MX2011012255A - Metodo para detectar infeccion en una herida. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona a un método para detectar infección en una herida que comprende las etapas de: poner en contacto una muestra obtenida de una herida con por lo menos dos substratos para por lo menos dos enzimas seleccionadas del grupo que consiste de lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa, y detectar infección en una herida cuando se determina una conversión de por lo menos dos substratos con por lo menos dos enzimas.

Description

METODO PARA DETECTAR INFECCION EN UNA HERIDA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un método para detectar infección en una herida.

La curación de una herida es el proceso natural del cuerpo para regenerar el tejido dérmico y epidérmico. Un grupo de eventos celulares y bioquímicos complejos toma lugar en una cascada orquestada cercanamente para reparar los tejidos dañados, mientras que las fases inflamatorias, proliferativas y de remodelación se traslapan al paso del tiempo. Las acciones coordenadas de tanto poblaciones celulares residentes y migratorias dentro del ambiente de matriz extracelular son esenciales para el restablecimiento de la continuidad y función anatómica. La curación en heridas agudas requiere la terminación coordinada de una variedad de actividades celulares incluyendo fagocitosis, quimiotaxis, mitogénesis, síntesis de colágeno y la síntesis de otros componentes de matriz, y puede ser terminado en el lapso de tres meses.

Ya que el proceso de curación de herida es muy susceptible a interrupción, varias causas que incluyen infección, envejecimiento, diabetes y enfermedad venosa o arterial, conducen a la formación de heridas crónicas, no curadas. En contraste a una herida aguda, estas heridas crónicas fallan para curarse en una forma sincronizada y REF: 225531 ordenada. Aunque la ulceración crónica puede afectar cualquier región anatómica, el sitio más común son las extremidades inferiores. La prevalencia estimada de ulceración de pierna activa en Europa es por lo menos 0.1-0.3 por ciento. Las úlceras secundarias a hipertensión venosa e insuficiencia venosa representan casi 70% de todas las úlceras de la pierna, con diabetes y enfermedad arterial que contribuyen hacia una proporción significativa del resto.

La curación de heridas en general es regulada por Q una multiplicidad de biomoléculas , incluyendo citocinas, factores de crecimiento y enzimas. En una herida crónica, el proceso normal de curación es alterado en uno o más puntos, en su mayoría en las fases inflamatorias o proliferativas . Debido a su importancia en el proceso de curación, las 5 alteraciones en los niveles de factores de crecimiento o enzimas pueden representar la curación dañada observada en heridas crónicas. En las fases de curación normal de heridas, la producción y actividad de las proteasas es fuertemente regulada. Sin embargo, en fluidos crónicos de heridas, niveles 0 de varias proteasas incluyendo catepsina G y neutrófilo elastasa, la cual es capaz para degradar la fibronectina, una proteína esencial implicada en la remodelación de la ECM, han sido observados para ser significativamente superiores en heridas crónicas. Además, ciertos factores de crecimiento 5 vistos para ser degradados por proteasas, las cuales son secretadas principalmente por macrófagos y leucocitos polimorfonucleares .

Además del desequilibrio de factores de crecimiento y enzimas, la infección bacterial es una causa muy común para heridas crónicas . Ya' que las bacterias compiten para nutrientes y oxígeno con macrófagos y fibroblastos, la infección bacteriana puede retrasar incluso detener la curación normal de heridas. La infección resulta cuando las bacterias logran dominar sobre los factores sistémicos y locales de resistencia al huésped. Esto produce una respuesta séptica sistémica y también inhibe múltiples procesos implicados en curación de heridas. Además del número relativo de microorganismos y su patogenicidad, la respuesta huésped y factores como inmunodeficiencia, diabetes mellitus y fármacos, dictan si una herida crónica llega a ser infectada o muestra signos de curación retrasada. Además de un volumen bacteriano incrementado, se detecta formación de biopelícula y la presencia de organismos resistentes a múltiples fármacos en heridas crónicas .

Ya que la- infección no solo resulta en una fase inflamatoria prolongada, sino puede provocar además necrosis de la herida y puede incluso llevar a muerte como una consecuencia de sepsis, los médicos pueden ser capaces de responder a la infección rápidamente. Los métodos actuales para identificar infección bacteriana dependen principalmente del juicio del olor y apariencia de la herida. Por expertos solamente (por ejemplo, doctores médicos) , es posible identificar infección en una herida por signos como enrojecimiento, dolor o mal olor.

En la mayoría de los casos, se toman hisopos y se identifican microorganismos por cultivación. Los resultados de este análisis son disponibles solamente después de 1-3 días. Adicionalmente , ya que la contaminación y colonización de heridas es muy normal, la información acerca del tipo de especies presentes en heridas no es una indicación confiable para infección de heridas. Los factores críticos son: altos niveles de contenido bacterial, bacterias capaces de alterar sus características fenotípicas y genotípicas, presencia de organismos resistentes a múltiples fármacos y formación de biopelícula. Adicionalmente la virulencia de patógenos es importante, es decir la producción de endo y exotoxinas, lo cual puede ser muy peligroso para el huésped. Ya que el uso de hisopos puede dar solamente información acerca del tipo de bacteria y aproximadamente el número aproximado de la carga bacterial, la identificación de especies bacterianas por métodos microbiológicos o PCR no es un diagnóstico real para infección. Adicionalmente, el método es caro y toma por lo menos tres días.

Si se sospecha infección, las pruebas sanguíneas proporcionan muy frecuentemente una indicación del siguiente tratamiento médico. Además de la determinación de la cantidad de glóbulos blancos (leucocitos) , la concentración de proteína C reactiva (CRP por sus siglas en inglés) se incrementa en caso de infección. La CRP pertenece a la familia de proteínas de fase aguda y tiene un tiempo de reacción muy corto (12 horas) . Las determinaciones de CRP han desplazado ampliamente la determinación de proporción de sedimentación de eritrocitos ya que es menos sensible y tiene un lapso de tiempo de más de una semana. Sin embargo, los niveles de CRP elevados son usualmente medidos en sangre lo cual requiere recolección de sangre y análisis en un laboratorio clínico.

En resumen, estos métodos disponibles son consumidores de tiempo y no pueden ser usados en cuidado de casa o para evaluación rápida durante los cambios de banda de herida. Por otra parte, la inspección de olor y apariencia de la herida lo cual puede indicar infecciones requiere doctores con experiencia.

