BRPI1009071B1 - Método para detectar uma infecção de ferimento, curativo de ferimento e haste flexívelcom algodão na extremidade - Google Patents

Método para detectar uma infecção de ferimento, curativo de ferimento e haste flexívelcom algodão na extremidade Download PDF

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Abstract

método para detectar uma infecção de ferimento, curativo de ferimento e haste flexível com algodão na extremidade a presente invenção está relacionada a um método para detectar uma infecção de ferimentos que compreende as etapas de: - colocar em contato uma amostra obtida a partir de um ferimento com pelo menos dois substratos para pelo menos duas enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em lisozima, elastase, catepsina g e mieloperoxidase, e - detectar uma infecção de ferimento quando uma conversão dos pelo menos dois substratos com as ditas pelo menos duas enzimas for determinada.

Description

“MÉTODO PARA DETECTAR UMA INFECÇÃO DE FERIMENTO, CURATIVO DE FERIMENTO E HASTE FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE” Campo da Invenção [001] A presente invenção está relacionada a um método para detectar uma infecção de ferimento.
Antecedentes da Invenção [002] A cura de ferimentos é o processo natural do corpo de regeneração de tecido dérmico e epidérmico. Um conjunto de eventos celulares e bioquímicos complexos ocorre em uma cascata cuidadosamente orquestrada para reparar os tecidos danificados, enquanto as fases inflamatória, proliferativa e remodeladora se sobrepõem ao longo do tempo. As ações coordenadas das populações celulares tanto residentes quando migratórias no ambiente de matriz extracelular são essenciais para a restauração da continuidade e da função anatômica. A cura de ferimentos agudos exige a conclusão coordenada de uma variedade de atividades celulares que incluem fagocitose, quimiotaxia, mitogênese, síntese de colágeno e a síntese de outros componentes da matriz, e deve ser concluída em 3 meses.
[003] Posto que um processo de cura de ferimento é muito suscetível à interrupção, diversas causas, incluindo infecção, idade avançada, diabetes e doença venosa ou arterial, resultam na formação de ferimentos crônicos e que não cicatrizam. Em contraste a um ferimento agudo, esses ferimentos crônicos não cicatrizam de maneira tempestiva e ordenada. Embora a ulceração crônica possa afetar qualquer região anatômica, o sítio mais comum são os membros inferiores. A prevalência estimada de ulceração ativa de perna na Europa é de pelo menos 0,1 a 0,3 por cento. As úlceras, após hipertensão venosa e insuficiência venosa, são responsáveis por quase 70% de todas as úlceras de perna, sendo que a diabetes e doença arterial contribuem para uma proporção significante do resto.
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2/32 [004] A cura do ferimento, em geral, é regulada por uma multiplicidade de biomoléculas, incluindo citocinas, fatores de crescimento e enzimas. Em ferimento crônico, o processo normal de cura é interrompido em um ou mais pontos, na maioria das vezes nas fases inflamatória ou proliferativa. Devido à sua importância no processo de cura, as alterações nos níveis de fatores de crescimento ou enzimas poderiam ser responsáveis pela cura prejudicada observada em ferimentos crônicos. Nas fases de cura normal de ferimento, a produção e a atividade de proteases são severamente reguladas. No entanto, nos fluidos de ferimento crônico, os níveis de diversas proteases, incluindo catepsina G e elastase de neutrófilo, o qual é capaz de degradar fibronectina, uma proteína essencial envolvida na remodelagem de ECM, também foram observados como significantemente maiores em ferimentos crônicos. Além disso, determinados fatores de crescimento parecem ser degradados por proteases, as quais são secretadas principalmente por macrófagos e leucócitos polimorfonucleares.
[005] Além do desequilíbrio de fatores de crescimento e enzimas, infecção bacteriana é uma causa muito comum de ferimentos crônicos. Uma vez que bactérias competem por nutrientes e oxigênio com macrófagos e fibroblastos, infecção bacteriana pode retardar ou mesmo interromper a cura normal do ferimento. A infecção é resultado de quando bactérias alcançam domínio sobre fatores sistêmicos e locais de resposta de hospedeiro. Isto proporciona uma resposta séptica sistêmica e também inibe múltiplos processos envolvidos em cura de ferimento. Além da relativa quantidade de micro-organismos e sua patogenicidade, resposta ao hospedeiro e fatores como imunodeficiência, diabetes mellitus e fármacos, determinam se um ferimento crônico se torna infectado ou mostra sinais de cura retardada. Além de uma crescente carga bacteriana, a formação de biofilme e a presença de organismos resistentes a múltiplos fármacos são detectados em ferimentos
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3/32 crônicos.
[006] Como infecção não apenas resulta em uma fase inflamatória prolongada, mas pode causar necrose posterior do ferimento e pode até mesmo levar à morte como uma consequência da sépsis, os clínicos devem ser capazes de responder à infecção rapidamente. Os métodos atuais para identificar infecção bacteriana dependem principalmente do julgamento de odor e aparência do ferimento. Por especialistas apenas (por exemplo, doutores médicos), é possível identificar infecção em um ferimento por sinais como vermelhidão, dor ou mau cheiro.
[007] Na maioria dos casos, esfregaços (swab) são tomados e micro-organismos são identificados por cultura. Resultados desta análise estão disponíveis apenas após 1 a 3 dias. Adicionalmente, como contaminação e colonização de ferimentos são muito normais, a informação sobre o tipo de espécie presentes nos ferimentos não é uma indicação confiável para infecção de ferimento. Os fatores críticos são: altos níveis de teor bacteriano, bactérias capazes de alterar suas características fenotípicas e genotípicas, presença de organismos resistentes a múltiplos fármacos e formação de biofilme. Além disso, a virulência de patógenos é importante, ou seja, a produção de endo e exotoxinas, que podem ser muito nocivas para o hospedeiro. Como o uso de hastes flexíveis com algodão na extremidade (swab) pode apenas fornecer informação sobre o tipo de bactérias e sobre o número aproximado da carga bacteriana, a identificação da espécie bacteriana por métodos microbiológicos ou PCR não é um diagnóstico real para infecção. Além disso, o método é custoso e leva pelo menos três dias.
[008] Se há suspeita de infecção, testes de sangue muito frequentemente fornecem uma indicação de que tratamento médico seguir. Além de determinar a quantidade de células brancas do sangue (leucócitos), a concentração de proteína reativa C (CRP) se eleva em caso de infecção. CRP
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4/32 pertence à família de proteínas de fase aguda e tem um tempo de reação muito curto (12 horas). Determinações de CRP têm substituído amplamente a determinação de taxa de sedimentação de eritrócito uma vez que este é menos sensível e tem um atraso de mais de uma semana. Entretanto, níveis elevados de CRP são geralmente medidos em sangue, o que exige coleta de sangue e análise em um laboratório clínico.
