ES2606716T3 - Método para detectar la infección de una herida - Google Patents

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Abstract

Método para detectar la infección de una herida que comprende las etapas de: - poner en contacto una muestra obtenida de una herida con al menos tres sustratos para al menos tres enzimas seleccionadas entre una de las siguientes combinaciones: lisozima, elastasa y catepsina G o lisozima, elastasa y mieloperoxidasa o lisozima, catepsina G y mieloperoxidasa, y - detectar la infección de una herida cuando se determina una conversión de los al menos tres sustratos con dichas al menos tres enzimas.

Description

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Ejemplo 2: ensayo a base de elastasa – sistema a base de gel
Preparación del sistema de diagnóstico
5 Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida a una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluyeron en tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4, que contiene NaCl 0,5 M). La concentración final de N-metoxisuccinilala-ala-pro-val-p-nitroanilida puede ser de entre 0,2 a 15 mM y es preferentemente de entre 0,50 y 5,00 mM. Se mezclan apropiadamente 100 µl de esta solución con el volumen igual de solución de agarosa caliente (45 ºC) (1,5 % p/v) y se transfieren a pocillos de una placa de 96 pocillos.
10
Diagnóstico
Un volumen de entre 1 y 15 µl de fluido de una herida se añade al sistema de ensayo, preferentemente de entre 46 µl. Esta mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos. A partir de entonces, la infección de la herida
15 se indicará por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de heridas no infectadas no cambiarán de color.
Protocolo de ensayo y resultados:
20 Se incubaron 5 µl de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito 1B que contenía una concentración de sustrato de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida 5,0 mM. La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indicó un cambio de color a amarillo solo para las muestras de heridas infectadas A, B y C.
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al ensayo Infección de acuerdo con el
herida diagnóstico de médicos ensayo
A sí amarillo sí B sí amarillo sí C sí amarillo sí D no sin cambio de color no E no sin cambio de color no F no sin cambio de color no
25
Ejemplo 3: ensayo a base de elastasa -sistema a base de torundas
Preparación del sistema de diagnóstico
30 Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida a una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluyen en tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4, que contiene NaCl 0,5 M). La concentración final de N-metoxisuccinil-alaala-pro-val-p-nitroanilida puede ser de entre 0,2 a 10 mM y es preferentemente de entre 0,50 y 5,00 mM. Se pipetearon 40 µl de esta solución en placas de microtitulación.
35 Diagnóstico
Se sumergen torundas pequeñas (0,5 × 0,5 cm) de una microfibra de PES de poliéster (Microjet S1000) en fluido de una herida adsorbiendo de este modo entre 1 y 12 µl de líquido de una herida, preferentemente de entre 5 y 8 µl. El sistema de ensayo después se coloca en placas de microtitulación que contienen la solución de sustrato y se incuba
40 a temperatura ambiente durante 5 minutos. A partir de entonces, la infección de la herida se indicará por un cambio de color de la torunda (es decir, el tejido de poliéster) a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de heridas no infectadas no cambiarán de color.
Protocolo de ensayo y resultados:
45 Usando torundas pequeñas (0,5 × 0,5 cm) de una microfibra de PES de poliéster (Microjet S1000) se tomaron muestras de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) y se colocaron en el sistema de diagnóstico descrito en 1C que contenía una concentración de sustrato de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-pnitroanilida 1,0 mM. La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indicó un cambio de
50 color a amarillo solo para las muestras de heridas infectadas A, B y C.
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al ensayo Infección de acuerdo con el
herida diagnóstico de médicos ensayo
A sí amarillo sí B sí amarillo sí C sí amarillo sí D no sin cambio de color no E no sin cambio de color no
8
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al ensayo Infección de acuerdo con el herida diagnóstico de médicos ensayo
F no sin cambio de color no
Ejemplo 4: ensayo a base de catepsina -sistema líquido
5 Preparación del sistema de diagnóstico
Se disuelve N-succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida a una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluyeron en tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4, que contiene NaCl 0,5 M). La concentración final de N-metoxisuccinilala-ala-pro-phe-p-nitroanilida puede ser de entre 0,5 a 5 mM y es preferentemente de 3 mM.
10
Diagnóstico
Un volumen de entre 1 y 15 µl de fluido de una herida se añade al sistema de ensayo, preferentemente entre 4-6 µl y se mezclan mediante agitación manual. Esta mezcla se incuba a 37 ºC durante 10 minutos. A partir de entonces, la
15 infección de la herida se indicará por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de heridas no infectadas no cambiarán de color.
Protocolo de ensayo y resultados:
