DE69013730T2

DE69013730T2 - Für ganze Zellen geeigneter Satz und Verfahren zu enzymatischen Bestimmungen.

Info

Publication number: DE69013730T2
Application number: DE69013730T
Authority: DE
Inventors: Dominique Carriere
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1989-03-24
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2010-03-24
Also published as: CA2012934A1; EP0389381B1; FI96723C; ATE113725T1; IE901081L; IE66587B1; FR2644894B1; DE69013730D1; FI96723B; FI901468A0; KR900014887A; FR2644894A1; IL93862A0; EP0389381A1; JPH02298866A; PT93548A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zur quantitativen Bestimmung von endogenen Enzymen, die für Zellpopulationen oder Zellunterpopulationen charakteristisch sind, und ein Verfahren zur quantitativen enzymatischen Be-Stimmung unter Verwendung dieses Kits. Das Verfahren zur enzymatischen Bestimmung und der entsprechende Kit sind ferner für die quantitative Bestimmung der Zellen selbst über die quantitative Bestimmung ihrer endogenen Enzyme vorgesehen. Diese quantitativen Bestimmungen sind in der Diagnostik verwendbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die spezifische Immobilisierung einer Zellpopulation durch Immunadsorption an einem festen Träger, und die anschließende quantitative Bestimmung eines speziellen endogenen Enzyms dieser Population oder einer Zellunterpopulation, wobei ein für dieses Enzym geeignetes Substrat und ggfs. die notwendigen Cofaktoren oder Hilfssubstanzen eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird in der folgenden Beschreibung und den folgenden Ansprüchen ein Enzym als endogenes Enzym bezeichnet, das im Cytoplasma der Zelle enthalten ist und dessen Substrat ein Molekül von niederem Molekulargewicht ist, das in das Innere der Zelle einzudringen vermag, wo es durch das Enzym unter Freisetzung eines gefärbten oder fluoreszierenden Reaktionsproduktes in das Medium umgewandelt wird, das die abschließende Messung eines Signals erlaubt, das proportional zur Aktivität des Einzyms ist.
Die Immunadsorption von Zellen ist ein Verfahren, bei dem Zellen an einem festen Träger durch eine Bindung zwischen einem oder mehreren Oberflächenantigenen dieser Zellen und einem oder mehreren spezifischen monoklonalen Antikörpern dieses Antigens oder dieser Antigene zurückgehalten werden.
Das Wissen über Antigene oder Marker der Zelloberfläche hat mit der Entwicklung der Lymphocyten-Mybridombildung und der Entdeckung der monoklonalen Antikörper durch Köhler und Milstein (Nature, 1975, Bd. 256, S. 495-497) enorm zugenommen. Die monoklonalen Antikörper haben es insbesondere ermöglicht, Oberflächenmarker oder Membranantigene von Zellen unterschiedlichster Herkunft nachzuweisen und zu analysieren. Diese Marker (oder Antigene) können unterschiedlicher Art sein: Proteine, Glykoproteine oder Glykolipide. Die gewünschten Charakterisierungen zielen also insbesondere auf die Marker von Geweben und Organen, auf Marker für den Differenzierungszustand oder Aktivierungszustand normaler Zellen und auf die Identifizierung oder Typisierung normaler Zellen oder von Krebszellen ab. Ein besonders wichtiges Anwendungsgebiet betrifft die Untersuchung von Zellinien der Blutbildung (Erythrocyten-, Megakaryocyten-, Granulocyten-, Monocyten- und Lymphocytenlinien).
So haben es beispielsweise die monoklonalen Antikörper erlaubt, die Eigenschaften der Oberfläche von T-Lymphocyten bzw. B-bymphocyten genauer zu erfassen. Die entsprechenden Marker identifizieren allein oder in Kombination die Differenzierungsstadien und die Spezialisierung der Funktion von Lymphocyten. Nach internationaler Übereinkunft sind die Oberflächenmarker von menschlichen Leukocyten in Differenzierungsgruppen oder -klassen (CD) eingeteilt worden, die 1984 im Unterausschuß IUIS-OMS festgelegt wurden und im Bulletin der Weltgesundheitsorganisation 1984, 62 (5), S. 813-815, beschrieben sind.
Monoklonale Antikörper sind mittlerweile unersätzliche Werkzeuge in der klinischen Biologie, die sich mit Zellanalysen befaßt.
Es gibt Verfahren zur Zählung von Zellen, bei denen die Markierung ihrer Oberflächenantigene herangezogen wird. Diese Verfahren sind jedoch häufig langwierig, umständlich und schwierig durchzuführen, und die Ergebnisse hängen mitunter vom Zufall ab.
Eine Gruppe von Verfahren zur Messung von Antigenen basiert auf der quantitativen Bestimmung der Oberflächenmarker der gesamten Zellpopulation. Diese Verfahren erlauben die Messung von Antigenen entweder über eine direkte oder eine indirekte Markierung, die dann meistens in zwei, drei oder vier Schritten durchgeführt wird. In all diesen Fällen trägt das in dem letzten Markierungsschritt verwendete Reagens eine Sonde, bei der es sich entweder um ein Isotop, beispielsweise 1251, für eine immunradiometrische Bestimmung (Brown et al., J. of Immunol. Methods, 1979, Bd. 31, S. 201; Stocker und Heusser, J. of Immunol. Methods, 1979, Bd. 26, S. 87-95) oder ein Enzym für eine immunenzymometrische Bestimmung, am häufigsten eine Peroxidase, eine alkalische Phosphatase oder eine β-Galactosidase (van Leuven et al., J. of Immuno. Methods, 1978, Bd. 23, S. 109-116 - Morris Transplantation, 1983, Bd. 36 (6), S. 719 - J. Baumgarten, Immunol. Methods, 1986, Bd. 94, S. 91-98), handelt.
Es ist festzuhalten, daß die bei diesen Verfahren verwendeten Enzyme analytische Reagentien sind, die bei der Bestimmung in mit einem Antikörper konjugierter Form zugeführt werden, der ein auf der äußeren Oberfläche der Zellmembran freiliegendes Antigen erkennt. Diese Enzyme dürfen demnach nicht mit den endogenen Enzymen der Zelle verwechselt werden, die zur natürlichen Ausstattung der Zelle mit Enzymen gehören.
Die Durchführung dieser Verfahren ist ziemlich schwierig, mühsam und unzuverlässig aufgrund der Notwendigkeit zahlreicher Wasch- und Zentrifugationsschritte, denen das Zellmaterial unterzogen wird; manchmal ist es notwendig, das bei der enzymatischen Reaktion entstehende gefärbte Medium für die abschließende spektrophotometrische Messung zu entnehmen; schließlich ist die chemische Fixierung der Zellen, die das am häufigsten durchgeführte Verfahren darstellt, ursächlich für die irreversible Zerstörung bestimmter Antigene, die gegenüber herkömmlichen chemischen Fixierungsmitteln, wie z.B. Glutaraldehyd oder Methanol (Drover et al., J. of Immunol. Methods, 1986, Bd. 90, S. 275-281), besonders empfindlich sind.