[009] Em suma, estes métodos disponíveis são demorados e não podem ser utilizados em assistência domiciliar ou para exame rápido durante trocas de bandagem de ferimento. Por outro lado, a inspeção de odor e aparência do ferimento que poderia indicar infecções exige médicos experientes.
[010] Portanto, há uma forte necessidade por um rápido auxiliar de prognóstico para diagnóstico de infecção de um ferimento frente a sintomas clínicos óbvios de infecção. Tal ferramenta de diagnóstico permitiria intervenção prévia com tratamento adequado e reduziria intervenção clínica e o uso de antibióticos. Ainda, tal método seria simples e aplicável em assistência domiciliar, por exemplo, por enfermeiras. Estes pré-requisitos exigem diagnóstico rápido em torno de 10 a 30 minutos. É um objetivo da presente invenção fornecer métodos e meios de satisfazer a necessidade identificada acima.
Descrição Resumida da Invenção [011] A presente invenção se refere a um método para detectar uma infecção de ferimento que compreende as etapas de:
- colocar em contato uma amostra obtida a partir de um ferimento com pelo menos dois substratos para pelo menos duas enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em lisozima, elastase, catepsina G e mieloperoxidase, e
- detectar uma infecção de ferimento quando uma conversão dos
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5/32 pelo menos dois substratos com as ditas pelo menos duas enzimas for determinada e a dita conversão for aumentada (por exemplo, pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 100%, mais preferivelmente pelo menos 200%) comparada à conversão do dito substrato em um ferimento não infectado.
Descrição Detalhada da Invenção [012] Ferimentos que estão infectados por micro-organismos como bactérias ou fungos contêm enzimas específicas em uma quantidade aumentada comparada a ferimentos não infectados. Em particular, a quantidade de enzimas lisozima, elastase, catepsina G e mieloperoxidase aumenta em ferimentos infectados. Uma atividade aumentada de um, preferivelmente dois, ou todas as ditas enzimas em um ferimento indica uma infecção.
[013] A presente invenção fornece um método para um diagnóstico rápido e preliminar de infecção de ferimentos. Esta assim chamada ferramenta de diagnóstico rápida é baseada em enzimas presentes em fluido de ferimento que são associadas com uma resposta inflamatória do corpo humano. A aplicação de substratos apropriados para enzimas, que são elevados em caso de infecção, pode levar, por exemplo, a uma reação colorida dentro de minutos e permite uma estimativa muito rápida do estado do ferimento. A invenção compreende possíveis dispositivos com base em níveis elevados de elastase, lisozima, catepsina G e mieloperoxidase como indicadores para uma possível infecção de ferimentos.
[014] Lisozima (também conhecido como Muramidase) é uma enzima que compreende 129 resíduos de aminoácido com um peso molecular de aproximadamente 14,7 kDa. Lisozima é um componente de grânulos citoplasmáticos dos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) e o principal produto secretório de macrófagos, encontrado em secreções e tecidos de mamíferos; e indiscutivelmente uma das principais enzimas de nosso sistema imunológico
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6/32 inato. Devido ao fato de que a enzima destrói as paredes de célula bacteriana por hidrólise de ligações 1,4-beta entre ácido N-acetilmurâmico e resíduos de N-acetil-D-glucosamina em peptideoglicano, é comumente referido como o antibiótico do próprio corpo. Além de sua atividade lítica contra bactérias Gram positivas, a lisozima pode agir como uma opsonina inata não específica ao se ligar à superfície bacteriana, o que reduz a carga negativa e facilita a fagocitose da bactéria antes de opsoninas a partir da chegada do sistema imunológico adquirido. Níveis elevados de lisozima em soro são descritos no caso de algumas doenças; níveis de lisozima, adicionalmente elevados poderiam ser detectados em amostras de fluido de ferimento em caso de infecção.
[015] Em humanos, existem dois genes para elastase: Elastase pancreática (ELA-I) e Elastase de neutrófilo (ELA-2). Elastase de neutrófilo (ou elastase de leucócito LE: EC 3.4.21.37) é uma glicoproteína de 30 kD que pertence à família quimiotripsina de proteases de serina expressas por leucócitos polimorfonucleares (PMN). O NE maduro, uma glicoproteína altamente catiônica, é visada para grânulos primários onde é embalada com catepsina G (outra protease de serina de neutrófilo).
[016] A elastase intracelular de neutrófilo é uma molécula executora chave do sistema imunológico inato, com potente atividade antimicrobiana contra bactérias Gram negativas, espiroquetas e fungos. Além do envolvimento em controle de patógenos por degradação de membrana após internalização, a elastase de neutrófilo cataliticamente ativo foi localizada na membrana plasmática de neutrófilos maduros após liberação a partir de armazenamentos intracelulares. Entretanto, em sítios inflamatórios, a elastase de neutrófilo é capaz de evadir regulação, e uma vez desregulada a mesma pode induzir a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6 e interleucina-8, levando a destruição de tecido e inflamação que caracteriza
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7/32 várias doenças. A elastina que, junto com colágeno, determina as propriedades mecânicas do tecido conectivo, tem a propriedade única de recuo elástico, e cumpre uma importante função estrutural nos pulmões, artérias, pele e ligamentos. Portanto, o excesso de atividade de LE foi envolvido em várias condições patológicas que levam à deficiência de organização de ECM, incluindo artrite reumatoide, enfisema hereditário, doença pulmonar obstrutiva crônica, síndrome da dificuldade respiratória adulta, enfisema por lesão de reperfusão isquêmica, fibrose cística e progressão de tumor. Níveis elevados de elastase podem ser observados no início da infecção e, portanto, a presença de elastase em fluido de ferimento fornece alerta em estágio prévio de infecção de ferimentos, antes de óbvios sinais clínicos de infecção estarem presentes.
[017] Catepsina G é uma protease que pertence ao grupo de proteases de cisteínas lisossômicas com um tiol de cisteína nucleofílica em uma tríade catalítica. Junto com elastase de leucócito humano e proteinase 3, a catepsina G é um teor principal dos grânulos azurofílicos em neutrófilos e é liberada em sítios de inflamação.
