und Cholesterin eingesetzt. Diese Kombination aus Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin wird im Folgenden auch als VDRL-Antigen bezeichnet. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das VDRL-Antigen die genannten Bestandteile in folgenden Massenverhältnissen Cardiolipin : Lectihin : Cholesterin in den Verhältnissen 0,1 bis 4,0: 1 bis 5,0: 1 bis 10,0. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Massenverhältnisse 1 bis 3,0 für Cardiolipin : 1 bis 3 für Lecithin : 5 bis 10 für Cholesterin.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger mehrere Positionen mit Cardiolipin, mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier Positionen, an denen das Cardiolipin in verschiedenen Konzentrationen vorliegt. Diese Konzentrationen sind für die einzelnen Positionen vorzugsweise wie folgt: 0,10 bis 1,00 mg/ml (Position 1), 0,05 - 0,50 mg/ml (Position 2), 0,02 bis 0,2 mg/ml (Position 3), 0,01 bis 0,1 mg/ml (Position 4).
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger mehrere Positionen mit VDRL-Antigen, mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier Positionen, an denen das VDRL-Antigen in verschiedenen Konzentrationen vorliegt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier verschiedene Tre- ponema-spezifische Antigene, wobei jedes Antigen in einer unterschiedlichen Position auf dem Träger immobilisiert ist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Treponema-spezifischen Antigene ausgewählt aus Antigenen von Treponema pallidum, vorzugsweise handelt es sich hierbei um die 15 kD, 17 kD, 44,5 kD und 47 kD Antigene.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Träger weitere Kontrollen, die geeignet sind, die sachgemäße Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anzuzeigen. Zu diesen Kontrollen zählt bspw. eine Serumkontrolle, vorzugsweise Protein A. Diese Kontrolle zeigt an, dass der Teststreifen in der Tat beim Durchführen des Verfahrens mit Serum in Kontakt gebracht worden ist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Kontrolle eine sog. Cut-Off- Kontrolle dar, welche bspw. eine Verdünnung von gereinigtem humanem Immunoglobu- lin enthält. Diese Kontrolle dient der Auswertung, indem ein schwächeres Signal als die Cut-off-Kontrolle einem negativen Testergebnis entspricht, während ein stärkeres Signal einem positiven Testergebnis entspricht. Als Trägermaterialien kommen Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidendifluorid), Nylon, Celluloseacetat, Polystyrol in Betracht, wobei Nitrocellulose besonders bevorzugt ist. Es hat sich gezeigt, dass beim Einsatz von Nitrocellulose ein besonders gutes Signal- Hintergrundverhältnis, insbesondere für das VDRL-Signal erhalten wird.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellen Kontrollen sogenannte Konju- gat-Kontrollen dar. Diese Kontrollen zeigen an, dass der Teststreifen in der Durchführung mit dem entsprechenden Konjugat, welches gegen humanes IgG bzw. humanes IgM bzw. humanes IgA gerichtet ist, in Kontakt gebracht worden ist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger als Teststreifen ausgestaltet, insbesondere in einem Format, das den Einsatz in herkömmlichen Verfahren der Immundiagnostik erlaubt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Träger als Westernblot ausgestaltet. Dabei enthält der Träger die diversen Reagenzien in immobilisierter Form.
Das oben genannte technische Problem wird ebenfalls gelöst durch ein Verfahren zur Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein oben genannter Träger mit einer Patientenprobe in Kontakt gebracht wird und so das Vorliegen von Antikörpern gegen ein Treponema-Antigen und/oder Cardiolipin in der Patientenprobe bestimmt wird.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Patientenprobe um eine Blut-, Serum-, Plasma-, Liquor- oder Synovialflüssigkeitsprobe des zu untersuchenden Patienten. Der Verfahrensablauf entspricht den üblichen Verfahren auf dem Gebiet der Immundiagnostik und ist dem Fachmann geläufig.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Träger nach der Testdurchführung mit der Auswertesoftware ViraScan® (automatisch) ausgelesen und ausgewertet. Die Träger werden mit ViraScan® densitometrisch analysiert. Dabei werden die Intensitäten der VDRL-IgG- und VDRL-IgM-Banden und die Treponemen-spezifischen- Antigenbanden mit der Cut-off-Kontrollbandenintensität, die sich ebenfalls auf den Trä- gern befindet, verglichen. Dies erlaubt eine quantitative Bestimmung der Antikörperreaktivitäten.