Die Immunadsorption von Zellen an einen festen Träger ist in der Patentanmeldung WO 86/02091 beschrieben, in der es das Ziel ist, unerwünschte Zellen aus Knochenmarkproben zu entfernen, die für Transplantationen vorgesehen sind. In dieser Patentanmeldung werden die Zellen an schwimmenden Mikrokugeln adsorbiert, was die Anbindung des verwendeten Antikörpers an einen festen Träger über eine komPlizierte makromolekulare Struktur, die als Relaisnetz bezeichnet wird, erforderlich macht, die eine bevorzugte Orientierung der Antikörper in bezug auf die Orientierung der entsprechenden zellulären Antigene zu gewährleisten vermag. In dieser Anmeldung wird keine Anwendung dieser Technik auf die quantitative Bestimmung eines in Zellen enthaltenen Enzyms angegeben.
Die Immunadsorption von Zellen ist ferner in der Patentanmeldung WO 84/03151 für eine analytische Anwendung beschrieben. In dieser Anmeldung wird das Ziel verfolgt, die Gewebegruppen zu identifizieren, zu denen die untersuchten Zellen gehören (der Vorgang wird üblicherweise als HLA-Typisierung bezeichnet). Die Adsorption der Zellen geschieht aufgrund von Antikörpern, die in einer besonderen geometrischen Anordnung auf sehr speziellen Trägern (Mikroskopdeckgläsern) angeordnet sind. Die Ergebnisse werden durch einfache visuelle Beobachtung des Trägers erhalten und führen zu 'Alles oder Nichts'-Antworten.
Die bis heute beschriebenen Systeme zur Immunadsorption von Zellen haben nicht zu analytischen Anwendungen geführt, die die quantitative Bestimmung eines spezifischen Markers der Zelle und insbesondere eines zelleigenen Enzyms erlauben.
Das Bestimmungsverfahren, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, weist bemerkenswerte Vorteile in bezug auf alle im Stand der Technik bekannten und verwendeten Verfahren auf, da es die quantitative Messung beliebiger endogener Enzyme einer Zellpopulation erlaubt. Diese quantitative Bestimmung wird mit Zellen durchgeführt, die bei ihrer spezifischen Adsorption keinem chemischen oder physikalischen Eingriff unterzogen wurden und die sich demnach in nicht beeinträchtigtem physiologischen Zustand befinden. Außerdem besitzt das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren hohe Spezifität, wie sie für Systeme zur Doppelerkennung typisch ist, bei denen zwei verschiedene spezifische Marker genutzt werden, die in der gleichen Zelle vorhanden sind, von denen der eine ein Antigen ist, das zur Immunadsorption der zu analysierenden Zellen ausgewählt wird, und der andere ein endogenes Enzym ist, das in den adsorbierten Zellen vorliegt. Dieses Verfahren ist einfach, schnell und reproduzierbar. Es ist vollkommen an die Analyse einer großen Zahl von Proben angepaßt, was seine Anwendung für diagnostische Zwecke in klinisch-biologischen Labors mit großem Durchsatz erlaubt.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur quantitativen Bestimmung mindestens eines endogenen Enzyms, das für eine Zellpopulation oder eine Zellunterpopulation charakteristisch ist, der folgende Bestandteile enthält:
a) einen festen Träger, an den über kovalente Bindungen oder durch physikalische Adsorption ein oder mehrere monoklonale Antikörper gebunden sind, die gegen Oberflächenantigene der untersuchten Zellpopulation gerichtet sind und die für die Immobilisierung der Zellen an dem Träger bestimmt sind, unter denen sich die Zellen der Unterpopulation befinden, die das quantitativ zu bestimmende Enzym enthalten;
b) eine Lösung, die das Substrat enthält, mit dem die Enzymaktivität meßbar ist, wobei dieses Substrat ein Molekül von niederem Molekulargewicht ist, das in das Innere der oben genannten Zellpopulation eindringen kann;
c) eine Pufferlösung, die zum Waschen des festen Trägers bestimmt ist.
Der Kit kann außerdem eine Lösung eines chromogenen Reagens, mit dem die Enzymaktivität meßbar ist, und Proben enthalten, die eine Eichung und die Kontrolle der Qualität der quantitativen Bestimmung erlauben.
Der Begriff Zelle, der in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, umfaßt menschliche und tierische Zellen, insbesondere die Blutzellen einschließlich der Blutplättchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung ist auf ganze Zellen, d.h. nichtlysierte Zellen, anwendbar.
Diese Zellen wurden bei der Immunadsorption keinem physikalischen oder chemischen Eingriff unterzogen und werden in einem physiologisch völlig intakten Zustand verwendet. Dies stellt die beste Garantie für die Unversehrtheit des für die Fixierung verwendeten Antigens und des endogenen Enzyms, das das Ziel der quantitativen Bestimmung ist, dar.
Als feste Träger können alle Vorrichtungen verwendet werden, die für die Handhabung von Zellsuspensionen angepaßt sind, vorzugsweise Rohre, teilchenförmige magnetische Träger oder feste oder flexible Mikrotiterplatten aus Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Nitrocellulose, die Mikrovertiefungen aufweisen. Die für die Immobilisierung der Zellen vorgesehenen monoklonalen Antikörper können an den festen Trägern entweder über kovalente chemische Bindungen oder durch physikalische Adsorption nach herkömmlichen, dem Fachmann wohlbekannten Techniken, wie z.B. den von Stocker und Heusser (J. of Immunol. Methods, 1979, Bd. 26, S. 87-95) beschriebenen Verfahren, fixiert werden. Vorteilhaft kann der Träger vorab mit einem Protein gesättigt werden.
Erfindungsgemäß müssen der oder die an dem festen Träger fixierten monoklonalen Antikörper die Immunadsorption der Zellpopulation erlauben, in der sich die eine oder mehrere Zellpopulationen befinden, die das quantitativ zu bestimmende Enzym enthalten. Wenn diese Population aus menschlichen Zellen besteht, handelt es sich bei den für die Immunadsorption bevorzugten monoklonalen Antikörpern um die Anti-HLA-Antikörper der Klasse I, die spezifisch sind für den Bereich, den die Antigene HLA A, HLA B und HLA C, die auf Leukocyten und den Zellen zahlreicher anderer Zellinien des Organismus vorhanden sind, gemeinsam aufweisen. Gleichermaßen sind die monoklonalen Antikörper bevorzugt, die spezifisch sind für die CD-Antigene, die auf Leukocyten festgestellt wurden. Von diesen Antikörpern ist insbesondere der als S-Klasse I bezeichnete Antikörper bevorzugt, der im Handel von Byosis erhältlich ist.