20 Se incubaron 5 µl de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito en 1A que comprendía una concentración de sustrato de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida 3,0 mM. La inspección visual de las muestras después de 10 a 15 minutos de incubación indicó un cambio de color a amarillo solo para las muestras de heridas infectadas A, B y C.
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al Infección de acuerdo conCatepsina G*
herida diagnóstico de médicos ensayo el ensayo U/ml
A sí amarillo sí 40 B sí amarillo sí 36 C sí amarillo sí 45 D no sin cambio de no 3
color E no sin cambio de no 2,5 color F no sin cambio de no 3,5 color
* medido con un ensayo convencional a base de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida 25
Ejemplo 5: ensayo a base de catepsina -sistema a base de gel
Preparación del sistema de diagnóstico
30 Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida a una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluyeron en tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4, que contiene NaCl 0,5 M). La concentración final de N-metoxisuccinilala-ala-pro-phe-p-nitroanilida puede ser de entre 0,5 a 10 mM y es preferentemente de 5,00 mM. Se mezclan apropiadamente 100 µl de esta solución con el volumen igual de solución de agarosa caliente (45 ºC) (1,5 % p/v) y se transfieren a pocillos de una placa de 96 pocillos.
35
Diagnóstico
Un volumen de entre 1 y 15 µl de fluido de una herida se añade al sistema de ensayo, preferentemente de entre 46 µl. Esta mezcla se incuba a 37 ºC durante 10 minutos. A partir de entonces, la infección de la herida se indicará
40 por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de heridas no infectadas no cambiarán de color.
Protocolo de ensayo y resultados:
45 Se incubaron 5 µl de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito 1B que contenía una concentración de sustrato de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida 5,0 mM. La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indicó un cambio de color a amarillo solo para las muestras de heridas infectadas A, B y C.
50
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imagen7
imagen8
Protocolo de ensayo y resultados:
Usando torundas pequeñas (0,5 × 0,5 cm) de una microfibra de PES de poliéster (Microjet S1000) se tomaron muestras de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) diluidas 1:20 y se colocaron en el
5 sistema de diagnóstico descrito en 1B que contenía los sustratos TMB. La inspección visual de las muestras después de 5 minutos de incubación indicó un cambio de color a azul solo para las muestras de heridas infectadas A, B y C.
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al ensayo Infección de acuerdo con el
herida diagnóstico de médicos ensayo
A sí azul sí B sí azul sí C sí azul sí D no sin cambio de color no E no sin cambio de color no F no sin cambio de color no
10 Ejemplo 10: ensayo a base de lisozima -sistema líquido
Preparación del sistema de diagnóstico
Una cantidad entre 1 y 15 mg de peptidoglicano de Micrococcus lysodeikticus se suspende en 15 ml de tampón de
15 KH2PO4 0,1 M (pH 7,0). Preferentemente, se suspende una cantidad de entre 8 y 10 mg. Se pipetean 290 µl de esta solución en un tubo eppendorf transparente.
Diagnóstico
20 Un volumen de 10 µl de fluido de una herida se añade al sistema de ensayo y se mezclan por agitación manual durante 10 segundos. Esta mezcla se incuba a 37 ºC durante 15 minutos. A partir de entonces, la infección de la herida se indicará por una disminución de la turbidez. Las mezclas que contienen muestras de heridas no infectadas no cambiarán.
25 Protocolo de ensayo y resultados:
Se incubaron 10 µl de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito en 2A que contenía Micrococcus lysodeikticus como sustrato para la lisozima. La inspección visual de las muestras después de 15 minutos de incubación a 37 ºC indicó un cambio de turbidez solo para las
30 muestras de heridas infectadas A, B y C.
Muestra de Infección de acuerdo con el Respuesta al Infección de acuerdo Actividad de herida diagnóstico de médicos ensayo con el ensayo lisozima* U/ml
A sí transparente sí 1200 B sí transparente sí 974 C sí transparente sí 1800 D no turbio no 210 E no turbio no 205 F no turbio no 320
* medido con peptidoglicano de Micrococcus lysodeikticus como sustrato
Ejemplo 11: ensayo a base de lisozima – sistema a base de gel
35 Preparación del sistema de diagnóstico
Se suspenden de 15 a 50 mg de peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus en 10 g de agarosa (1 % p/v) que se disuelven en tampón de fosfato 0,1 M pH 7,0 y se calentaron en el microondas. La solución se mezcla apropiadamente y se transfiere a pocillos de una placa de 96 pocillos. En un segundo ensayo, se tiñe el 40 peptidoglicano (Micrococcus lysodeictikus) con Remazol Brilliant Blue (RBB). Por tanto, se suspenden 50 mg de peptidoglicano en 0,5 ml de solución de Remazol Brilliant Blue (0,5 % p/v) y se diluyen con el mismo volumen de solución de tinción (NaSO4 al 2,5 % p/v). Después del gradiente térmico se utiliza: 25 ºC durante 10 minutos, 65 ºC durante 5 minutos. Después de la centrifugación durante 4 minutos a 13000 rpm, se realizan varias etapas de lavado hasta que el sobrenadante es incoloro. En un tercer ensayo, se utilizan dos capas de peptidoglicano teñidas y sin
45 teñir, mientras que el peptidoglicano teñido se aplica como se ha descrito anteriormente (sistema de doble capa). Además, se utiliza una matriz que comprende el 80 % de agarosa al 1 % y el 20 % de gelatina al 2 %, elastina, fibronectina y colágeno respectivamente.
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