[018] Mieloperoxidase (MPO) é uma proteína de enzima peroxidase de 150 kDa (EC 1.11.1.7) existente como um dímero que consiste em duas cadeias leves de 15 kDa e duas cadeias pesadas glicosiladas de peso variável ligadas a um grupo prostético heme. Esta proteína lisossômica é armazenada em grânulos azurofílicos do neutrófilo. O MPO produz ácido hipoclorídrico (HOCl) a partir de peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion cloreto (Cl-) durante o rompante respiratório de neutrófilo. O ácido hipoclorídrico e radical tirosil são citotóxicos e são capazes de matar bactérias e outros patógenos. Embora a morte de deficiência de MPO seja inicialmente impedida, mas alcança níveis normais após um período de tempo, sugerindo que um mecanismo alternativo aparentemente mais lento mortífero pode dominar
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8/32 neutrófilos deficientes de MPO, atividade elevada de MPO em caso de infecção foi medida em sangue e tecido. Isto parece ser devido à infiltração aumentada de neutrófilo no sítio infectado.
[019] A invenção é baseada em reações bioquímicas que causam mudanças de cor devido à presença de quatro diferentes enzimas em ferimentos em níveis elevados em caso de infecção. A avaliação de quatro diferentes enzimas pode compensar variações nas atividades individuais de enzima em fluidos de ferimento que intensificam a precisão da ferramenta de diagnóstico.
[020] Para aumentar a precisão do método da presente invenção, a amostra é preferivelmente colocada em contato com pelo menos três, preferivelmente pelo menos quatro, dos ditos substratos que habilitam a determinação da presença de pelo menos três, preferivelmente de todas as quatro, enzimas da presente invenção.
[021] Os substratos utilizados no método da presente invenção são específicos para lisozima, elastase, catepsina G e/ou mieloperoxidase. É particularmente preferido utilizar pelo menos dois dos ditos substratos específicos de enzima para determinar sua presença aumentada em comparação com um ferimento não infectado. As combinações preferidas dos substratos incluem substratos para lisozima e elastase; catepsina G e mieloperoxidase; lisozima e catepsina G; lisozima e mieloperoxidase; elastase e catepsina G; elastase e mieloperoxidase; lisozima, elastase e catepsina G; lisozima, elastase e mieloperoxidase; lisozima, catepsina G e mieloperoxidase; elastase, catepsina G e mieloperoxidase.
[022] A amostra obtida a partir do ferimento pode ser o fluido de ferimento, um curativo de ferimento que compreende fluido de ferimento ou uma haste flexível com algodão na extremidade que compreende fluido de ferimento.
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9/32 [023] A presença e a quantidade das enzimas da presente invenção no ferimento podem ser determinadas ao utilizar diretamente o fluido de ferimento. De forma alternativa, curativos de ferimento ou hastes flexíveis com algodão na extremidade que foram colocados em contato com o fluido de ferimento podem ser utilizados.
[024] Para determinar a presença de lisozima, elastase, catepsina G e/ou mieloperoxidase diretamente em um curativo de ferimento ou uma haste flexível com algodão na extremidade, pelo menos dois substratos são preferivelmente dispersos em uma matriz de um polímero medicinalmente aceitável, preferivelmente um hidrogel com base em alginato, peptideoglicano e/ou ácido poligalacturônico, preferivelmente fornecido na forma de, por exemplo, um filme ou microesferas e/ou ligado a uma fibra, em particular a uma fibra de um curativo de ferimento ou uma haste flexível com algodão na extremidade.
[025] Um curativo de ferimento, haste flexível com algodão na extremidade ou bastonete de diagnóstico particularmente preferido pode compreender um carreador, uma matriz biodegradável, por exemplo, filme de mono ou múltipla camada ou microesferas e uma barreira. O carreador pode ser um polímero como poliamida ou polipropileno. No dito carreador, uma matriz biodegradável pode ser localizada. Esta matriz pode ser elaborada, por exemplo, como filme (1 a 5 mm de espessura) ou microesferas como mono ou múltipla camada (2 a 8 mm em diâmetro).
[026] O substrato das enzimas, em particular de lisozima e elastase, pode ser um polímero ou biopolímero ou disperso nos ditos polímeros que podem ser degradados pelas ditas enzimas. Por exemplo, um polímero peptideoglicano pode agir como um substrato para lisozima e elastina como um substrato para elastase. O polímero degradável pode compreender pelo menos um substrato ligado a, pelo menos, uma molécula marcadora como pelo menos
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10/32 um corante que é liberado no curso da degradação de substrato. Os filmes de múltiplas camadas (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 camadas) ou microesferas podem compreender uma matriz que contém o substrato de enzima identificado que é coberto por substrato de enzima não identificado. Na matriz de polímero biodegradável, uma camada de barreira está localizada. A dita camada de barreira é uma membrana não degradável que impede que as substâncias da matriz biodegradável e do substrato e substratos convertidos sejam liberados para o exterior. Entretanto, a dita camada de barreira é permeável para os fluidos de ferimento.
[027] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o substrato para lisozima é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptideoglicano corado, preferivelmente um peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus, e quitosana corada, ambos preferivelmente corados com um corante de vinil sulfona (por exemplo, Remazol).
[028] O substrato para elastase é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida e cisteamida-Succ-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, que é preferivelmente diretamente ligado ao carreador ou à matriz.
[029] De acordo com uma realização preferida adicional da presente invenção, o substrato para catepsina G é selecionado do grupo que consiste em N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida e cisteamida-SuccAla-Ala-Pro-Phe-pNA, que são, de preferência, diretamente ligados ao carreador ou à matriz.
[030] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o substrato para mieloperoxidase é selecionado a partir do grupo que consiste em 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina, 2,2'-azino-bis (ácido 3etilbenzitiazolina-6-sulfônico), violeta cristal, violeta leucocristal, ácido sináptico, alcoxissilanureia e outros compostos como Fast Blue RR modificado com
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11/32 isocianato. Os substratos podem ser covalentemente imobilizados no sistema. O peróxido de hidrogênio pode estar presente como um cossubstrato. A integração de celobiose desidrogenase (por exemplo, celobiose desidrogenase a partir de Myriococcum thermophilum), mesilato de desferrioxamina e 5 a 500 mM, preferivelmente 10 a 200 mM, em particular 30 mM, celobiose como substratos, resultam na produção de peróxido de hidrogênio que é utilizado por mieloperoxidase como um cossubstrato. É claro que outros sistemas de enzima que também envolvem outros substratos podem ser utilizados para produzir peróxido de hidrogênio.
[031] A quantidade dos substratos utilizados pode variar de substrato para substrato. Uma vez que o método da presente invenção é otimizado para uma rápida detecção de uma infecção de ferimentos, a quantidade de substrato utilizado depende da taxa de conversão da enzima e no ambiente (por exemplo, líquido, curativo de ferimento, haste flexível com algodão na extremidade, etc.) onde a conversão ocorre.