Por lo tanto hay una fuerte necesidad para un auxiliar de prognóstico rápido para diagnóstico de infección de una herida antes a los síntomas clínicos obvios de infección. La herramienta de diagnóstico puede permitir intervención temprana con tratamiento adecuado y puede reducir la intervención clínica y el uso de antibióticos. También, el método puede ser simple y aplicable en cuidado en casa por ejemplo por enfermeras. Estos prerrequisitos requieren diagnóstico rápido en alrededor de 10 a 30 minutos. Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos y un medios para satisfacer la necesidad identificada anteriormente .

La presente invención se relaciona a un método para detectar una infección en una herida que comprende las etapas de : poner en contacto una muestra obtenida de una herida con por lo menos dos substratos para al menos dos enzimas seleccionadas del grupo que consiste de lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa, y detectar una infección de herida cuando es determinada una conversión de por lo menos dos substratos con por lo menos dos enzimas y la conversión es incrementada (por ejemplo por al menos 50%, preferentemente por al menos 100%, más preferentemente por al menos 200%) comparada con la conversión del substrato en una herida no infectada.

Las heridas que son infectadas por microorganismos como bacterias u hongos contienen enzimas específicas en una cantidad incrementada comparada con las heridas no infectadas . En particular la cantidad de las enzimas lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa es incrementada en heridas infectadas. Una actividad incrementada de una, preferentemente dos o todas estas enzimas en una herida indica una infección.

La presente invención proporciona un método para un diagnóstico rápido y temprano de infección de herida. La llamada "herramienta de diagnóstico rápido" se basa en enzimas presentes en fluido de heridas las cuales se asocian con una respuesta inflamatoria del cuerpo humano. La aplicación de substratos apropiados para enzimas, las cuales son elevadas en caso de infección, puede llevar, por ejemplo a una reacción colorida dentro de pocos minutos y permite una estimación muy rápida del estado de la herida. La invención comprende posibles dispositivos en base a niveles elevados de elastasa, lisozima, catepsina G y mieloperoxidasa como indicadores para una posible infección de herida.

La lisozima (también conocida como muramidasa) es una enzima, la cual comprende 129 residuos de aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 14.7 kDa. La lisozima es un componente de gránulos citoplásmicos de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN por sus siglas en inglés) y el producto secretorio principal de los macrofagos, encontrada en secreciones y tejidos de mamíferos,- e indudablemente una de las enzimas principales importantes de nuestro sistema inmunológico innato. Debido al hecho de que la enzima destruye paredes celulares bacterianas por hidrólisis de enlaces 1,4-beta entre el ácido N-acetilmurámico y residuos de N-acetil-D-glucosamina en peptidoglicanno, es comúnmente referida como "antibiótico propio del cuerpo" . Además de su actividad lítica contra bacterias Gram positivas, la lisozima puede actuar como una opsonina innata no específica por enlazar a la superficie bacteriana, reduciendo la carga negativa y facilitando la fagocitosis de la bacteria antes de que lleguen las opsoninas a partir del sistema inmunológico adquirido. Niveles elevados de lisozima en suero son descritos en caso de algunas enfermedades; adicionalmente niveles de lisozima elevados pueden ser detectados en muestras de fluidos de heridas en caso de infección.

En los humanos, existen dos genes para elastasa: elastasa pancreática (ELA-1) y neutrófilo elastasa (ELA-2) ; neutrófilo elastasa (o leucocito elastasa LE : EC 3.4.21.37) es una glicoproteína de 30 kD la cual pertenece a la familia quimotripsina de serina proteasas expresadas por leucocitos polimorfonucleares (PMN por sus siglas en inglés) . La NE madura, una glicoproteína altamente catiónica, es objetivada a granulos primarios donde se empaca con catepsina G (otra serina proteasa de neutrófilo) .

La neutrófila elastasa intracelular es una molécula efectora clave del sistema inmunológico innato, con potente actividad antimicrobiana contra bacterias Gram negativas, espiroquetas, y hongos. Además de la implicación en control de patógenos por degradación de membrana después de la internalización, la neutrófilo elastasa activa catalíticamente ha sido localizada a la membrana plasmática de neutrófilos maduros después de la liberación a partir de almacenamientos intracelulares . Sin embargo, en sitios inflamatorios, la neutrófilo elastasa es capaz de evadir la regulación, y una vez no regulada puede inducir la liberación de citocinas pro- 5 inflamatorias, como la interleucina-6 e interleucina-8 , llevando a destrucción de tejido e inflamación que caracteriza numerosas enfermedades. La elas ina, la cual, junto con colágeno, determina las propiedades mecánicas de tejido conectivo, tiene la única propiedad de embobinado elástico y ^0 tiene una función estructural principal en pulmones, arterias, piel y ligamentos. Por lo tanto, el exceso de actividad de LE ha sido implicado en un número de condiciones patológicas que llevan al daño de organización de ECM, incluyendo artritis reumatoide, enfisema hereditaria, enfermedad pulmonar "L obstructiva crónica, síndrome de insuficiencia respiratoria adulta, enfisema de daño de reperfusión isquémica, fibrosis cística y progresión tumora. Los niveles de elastasa elevados pueden ser observados en el temprano inicio de infección y por lo tanto la presencia de elastasa en fluido de heridas da una 20 precaución de etapa temprana de infección de herida, antes de que estén presentes signos obvios clínicos de infección.

La catepsina G es una proteasa la cual pertenece al grupo de proteasas de cisteína lisosomales con una cisteína tiol nucleofílica en una triada catalítica. Junto con una 25 leucocito elastasa humana y proteinasa 3, la catepsina G es un contenido principal de los gránulos azurofilo en neutrófilos y se libera en sitios de inflamación.

La mieloperoxidasa (MPO por sus siglas en inglés) es una proteína de enzima peroxidasa de 150 kDa (EC 1.11.1.7) que es existente como un dímero que consiste de dos cadenas ligeras de 15 kDa y dos cadenas pesadas glicosiladas de peso variable enlazadas a un grupo hemo prostético. Esta proteína lisosomal es almacenada en gránulos azurofílicos del neutrófilo. MPO produce ácido hipocloroso (H0C1) de peróxido de hidrógeno (H202) y anión cloro (C1-) durante el estallido respiratorio del neutrófilo. El ácido hipocloroso y el radical tirosilo son citotóxicos y son capaces de matar bacterias y otros patógenos. Mientras que la muerte deficiente de MPO es dañada inicialmente pero alcanza niveles normales después de un periodo de tiempo, sugiriendo que un mecanismo alternativo, aparentemente menor de muerte puede tomar sobre neutrófilos deficientes en MPO, la actividad elevada de MPO en caso de infección es medida en sangre y tejido. Esto parece ser debido a la infiltración de neutrófilo incrementada al sitio infectado.