In anderen Fällen, in denen die untersuchten Zellen menschliche Zellen sind, und in allen Fällen, in denen es sich nicht um menschliche Zellen handelt, können monoklonale Antikörper, die geeignet sind für den Typ der untersuchten Zellen, gleichermaßen bei der erfindungsgemäßen Immunadsorption verwendet werden.
Das Substrat für das quantitativ zu bestimmende endogene Enzym und die Reagentien werden so ausgewählt, daß das Endprodukt der Reaktion oder der Folge von Reaktionen, die durch das Enzym ausgelöst werden, bei Anwendung dieser Substanzen
- eine gefärbte oder fluoreszierende Substanz ist, die in das flüssige Medium, das die Zellen umgibt, diffundiert und die am Ende spektrophotometrisch bzw. fluorimetrisch gemessen wird, oder
- eine unlösliche gefärbte Substanz ist, die sich an den Zellen und den Wänden, an denen die Zellen fixiert sind, niederschlägt und die entweder photometrisch in Reflexion gemessen oder mit dem bloßen Auge, ggfs. durch Vergleich mit einer Reihe geeichter Farbtöne, abgeschätzt werden kann
Die Verwendung eines Chromogens ist nicht notwendig, wenn mit dem Substrat allein eine gefärbte oder fluoreszierende Substanz erzeugt werden kann.
Der Kit zur quantitativen Bestimmung enthält als zusätzlichen Bestandteil eine Pufferlösung, die zum Waschen des festen Trägers nach der Immobilisierung der Zellen bestimmt ist.
Der Kit zur quantitativen Bestimmung kann ferner als weitere zusätzliche Bestandteile die Proben enthalten, die für die Eichung der quantitativen Bestimmung sowie für die Kontrolle der Qualität der quantitativen Bestimmung notwendig sind.
Die vorliegende Erfindung hat ferner ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von endogenen Enzymen einer Zellpopulation oder einer Zellunterpopulation zum Gegenstand, das gekennzeichnet ist durch folgende Schritte:
- Immobilisierung der Zellpopulation, zu der die Unterpopulation gehört, die das endogene Enzym enthält, an einem festen Träger unter Verwendung von einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die zuvor über kovalente Bindungen oder durch physikalische Adsorption an dem oben genannten Träger gebunden wurden und die ein Antigen zu erkennen vermögen, das an der Oberfläche der Zellen vorhanden ist,
- Inkubation während einer bestimmten Dauer, während der die Immunadsorption stattfindet,
- Waschen des festen Trägers zur Entfernung der nicht immobilisierten Zellen,
- Zugabe des oder der für die Ermittlung der Aktivität des endogenen Enzyms benötigten Reagentien (Substrat und ggfs. Chromogen),
- Bestimmung der Ergebnisse durch Messen der Lichtsignale (Färbung oder Fluoreszenz), indem man sich ggfs. auf eine Eichreihe bezieht.
So erfolgt die Erfassung des quantitativ zu bestimmenden endogenen Enzyms, das zu der immobilisierten Zellpopulation oder einer seiner Zellunterpopulationen gehört, unmittelbar mit einem für dieses endogene Enzym spezifischen Substrat, woran anschließend die eigentliche quantitative Bestimmung des endogenen Enzyms durch photometrische Messung in Transmission oder in Reflexion oder durch Messung der Fluoreszenzemission durchgeführt wird.
Der erfindungsgemäße Kit und das erfindungsgemäße Verfahren sind besonders einfach anwendbar, da, wenn man über zuvor hergestellte Träger für die Immunadsorption verfügt, darüber hinaus nur eine oder mehrere Lösungen erforderlich sind, welche die speziellen Reagentien (Substrat und ggfs. Chromogen) enthalten, die für die Messung der Enzymaktivität benötigt werden.
Der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung und das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren lassen sich vorzugsweise für die quantitative Bestimmung von endogenen Enzymen von festen Bestandteilen des menschlichen Blutes, insbesondere von Leukocyten und vor allem von Granulocyten, verwenden.
Der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung und das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren erlauben die Messung von Signalen (absorbiertes oder emittiertes Licht), die sowohl von der Anzahl der in der untersuchten Zellpopulation vorhandenen Zellen als auch der Konzentration des gemessenen endogenen Enzyms in den Zellen abhängt. Die Messung dieser Signale erlaubt eine quantitative Bestimmung der Aktivität von Molekülen dieses Enzyms, die in den Zellen der untersuchten Zellpopulation oder Zellunterpopulation enthalten sind.
Bei einer Anwendung der Erfindung wird eine Mikrotiterplatte als fester Träger ausgewählt. Der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung und das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren können also vorteilhaft zur quantitativen Bestimmung einer Reihe von endogenen Enzymen auf einer einzigen Platte verwendet werden, die charakteristisch sind für verschiedene Unterpopulationen, die Bestandteile der untersuchten Zellpopulation darstellen. Für diese Anwendung kann man einerseits gebrauchsfertige Mikrotiterplatten verwenden, auf denen zuvor ein oder mehrere monoklonale Antikörper fixiert worden sind, die alle Zellen der untersuchten Population zurückzuhalten vermögen, und andererseits hat man eine Reihe von Substraten zur Vertügung, von denen jedes spezifisch ist für ein endogenes Enzym, das für eine der zu bestimmenden Unterpopulationen charakteristisch ist. So ist auf einem einzigen Träger die quantitative Bestimmung von allen endogenen Enzymen möglich, die für die Charakterisierung der ausgewählten Unterpopulationen notwendig sind.
Als Beispiel für eine Anwendung der Erfindung kann die Untersuchung der menschlichen Leukocyten genannt werden, bei denen es insbesondere eine Zellunterpopulation von Zellen gibt, die als polymorphkernige Leukocyten oder als Granulocyten bezeichnet werden.