[032] A quantidade de substrato e de fluido de ferimento a ser utilizada varia também a partir do método de detecção: fluido, em gel (matriz biodegradável), haste flexível com algodão na extremidade, curativo de ferimento, etc.
[033] Em um sistema de teste líquido, a quantidade do substrato de elastase adicionada a uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, varia a partir de 10 a 500 pL, preferivelmente a partir de 20 a 400 pL, mais preferivelmente a partir de 50 a 300 pL, ainda mais preferivelmente a partir de 80 a 150 pL, de uma solução que compreende 0,05 a 5 mM, preferivelmente 0,05 a 2,5 mM, em particular 0,8 a 1,2 mM, substrato. Em uma realização particularmente preferida da presente invenção 4 a 6 pL, preferivelmente 5 pL, de líquido de ferimento é incubada com 90 a 110 pL, preferivelmente 100 pL, de uma solução de
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12/32 substrato que compreende 0,8 a 1,2 mM, preferivelmente 1 mM, de substrato de elastase, preferivelmente N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida.
[034] Em um sistema de teste líquido, a quantidade do substrato de catepsina G adicionada a uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, varia a partir de 10 a 500 pL, preferivelmente a partir de 20 a 400 pL, mais preferivelmente a partir de 50 a 300 pL, ainda mais preferivelmente a partir de 80 a 150 pL, de uma solução que compreende 0,1 a 10 mM, preferivelmente 0,5 a 5 mM, em particular 3 mM, substrato. Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, 4 a 6 pL, preferivelmente 5 pL, de líquido de ferimento é incubada com 90 a 110 pL, preferivelmente 100 pL, de uma solução de substrato que compreende 2 a 4 mM, preferivelmente 3 mM, de substrato de catepsina G, preferivelmente N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida.
[035] Em um sistema de teste líquido, a quantidade do substrato de mieloperoxidase adicionada a uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, varia a partir de 10 a 500 pL, preferivelmente a partir de 20 a 400 pL, mais preferivelmente a partir de 50 a 300 pL, ainda mais preferivelmente a partir de 80 a 150 pL, de uma solução que compreende 0,01 a 1 mM, preferivelmente 0,02 a 0,45 mM, substrato. Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, 4 a 6 pL, preferivelmente 5 pL, de líquido de ferimento diluído 1:10 a 1:30, preferivelmente 1:20, é incubada com 90 a 110 pL, preferivelmente 100 pL, de uma solução de substrato que compreende 2 to 4 mM, preferivelmente 3 mM, de substrato de mieloperoxidase, preferivelmente 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina e/ou 2, 2'azino-bis (ácido 3-etilbenzitiazolina-6-sulfônico), violeta cristal, 0,1 mm violeta leucocristal ou fenólicos naturais como ácido sináptico, alcoxissilanureia e fast blue RR modificado com isocianato.
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13/32 [036] A solução que compreende os ditos substratos pode compreender ainda 0,1 a 0,5 M, preferivelmente 0,3 M, sacarose e 1 a 30 pL, preferivelmente 15 pL de H2O2, Em vez de peróxido de hidrogênio, o sistema pode conter um peróxido de hidrogênio produtor de enzima a partir de carboidratos como glicose oxidase ou outro carboidrato oxidase como celobiohidrolase (CBH).
[037] Em um sistema de teste líquido, a quantidade do substrato de lisozima adicionada a uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, varia a partir de 1 a 25 mg, preferivelmente a partir de 5 a 20 mg, mais preferivelmente a partir de 8 a 10 mg, em uma solução que compreende 1 a 30 ml, preferivelmente 15 ml, tampão. Em uma realização particularmente preferida da presente invenção, 4 a 6 pL, preferivelmente 5 pL, de líquido de ferimento é incubada com 90 a 110 pL, preferivelmente 100 pL, de uma solução de substrato que compreende substrato de lisozima, preferivelmente um peptideoglicano, mais preferivelmente um peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus, e quitosana corada, ambos preferivelmente corados com um corante vinil sulfona (por exemplo, Remazol).
[038] Em um sistema de teste com base em gel para detectar atividade de elastase e catepsina G 20 a 250 pL, preferivelmente 50 a 150 pL, mais preferivelmente 100 pL de um 0,05 a 25 mM, preferivelmente 0,1 a 20 mM, solução de substrato são adicionados a um 40 a 50°C, mais preferivelmente um 45°C, solução de gel (que compreende, por exemplo, 1 a 2%, preferivelmente 1,5% agarose) que tem um volume de 50 a 150 pL, preferivelmente de 100 pL. Ao dito gel, uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, é adicionada.
[039] Em um sistema de teste com base em gel para detectar
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14/32 atividade de mieloperoxidase, um volume de 50 a 150 pL, preferivelmente de 100 pL, de uma solução utilizada para teste de líquido é adicionada ao mesmo volume de gel aquecido como mencionado acima. Ao dito gel, uma amostra líquida de ferimento que tem um volume em entre 0,5 e 30 pL, preferivelmente em entre 1 e 15 pL, é adicionada.
[040] Em um sistema de teste com base em gel para detectar atividade de lisozima, 5 a 100 mg, preferivelmente 10 a 75 mg, mais preferivelmente 15 a 50 mg, peptideoglicano, preferivelmente de Micrococcus lysodeictikus, é suspenso em um gel aquecido, preferivelmente gel de agarose (que compreende, por exemplo, 10 g de agarose em uma concentração de aproximadamente 1% p/v). De forma alternativa, o peptideoglicano é colorido com um corante como descrito nesta invenção ao aquecer peptideoglicano junto com o corante até 60 a 70 °C. O precipitado pode ser utilizado em teste de atividade de lisozima. De forma alternativa, o sistema de teste com base em gel compreende duas camadas de peptideoglicano colorido e não colorido. Em caso de degradação de Peptideoglicano devido à atividade de lisozima, a cor mudaria de amarelo para azul.
[041] Os sistemas de teste com base em haste flexível com algodão na extremidade são realizados com as soluções como indicado acima para os sistemas de teste com base em líquido. As hastes flexíveis com algodão na extremidade a ser utilizadas são capazes de absorver 0,5 a 20 pL, preferivelmente 1 a 15 pL, de fluido de ferimento.
[042] Se o sistema de teste é utilizado como um indicador em curativos de ferimento, as soluções acima mencionadas são trazidas no curativo e seco ou os substratos de enzimas estão ligados covalentemente ao curativo.