La invención se basa en reacciones bioquímicas que provocan cambios de color debido a la presencia de cuatro enzimas diferentes en heridas en niveles elevados en caso de infección. La evaluación de cuatro enzimas diferentes puede compensar las variaciones en las actividades de enzima individuales en fluidos de heridas que incrementan la exactitud de la herramienta de diagnóstico.

Con el fin de incrementar la exactitud del método de la presente invención la muestra es preferentemente contactada con por lo menos tres, preferentemente por lo menos cuatro, de los substratos permitiendo la determinación de la presencia de por lo menos tres, preferentemente de todas las cuatro enzimas de la presente invención.

Los substratos usados en el método de la presente invención son específicos para lisozima, elastasa, catepsina G y/o mieloperoxidasa . Es particularmente preferido usar por lo menos dos de los substratos específicos a enzimas con el fin de determinar su presencia incrementada en comparación con una herida no infectada. Las combinaciones preferidas de los substratos incluyen substratos para lisozima y elastasa; catepsina G y mieloperoxidasa; lisozima y catepsina G; lisozima y mieloperoxidasa; elastasa y catepsina G; elastasa y mieloperoxidasa; lisozima, elastasa y catepsina G; lisozima, elastasa y mieloperoxidasa, lisozima, catepsina G y mieloperoxidasa; elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa.

La muestra obtenida a partir de la herida puede ser el fluido de herida, un vendaje de herida que comprende fluido de herida o un hisopo que comprende fluido de la herida.

La presencia y la cantidad de las enzimas de la presente invención en la herida puede ser determinada por usar directamente el fluido de herida. Alternativamente pueden ser usados vendajes de herida o hisopos los cuales han estado en contacto con el fluido de herida.

Con el fin de determinar la presencia de lisozima, elastasa, catepsina G y/o mieloperoxidasa directamente en un vendaje de herida o un hisopo, por lo menos dos substratos son preferentemente dispersados en una matriz de un polímero aceptable médicamente, preferentemente un hidrogel en base a alginato, peptidoglicano y/o ácido poligalacturónico, preferentemente proporcionado en la forma de por ejemplo, una película o perlas y/o enlazado a una fibra, en particular a una fibra de un vendaje de herida o un hisopo Un vendaje de herida, hisopo o pinchazo diagnóstico particularmente preferido puede comprender un portador, una matriz biodegradable por ejemplo película monocapa o multicapa o perlas y una barrera. El portador puede ser un polímero como poliamida o polipropileno. En el portador puede ser localizada una matriz biodegradable. Esta matriz puede ser elaborada por ejemplo como una película (1-5 mm de espesor) o perlas como mono o multicapa (2-8 mm en diámetro) .

El substrato de las enzimas, en particular de lisozima y elastasa, puede ser un polímero o biopolímero o dispersado en los polímeros el cual puede ser degradado por las enzimas. Por ejemplo, un polímero de peptidoglicano puede actuar como un substrato para lisozima y elastina como un substrato para elastasa. El polímero degradable puede comprender por lo menos un substrato enlazado a por lo menos una molécula marcadora como por lo menos un tinte el cual es liberado en el curso de la degradación del substrato. Las películas multicapa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 capas) o perlas pueden comprender una matriz que contiene el substrato de enzima etiquetado el cual es cubierto por substrato de enzima no etiquetado. En la matriz de polímero biodegradable se localiza una capa de barrera. La capa de barrera es una membrana no degradable la cual evita que las substancias de la matriz biodegradable y el substrato y substratos convertidos sean liberados al exterior. Sin embargo, la capa de barrera es permeable para los fluidos de herida .

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención el substrato para lisozima es seleccionado del grupo el cual consiste de un peptidoglicano teñido, preferentemente un peptidoglicano de Micrococcus lysodictikus, y quitosan teñido, ambos teñidos preferentemente con un tinte de vinil sulfona (por ejemplo Remazol) .

El substrato para elastasa es seleccionado preferentemente del grupo que consiste de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida y Cisteamid-Succ-Ala-Ala-Pro-Val-pNa, la cual es enlazada directa y preferentemente al portador o a la matriz.

De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención el substrato para catepsina g es seleccionado del grupo que consiste de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida y Cisteamid-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa, la cual es enlazada directa y preferentemente al portador o a la matriz.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención el substrato para mieloperoxidasa es seleccionada del grupo que consiste de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina, ácido 2, 2'-azino-bis (3-etilbentiazolina-6-sulfónico) , cristal violeta, leuco cristal violeta, ácido sináptico, alcoxisilanurea y otros compuestos como Fast Blue RR modificado con isocianato. Los substratos pueden ser inmovilizados covalentemente en el sistema. El peróxido de hidrógeno puede estar presente como un co-substrato . La integración de celobiosa deshidrogenasa (por ejemplo, celobiosa deshidrogenada de Myriococcum thermophilum) , mesilato de desferrioxamina y 5 a 500 mM, preferentemente 10 a 200 mM, en particular 30 mM, de celobiosa como substrato, resulta en la producción de peróxido de hidrógeno el cual es usado por mieloperoxidasa como un co-substrato. Por supuesto también otros sistemas de enzima que implican otros substratos pueden ser usados para producir peróxido de hidrógeno.

La cantidad de los substratos usados puede variar de substrato a substrato. Ya que el método de la presente invención es optimizado para una rápida detección de infección de una herida la cantidad del substrato usado depende de la proporción de conversión de la enzima y del ambiente (por ejemplo, líquido, vendaje de herida, hisopo etc.) donde ocurre la conversión.

La cantidad de substrato y de fluido de herida a ser usados varía además a partir del método de detección-, fluido, en gel (matriz biodegradable) , hisopo, vendaje de herida, etc.

En un sistema de prueba líquido la cantidad del substrato de elastasa agregado a una muestra líquida de herida que tiene un volumen en entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente entre 1 y 15 µ?, varía de 10 a 500 µ? , preferentemente de 20 a 400 µ?, más preferentemente de 50 a 300 µ?, incluso más preferentemente de 80 a 150 µ?, de una solución la cual comprende 0.05 a 5 mM, preferentemente 0.05 a 2.5 mM, en particular 0.8 a 1.2 mM, de substrato. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención 4 a 6 µ, preferentemente 5 µ, de líquido de herida es incubado con 90 a 110 µ?, preferentemente 100 µ?, de una solución de substrato que comprende 0.8 a 1.2 mM, preferentemente 1 mM de substrato de elastasa, preferentemente N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida .

En un sistema de prueba líquida la cantidad del substrato de catepsina G agregado a una muestra de líquida de herida que tiene un volumen en entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente en entre 1 y 15 µ?, varía de 10 a 500 µ?, preferentemente de 20 a 400 µ? , más preferentemente de 50 a 300 µ?, incluso más preferentemente de 80 a 150 µ?, de una solución que comprende 0.1 a 10 mM, preferentemente 0.5 a 5 mM, en particular 3 mM, de substrato. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención 4 a 6 µ? , preferentemente 5 µ? , de líquido de herida es incubado con 90 a 110 µ?, preferentemente 100 µ?, de una solución de substrato que' comprende 2 a 4 mM, preferentemente 3 mM, de substrato de catepsina G, preferentemente N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida .

En un sistema de prueba líquida la cantidad del substrato mieloperoxidasa agregado a una muestra líquida de herida que tiene un volumen entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente entre 1 y 15 µ?, varía de 10 a 500 µ?, preferentemente de 20 a 400 µ?, más preferentemente de 50 a 300 µ?, incluso más preferentemente de 80 a 150 µ?, de una solución que comprende 0.01 a 1 mM, preferentemente 0.02 a 0.45 mM, de substrato. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención 4 a 6 µ?, preferentemente 5 µ?, de líquido de herida diluido 1:10 a 1:30, preferentemente 1:20, es incubado con 90 a 110 µ?, preferentemente 100 µ?, de una solución de substrato que comprende 2 a 4 mM, preferentemente 3 mM, de substrato de mieloperoxidasa, preferentemente 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametilbencidina y/o ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-5-sulfónico) , cristal violeta, leuco cristal violeta 0.1 mm o fenólicos naturales como ácido sináptico, alcoxisilanurea y Fast Blue RR modificado con isocianato .

La solución que comprende los substratos puede además comprender 0.1 a 0.5 M, preferentemente 0.3 M, de sacarosa y 1 a 30 µ?, preferentemente 15 µ? de H202. En lugar de peróxido de hidrógeno, el sistema puede contener una enzima que produce peróxido de hidrógeno a partir de carbohidratos como la glucosa oxidasa u otra carbohidrato oxidasa como celobiohidrolasa (CBH por sus siglas en inglés) .

En un sistema de prueba líquida la cantidad del substrato de lisozima agregada a una muestra líquida de herida que tiene un volumen entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente entre 1 y 15 µ?, varía de 1 a 25 mg, preferentemente de 5 a 20 mg, más preferentemente de 8 a 10 mg, en una solución que comprende 1 a 30 mi, preferentemente 15 mi, de amortiguador. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención 4 a 6 µ?, preferentemente 5 µ?, de líquido de herida es incubado con 90 a 110 µ?, preferentemente 100 µ?, de una solución de substrato que comprende substrato de lisozima, preferentemente un peptidoglicano, más preferentemente un peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus, y quitosan teñido, ambos preferentemente teñidos con un tinte de vinil sulfona (por ejemplo Remazol) .

En un sistema de prueba a base de gel para detectar actividad de elastasa y catepsina G 20 a 250 µ?, preferentemente 50 a 150 µ? más preferentemente 100 µ? de un 0.05 a 25 mM, preferentemente 0.1 a 20 mM de solución de substrato son agregados a 40 a 50°C, más preferentemente una solución de gel a 45 °C (que comprende por ejemplo 1 a 2%, preferentemente 1.5% de agarosa) que tiene un volumen de 50 a 150 µ? preferentemente de 100 µ? . Se agrega al gel una muestra líquida de herida que tiene un volumen en entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente en entre 1 y 15 µ? .

En un sistema de prueba a base de gel para detectar actividad de mieloperoxidasa un volumen de 50 a 150 µ?, preferentemente de 100 µ? , de una solución usada para prueba líquida es agregado al mismo volumen de gel calentado como se menciona anteriormente. Al gel se agrega una muestra líquida de herida que tiene un volumen entre 0.5 y 30 µ?, preferentemente entre 1 y 15 µ?.

En un sistema de prueba a base de gel para detectar la actividad de lisozima 5 a 100 mg, preferentemente 10 a 75 mg, más preferentemente 15 a 50 mg, de peptidoglicano, preferentemente de Micrococcus lysodeictikus, es suspendido en un gel caliente, preferentemente gel de agarosa (que comprende por ejemplo 10 g de agarosa en una concentración de aproximadamente 1% p/v) . Alternativamente se tiñe el peptidoglicano con un tinte como se describe en la presente por calentar peptidoglicano junto con el tinte a aproximadamente 60 a 70°C. El precipitado puede ser usado para probar actividad de lisozima. Alternativamente, el sistema de prueba a base de gel comprende dos capas de peptidoglciano teñido y no teñido. En caso de degradación de peptidoglicano debido a la actividad de lisozima, el color puede cambiar de amarillo a azul.

Los sistemas de prueba a base de hisopo son realizados con las soluciones como se indica anteriormente para los sistemas de prueba a base de liquido. Los hisopos a ser usados son capaces de absorber 0.5 a 20 µ?, preferentemente 1 a 15 µ?, de fluido de herida.

Si se usa el sistema de prueba como un indicador en vendajes de herido las soluciones mencionadas anteriormente son llevadas al vendaje y secadas o los substratos de enzimas son enlazados covalentemente al vendaje.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un vendaje de herida o hisopo que comprende por lo menos dos substratos para al menos dos enzimas seleccionadas del grupo que consiste de lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa .

Un vendaje de herida y un hisopo que comprenden el por lo menos un substrato es particularmente ventajoso ya que permite determinar directamente en el vendaje e hisopo si una herida está infectada o no. Los substratos a ser usados desarrollan preferentemente un color cuando se convierten por enzimas presentes en una muestra a la cual se pone en contacto el vendaje o hisopo. Alternativamente es también posible proporcionar en el vendaje o hisopo otras substancias capaces de reaccionar con el substrato convertido.

Un vendaje de herida que comprende los substratos y opcionalmente un medio para detectar la conversión de los substratos por las enzimas presentes en una herida infectada es particularmente ventajoso ya que permite monitorear si una herida cubierta por el vendaje está infectada o no. Consecuentemente cualquier persona puede decidir cuando tiene que ser cambiado un vendaje de herida.