Das Vorliegen menschlicher Granulocyten kann im Blut oder im Urin festgestellt werden. So ist es bei Harnröhreninfektionen, wie z.B. der Cystitis oder der Pyelonephritis, von besonderer Bedeutung, ein einfaches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Granulocyten im Urin zur Verfügung zu haben.
Der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung und das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren können zur quantitativen Bestimmung von Granulocyten verwendet werden. In diesem Fall wird die spezifische Immobilisierung der Granulocyten der untersuchten Probe an einem festen Träger durchgeführt, woraufhin die quantitative Bestimmung eines für die Granulocyten charakteristischen endogenen Enzyms unter Verwendung eines geeigneten Substrats erfolgt. Die Myeloperoxidase ist ein solches endogenes Enzym der Granulocyten, und seine quantitative Bestimmung wird unter Verwendung von Wasserstoffperoxid als Substrat für die Peroxidase durchgeführt.
Um eine spezifische Immobilisierung von Granulocyten zu erzielen, werden monoklonale Anti-CD15-Antikörper verwendet, die beispielsweise an einem festen Träger fixiert sind, wie z.B. den Wänden der Mikrovertiefungen von Mikrotiterplatten.
Die so hergestellten Platten können lyophilisiert und vorzugsweise bei 4 ºC gelagert werden. Dieser Schritt kann im technischen Maßstab durchgeführt werden, so daß man gebrauchsfertige Platten für Kits zur quantitativen Bestimmung, die für Granulocyten aus der zu untersuchenden Blutprobe oder dem zu untersuchendem Urin verwendbar sind, zur Verfügung hat.
Die Proben, welche die quantitativ zu bestimmenden Zellen enthalten und von Blut oder einer beliebigen anderen geeigneten, normalen oder pathologischen biologischen Flüssigkeit, insbesondere Urin, stammen, können als solche oder nach einer Aufbereitung, insbesondere nach Aufkonzentrierung, verwendet werden.
Aliquote Teile der geeigneten Zellsuspension werden mit dem festen Träger in Kontakt gebracht, beispielsweise in Rohren, die den in Mikropartikeln vorliegenden Träger für die Immunadsorption enthalten, oder in Mikrovertiefungen einer zuvor hergestellten Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen wird die zum Kit zur quantitativen Bestimmung gehörende Lösung zugegeben, die das spezifische Substrat für das endogene Enzym enthält, das für die anvisierte Zellpopulation charakteristisch ist.
Die für die Immobilisierung der Zellen benötigte Zeit beträgt vorzugsweise 15 min oder weniger. Während dieser Dauer kann man den festen Träger zentrifugieren, um die Immobilisierung der Zellen zu verbessern. Der feste Träger, beispielsweise das Rohr oder die Mikrotiterplatte, wird anschließend zur Entfernung der nicht fixierten Zellen gewaschen.
Ein gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt tritt auf, indem zu dem festen Träger, an dem die Zellpopulation fixiert wurde, die das quantitativ zu bestimmende endogene Enzym enthält, eine Lösung gegeben wird, die das Substrat für das Enzym enthält, und indem erforderlichenfalls ein oder mehrere Hilfsreagentien zugegeben werden, mit denen schließlich als Reaktionsprodukt entweder ein in dem Medium lösliches gefärbtes Produkt, ein unlösliches gefärbtes Produkt oder ein lösliches fluoreszierendes Produkt erhalten werden kann, wie dies zuvor erläutert worden ist. Anschließend wird ein von den so behandelten Proben stammendes optisches Signal mit einer dem jeweiligen Fall angepaßten Apparatur, d.h. einem Transmissionsphotometer, einem Reflexionsphotometer bzw. einem Fluorimeter, gemessen. Wenn der feste Träger eine Mikrotiterplatte ist, kann das optische Signal nacheinander in allen Vertiefungen derselben Platte mit einem automatisierten Meßgerät, das üblicherweise in biologischen Labors verwendet wird, gemessen werden, beispielsweise mit den für Mikrotiterplatten verwendeten Meßgeräten Titertek und Fluoroscan, für die spektrophotometrische bzw. die fluorometrische Messung.
Die Reagentien, die zur Erfassung der endogenen Peroxidase oder der endogenen Myeloperoxidase verwendet werden, enthalten Wasserstoffperoxid, welches das Substrat für das Enzym ist, und ein geeignetes Chromogen, beispielsweise o-Phenylendiamin, 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure) (ABTS), um ein gefärbtes und in dem Medium lösliches Endprodukt der Reaktion zu erhalten, oder 3,3'- Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol oder 4-Chlor-α- naphthol, um ein unlösliches Endprodukt der Reaktion zu erhalten, oder p-Hydroxyphenylpropionsäure, um ein in dem Medium lösliches fluoreszierendes Reaktionsprodukt zu erhalten.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung der Myeloperoxidase, die für Granulocyten charakteristisch ist:
a) eine Mikrotiterplatte, in deren Vertiefungen ein oder mehrere monoklonale Anti-Granulocyten-Antikörper fixiert wurden,
b1) eine Lösung, die Wasserstoffperoxid und das Substrat für das Enzym in einem geeigneten Puffer enthält,
b2) eine Lösung, die das Chromogen, das zur Erfassung der Enzymaktivität verwendet wird, und ggfs. ein Reagens enthält, das die Permeabilität der Zellmembranen verbessert.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Kit zur quantitativen Bestimmung der Myeloperoxidase, die für Granulocyten charakteristisch ist, Rohre oder teilchenförmige magnetische Träger als feste Träger, auf denen ein oder mehrere monoklonale Anti-Granulocyten-Antikörper fixiert wurden.
Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen quantitativen Bestimmung von endogenen Enzymen können in jeder für die durchgeführte Untersuchung geeigneten Weise ausgedrückt werden. Insbesondere können diese Ergebnisse in Form der Gesamtaktivität eines bestimmten endogenen Enzyms, das in einem gegebenen Volumen der untersuchten Probe enthalten ist (beispielsweise pro Mikroliter Blut), ausgedrückt werden.
Zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten endogenen Enzyms in der untersuchten Probe wird vorzugsweise eine Eichkurve aus einer Reihe von Eichproben verwendet, die aus geeigneten Zellen oder Zubereitungen bestehen, die das quantitativ zu bestimmende endogene Enzym enthalten und die zuvor nach einem bekannten Referenzverfahren geeicht wurden. Diese Eichproben bestehen vorzugsweise entweder aus Zellen gleicher Herkunft wie die Zellen, die Gegenstand der quantitativen Bestimmung sind, oder aus Zellen von etablierten Zellinien, die das gewünschte endogene Enzym enthalten, oder aus zellfreien Zubereitungen, die das gewählte Enzym enthalten.