[043] Outro aspecto da presente invenção se refere a um curativo de ferimento ou haste flexível com algodão na extremidade que compreende
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15/32 pelo menos dois substratos para pelo menos duas enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em lisozima, elastase, catepsina G e mieloperoxidase.
[044] Um curativo de ferimento e uma haste flexível com algodão na extremidade que compreende o dito pelo menos um substrato é particularmente vantajoso porque permite determinar diretamente no dito curativo e haste flexível com algodão na extremidade se um ferimento está infectado ou não. Os substratos a serem utilizados desenvolvem preferivelmente uma cor quando convertidos por enzimas presentes em uma amostra ao qual o dito curativo ou haste flexível com algodão na extremidade é colocado em contato. De forma alternativa, também é possível fornecer no curativo ou haste flexível com algodão na extremidade outras substâncias capazes de reagir com o substrato convertido.
[045] Um curativo de ferimento que compreende os dito substratos e opcionalmente meios para detectar a conversão dos substratos pelas enzimas presentes em um ferimento infectado é particularmente vantajoso porque permite monitorar se um ferimento coberto pelo dito curativo está infectado ou não. Em consequência, qualquer pessoa pode decidir quando um curativo de ferimento precisa ser trocado.
[046] O curativo de ferimento ou um sistema de diagnóstico, que pode ser posicionado próximo de um ferimento em contato com o fluido de ferimento pode compreender uma camada de carreador, uma matriz operacional e uma camada de barreira. Poliamida enzimaticamente funcionalizada ou polipropilenos podem ser utilizados como camadas de carreador. Para matriz operacional, diferentes mesclas de géis, por exemplo, alginato/agarose e gelatina, com substratos de enzima incorporados, como peptideoglicano ou quitosana como substratos para lisozima, podem ser utilizadas. Por exemplo, quando a quantidade de lisozima é determinadas
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16/32 combinações de agarose com várias quantidades de peptideoglicano que varia a partir de 15 a 50 mg por 10 g agarose/gelatina podem ser aplicados. A camada de barreira pode ser com base em uma membrana (com uma espessura de, por exemplo, 0,2 pm) para excluir substrato convertido como material colorido a partir de fluidos de ferimento como eritrócitos. Uma clara resposta deste sistema de lisozima e fluidos de ferimento pode ser obtida ao medir transparência aumentada em, por exemplo, 450 nm. E também, em caso de altas atividades de lisozima, uma liberação do corante Remazol Brilliant Blue covalentemente ligado ao peptideoglicano poderia ser detectada por uma mudança de cor do sobrenadante para azul, por uma mudança de cor de haste flexível com algodão na extremidade colocada no sistema para azul ou ser medido em 600 nm.
[047] De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o curativo ou haste flexível com algodão na extremidade compreende pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três, em particular quatro, dos ditos substratos.
[048] De acordo com uma realização preferida adicional da presente invenção, o pelo menos um substrato é disperso em uma matriz de um polímero medicinalmente aceitável ou ligado em uma fibra.
[049] O pelo menos um substrato é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em um peptideoglicano, preferivelmente um peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus corado com um corante vinil sulfona, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida, N-metoxisuccinil-ala-alapro-phe p-nitroanilida, 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina, 2,2'-azino-bis (ácido 3etilbenzitiazolina-6-sulfônico), violeta cristal, violeta leucocristal ou outros fenólicos naturais como ácido sináptico, alcoxissilanureia e Fast Blue RR modificado com isocianato.
[050] A presente invenção é ilustrada ainda no seguinte exemplo,
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17/32 entretanto, sem ficar restrita ao mesmo.
Exemplos:
Exemplo 1: Teste com base em elastase - sistema líquido Preparação de sistema de diagnóstico [051] 100 pL de uma solução de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-valp-nitroanilida dissolvida a uma concentração de 20 mM em DMSO em tampão HEPES de 0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl) são pipetados em um tubo transparente de eppendorf. A concentração final de N-metoxisuccinil-ala-alapro-val-p-nitroanilida pode ser entre 0,05 a 2,50 mM, e é preferencialmente entre 0,80 e 1,20 mM.
Diagnóstico [052] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL e misturado por agitação manual por 10 segundos. Esta mistura é incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor de rosa limpo para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[053] 5 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 1A que contém uma concentração de substrato de 1,0 mM N-metoxisuccinilala-ala-pro-val-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 10 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste infecção de acordo com o teste Atividade de elastase* U/mL
A sim amarelo sim 3,5
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18/32
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste Atividade de elastase* U/mL
B sim amarelo sim 3,4
C sim amarelo sim 4,1
D não cor inalterada não 0,4
E não cor inalterada não 0,3
F não cor inalterada não 0,4
*medido com N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida com base em ensaio padrão.
Exemplo 2: Teste com base em elastase - sistema com base em gel Preparação de sistema de diagnóstico [054] A N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida é dissolvida a uma concentração de 20 mM em dimetoxissulfóxido e diluída em tampão HEPES de 0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl). A concentração final de Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida pode estar entre 0,2 a 15 mM, e está preferencialmente entre 0,50 e 5.00 mM. 100 pL desta solução são apropriadamente misturados com o mesmo volume de solução de agarose aquecida (45 °C) (1,5% p/v) e transferida para cavidades de uma placa de 96 cavidades.
Diagnóstico [055] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL. Esta mistura é incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
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19/32
Protocolo de teste e resultados:
[056] 5 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 1B que contém uma concentração de substrato de 5,0 mM N-metoxisuccinilala-ala-pro-val-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 10 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com o diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
A sim amarelo sim
B sim amarelo sim
C sim amarelo sim
D não cor inalterada não
E não cor inalterada não
F não cor inalterada não
Exemplo 3: Teste com base em elastase - sistema com base em Haste FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE Preparação de sistema de diagnóstico [057] A N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida é dissolvida a uma concentração de 20 mM em dimetoxissulfóxido e diluída em tampão HEPES de 0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl). A concentração final de Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida pode estar entre 0,2 a 10 mM, e está preferencialmente entre 0,50 e 5,00 mM. 40 pL desta solução foram pipetados em placas de microtitulação.