El vendaje de herida o un sistema diagnóstico, el cual puede ser posicionado en la vecindad de una herida estando en contacto con el fluido de herida puede comprender una capa portadora, una matriz operante y una capa de barrera. Pueden ser usados la poliamida enz imáticamente funcionalizada o polipropilenos como capas portadoras. Para la matriz operante diferentes mezclas de geles, por ejemplo alginato/agarosa y gelatina, con substratos de enzima incorporados, como peptidoglicano o quxtosan como substratos para lisozima, pueden ser usados. Por ejemplo cuando la cantidad de lisozima es determinada pueden ser aplicadas combinaciones de agarosa con varias cantidades de peptidoglicano en el intervalo de 15 a 50 mg por 10 g de agarosa/gelatina . La capa de barrera puede ser usada en una membrana (con un espesor de por ejemplo 0.2 µp?) para excluir substrato convertido como material colorido de fluidos de herida como eritrocitos. Una respuesta clara de este sistema para lisozima y fluidos de herida puede ser obtenida por medir transparencia incrementada en por ejemplo, 450 nm. Adicionalmente, en caso de altas actividades de lisozima, una liberación del tinte Remazol Brilliant Blue enlazado covalentemente al peptidoglicano puede ser detectado por un cambio de calor del sobrenadante a azul, por un cambio de color de hisopo colocado en el sistema a azul o ser medido en 600 nm.

De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención el vendaje o hisopo comprende por lo menos dos preferentemente por lo menos tres, en particular cuatro de los substratos .

De acuerdo con una modalidad preferida adicional de la presente invención el por lo menos un substrato se dispersa en una matriz de un polímero aceptable médicamente o es enlazado en una fibra.

Por lo menos un substrato es seleccionado preferentemente del grupo que consiste de un peptidoglicano, preferentemente un peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus teñido con un tinte de vinil sulfona, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida, 3 , 3 ' , 5 , 5' -tetrametilbencidina, ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-5-sulfónico) , cristal violeta, leuco cristal violeta u otros fenólicos naturales como ácido sináptico, alcoxisilanurea y Fast Blue RR modificado con isocianato.

La presente invención es además ilustrada en el siguiente ejemplo, sin embargo, sin ser restringida al mismo.

Ejemplo 1: Sistema liquido - Prueba a base de elastasa Preparación del Sistema de Diagnóstico 100 µ? de una solución de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida disuelto en una concentración de 20 mM en DMSO en amortiguador de HEPES 0.1 M (pH 7.4 que contiene 0.5 M de NaCl) es pipeteado en un tubo eppendorf transparente. La concentración final de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida puede estar entre 0.05 a 2.50 mM y es preferentemente entre 0.80 y 1.20 mM.

Diagnóstico Se agrega un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida al sistema de prueba, preferentemente entre 4-6 µ? y se mezcla por agitación manual por 10 segundos. Esta mezcla es incubada en temperatura ambiente por 5 minutos . Después de esto, la infección de la herida será indicada por un cambio de color de rosa claro a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color.

Protocolo y Resultados de Prueba: 5 µ? de muestras de heridas infectadas (A, B, C) y no infectadas son incubadas con el sistema de diagnóstico descrito en 1A que contiene una concentración de substrato de 1.0 mM de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indica un cambio de color a amarillo solamente para muestras de herida infectada A, B y C. *medida con N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida en base al ensayo estándar.

Ejemplo 2: Sistema a base de gel - prueba a base de elastasa Preparación del Sistema de Diagnóstico Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida en una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y diluido en amortiguador ????? 0.1 (pH 7.4, que contiene 0.5 M de NaCl) . La concentración final de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida puede estar entre 0.2 a 15 mM, y está preferentemente entre 0.50 y 5.00 mM. Se mezclan 100 µ? de esta solución apropiadamente con el volumen igual de solución de agarosa caliente (45°C) (1.5% p/v) y se transfiere a los pozos de una placa de 96 pozos.

Diagnóstico Se agrega un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida al sistema de prueba, preferentemente entre 4-6 µ? . Esta mezcla es incubada en temperatura ambiente por 5 minutos. Después de esto, será indicada la infección de una herida por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color .

Protocolo y Resultados de la Prueba: Se incuban 5 µ? de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) con el sistema diagnóstico descrito IB que contiene una concentración de substrato de 5.0 mM de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indican un cambio de color a amarillo solamente para las muestras de herida infectadas A, B y C.

Muestra de Infección de Respuesta de la prueba Infección de la herida acuerdo al acuerdo con diagnóstico de la prueba los médicos A Si Amarillo Si B si Amarillo Si C si Amarillo Si D No No cambia de color No E No No cambia de color No F No No cambia de color No Ejemplo 3: Sistema de hisopo -Prueba a base de elastasa Preparación del Sistema de Diagnóstico Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida en una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y diluida en amortiguador HEPES 0.1 M (pH 7.4, que contiene 0.5 M de NaCl) . La concentración final de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida puede estar entre 0.2 a 10 mM, y está preferentemente entre 0.50 y 5.00 mM. 40 µ? de esta solución son pipeteados en placas de microtítulo .

Diagnóstico Hisopos pequeños 0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) son sumergidos en fluidos de herida por lo mismo adsorbiendo entre 1 y 12 µ? de líquido de herida, preferentemente entre 5 y 8 µ? . El sistema de prueba es entonces colocado en las placas de microtítulo que contienen la solución substrato y se incuban en temperatura ambiente por 5 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por un cambio de color del hisopo (es decir la tela de poliéster) a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectadas no cambiarán en color.

Protocolos y Resultados de la Prueba Usando hisopos pequeños (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) son tomadas muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) y colocadas en el sistema de diagnóstico descrito en 1C que contiene una concentración de substrato de 1.0 mM N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indica un cambio de color a amarillo solo para muestras de herida infectada A, B y C.

Muestra de Infección de Respuesta de la prueba Infección de herida acuerdo al acuerdo con diagnóstico de la prueba los médicos A Si Amarillo Si B Si Amarillo Si C Si Amarillo Si D No No cambia de color No E No No cambia de color No No cambia de color No Ejemplo 4. Sistema Líquido - Prueba a base de Catepsina Preparación del Sistema de Diagnóstico Se disuelve N-succinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida en una concentración de 20 mM en dimetoxisulfoxido y se diluye en 0.1 M de amortiguador HEPES (pH 7.4, que contiene 0.5 M de NaCl) . La concentración final de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida puede estar entre 0.5 a 5 mM, y es preferentemente 3 mM.

Diagnóstico Se agrega un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida al sistema de prueba, preferentemente entre 4-6 µ? y se mezcla por agitación manual. Esta mezcla es incubada en 37°C por 10 minutos . Después de esto la infección de la herida será indicada por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color .