Diese Eichproben werden dann genauso behandelt wie die zu untersuchenden Proben. Die sich dabei ergebenden Signale dienen der Aufstellung einer Eichkurve, auf die die mit den zu untersuchenden Proben gemessenen Signale bezogen werden. Nachfolgende Berechnungen werden in herkömmlicher Weise durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen enzymatischen Bestimmung ist einfach, schnell und reproduzierbar. Sein Einsatz ist vollständig an die Analyse einer großen Anzahl von Proben angepaßt. Die Vorteile im Vergleich mit den anderen beschriebenen Verfahren werden verständlich, wenn man die verschiedenen Schritte analysiert.
Die Immobilisierung der Zellen an dem festen Träger ist das Stadium der quantitativen Bestimmung, das üblicherweise die meisten Schwierigkeiten mit sich bringt oder dessen Durchführung am kritischsten ist. Die chemische Fixierung der Zellen mit Glutaraldehyd oder Methanol in ggfs. mit Poly-L- lysin behandelten Bechern (F. van Leuven et al., J. of Immunol. Methods, 1978, Bd. 23, S. 109) stellt den am häufigsten eingeschlagenen Weg dar. Die so durchgeführten chemischen Fixierungen können jedoch den gewünschten spezifischen Nachweis verschlechtern oder sogar unterdrücken oder im Gegenteil fälschlich positive Markierungen von Zellen hervorrufen, was einen sehr schwerwiegenden Nachteil darstellt (Drover und Marshall, J. of Immunol. Methods, 1986, Bd. 90, S. 275-281).
Außerdem macht die Durchführung des Verfahrens der chemischen Fixierung mehrere Schritte erforderlich: Die Zentrifugierung der Zellen, die Herstellung des Gemischs des Fixierungsmittels, die Fixierung und anschließend das mehrmalige Waschen der fixierten Zellen.
Ferner ist die Trocknung der Zellen bei 37 ºC, auf die ggfs. eine Fixierung mit Methanol in den Mikrovertiefungen folgt vorgeschlagen worden (Baumgarten, J. of Immunol. Methods, 1986, Bd. 94, S. 91-98). Allerdings kann die Dehydratisierung der Zellen bei 37 ºC bestimmte empfindliche Antigene, die für die Immunadsorption der Zellen brauchbar sein könnten, sowie die quantitativ zu bestimmenden endogenen Enzyme verändern.
Außerdem ist die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens zweifelhaft; das Dekantieren der Zellen in den Mikrovertiefungen bei der quantitativen Bestimmung und die Trocknung der Zellen können von einem Experiment zum nächsten variieren. Schließlich ist die Durchführung der quantitativen Bestimmung langwierig, da der Schritt der Trocknung der Zellen allein mehr als 2 h erfordert.
Die Immobilisierung von Lymphocytenpopulationen ist auch unter Einsatz von in Mikrovertiefungen adsorbierten polyklonalen Antikörpern erreicht worden (Stocker und Heusser, J. of Immunol. Methods, 1979, Bd. 26, S. 87-95). Bei diesem Verfahren ist auch eine Immobilisierung von Zellen möglich, die nicht zu der einzigen Population gehören, die analysiert werden soll, was auch einen gewissen Nachteil darstellt.
Die Verwendung von hochspezifischen und gereinigten monoklonalen Antikörpern, die an dem festen Träger, insbesondere in den Vertiefungen für die quantitative Bestimmung, den Rohren oder an dem teilchenförmigen Träger adsorbiert oder fixiert sind, erlaubt die ausschließliche Bindung der angestrebten Zellen, wobei die anderen, nicht zurückgehaltenen Zellpopulationen während der durchgeführten Waschschritte entfernt werden. Außerdem verändert in diesem Schritt kein chemisches oder physikalisches Mittel die Eigenschaften der Antigene, da die verschiedenen Arbeitsgänge entfallen, die für die chemische oder physikalische Fixierung der Zellen an dem Träger vorgesehen sind.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Immobilisierung der Zellen durch monoklonale Antikörper ein Verfahren darstellt, das eine Vereinfachung des Schritts der Immobilisierung der Zellen, die das quantitativ zu bestimmende Enzym enthalten, ermöglicht, was die Ergebnisse zuverlässiger macht.
Zum erfindungsgemäßen Verfahren gehört die Durchführung der Immunadsorption ganzer Zellen, ohne daß hierbei physikalisch oder chemisch auf die Zellen eingewirkt wird. Die Messung der Aktivität eines endogenen Enzyms in allen Zellen oder in einem Teil davon durch Einsatz eines für das Enzym spezifischen Substrats erlaubt erstmalig die quantitative Bestimmung der gewählten endogenen Enzyme in den Zellen selbst.
Erfindungsgemäß gestattet die direkte Markierung der immunologisch immobilisierten Zellen:
- einen sparsamen Verbrauch an Reagentien,
- die Erzielung einer verbesserten Zuverlässigkeit durch Verringerung der Anzahl an Schritten und Handhabungen,
- einen Zeitgewinn,
- die Möglichkeit, gleichzeitig, unter ausschließlichem Einsatz von üblichen Materialien und Vorrichtungen, eine große Anzahl an Proben zu behandeln.
Für die Immobilisierung der quantitativ zu bestimmenden Zellpopulation oder Zellunterpopulation wird nur wenig Zeit benötigt. Sie beträgt höchstens 15 min für die quantitative Bestimmung von Granulocyten im Blut oder im Urin. Ebenso dauert die quantitative Bestimmung der Aktivität des endogenen Enzyms höchstens 15 min.
Nach Waschen des festen Trägers wird die eigentliche quantitative Bestimmung durch Erfassung eines genau und einfach zu messenden Signals mit herkömmlichen Vorrichtungen zur Messung der Absorption oder Emission von Licht durchgeführt.
Dementsprechend weist das erfindungsgemäße Verfahren insgesamt zahlreiche Vorteile auf: Es ist schnell, zuverlässig, ökonomisch und einfach durchführbar.
Es wurde nachgewiesen, daß die aufgezeichneten Signale (photometrische Messungen) die Aufstellung korrekter und befriedigender Eichkurven in Abhängigkeit von der Zahl der eingesetzten Zellen unter herkömmlichen Arbeitsbedingungen erlauben.
In den nachstehenden Beispielen werden folgende Begriffe und Abkürzungen verwendet:
BSA: Rinderserumalbumin
PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung von pH 7,4.