Diagnóstico [058] Pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) mergulhadas
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20/32 em fluido de ferimento com isso adsorveram entre 1 e 12 pL de líquido de ferimento, preferencialmente entre 5 e 8 pL. O sistema de teste é então colocado nas placas de microtitulação que contêm a solução de substrato e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor da haste flexível com algodão na extremidade (ou seja, tecido de poliéster) para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[059] Ao utilizar hastes flexíveis com algodão na extremidade pequenas (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000), amostras foram tomadas a partir das amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) e colocadas no sistema de diagnóstico descrito em 1C que contém uma concentração de substrato de 1,0 mM N-metoxisuccinil-alaala-pro-val-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 10 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
A sim amarelo sim
B sim amarelo sim
C sim amarelo sim
D não cor inalterada não
E não cor inalterada não
F não cor inalterada não
Exemplo 4: Teste com base em catepsina - sistema líquido
Preparação de sistema de diagnóstico [060] A N-succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida é dissolvida a uma concentração de 20 mM em dimetoxissulfóxido e diluída em tampão HEPES de
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0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl). A concentração final de Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida pode estar entre 0,5 a 5 mM, e é preferencialmente de 3 mM.
Diagnóstico [061] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL e misturado por agitação manual. Esta mistura é incubada a 37 °C por 10 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[062] 5 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 1A que compreende uma concentração de substrato de 3.0 mM Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 10 a 15 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste Catepsina G* U/mL
A sim amarelo sim 40
B sim amarelo sim 36
C sim amarelo sim 45
D não cor inalterada não 3
E não cor inalterada não 2,5
F não cor inalterada não 3,5
*medido com N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida com base em ensaio padrão.
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Exemplo 5: Teste com base em catepsina - sistema com base em gel Preparação de sistema de diagnóstico [063] A N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida é dissolvida a uma concentração de 20 mM em dimetoxissulfóxido e diluída em tampão HEPES de 0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl). A concentração final de Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida pode estar entre 0,5 a 10 mM, e é preferencialmente de 5,00 mM. 100 pL desta solução são apropriadamente misturados com o mesmo volume de solução de agarose aquecida (45 °C) (1,5% p/v) e transferida para cavidades de uma placa de 96 cavidades.
Diagnóstico [064] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL. Esta mistura é incubada a 37 °C por 10 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[065] 5 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 1B que contém uma concentração de substrato de 5,0 mM N-metoxisuccinilala-ala-pro-phe-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 10 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
A sim amarelo sim
B sim amarelo sim
C sim amarelo sim
D não cor inalterada não
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23/32
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
E não cor inalterada não
F não cor inalterada não
Exemplo 6: Teste com base em catepsina - sistema com base em Haste FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE Preparação de sistema de diagnóstico [066] A N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida é dissolvida a uma concentração de 20 mM em dimetoxissulfóxido e diluída em tampão HEPES de 0,1 M (pH 7,4, que contém 0,5 M NaCl). A concentração final de Nmetoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida pode estar entre 0,5 a 10 mM, e é preferencialmente de 5,00 mM. 40 pL desta solução foram pipetados em placas de microtitulação.
Diagnóstico [067] Pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) mergulhadas em fluido de ferimento com isso adsorvendo entre 1 e 12 pL de líquido de ferimento, preferencialmente entre 5 e 8 pL. O sistema de teste é então colocado em placas de microtitulação que contêm a solução de substrato e são incubadas a 37 °C por 15 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor da haste flexível com algodão na extremidade (ou seja, tecido de poliéster) para amarelo. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados [068] Ao utilizar pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000), amostras foram tomadas a partir de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) e colocadas no sistema de diagnóstico descrito em 1C
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24/32 que contém uma concentração de substrato de 5,0 mM N-metoxisuccinil-alaala-pro-phe-p-nitroanilida. A inspeção visual das amostras após 15 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para amarelo apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
A sim amarelo sim
B sim amarelo sim
C sim amarelo sim
D não cor inalterada não
E não cor inalterada não
F não cor inalterada não
Exemplo 7: Teste com base em mieloperoxidase - sistema líquido
Preparação de sistema de diagnóstico [069] Para esta ferramenta de diagnóstico, dois diferentes substratos podem ser utilizados, ou seja, TMB ou ABTS. 3350 pL de tampão de succinato (pH 5,4) que compreende 0,3 M de sacarose foram utilizados, 15 pL de H2O2 1% e 7 pL dos substratos (5 a 40 mM ABTS, 20 a 150 mM TMB, 0,0128 mM violeta cristal e 0,025 mM de Fast Blue RR modificado) foram adicionados. TMB (3, 3', 5, 5'-Tetrametilbenzidina) é primeiro dissolvido em N,N-metilformamida, violeta cristal, violeta leucocristal e Fast Blue RR modificado é dissolvido em etanol, enquanto ABTS pode ser dissolvido em água. 100 pL das soluções são pipetados em um tubo transparente de eppendorf.
Diagnóstico [070] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL e misturado por agitação manual por 10 segundos. Esta mistura é incubada em temperatura
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25/32 ambiente por 10 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor de incolor para azul (TMB ou verde (ABTS)), respectivamente. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor
Protocolos de teste e resultados:
[071] Fluido de ferimento de amostras infectadas e não infectadas é diluído 1:20, 5 pL destas diluições de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) são incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 1A que contém os dois diferentes substratos. A inspeção visual das amostras após 5 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para azul no caso de TMB apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste Atividade de mpo* U/mL
A sim azul sim 190
B sim azul sim 160
C sim azul sim 175
D não cor inalterada não 5
E não cor inalterada não 12
F não cor inalterada não 17
*medido com Guaiacol como ensaio padrão
Exemplo 8: Teste com base em mieloperoxidase - sistema de gel
Preparação de sistema de diagnóstico [072] Para esta ferramenta de diagnóstico, dois diferentes substratos podem ser utilizados, ou seja, TMB ou ABTS. 3350 pL de tampão de succinato (pH 5,4) que compreende 0,3 M sacarose foram utilizados, 15 pL 1% H2O2 e 7 pL dos substratos (5 a 40 mM ABTS, 20 a 150 mM TMB, 0,0128 mM
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26/32 violeta cristal, 0,1 mM violeta leucocristal ou 0,025 mM de Fast Blue RR modificado) foram adicionados. TMB (3, 3', 5, 5'-Tetrametilbenzidina) é primeiro dissolvida em N, N-Metilformamida, enquanto ABTS pode ser dissolvido em água. 100 pL desta solução é apropriadamente misturado com o mesmo volume de solução de agarose aquecida (45 °C) (1,5% p/v) e transferido para cavidades de uma placa de 96 cavidades.
Diagnóstico [073] Um volume entre 1 e 15 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste, preferencialmente entre 4 a 6 pL. Esta mistura é incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor para azul e verde, respectivamente. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[074] 5 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito 1B que contém os dois substratos para MPO. A inspeção visual das amostras após 5 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para azul ou verde apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Exemplo 9: Teste com base em mieloperoxidase - sistema com base em Haste FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE Preparação de sistema de diagnóstico [075] 3350 pL de tampão de succinato (pH 5,4) que compreende 0,3 M sacarose foram utilizados, 15 pL 1% H2O2 e 7 pL dos substratos (20 mM ABTS, 100 mM TMB, 0,0128 mM violeta cristal, 0,1 mM violeta leucocristal e 0,025 mM de Fast Blue RR modificado) foram adicionados. 40 pL desta solução foram pipetados em placas de microtitulação.