Das oben genannte technische Problem wird ferner gelöst durch einen Testkit zur Diagnose einer Treponemainfektion und/oder der Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, wobei der Testkit einen eingangs genannten Träger enthält sowie die weiteren Reagenzien zur Durchführung des diagnostischen Verfahrens sowie eine Gebrauchsanleitung zur Durchführung des Assays.
Mit dem neuen Testverfahren bzw. Träger können in einem Ansatz sowohl Treponema pallidum spezifische Antikörper jeweils gegen das 47 kD -, das 44,5 kD -, das 17 kD und das 15 kD Protein als auch Antikörper gegen das VDRL Antigen (Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin), insbesondere Cardiolipin, nachgewiesen werden.
Durch die Kombination von Treponema pallidum spezifischen Antigenen (47 kD -, 44,5 kD-, 17 kD-, 15 kD - Proteine) mit nicht-Treponema pallidum Antigenen (z.B. Cardiolipin) in einem Testformat kann gewährleistet werden, dass eine sicherere, besser automatisierbare und aussagekräftigere Syphilis-Diagnostik erfolgen kann.
Im Rahmen der Stufendiagnostik zur Diagnose der Syphilis ist es somit möglich, nach einem Screening Test (TPPA, TPHA, TPLA, Tp Elisa) anschließend mit dem erfindungsgemäßen Träger bzw. Verfahren sowohl die serologische Bestätigungsreaktion, als auch die Analyse zur Feststellung der Behandlungsbedürftigkeit, als auch die serologische Verlaufskontrolle durchführen zu können.
Insbesondere die Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion wird mittels des erfindungsgemäßen Trägers zuverlässig und einfach möglich. Das mit VDRL-Antigen erhaltene Meßsignal ist eine zuverlässige Größe für den Grad der Treponemainfektion. Während die in der Patientenprobe vorliegende Reaktivität mit den Treponema-Antigenen relativ unabhängig ist von dem Grad der Infektion (d.h. der Schwere der Infektion) gibt das VDRL-Signal hierzu aussagekräftigere Werte.
Bei der Auswertung der VDRL-Signale werden die Intensitäten der einzelnen VDRL- Banden mit der Intensität der Cut-off Kontrollbande verglichen und mit 0, 1 oder 2 Vi- raBlot Einheiten bewertet, je nachdem ob die VDRL-Banden schwächer, gleich stark oder eindeutig stärker als die Cut-off Kontrollbande erscheinen. Die Summe der einzelnen VDRL-ViraBlot Einheiten gibt die Reaktivität der vorhandenen Lipoidantikörper an. Hierbei korreliert die Zunahme der Summe der VDRL-ViraBlot Einheiten mit einer Zunahme der Reaktivität der Lipoidantikörper. Eine ViraBlot-Einheit bedeutet dabei, dass der Wert 1 vorgegeben wird, wann ein Signal, das mit einer VDRL-Bande beobachtet wird, die gleiche Intensität aufweist wie das Signal, das mit Cut-off Kontrollbande erhalten wird. 0 bedeutet dabei, dass das Signal der VDRL-Bande deutlich schwächer ist als das Signal der Cut-off Kontrollbande und der Wert 2 bedeutet, dass die Intensität der VDRL-Bande deutlich höher ist, als die Intensität der Cut-off Kontrollbande. Je höher die Anzahl der so ermittelten ViraBlot-Einheiten ist, um so größer ist die Reaktivität von Antikörpern in der Analysenprobe mit den VDRL-Banden.
Schließlich erlaubt der erfindungsgemäße Träger und das damit ausgeführte Verfahren eine Unterscheidung zwischen den Antikörperklassen IgG und IgM, die gegen VDRL gerichtet sind. Dies hat insbesondere auch Vorteile bei der Diagnose, z.B. bei der Beurteilung der Behandlungsbedürftigkeit von Kindern mit fraglicher konnataler Syphilis.