Beispiel 1

Quantitative Bestimmung der Myeloperoxidase mehrkerniger Leukocyten des menschlichen Blutes: Durchführung der quantitativen Bestimmung auf Mikrotiterplatten

Die Myeloperoxidase ist ein Glykoprotein-Enzym, das eine Häm-Struktur aufweist. Dieses reichlich in den polymorphkernigen Leukocyten des menschlichen Blutes vorhandene Enzym ist an den bakteriziden und antimikrobiellen Funktionen der Zellen beteiligt (S.J. Klebanoff, J. of Bacteriol., 1968, Bd. 95, S. 2131; Diamond et al., J. of Clin. Invest., 1980, Bd. 66, S. 908-917).
Die quantitative Bestimmung der Myeloperoxidase von polymorphkernigen Zellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren umf aßt drei nacheinander durchgeführte Schritte:
1. Abtrennung der polymorphkernigen Zellen aus dem Gesamtblut,
2. Adsorption und selektive Immobilisierung der Zellen mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der zuvor in den Mikrovertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert wurde, und
3. Feststellung der Aktivität des Zellenzyms.

a) Vorbereitung der Platten

Es wird eine Mikrotiterplatte aus Kunststoff verwendet, die im Handel von NUNC (Bezeichnung 64394) erhältlich ist und 96 Mikrovertiefungen aufweist. In jede Mikrovertiefung werden 200 ul einer Lösung gegeben, die den gereinigten monoklonalen Anti-CDIS-Antikörper (als SMY 15a bezeichnet) enthält, der zur Immobilisierung der polymorphkernigen Leukocyten, d.h. zur Durchführung der Immunadsorption, verwendet wird. Dieser im Handel von Biosys, Compiegne, Frankreich, unter der Bezeichnung SMY 15a erhältliche Antikörper wird in einer Konzentration von 5 ug/ml in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) von pH 7,4 verwendet.
Die Adsorption des monoklonalen Antikörpers erfolgt bei 4 ºC während 12 h. Überschüssiger Antikörper wird durch Umdrehen der Platte entfernt.
Man stellt eine Lösung her, die 0,1 % Gelatine und 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA) in einer phosphatgepuf ferten Salzlösung enthält. In jede Mikrovertiefung werden 250 ul dieser Lösung gegeben, um die Oberfläche der Vertiefungen mit dem Protein zu sättigen; dies wird nach 1 h bei 37 ºC erreicht; die Platten werden dreimal mit der phosphatgepufferten Kochsalzlsöung gewaschen. Die so hergestellten Platten werden bei 4 ºC gelagert.