Protocolo y Resultados de la Prueba: 5 µ? de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) se incuban con el sistema de diagnóstico descrito en 1A que comprende una concentración de substrato de 3.0 mM de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 10 a 15 minutos de incubación indica un cambio de color a amarillo solamente para muestras de heridas infectadas A, B y C.

Muestra Infección de Respuesta de la Infección Catepsina de la acuerdo al prueba de acuerdo G* herida diagnóstico con la U/mL de los prueba médicos A Si Amarillo Si 40 B Si Amarillo Si 36 C Si Amarillo Si 45 D No No cambia de color NO 3 E No No cambia de color No 2.5 F No No cambia de color No 3.5 *medida con N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida en base al ensayo estándar.

Ejemplo 5: Sistema a base de gel -Prueba a base de catepsina Preparación del Sistema de Diagnóstico Se disuelve la N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida en una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluye en amortiguador 0.1 M HEPES (pH 7.4 que contiene 0.5 M de NaCl) . La concentración final de N-metoxisuccinil -ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida puede estar entre 0.5 a 10 mM, y es preferentemente 5.0 mM. 100 µ? de esta solución es mezclada apropiadamente con el volumen igual de solución de agarosa caliente (45°C) (1.5% p/v) y se transfiere en pozos de una placa de 96 pozos .

Diagnóstico Un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida es agregado al sistema de prueba preferentemente entre 4-6 µ? . Esta mezcla es incubada en 37°C por 10 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por un cambio de color a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color.

Protocolo y Resultados de Prueba Se incuban 5 µ? de muestras de herida infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito en IB que contienen una concentración de substrato de 5.0 mM N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 10 minutos de incubación indica un cambio de color a amarillo solamente para muestras de herida infectada A, B y C.

Muestra Infección de Respuesta de la Infección de la acuerdo al prueba de acuerdo herida diagnóstico de con la los médicos prueba A Si Amarillo Si B Si Amarillo Si C Si Amarillo Si D No No cambia de color No E NO No cambia de color No F No No cambia de color No Ejemplo 6: Sistema de hisopo- Prueba a base de catepsina Preparación del Sistema de Diagnóstico Se disuelve N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida en una concentración de 20 mM en dimetoxisulfóxido y se diluye en amortiguador HEPES 0.1 M (pH 7.4, que contiene 0.5 M de NaCl) . La concentración final de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida puede estar entre 0.5 a 10 mM, y es preferentemente 5.0 mM. 40 µ? de esta solución son pipeteados en placas de microtítulo.

Diagnóstico Se sumergen pequeños hisopos (0.5x0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) en un fluido de herida por lo mismo adsorbiendo entre 1 y 12 µ? de líquido de herida preferentemente entre 5 y 8 µ? . El sistema de prueba es entonces colocado en las placas de microtítulo que contienen la solución de substrato y se incuba en 37°C por 15 minutos. Después de esto la infección de la herida será indicada por un cambio de color del hisopo (es decir tela de poliéster) a amarillo. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color.

Protocolo y Resultados de la Prueba Usando hisopos pequeños (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) se toman muestras de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) y se colocan en el sistema de diagnóstico descrito en 1C que contiene una concentración de substrato de 5.0 mM de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilida . La inspección visual de las muestras después de 15 minutos de incubación indica un cambio de color a amarillo solamente para muestras de herida infectada A, B y C.

Muest a Infección de Respuesta de la Infección de herida acuerdo al prueba de acuerdo diagnóstico de con la los médicos prueba A Si Amarillo Si B Si Amarillo Si C Si Amarillo Si D No No cambia de color No E No No cambia de color No F No No cambia de color No Ejemplo 7: Sistema de Líquido - Prueba a Base de Mieloperoxidasa Preparación del Sistema de Diagnóstico Para esta herramienta de diagnóstico, pueden ser usados dos substratos diferentes, es decir TMB o ABTS . 3350 µ? de amortiguador de succinato (pH 5.4) que comprende 0.3 M de sacarosa son usados, son agregados 15 µ? de H202 al 1% y 7 µ? de los substratos (5-40 mM de ABTS, 20-15 mM de TMB, 0.0128 mM de cristal violeta y 0.025 mM de Fast Blue RR modificado). TMB (por sus siglas en inglés de 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametilbencidina) es disuelta primeramente en N, N-metilformamida, cristal violeta, leuco cristal violeta y Fast Blue RR modificado es disuelto en etanol, mientras que ABTS puede ser disuelto en agua. 100 µ? de las soluciones son pipeteadas en un tubo de eppendorf transparente .

Diagnóstico Se agrega un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida al sistema de prueba, preferentemente entre 4-6 µ? y se mezcla por agitación manual por 10 segundos. Esta mezcla es incubada en temperatura ambiente por 10 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por un cambio de color de incoloro a azul (TMB o verde (ABTS), respectivamente. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectadas no cambiarán en color.

Protocolo y Resultados de la Prueba El fluido de herida de muestras infectadas y no infectadas es diluido 1:20. 5 µ? de estas diluciones de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E F) son incubadas con el sistema de diagnóstico descrito en 1A que contiene los dos substratos diferentes. La inspección visual de las muestras después de 5 minutos de incubación indican un cambio de color a azul en caso de TMB solamente para muestras de heridas infectadas A, B y C.

Muestra Infección de Respuesta de la eba Infección Actividad de la acuerdo . al de acuerdo de MPO* herida diagnótico con la U/mL de los prueba médicos A Si Azul Si 190 B Si Azul Si 160 C Si Azul Si' 175 D No No cambia de color No 5 E NO No cambia de color No 12 F No No cambia de color No 17 *medida con guayacol como ensayo estándar base Ejemplo 8: Sistema de Gel - Prueba a base de Mieloperoxidasa Preparación del Sistema de Diagnóstico Para esta herramienta de diagnóstico, pueden ser usados dos substratos diferentes, es decir TMB o ABTS . Se usan 3350 µ? de amortiguador de succinato (pH 5.4) que comprende 0.3 M de sacarosa, se agregan 15 µ? de H202 al 1% y 7 µ? de los substratos (5-40 mM de ABTS, 20-150 mM de TMB, 0.0128 mM de cristal violeta, 0.1 mM de leuco cristal violeta ó 0.025 m M de Fast Blue RR modificado. Se disuelve primero TMB (3 , 3 5 , 5 ' -tetrametilbencidina en N, -metilformamida, mientras que ABTS puede ser disuelto en agua. 100 µ? de esta solución es mezclada apropiadamente con el volumen igual de solución de agarosa caliente (45°C) (1.5% de p/v) y se transfiere en pozos de una placa de 96 pozos.