Es war insbesondere überraschend, dass es gelungen ist, die körpereigenen Lipide (Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin) derart auf einen festen Träger zu immobilisieren, dass deren Reaktivität mit den Antikörpern des Patientenmaterials erhalten bleibt. Dies war keineswegs zu erwarten, da es sich bei den Lipidstrukturen, insbesondere beim Cardiolipin, um relativ labile dreidimensionale Strukturen handelt, so dass das Aufbringen auf einen festen Träger ein hohes Risiko der Zerstörung der relevanten Epitope darstellte. Überraschenderweise bleiben die diagnostisch relevanten Epitope jedoch auch nach Fixierung auf dem festen Träger erhalten und erlauben somit einen raschen, einfachen und dennoch sicheren Nachweis der gegen Cardiolipin gerichteten Antikörper.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Träger mit VDRL-Antigenen verschiedener Konzentrationen sowie mit vier verschiedenen Treponema pallidum Antigenen, Serumkontrolle und Cut-off Kontrolle
Abbildung 2 zeigt erfindungsgemäßige Träger für die VDRL-lgG-Verlaufskontrolle bei einem Patienten mit Lues II
Abbildung 3 zeigt die Korrelation von VDRL ViraBlot Einheiten mit den bekannten, herkömmlich ermittelten, VDRL- oder Cardiolipin-KBR Titer
Abbildung 4 zeigt IgG und IgM- Antworten der erfindungsgemäßen Träger nach einer Reaktion mit menschlichem Serum bei einem Lues II Patienten mit HIV Infektion Abbildung 5 zeigt IgG und IgM- Antworten der erfindungsgemäßen Träger nach einer Reaktion mit menschlichem Serum bei einer Mutter und ihrem Kind mit fraglicher kon- nataler Syphilis
Die folgenden Beispiele erläutern weiterhin die Erfindung.
Abbildung 2 zeigt Teststreifen vom Typ IgG zur VDRL-Antigen-Verlaufskontrolle bei einem Lues II Patienten. Die Tests wurden im Abstand von je einem Monat, in einem Zeitraum von 3 Monaten durchgeführt. Die Treponema spezifischen Antigenbanden sind auf jedem der Teststreifen deutlich erkennbar. Bei den VDRL-Antigenbanden, ist der Abfall des VDRL-IgG Titers im Verlauf der abklingende Infektion nach Therapie gut zu sehen.
Die VDRL ViraBlot Einheiten korrelieren mit den bekannten, herkömmlich ermittelten, VDRL oder Cardiolipin-KBR Titem. Diese Korrelation wird im Folgenden in Abbildung 3 dargestellt.
In Abbildung 4 sind Treponema+VDRL ViraBlot IgG und IgM-lmmunoantworten zu Lues II bei einem HIV Patienten dargestellt. Die Banden der Treponemen spezifischen Antigene 47 kD, 44,5 kD, 17 kD und 15 kD sind jeweils im IgG und IgM deutlich erkennbar. VDRL-Banden sind nur im IgM und nicht im IgG deutlich sichtbar.
Summiert man die einzelnen ViraBlot-Einheiten für die VDRL-ViraBlot IgG- und IgM- Antikörperbefunde auf und wertet diese mit den Treponema spezifischen Banden aus, so sieht man, dass der Patient, je nach Klinik, entweder kürzlich einer Infektion unterlag oder sich noch in einer aktiven Syphilis-Phase befindet. Das Aufbringen von VDRL- Antigenen und Treponema spezifischen Antigenen auf einem Träger, vereinfacht die Testdurchführung und lässt eine schnelle serodiagnostische Aussage auf einem Blick zu. Anstatt wie bisher zwei Tests hintereinander durchzuführen (z.B. VDRL und 19S-lgM- FTA-ABS), sind diese nun in einem Schritt integriert.
In Abbildung 5 sind die Immunoreaktivitäten von VDRL und Treponema spezifischen Antigenen im IgG und IgM Imunoassay bei einer Mutter und ihrem Kind mit Verdacht auf konnatale Syphilis dargestellt. Im IgG bei Mutter und Kind und im IgM bei der Mutter sind jeweils die Banden für die Antigene 47 kD, 44,5 kD, 17 kD und 15 kD deutlich erkennbar. Die Summe der einzelnen ViraBlot-Einheiten für die VDRL-ViraBlot IgG- und IgM- Antikörperbefunde bei der Immunantwort der Mutter zeigen eine eindeutige Reaktion für die Lipoidantikörper. Treponema spezifische IgG und IgM Banden, zusammen mit den VDRL- ViraBlot IgG- und IgM- Antikörperbefunden zeigen somit an, dass die Mutter erst kürzlich einer Treponema-Infektion unterlag, oder je nach Anamnese, sich noch in einer aktiven Infektionsphase befindet.