b) Abtrennung der polymorphkernigen Leukocyten

Das Blut wird über einem Antikoagulans (Heparin) entnommen. In ein 5 ml-Hämolyseröhrchen werden nacheinander 2 ml des Trennmediums MONO-POLY (von Flow, Bezeichnung 16.980-49) und dann 2 ml Blut eingebracht. Anschließend wird das Röhrchen 40 min bei Labortemperatur und einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 400 zentrifugiert. Es bilden sich zwei Ringe aus Zellsuspensionen; der untere Ring enthält die polymorphkernigen Zellen, die mit Hilfe einer Mikropipette entnommen werden.

c) Immunadsorption der Zellen

Die Adsorption der Zellen wird mit dem adsorbierten monoklonalen Anti-CD15-Antikörper durchgeführt.
In die Mikrovertiefungen der Platte werden 100 ul der Zellsuspension, die auf 5 10&sup5; Zellen pro Milliliter PBS-Puffer eingestellt ist, gegeben. Zur Verbesserung der Fixierung der Zellen an dem Träger wird die Platte nach 10 min Stehenlassen bei Umgebungstemperatur 3 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 150 zentrifugiert.

d) Erfassung und Messung der Myeloperoxidase

Die Mikrovertiefungen werden durch Umdrehen der Platte entleert. Die Mikrovertiefungen werden zweimal mit 200 ul PBS- Puffer gewaschen, was die Entfernung von unerwünschten Zellpopulationen, wie z.B. Monocyten oder Erythrocyten, erlaubt, die ein Störsignal bei der Messung der Absorption verursachen könnten. Nach dem zweiten Waschen werden in jede Vertiefung 100 ul des unmittelbar zuvor hergestellten Reagens zur Erfassung der Myeloperoxidase zugesetzt.
Dieses Reagens wird folgendermaßen erhalten: Man stellt einen 0,1 M-Citratpuffer her, indem man Citronensäuremonohydrat zu einer Konzentration von 2 % in Wasser auflöst, wonach man den pH-Wert durch Zugabe von 7 N NaOH auf 5 einstellt. Anschließend wird eine 2%ige Ammoniumhexadecyltrimethylbromid-Lösung (CETAB, von Touzart und Matignon, T 5650) in dem Puffer hergestellt. Das Reagens permeabilisiert die Zellmembranen und verbessert die Aktivität der Myeloperoxidase gegenüber dem Substrat. Zu 20 ml dieser Lösung werden vor der Anwendung 30 mg o-Phenylendiamindihydrochlorid und anschließend 40 ul Wasserstoffperoxid (Substrat für das Enzym) gegeben.
Nach 10minütiger Inkubation wird die Absorption mit einem Spektrophotometer bei 450 nm (Gerät Titertek Multiskan Typ 310 C - Flow Laboratories) gemessen.
Die bei einem Versuch mit 50000 Zellen erhaltenen Extinktionswerte sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1 Zellen allein Zellen + Reagens ohne CETAB Zellen + Reagens mit CETAB Extinktion
Die Gegenwart von CETAB in dem Bestimmungsmedium erhöht die optische Dichte, die auf die durch die Myeloperoxidase katalysierte Reaktion zurückzuführen ist, um den Faktor 4, was eine Verringerung der für die quantitative Bestimmung benötigten Zahl der Zellen erlaubt.

Beispiel 2

Quantitative Bestimmung der Myeloperoxidase der polymorphkernigen Leukocyten im Blut oder im Urin: Durchführung der quantitativen Bestimmung auf magnetischen Kugeln