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27/32
Diagnóstico [076] Pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) mergulhadas em fluido de ferimento diluído 1:20 com isso adsorvendo entre 1 e 12 pL de líquido de ferimento, preferencialmente entre 5 e 8 pL. O sistema de teste é então colocado nas placas de microtitulação que contém a solução de substrato e incubado em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, infecção de ferimento será indicada por uma mudança de cor da haste flexível com algodão na extremidade (ou seja, tecido de poliéster) para azul ou verde, respectivamente. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão de cor.
Protocolo de teste e resultados:
[077] Ao utilizar pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000), amostras foram tomadas a partir de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) diluídas 1:20 e colocadas no sistema de diagnóstico descrito em 1B que contém os substratos TMB. A inspeção visual das amostras após 5 minutos de incubação indicou uma mudança de cor para azul apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste Infecção de acordo com o teste
A sim azul sim
B sim azul sim
C sim azul sim
D não cor inalterada não
E não cor inalterada não
F não cor inalterada não
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28/32
Exemplo 10: Teste com base em lisozima - sistema líquido Preparação de sistema de diagnóstico [078] Uma quantidade entre 1 e 15 mg de Micrococcus lysodeikticus peptideoglicano é suspensa em tampão de 15 mL 0,1 M KH2PO4 (pH 7,0). De preferência, uma quantidade entre 8 e 10 mg é suspensa. 290 pL desta solução são pipetados em um tubo transparente de eppendorf.
Diagnóstico [079] Um volume de 10 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste e misturado por agitação manual por 10 segundos. Esta mistura é incubada a 37 °C por 15 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por uma diminuição na turbidez. As misturas que contêm amostras de ferimento não infectado não mudarão.
Protocolo de teste e resultados:
[080] 10 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito em 2A que contém Micrococcus lysodeikticus como um substrato para lisozima. A inspeção visual das amostras após 15 minutos de incubação a 37 °C indicou uma mudança de turbidez apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste infecção de acordo com o teste Atividade de lisozima* U/mL
A sim limpo sim 1200
B sim limpo sim 974
C sim limpo sim 1800
D não turvo não 210
E não turvo não 205
F não turvo não 320
medido com Micrococcus lysodeikticus e peptideoglicano como um substrato.
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29/32
Exemplo 11: Teste com base em lisozima - sistema com base em gel Preparação de sistema de diagnóstico [081] 15 a 50 mg peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus são suspensos em 10 g de agarose (1% p/v), que são dissolvidos em 0,1 M de tampão fosfato pH 7,0 e aquecidos por micro-ondas. A solução é apropriadamente misturada e transferida para cavidades de uma placa de 96 cavidades. Em um segundo ensaio, o peptideoglicano (Micrococcus lysodeictikus) é colorido com Remazol Brilliant Blue (RBB). Portanto, 50 mg peptideoglicano são suspensos em solução de 0,5 mL Remazol Brilliant Blue (0,5% p/v) e diluídos com o mesmo volume de solução colorante (2,5% p/v NaSO4). Em seguida, gradiente térmico é utilizado: 25 °C por 10 minutos, 65 °C por 5 minutos. Após centrifugação por 4 minutos a 13.000 rpm, diversas etapas de lavagem são realizadas até que o sobrenadante seja incolor. Em um terceiro ensaio, duas camadas de peptideoglicano colorido e não colorido são utilizadas, dado que o peptideoglicano colorido é aplicado como descrito acima (sistema de camada dupla). E também, uma matriz que compreende 80% 1% de agarose e 20% 2% de gelatina, elastina, fibronectina e colágeno, respectivamente, foram utilizados.
Diagnóstico [082] Um volume de 100 pL de fluido de ferimento é adicionado ao sistema de teste. Esta mistura é incubada a 37 °C entre 15 e 60 minutos. A digestão de peptideoglicano devido à atividade de lisozima leva a um aumento na transparência que pode ser medido a 450 nm e que pode ser visto claramente no caso de ferimentos infectados. No caso do peptideoglicano corado, o corante é liberado no sobrenadante, que se torna azul em caso de ferimentos infectados. No caso do sistema de camada dupla, o sistema muda de cor de amarelo para azul que pode facilmente ser visto após incubação por pelo menos 30 minutos.
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Protocolo de teste e resultados:
[083] 100 pL de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) foram incubados com o sistema de diagnóstico descrito 2B que contém peptideoglicano como um substrato para lisozima. A inspeção visual das amostras após 15 e 60 minutos de incubação indicou uma mudança na transparência apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Amostra de Ferimento Infecção de acordo com diagnóstico dos médicos Resposta do teste sistema não colorido Resposta do teste sistema colorido Resposta do teste - sistema de camada dupla infecção de acordo com o teste
A sim limpo azul azul sim
B sim limpo azul azul sim
C sim limpo azul azul sim
D não turvo limpo amarelo/branco não
E não turvo limpo amarelo/branco não
F não turvo limpo amarelo/branco não
Exemplo 12: Teste com base em lisozima - sistema com base em Haste FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE Preparação de sistema de diagnóstico [084] 15 a 50 mg de peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus corado com Remazol Brilliant Blue (RBB) são suspensos em 10 g de agarose (1% p/v) dissolvidos em 0,1 M de tampão fosfato pH 7,0 e aquecidos por microondas. A solução é apropriadamente misturada e transferida para cavidades de uma placa de 96 cavidades.
Diagnóstico [085] Pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) são mergulhadas em fluido de ferimento com isso adsorvendo entre 1 e 12 pL de líquido de ferimento, preferencialmente entre 5 e 8 pL. A haste flexível com
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31/32 algodão na extremidade é então enxaguada em solução tampão e esta solução é então colocada nas placas de microtitulação que contêm o sistema com base em gel com peptideoglicano corado. O sistema é então incubado a 37 °C por 30 minutos. Em seguida, a infecção de ferimento será indicada por um sobrenadante azul/os tecidos ficando azuis em caso de ferimentos infectados.