Da IgM-Antikörper in der Regel nicht diaplazentar auf den Fetus übertragen werden, würde eine Therapiebedürftigkeit erst bestehen, wenn beim Neugeborenen Treponema spezifische IgM- Antikörper und/oder IgM-VDRL-Antikörper auf eine Infektion hindeuten, was in diesem Beispiel nicht der Fall ist. Daher lässt der Nachweis von IgG-Antikörpem beim Kind in diesem Falle darauf schließen, dass sie diaplazentar von der Mutter übertragen worden sind.
Im Gegensatz zu den herkömmlichen Tests unterscheidet die hier vorliegende Erfindung zwischen anti-VDRL-IgG- und anti-VDRL-IgM-Antikörpern. Diese Differenzierung ermöglicht eine bessere Aussage der Behandlungsbedürftigkeit bei einem Kind mit fraglicher konnataler Syphilis.
Nach den herkömmlichen Testverfahren und den daraus resultierenden Ergebnissen (TPPA, 19S-IGM-FTA-ABS, IgG-FTA-ABS und Cardiolipin-KBR) wäre das Kind in diesem Beispiel therapiert worden, insbesondere da der Cardiolipin-KBR Wert positiv ausfällt (1:40).
Mit der hier vorliegenden Erfindung ergibt sich in diesem Beispiel sowohl für die IgM- VDRL-Antikörper als auch für die Treponema spezifischen IgM-Antikörper ein negatives Testergebnis, das nicht auf eine Therapiebedürftigkeit des Kindes hinweist. Dieses Beispiel belegt den Vorteil eines separaten Nachweises verschiedener Antikörperreaktivitäten in dem Analysenmaterial.
Herstellung des Treponema Testsstreifens
Herstellung des VDRL Antigens
VDRL Antigen wurde aus einer Mischung aus den Einzelkomponenten Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin in Ethanol hergestellt. Cardiolipin wurde aus Rinderherz gereinigt (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA), Lecithin aus Hühnerei (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA) und Cholesterin aus Wollfett (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). Die Einzelkomponenten wurden in Reinheitsstufen von mindestens 98 % eingesetzt. Die Einzelkomponenten lagen jeweils als Trockensubstanz vor und wurden in Ethanol (100%) aufgenommen. Die Konzentration von Cardiolipin betrug 4 g/l in Ethanol (100%), die Konzentration von Lecithin betrug 100 g/l in Ethanol (100%) und die Konzentration von Cholesterin betrug 25g/l in Ethanol (100 %). In der Reihenfolge Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin wurden die Einzelkomponenten entsprechend dem gewünschten Mischungsverhältnis gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 12-24 Stunden im Dunkeln vor einer weiteren Verarbeitung aufbewahrt. In der VDRL Mischung lagen die Massenverhältnisse von Cardiolipin: Lecithin:Cholesterin im Bereich von (0,1- 4,0) : (0,1-5,0) : (0,1-10,0). Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus Cardiolipin: Lecithin:Cholesterin mit einem Massenverhältnis von 2,0:1 ,4:9,0 erzielt.
Herstellung von VDRL - Verdünnungen
VDRL Antigen wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 stufenweise in 1,4- bis 1000 - fachen Verdünnungen hergestellt.
Herstellung von Treponema spezifischen Antigenlösungen
47 kD Protein aus Treponema pallidum (Capricom.USA), 44,5 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA), 17 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA) und 15 kD Protein aus Treponema pallidum (Lee Laboratories, USA) wurden zur Herstellung der Treponema spezifischen Antigenlösungen verwendet. Die Verdünnungen der Antigene erfolgte in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2. Es wurden Konzentrationen zwischen 1 μg/ml und 200 μg/ml pro Antigen verwendet. Gut geeignet haben sich beim 47 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 60 μg/ml, beim 44,5 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 5 μg/ml, beim 17 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 10 μg/ml und beim 15 kD Protein Lösungen mit einer Konzentration von 20 μg/ml.
Immobilisierung der Antigene auf festphasigem Trägermaterial