Diagnóstico Se agrega un volumen entre 1 y 15 µ? de fluido de herida al sistema de prueba, preferentemente entre 4-6 µ? . Esta mezcla es incubada en temperatura ambiente por 5 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por un cambio de color a azul y verde respectivamente. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectada no cambiarán de color .

Protocolo y Resultados de la Prueba Se incuban 5 µ? de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito en IB que contiene los dos substratos para MPO . La inspección visual de las muestras después de 5 minutos de incubación indica un cambio de color a azul o verde solamente para muestras de herida infectadas A, B y C.

Ejemplo 9: Sistema a Base de Hisopo -Prueba a base de mieloperoxidasa Preparación del Sistema de Diagnóstico Se usan 3350 µ? de amortiguador de succinato (pH 5.4) que comprende 0.3 M de sacarosa, se agregan 15 µ? de H202 al 1% y 7 µ? de los substratos (20 mM de ABTS, 100 mM de TMB , 0.0128 de mM de cristal violeta, 0.1 mM de leuco cristal violeta y 0.025 mM de Fast Blue RR modificado). 40 µ? de esta solución son pipeteados en placas de microtítulo.

Diagnóstico Se sumergen pequeños hisopos (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) en fluido de herida diluido 1:20 por lo mismo adsorbiendo entre 1 y 12 µ? de líquido de herida, preferentemente entre 5 y 8 µ? . El sistema de prueba es entonces colocado en las placas de microtítulo que contienen la solución de substrato y se incuban en temperatura ambiente por 10 minutos. Después de esto la infección de herida será indicada por un cambio de color del hisopo (es decir tela de poliéster) a azul o verde, respectivamente. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectadas no cambiarán de color .

Protocolo y Resultados de la Prueba Se toman muestras usando hisopos pequeños (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) de muestras de herida infectadas (A, B, C) y no infectadas (D, E, F) diluidas 1:20 y se colocan en el sistema de diagnóstico descrito en IB que contiene los substratos TMB . La inspección visual de las muestras después de 5 minutos de incubación indican un cambio de color a azul solamente para muestras de herida infectada A, B y C.

Muestra Infección de Respuesta de la Infección de la acuerdo al prueba de acuerdo herida diagnostico de con la los médicos prueba A Si Azul Si B Si Azul Si C Si Azul Si D No No cambia de color No E No No cambia de color No F No No cambia de color No Ejemplo 10: Sistema Líquido - Prueba a base de Lisozima Preparación del Sistema de Diagnóstico Una cantidad entre 1 y 15 mg de peptidoglicano de Micrococcus lysodeikticus es suspendida en 15 mi de amortiguador de KH2P04 0.1 M (pH 7.0). Preferentemente, una cantidad entre 8 y 10 mg es suspendida. 290 µ? de esta solución es pipeteada en un tubo eppendorf transparente.

Diagnóstico Se agrega un volumen de 10 µ? de fluido de herida al sistema de prueba y se mezcla por agitación manual por 10 segundos. Esta mezcla es incubada en 37°C por 15 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por una disminución en turbidez. Las mezclas que contienen muestras de herida no infectadas no cambiarán .

Protocolos y Resultados de la Prueba Se incuban 10 µ? de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito en 2A que contiene Micrococcus lysodeikticus como un substrato para lisozima. La inspección visual de las muestras después de 15 minutos de incubación en 37°C indica un cambio de turbidez solamente para muestras de herida infectada A, B y Muestra Infección de Respuesta de la Infección Actividad de la acuerdo al prueba de acuerdo de herida diagnóstico de con la lisozima* los médicos prueba U/mL A Si Claro Si 1200 B Si Claro Si 974 C Si Claro Si 1800 D No Turbio No 210 E No Turbio No 205 F No Turbio No 320 *medida con peptidoglicano de Micrococcus lysodeikticus como un substrato Ejemplo 11: Sistema a Base de Gel - Prueba a Base de Lisozima Preparación del Sistema de Diagnóstico Se suspende 15 a 50 mg de peptidoglicano de Micrococcus lisodeictikus en 10 g de agarosa (1% de p/v) que se disuelve en 0.1 M de amortiguador de fosfato pH 7.0 y se calienta en el horno de microondas . La solución es apropiadamente mezclada y transferida en pozos de una placa de 96 pozos. En un segundo ensayo, se tiñe peptidoglicano {Micrococcus ysodeictikus) con Remazol Brilliant Blue (RBB) . Por lo tanto, se suspenden 50 mg de peptidoglicano en 0.5 mi de solución de Remazol Brilliant Blue (0.5% de p/v) y se diluye con el volumen igual de solución de tinción (2.5% p/v NaS04) . Después se usa el gradiente térmico: 25°C por 10 minutos, 65°C por 5 minutos. Después de la centrifugación por 4 minutos en 13000 rpm, se realizan varias etapas de lavado hasta que el sobrenadante es incoloro. En un tercer aspecto, se usan dos capas de peptidoglicano teñido y no teñido, mientras que se aplica el peptidoglicano teñido como se describe anteriormente (sistema de capa doble) . Adicionalmente , se usa una matriz que comprende 80% de agarosa al 1% y 20% de gelatina al 2%, elastina, fibronectina y colágeno respectivamente.

Diagnóstico Se agrega un volumen de 100 µ? de fluido de herida al sistema de prueba. Esta mezcla es incubada en 37°C entre 15 y 60 minutos. La digestión de peptidoglicano debido a la actividad de lisozima lleva a un incremento en trasparencia lo cual puede ser medido en 450 nm y lo cual puede ser visto claramente en caso de heridas infectadas. En caso del peptidoglicano teñido, el tinte es liberado en el sobrenadante, el cual cambia a azul en caso de heridas infectadas. En caso del sistema de doble capa, el sistema cambia de color de amarillo a azul lo cual puede ser fácilmente visto después de la incubación por al menos 30 minutos .

Protocolo y Resultados de la Prueba Se incuban 100 µ? de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) con el sistema de diagnóstico descrito 2B que contiene peptidoglicano como un substrato para lisozima. La inspección visual de las muestras después de 15 y 60 minutos de incubación indica un cambio en transparencia solamente para muestras de herida infectada A, B y c.