Protocolo de teste e resultados:
[086] Ao utilizar pequenas hastes flexíveis com algodão na extremidade (0,5x0,5 cm) de uma Microfibra de poliéster PES (Microjet S1000), amostras foram tomadas a partir de amostras de ferimento infectado (A, B, C) e não infectado (D, E, F) e colocadas no sistema de diagnóstico descrito acima que contém o sistema com base em gel com peptideoglicano corado com remazol. A inspeção visual do sobrenadante/dos tecidos após 30 minutos de incubação indicou o desenvolvimento de uma cor azul apenas para amostras de ferimento infectado A, B, e C.
Exemplo 13: Combinação de enzimas - sistema líquido Preparação de sistema de diagnóstico [087] 100 pL dos substratos líquidos descrito para as enzimas elastase, mieloperoxidase e Catepsina G (ver exemplos 1 a 10) foram preparados e transferidos par uma placa de microtitulação.
Diagnóstico [088] 5 pL de fluidos de ferimento dos ferimentos infectados (A a F) e não ferimentos infectados (G a L) são adicionados. Fluido de ferimento pode ser tomado com um vaso capilar ou uma seringa e são aliquotados depois. De forma alternativa, as hastes flexíveis com algodão na extremidade foram utilizadas para transferir amostras a partir de ferimentos infectados (A a F) e ferimentos não infectados (G a L) para 1 a 2 mL de solução tampão. Alíquotas de 250 uL (500 pL) foram adicionadas à placa de microtitulação com os quatros diferentes substratos de enzima.
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32/32 [089] As placas são incubadas a 37 °C. Após 10 minutos, o ensaio para elastase foi inspecionado e tornou-se amarela no caso dos ferimentos infectados. Após 30 minutos, o ensaio de Catepsina G e de lisozima foi inspecionado e indicou infecção ao tornar-se amarelo, azul e limpo, respectivamente. Após 5 minutos, dois ensaios para MPO (TMB e ABTS) foram inspecionados e indicaram infecção ao tornarem-se azul e verde, respectivamente. Após 60 minutos, o ensaio para MPO ao utilizar violeta cristal, violeta leucocristal e Fast Blue RR modificado foi inspecionado e indicou infecção pela mudança de cor.
[090] A amostra A mostra um desenvolvimento de cor menos evidente no ensaio de Elastase, mas foi claramente positivo nos outros ensaios. Em contraste, as amostras D e E mostraram um desenvolvimento de cor menos evidente no ensaio de MPO ABTS, enquanto os mesmos foram positivos nos outros ensaios. Isto confirma a importância da combinação de pelo menos 2, preferivelmente 3, ideal e preferivelmente 4, diferentes ensaios para a ferramenta de diagnóstico.

Claims (16)

  1. Reivindicações
    1. MÉTODO PARA DETECTAR UMA INFECÇÃO DE FERIMENTO, caracterizado por compreender as etapas de:
    - colocar em contato uma amostra obtida a partir de um ferimento com pelo menos três substratos para pelo menos três enzimas selecionadas a partir de uma das seguintes combinações:
    lisozima, elastase e catepsina G, ou lisozima, elastase e mieloperoxidase, ou lisozima, catepsina G e mieloperoxidase, e
    - detectar uma infecção de ferimento quando uma conversão dos pelo menos três substratos com as ditas pelo menos três enzimas for determinada.
  2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra ser colocada em contato com pelo menos quatro dos ditos substratos.
  3. 3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 2, caracterizado pela amostra ser fluido de ferimento, um curativo de ferimento que compreende fluido de ferimento, uma haste flexível com algodão na extremidade (swab) que compreende fluido de ferimento.
  4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 3, caracterizado por ditos substratos serem dispersado em uma matriz de um polímero medicinalmente aceitável, de preferência, um hidrogel.
  5. 5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 3, caracterizado por dito substratos serem ligados a uma fibra, em particular, a uma fibra de um curativo de ferimento ou a uma haste flexível com algodão na extremidade.
  6. 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 5, caracterizado pelo substrato para lisozima ser selecionado a partir do
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    2/3 grupo que consiste em um peptideoglicano, de preferência, um peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus corado com um corante de vinil sulfona.
  7. 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 6, caracterizado pelo substrato para elastase ser selecionado a partir do grupo que consiste em N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida e cisteamida-Succ-Ala-Ala-Pro-Val-pNA.
  8. 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 7, caracterizado pelo substrato para catepsina G ser selecionado a partir do grupo que consiste em N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida e cisteamida-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA.
  9. 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
    1 a 8, caracterizado pelo substrato para mieloperoxidase ser selecionado a partir do grupo que consiste em 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzitiazolina-6-sulfônico), violeta cristal, violeta leucocristal, ácido sináptico, Fast Blue RR modificado com isocianato.
  10. 10. CURATIVO DE FERIMENTO, caracterizado por compreender pelo menos três substratos para pelo menos três enzimas selecionadas a partir de uma das seguintes combinações:
    lisozima, elastase e catepsina G, ou lisozima, elastase e mieloperoxidase, ou lisozima, catepsina G e mieloperoxidase, em que os ditos substratos são capazes de liberar um agente colorido ou de causar desnevoamento.
  11. 11. CURATIVO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo curativo compreender pelo menos quatro dos ditos substratos.
  12. 12. CURATIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelos substratos serem dispersos ou
    Petição 870200005913, de 13/01/2020, pág. 50/89
    3/3 ligados covalentemente em uma matriz de um polímero medicinalmente aceitável ou ligado em uma fibra.
  13. 13. CURATIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelos substratos serem selecionadas a partir do grupo que consiste em um peptideoglicano, de preferência, um peptideoglicano de Micrococcus lysodeictikus corado com um corante de vinil sulfona, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida, N-metoxisuccinil-ala-alapro-phe p-nitroanilida, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, 2,2'-azino-bis(ácido de 3etilbenzitiazolina-6-sulfônico), violeta cristal, violeta leucocristal, ácido sináptico e Fast Blue RR modificado com isocinato.
  14. 14. HASTE FLEXÍVEL COM ALGODÃO NA EXTREMIDADE (swab), caracterizada por compreender pelo menos três substratos para pelo menos três enzimas selecionadas a partir de uma das seguintes combinações:
    lisozima, elastase e catepsina G, ou lisozima, elastase e mieloperoxidase, ou lisozima, catepsina G e mieloperoxidase, em que os ditos substratos são capazes de liberar um agente colorido ou de causar desnevoamento.
  15. 15. HASTE FLEXÍVEL, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela haste flexível com algodão na extremidade compreender pelo menos quatro dos ditos substratos.
  16. 16. HASTE FLEXÍVEL, de acordo com a reivindicação 14 ou
    15, caracterizada pelos substratos serem dispersos ou ligados covalentemente em uma matriz de um polímero medicinalmente aceitável ou ligado em uma fibra.
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