Als festphasiges Trägermaterial wurde Nitrocelluose (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) eingesetzt. Die entsprechend verdünnten Antigene (Konzentrationen: VDRL: 1 ,40 - fache, 28,6 - fache, 55,6 - fache und 111 , 1 - fache Verdünnung der VDRL Antigenlösung; 47 kD - Protein: 60 μg/ml; 44,5 kD - Protein: 5 μg/ml; 17 kD - Protein: 10 μg/ml; 15 kD - Protein: 20 μg/ml) konnten durch passive Adsorption auf Nitrocellulose als festphasigem Trägermaterial gebunden werden. Die Antigen-Lösungen wurden mit einem Dispensierautomaten mit Tropfengrößen von 10,67 nl bis 85 nl und Flussraten von 0,5 μl/cm bis 5,0 μl/cm aufgetragen. Blockierung freier Bindestellen
Mit Antigen beschichtete Nitrocellulose wurde mit einem Puffer aus Trishydroxymethyla- minomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/l), Milchpulver (40 g/l), pH 7,5, bei 37 °C 30 min inkubiert, anschließend in einem Puffer aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/l), Milchpulver (5 g/l), pH 7,5, bei 37 °C 30 min inkubiert und getrocknet.
Zur weiteren Verwendung wurde die blockierte Nitrocellulose in Streifen geschnitten (Teststreifen).
Entwicklung der Nitrocellulosestreifen mit Probenmaterial
Als Probenflüssigkeit eignen sich Serum, Plasma, CSF (zerebrospinale Flüssigkeit) oder Synovialflüssigkeit.
Der mit Antigen beschichtete Nitrocellulosestreifen (=Teststreifen, zum Beispiel Darstellung 1) wird in 1,5 ml Waschpuffer bestehend aus Trishydroxymethylaminomethan (3,25 g/l), Natriumchlorid (7,51 g/l), Tween 20 (3,83 ml/l), Thimerosal (0,02 g/l), Milchpulver (5 g/l), pH 7,5, bei Raumtemperatur 5 min auf einem Wippschüttler in einer Wanne inkubiert. Anschließend wird der Puffer dekantiert. 20 μl Probenflüssigkeit werden zusammen mit 1,5 ml Waschpuffer auf den Teststreifen gegeben. Der Teststreifen wird 30 min auf dem Wippschüttler inkubiert. Nach der Inkubation mit Probenflüssigkeit wird der Teststreifen dreimal mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer gewaschen und anschließend mit anti- human-IgG oder anti-human-lgM oder anti-human-lgA - alkalische Phosphatase- Konjugat inkubiert. Anschließend wird mit jeweils 1,5 ml Waschpuffer dreimal jeweils 5 min gewaschen. In einem weiteren Waschschritt wird mit destilliertem Wasser für 1 min nachgewaschen und anschließend mit Chromogen/Substrat Lösung (BCIP/NBT) entwik- kelt. Die Entwicklung wird entsprechend der Färbung einer Cut-Off Kontrolle durch Dekantieren der Entwicklungslösung und dreimaliges Waschen mit jeweils 1,5 ml destilliertem Wasser gestoppt.
Interpretation der Färbungen auf den Teststreifen
Auf den Teststreifen werden Färbeintensitäten der Antigenlinien mit der Färbeintensität der Cut-Off Kontrolle verglichen. Eine Färbeintensität kann durch Scannen (handelsübliche Farbscanner; Programm ViraScan®, Viramed, Planegg, Deutschland) der entwik- kelten Teststreifen quantifiziert werden. Aus den Messwerten der Färbeintensitäten wer- den Verhältnisse zur Cut-Off Kontrolle berechnet (Ratio). Ist das Ratio größer oder gleich eins, so wird eine entsprechend gefärbte Antigenlinie als positiv gewertet. Ist das Ratio kleiner als eins aber größer oder gleich 0,5 so wird die entsprechende Antigenlinie grenzwertig gewertet. Ist das Ratio kleiner als 0,5 so wird die entsprechende Antigenlinie negativ gewertet.
Eine oder mehrere positive Antigenlinien der Proteine 47 kD, 44,5 kD, 17 kD oder 15 kD weisen auf das Vorhandensein entsprechender Antikörper in der jeweiligen untersuchten Probe hin.
Eine oder mehrere positive Antigenlinien der aufgetragenen VDRL Verdünnungsstufen weisen auf das Vorhandensein von anti-Cardiolipin-Antikörpern eines entsprechenden Titers hin. Es besteht eine Korrelation zwischen dem VDRL-Titer, ermittelt nach dem herkömmlichen VDRL Testverfahren und der quantifizierbaren Färbeintensität der VDRL Antigenlinien auf dem Teststreifen (Abbildung 3). Somit ist das Trägergebundene VDRL ein geeignetes Mittel zum quantitativen, zumindest semi-quantitativen, Nachweis von Anti-Cardiolipin-Antikörpern und kann somit zur Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion herangezogen werden.