Muestra Infección Respuesta Respuesta Respuesta de la Infección de la de acuerdo de la de la prueba en de herida al prueba en prueba en sistema de acuerdo diagnóstico sistema sistema doble capa con la de los no teñido teñido pruebi médicos A Si Claro Azul Azul Si B Si Claro Azul Azul Si C Si Claro Azul Azul Si D No Turbio Claro Amarillo/blanco No E NO Turbio Claro Amarillo/blanco No F NO Turbio Claro Amarillo/blanco No Ejemplo 12: Sistema a Base de Hisopo - Prueba a Base de Lisozima Preparación del Sistema Diagnóstico Se suspenden 15 a 50 mg de peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus teñido con Remazol Brilliant Blue (RBB) en 10 g de agarosa (1% p/v) disuelto en 0.1 M de amortiguador de fosfato pH 7.0 y se calienta en el horno de microondas . La solución es mezclada apropiadamente y transferida en pozos de una placa de 96 pozos.

Diagnóstico Los hisopos pequeños (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) son sumergidos en fluido de herida por lo mismo adsorbiendo entre l y 12 µ? de líquido de herida, preferentemente entre 5 y 8 µ? . El hisopo es entonces enjuagado en solución de amortiguador y esta solución es entonces colocada en las placas de microtítulo que contienen el sistema a base de gel con peptidoglicano teñido. El sistema es entonces incubado en 37 °C por 30 minutos. Después de esto, la infección de herida será indicada por un sobrenadante azul/las telas que cambian a azul en caso de heridas infectadas .

Protocolo y Resultados de la Prueba Se toman muestras usando hisopos pequeños (0.5 x 0.5 cm) de una microfibra de poliéster PES (Microjet S1000) de muestras de herida infectada (A, B, C) y no infectada (D, E, F) y se colocan en el sistema de diagnóstico descrito anteriormente que contiene el sistema a base de gel con peptidoglicano teñido con remazol. La inspección visual del sobrenadante/las telas después de 30 minutos de incubación indica el desarrollo de un color azul solamente para muestras de herida infectadas A, B y C.

Ejemplo 13: Sistema Líquido- Combinación de Enzimas Preparación del Sistema Diagnóstico Se preparan 100 µ? de los substratos líquidos descritos para las enzimas elastasa, mieloperoxidasa y catepsina G (ver los ejemplos 1 a 10) y se transfieren a una placa de microtítulo.

Diagnóstico Se agregan 5 µ? de fluidos de herida de heridas infectadas (A-F) y heridas no infectadas (G-L) . El fluido de herida puede ser tomado con un capilar o una jeringa y es llevado a alícuotas después de esto. Alternativamente, se usan los hisopos para transferir muestras de heridas infectadas (A-F) y heridas no infectadas (G-L) a 1-2 mi de solución de amortiguador. Se agregan alícuotas de 250 µ? (500 µ?) a la placa de microtítulo con los cuatro substratos de enzima diferentes .

Las placas son incubadas en 37°C. Después de 10 minutos, se inspecciona el ensayo para elastasa y cambia a amarillo en el caso de las heridas infectadas. Después de 30 minutos son inspeccionados el ensayo de la catepsina G y la lisozima y se indica infección por cambio a amarillo, azul y claro respectivamente. Después de 5 minutos, dos ensayos para MPO (TMB y ABTS) son inspeccionados e indican infección por cambio a azul y verde respectivamente. Después de 60 minutos, es inspeccionado el ensayo para MPO usando cristal violeta, leuco cristal violeta y Fast Blue RR modificado e indica infección por cambio en el color.

Q La muestra A muestra un desarrollo de color menos pronunciado en el ensayo de elastasa, pero es claramente positiva en los otros ensayos. En contraste, las muestras D y E muestran un desarrollo de color menos pronunciado en el ensayo MPO ABTS mientras que son positivas en los otros 5 ensayos. Esto confirma la importancia de la combinación de por lo menos 2, preferentemente 3, más preferentemente 4, diferentes ensayos para la herramienta de diagnóstico.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la o práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 5

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para detectar infección en una herida caracterizado porque comprende las etapas de: poner en contacto una muestra obtenida de una herida con por lo menos dos substratos para al menos dos enzimas seleccionadas del grupo que consiste de lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa, y detectar infección en una herida cuando se determina una conversión de por lo menos dos substratos con las por lo menos dos enzimas .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se pone en contacto con por lo menos tres, preferentemente por lo menos cuatro, de los substratos .

3. El método de conformidad con la reivindicación 7 1 ó 2, caracterizado porque la muestra es un fluido de herida, un vendaje de herida que comprende fluido de herida, un hisopo que comprende fluido de herida.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el por lo menos un substrato es dispersado en una matriz de un polímero aceptable médicamente, preferentemente un hidrogel .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los por lo menos dos substratos son enlazados a una fibra, en particular a una fibra de un venda e de herida o un hisopo.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el substrato para lisozima es seleccionado del grupo que consiste de peptidoglicano, preferentemente un peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus teñido con un tinte de vinilsulfona .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el substrato para elastasa es seleccionado del grupo que consiste de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida y Cisteamid-Succ-Ala-Ala-Pro-Val-pNA.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el substrato para catepsina G es seleccionado del grupo que consiste de N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida y Cisteamid-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el substrato para mieloperoxidasa es seleccionado del grupo que consiste de 3 , 3 ' , 5 , 5 ' - tetrametilbencidina, ácido 2 , 2 ' -azino-bis (3 -etilbenztiazolina-6-sulfónico) , cristal violeta, leuco cristal violeta, ácido sináptico y Fast Blue RR modificado con isocianato .

10. El vendaje de herida o hisopo caracterizado porque comprende por lo menos dos substratos para al menos dos enzimas seleccionadas del grupo que consiste de lisozima, elastasa, catepsina G y mieloperoxidasa los substratos capaces de liberar un agente colorido o provocar reducción de turbidez.

11. El vendaje de herida o hisopo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el vendaje o hisopo comprende por lo menos tres, preferentemente por lo menos cuatro, de los substratos.

12. El vendaje de herida o hisopo de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el por lo menos substrato es dispersado o enlazado covalentemente en una matriz de un polímero aceptable médicamente o enlazado a una fibra.

13. El vendaje de herida de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el por lo menos dos substratos son seleccionados del grupo que consiste de un peptidoglicano, preferentemente un peptidoglicano de Micrococcus lysodeictikus teñido con un tinte de vinil sulfona, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida, N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-phe p-nitroanilida, 3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina, ácido 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfónico) , cristal violeta, leuco cristal violeta, ácido sináptico, y Fast Blue RR modificado con isocianato.