Dieses Beispiel dient dem Nachweis, daß die für die quantitative Bestimmung eines endogenen Enzyms benötigte Zeit im Vergleich zu den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen verringert werden kann, indem das Verfahren zur Immunadsorption der Zellen verändert wird. Der zur Adsorption der Zellen verwendete Träger besteht aus magnetischen Dynabeads-Kugeln. Die Kugeln (Bezeichnung DYN-11001, im Handel von Byosis erhältlich) weisen an ihrer Oberfläche Anti- Immunglobulin-Antikörper der Maus auf. Vor der Verwendung werden die Kugeln 12 h bei 4 ºC mit einer Lösung von monoklonalen Anti-CDIS-Antikörpern (Bezeichnung SMY 15a - Byosis, Frankreich) behandelt. Hierfür werden 25 ul der Suspension der Kugeln mit 0,5 ml Antikörperlösung, die 100 ug Antikörper pro Milliliter PBS-Puffer enthält, gemischt. Die Kugeln werden anschließend dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und danach 12 h bei 4 ºC mit einer Lösung gesättigt, die 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Die gebrauchsfertigen Kugeln werden bei 4 ºC aufbewahrt.
Die quantitative Bestimmung der Myeloperoxidase wird in einem 5 ml-Hämolyseröhrchen durchgeführt; in das Röhrchen werden 300 ul PBS-Puffer, 25 ul der Suspension der Kugeln und 100 ul Gesamtblut, das über Lithiumheparinat gewonnen worden war, gegeben (Vacutainer-Röhrchen, Bezeichnung 606 484). Nach 5 min leichtem Rühren werden die Kugeln mit Hilfe eines Magneten abgetrennt, wonach die an den Kugeln fixierten Zellen mit PBS gewaschen werden (smaliges Waschen).
Die Myeloperoxidase wird mit einem gemischten Reagens erfaßt, welches das Substrat (Wasserstoffperoxid) und das Chromogen (o-Phenylendiamin) enthält und wie in Beispiel 1 mit oder ohne Zusatz von CETAB hergestellt wurde. Die Extinktion wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Die Messung der Myeloperoxidase der Granulocyten, die bei Harnröhreninfektionen im Urin vorhanden sind, ist ein wichtiger Faktor bei der Diagnose der Pyelonephritis und der Pyurie. Im zweiten Teil des Beispiels wurde gezeigt, daß die magnetischen Teilchen, die den gleichen monoklonalen Anti-CD15-Antikörper tragen, die polymorphkernigen Leukocyten aus dem Harn zu binden vermögen. Die quantitative Bestimmung wird mit 400 ul Harn durchgeführt, der etwa 2 10&sup5; Granulocyten pro Milliliter enthält. Die Zellen werden mit 25 ul der Suspension der Kugeln gebunden und anschließend unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorhergehenden Beispiel behandelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Extinktion Kugeln + Bestimmungsreagens Kugeln + ausschließlich Zellen Kugeln + Zellen + Bestimmungsreagens, ohne CETAB Kugeln + Zellen + Bestimmungsreagens, mit CETAB Gesamtblut Urin
Gemäß dem in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren wurde die quantitative Bestimmung direkt mit der Blutprobe und anschließend mit der Urinprobe durchgeführt, ohne daß eine vorherige Abtrennung der zu analysierenden Zellpopulation notwendig war. Im übrigen dauert die Inkubation nur 5 min. Unter Verwendung der magnetischen Kugeln als fester Träger sind alle Arbeitsgänge der quantitativen Bestimmung besonders einfach und schnell durchführbar.

Claims

1. Kit zur quantitativen Bestimmung von endogenen Enzymen, die für eine Zellpopulation oder eine Zellunterpopulation charakteristisch sind, der folgende Bestandteile enthält:

a) einen festen Träger, an den über kovalente Bindungen oder durch physikalische Adsorption ein oder mehrere monoklonale Antikörper gebunden sind, die gegen Oberflächenantigene der quantitativ zu bestimmenden Zellpopulation gerichtet sind;

b) eine Lösung, die das Substrat enthält, mit dem das betreffende Enzym meßbar ist, wobei dieses Substrat ein Molekül von niederem Molekulargewicht ist, das in das Innere der oben genannten Zellpopulation eindringen kann,

c) eine Pufferlösung zum Waschen.

2. Kit nach Anspruch 1, der zusätzlich ein chromogenes Reagens, mit dem die Enzymaktivität meßbar ist, enthält.

3. Kit nach einem der Ansprüche 1 und 2, der zusätzlich Proben enthält, die eine Eichung und Kontrolle der Qualität der quantitativen Bestimmung erlauben.

4. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der außerdem ein Reagens enthält, durch das die Permeabilität der Zellmembran verbessert wird.

5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bestandteil (a) ein fester Träger ist, der aus einer Mikrotiter-Platte besteht, in deren Vertiefungen der oder die Antikörper gebunden sind, die für die Immobilisierung der Zellen bestimmt sind, unter denen sich Zellen der Population oder der Unterpopulation befinden, die das quantitativ zu bestimmende Enzym enthalten.

6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bestandteil (a) ein teilchenförmiger magnetischer Träger ist.

7. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bestandteil (a) ein Rohr ist.

8. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Bestandteil (a) aus einem festen Träger besteht, an den ein oder mehrere monoklonale Anti-HLA-Antikörper der Klasse I gebunden sind.

9. Kit nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei der Bestandteil (b) im wesentlichen sauerstoffhaltiges Wasser und ein Chromogen enthält, das unter o-Phenylendiamin, 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure), 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol und den wasserlöslichen Salzen dieser Verbindungen ausgewählt ist.

10. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von endogenen Enzymen einer Zellpopulation oder einer Zellunterpopulation, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Immobilisierung der Zellpopulation, die das quantitativ zu bestimmende Enzym enthält, oder einer Zellpopulation, die die Zellunterpopulation einschließt, die das quantitativ zu bestimmende endogene Enzym enthält, auf einem festen Träger unter Verwendung von einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die zuvor über kovalente Bindungen oder durch physikalische Adsorption an den oben genannten Träger gebunden werden und die ein Antigen zu erkennen vermögen, das an der Oberfläche der Zellen vorhanden ist,

b) Inkubation während einer bestimmten Dauer,

c) Waschen des Trägers zur Entfernung der nicht immobilisierten Zellen,

d) Zugabe einer Lösung des wie in Anspruch 1 definierten Substrats, mit dem die Aktivität des endogenen Enzyms meßbar ist,

e) Bestimmung der Ergebnisse durch Messen der Lichtsignale (Färbung oder Fluoreszenz).

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt d) zusätzlich ein Chromogen zugegeben wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Ergebnisse gemäß einer Eichkurve erhalten werden.

13. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der feste Träger so wie in einem der Ansprüche 5, 6 und 7 definiert ist.

14. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Enzymaktivität mit sauerstoffhaltigem Wasser und einem Chromogen meßbar gemacht wird, das unter o-Phenylendiamin, 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure), 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol und den wasserlöslichen Salzen dieser Verbindungen ausgewählt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die Gesamtdauer zur Durchführung der quantitativen Bestimmung kleiner als oder gleich 30 min ist.

16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der oder die an den festen Träger gebundenen monoklonalen Antikörper Anti-HLA-Antikörper der Klasse I sind.

17. Verfahren nach Anspruch 11 zur quantitativen Bestimmung der endogenen Myeloperoxidase von Granulocyten im menschlichen Blut oder im Urin.