Claims

Ansprüche
1. Träger für die Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, umfassend a) mindestens ein immobilisiertes Cardiolipin und b) mindestens ein immobilisiertes Treponema-spezifisches-Antigen.
2. Träger nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Cardiolipin zusammen mit Lecithin und Cholesterin als VDRL-Antigen vorliegt, wobei diese Produkte vorzugsweise in einem Massenverhältnis Cardiolipin : Lecithin : Cholesterin von 0,1 - 4,0 : 1 - 5,0 : 1-10 vorliegen.
3. Träger nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Cardiolipin in mindestens zwei, vorzugsweise in mindestens drei, besonders bevorzugt in mindestens vier verschiedenen Konzentrationen an unterschiedlichen Positionen des Trägers vorliegt.
4. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier verschiedene Treponema-Antigene in unterschiedlichen Positionen auf dem Träger vorliegen.
5. Träger nach einem Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene ausgewählt werden aus Treponema pallidum spezifischen Antigen, vorzugsweise dem 15kD, 17 kD, 44,5 kD und 47 kD Antigenen.
6. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger weitere Kontrollen umfaßt.
7. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kontrolle eine Serumkontrolle ist, vorzugsweise Protein A.
8. . Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Kontrolle eine Cut-off-Kontrolle ist, vorzugsweise enthaltend gereinigtes humanes Immunglobulin.
9. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Serumkontrolle, welche vorzugsweise Protein A enthält und eine Cut-off-Kontrolle, welche vorzugsweise humanes Immunglobulin enthält, umfasst.
10. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgewählt wird aus Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidendifluorid), Nylon, Celluloseacetat, Polystyrol.
11. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger als Teststreifen zum Einsatz in der Immundiagnostik ausgestaltet ist.
12. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger als Immunoblot ausgestaltet ist.
13. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die auf den Träger aufgetragenen VDRL-Antigenbanden nach Reaktion mit einer Patientenprobe, vorzugsweise ausgewählt aus Blut, Serum, Plasma, Liquor oder Syno- vialflüssigkeit, eine Differenzierung zwischen anti-VDRL-IgG- und anti-VDRL-lgM Antikörpern, ermöglichen.
14. Verfahren zur Diagnostik und/oder Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit einer Patientenprobe in Kontakt gebracht wird und das Vorliegen von Antikörpern gegen ein Treponema-Antigen und/oder ein Cardiolipin bestimmt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktivität von Antikörpern aus dem Patientenserum mit dem Cardiolipin des Teststreifens mehrmals über einen längeren Zeitraum ermittelt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe Blut, Serum, Plasma, Liquor oder Synovialflüssigkeit ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung mittels der Auswertesoftware ViraScan® erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass anti-VDRL-IgG- und anti-VDRL-lgM Antikörper in einer Patientenprobe differenziert werden.
19. Testkit zur Diagnose einer Treponemainfektion und/oder der Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion, enthaltend einen Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und weitere Reagenzien sowie eine Gebrauchsanleitung zur Durchführung des Nachweisverfahrens.
20. Verwendung eines Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Diagnostik und/oder der Verlaufskontrolle einer Treponemainfektion.
PCT/EP2003/012011 2002-10-29 2003-10-29 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion WO2004040311A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03809742A EP1556697B1 (de) 2002-10-29 2003-10-29 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion
AU2003301694A AU2003301694A1 (en) 2002-10-29 2003-10-29 Means and methods for diagnosing a treponema infection
DE50308325T DE50308325D1 (de) 2002-10-29 2003-10-29 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10250368A DE10250368A1 (de) 2002-10-29 2002-10-29 Mittel und Verfahren zur Diagnose einer Treponemainfektion
DE10250368.0 2002-10-29
PCT/EP2002/013088 WO2004040310A1 (de) 2002-10-29 2002-11-21 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion
EPPCT/EP02/13088 2002-11-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004040311A1 true WO2004040311A1 (de) 2004-05-13

Family

ID=32114928

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/013088 WO2004040310A1 (de) 2002-10-29 2002-11-21 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion
PCT/EP2003/012011 WO2004040311A1 (de) 2002-10-29 2003-10-29 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/013088 WO2004040310A1 (de) 2002-10-29 2002-11-21 Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7691581B2 (de)
AT (1) ATE374948T1 (de)
AU (2) AU2002356706A1 (de)
DE (1) DE10250368A1 (de)
WO (2) WO2004040310A1 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1956373A1 (de) * 2005-12-07 2008-08-13 Sekisui Medical Co., Ltd. Reagens zum testen eines antiphospholipid-antikörpers und reagens zum testen eines antikörpers gegen treponema pallidum
USRE43914E1 (en) 1999-06-09 2013-01-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for detecting syphilis using synthetic antigens
US8389229B2 (en) 2005-06-21 2013-03-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Methods, immunoassays and devices for detection of anti-lipoidal antibodies
US8394600B2 (en) 2005-06-21 2013-03-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Methods, immunoassays and devices for detection of anti-lipoidal antibodies
EP1949108B1 (de) * 2005-11-18 2013-09-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Modifizierte cardiolipin und verwendungszwecken dafür
US8778619B2 (en) 2005-11-18 2014-07-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oxidized cardiolipin and uses to detect cardiolipin antibodies

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102183646B (zh) * 2010-12-16 2013-08-21 孙爱华 一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
CN102095861A (zh) * 2011-01-25 2011-06-15 厦门大学附属中山医院 梅毒特异性总抗体和心磷脂抗体免疫印迹试剂盒及其制备
CN102081096A (zh) * 2011-01-25 2011-06-01 厦门大学附属中山医院 梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒及其制备
CN102095858A (zh) * 2011-01-25 2011-06-15 厦门大学附属中山医院 梅毒心磷脂和特异性抗体IgM免疫印迹试剂盒及其制备
CN102095862A (zh) * 2011-01-25 2011-06-15 厦门大学附属中山医院 梅毒特异性IgM抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法
CN102095860B (zh) * 2011-01-25 2013-12-18 厦门大学附属中山医院 梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法
CN102095859A (zh) * 2011-01-25 2011-06-15 厦门大学附属中山医院 梅毒特异性总抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法
CN102520159A (zh) * 2011-12-22 2012-06-27 北京海瑞祥天生物科技有限公司 带有临界值线的酶免疫分析膜条及其判读方法
US8945827B2 (en) 2013-03-13 2015-02-03 Awareness Technology, Inc. Serological methods and diagnostic tests for syphilis antibodies
CN104049081B (zh) * 2013-03-13 2016-03-09 意识科技股份有限公司 针对梅毒抗体的血清学方法和诊断测试
EP3268743B1 (de) 2015-03-10 2020-09-02 Bio-rad Laboratories, Inc. Kombinationstest für treponema- und non-treponema-syphilis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3564089A (en) * 1966-09-29 1971-02-16 Sandra Jean Kiddy Diagnostic reagent for syphilis
WO1991010138A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-11 Baxter Diagnostics Inc. Method to immobilize cardiolipin, phosphatidyl choline and cholesterol to solid phase and immunoassay
WO1997013151A1 (de) * 1995-09-29 1997-04-10 Siegfried Krell Verfahren und mittel zum nachweis von antikörpern gegen treponema pallidum

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478753A (en) * 1993-06-29 1995-12-26 Pb Diagnostic Systems, Inc. Positive calibrator/control composition for an IgM serology assay and an IgM serology assay
FR2712760B1 (fr) 1993-11-19 1996-01-26 France Telecom Procédé pour transmettre des bits d'information en appliquant des codes en blocs concaténés.
EP0985931A3 (de) * 1998-09-04 2000-03-29 Becton Dickinson and Company Rekombinantes-Antigen-Immunoassay zur Diagnose von Syphilis
DE60025605T2 (de) * 1999-06-09 2006-11-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetische antigene zum nachweis von syphilis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3564089A (en) * 1966-09-29 1971-02-16 Sandra Jean Kiddy Diagnostic reagent for syphilis
WO1991010138A1 (en) * 1989-12-27 1991-07-11 Baxter Diagnostics Inc. Method to immobilize cardiolipin, phosphatidyl choline and cholesterol to solid phase and immunoassay
WO1997013151A1 (de) * 1995-09-29 1997-04-10 Siegfried Krell Verfahren und mittel zum nachweis von antikörpern gegen treponema pallidum

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KREBS A ET AL: "LUES, SEUCHE UND SEROLOGIE SYPHILIS UP-TO-DATE, INFECTION AND SEROLOGY", PRAXIS, HUBER, BERN, CH, vol. 71, no. 46, 16 November 1982 (1982-11-16), pages 1807 - 1811, XP009019593, ISSN: 0369-8394 *
LARSEN S A ET AL: "Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis", CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, WASHINGTON, DC, US, vol. 8, no. 1, 1995, pages 1 - 21, XP002259001, ISSN: 0893-8512 *
LEFEVRE J-C ET AL: "EVALUATION OF THE CAPTIA ENZYME IMMUNOASSAYS FOR DETECTION OF IMMUNOGLOBULINS G AND M TO TREPONEMA-PALLIDUM IN SYPHILIS", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 28, no. 8, 1990, pages 1704 - 1707, XP009024599, ISSN: 0095-1137 *
MIRANDA A ET AL: "A comparison of VDRL and immunoassays developed with a recombinant TmpA antigen in the screening of anitbodies to Treponema pallidum", SERODIAGNOSIS AND IMMUNOTHERAPY IN INFECTIOUS DISEASE, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, vol. 8, no. 3/4, 1997, pages 149 - 155, XP009019601, ISSN: 0888-0786 *
PEDERSEN N S ET AL: "ELISA FOR DETECTION OF ANTIBODIES TO THE VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY VDRL ANTIGEN IN SYPHILIS", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 25, no. 9, 1987, pages 1711 - 1716, XP009024598, ISSN: 0095-1137 *
YOUNG H ET AL: "A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis", INTERNATIONAL JOURNAL OF STD AND AIDS, ROYAL SOCIETY OF MEDICINE SERVICES, LONDON, GB, vol. 9, no. 4, April 1998 (1998-04-01), pages 196 - 200, XP009019582, ISSN: 0956-4624 *
ZREIN M ET AL: "Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 33, no. 3, March 1995 (1995-03-01), pages 525 - 527, XP002259000, ISSN: 0095-1137 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE43914E1 (en) 1999-06-09 2013-01-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for detecting syphilis using synthetic antigens
US8389229B2 (en) 2005-06-21 2013-03-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Methods, immunoassays and devices for detection of anti-lipoidal antibodies
US8394600B2 (en) 2005-06-21 2013-03-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Methods, immunoassays and devices for detection of anti-lipoidal antibodies
EP1894011B1 (de) * 2005-06-21 2015-09-30 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Verfahren, immuntests und vorrichtungen zum nachweis antilipoidaler antikörper
EP1949108B1 (de) * 2005-11-18 2013-09-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Modifizierte cardiolipin und verwendungszwecken dafür
US8778619B2 (en) 2005-11-18 2014-07-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oxidized cardiolipin and uses to detect cardiolipin antibodies
US8906603B2 (en) 2005-11-18 2014-12-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Modified cardiolipin and uses therefor
US9081009B2 (en) 2005-11-18 2015-07-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oxidized cardiolipin and uses to detect cardiolipin antibodies
EP1956373A1 (de) * 2005-12-07 2008-08-13 Sekisui Medical Co., Ltd. Reagens zum testen eines antiphospholipid-antikörpers und reagens zum testen eines antikörpers gegen treponema pallidum
EP1956373A4 (de) * 2005-12-07 2009-02-04 Sekisui Medical Co Ltd Reagens zum testen eines antiphospholipid-antikörpers und reagens zum testen eines antikörpers gegen treponema pallidum

Also Published As

Publication number Publication date
US7691581B2 (en) 2010-04-06
WO2004040310A1 (de) 2004-05-13
AU2003301694A1 (en) 2004-05-25
AU2002356706A1 (en) 2004-05-25
US20060171967A1 (en) 2006-08-03
ATE374948T1 (de) 2007-10-15
DE10250368A1 (de) 2004-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2004040311A1 (de) Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion
DE2851150C2 (de) Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe
DE3006899C2 (de)
DE60037362T2 (de) Rückwärtsbestimmung von ABO-Blutgruppen
EP0407904B1 (de) Verfahren zur Bestimmung eines Analyten
DE3002973C2 (de)
DE4140142A1 (de) Multivalentes dextranreagenz zum einsatz in praezipitationstests
DE19920704C1 (de) Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitors gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS
DE19500862C2 (de) Reaktionssäulen für simultane Mehrfachmessung und Verfahren zur Bestimmung von Verbindungen
DE2755689A1 (de) Verfahren zur bestimmung der anwesenheit einer komponente einer immunchemischen reaktion und diagnostisches immunchemisches testmaterial zur durchfuehrung des verfahrens
DE4218257A1 (de) Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Analyten
EP0366092A2 (de) Verfahren zur Bestimmung von für ein Antigen klassenspezifischen Antikörpern und dazu geeignetes Reagenz
EP1556697B1 (de) Mittel und verfahren zur diagnose einer treponemainfektion
DE69715014T2 (de) Glycolipid-komplexe und ihre anwendung.
EP0599803B1 (de) Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern und Antigenen
WO2015180834A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur bestimmung von blutgruppenantigenen mit einem inkompletten antikörper
EP0554657A2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in Gegenwart eines Immunkomplexes
DE19521388C2 (de) Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz
DE10239568A1 (de) Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung
EP0391330B1 (de) Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen Erreger von Infektionskrankheiten in Körperflüssigkeiten, Mittel dazu und ihre Verwendung in diesem Verfahren
EP0453060B1 (de) Verfahren zur Bestimmung von antinukleären Antikörpern
DE3513915A1 (de) Immunologischer testkit
AT399781B (de) Verfahren und reaktionsgemisch zum nachweisen von antikörpern und verfahren zum herstellen des reaktionsgemisches
DE4212706A1 (de) Diagnostisches Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten
WO1999051982A2 (de) Verfahren zur automatisierten, erythrozytenseitigen blutgruppen-bestimmung

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003809742

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003809742

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10533618

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2003809742

Country of ref document: EP