KR20190008199A - 상처에서 미생물 감염의 검출 방법 - Google Patents

상처에서 미생물 감염의 검출 방법 Download PDF

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마틴 라이서
니콜라스 피트르직
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시노보 게엠베하
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Abstract

개시된 기술은 상처, 예를 들어 만성 상처 또는 감염된 상처의 검출을 위한 화학적 실체 및 이 같은 화합물을 함유하는 시스템에 관한 것으로, 상기 화학적 실체는 조성물, 기질, 키트, 드레싱 물질 및 물품을 포함한다. 또한 개시된 기술은 진단 검정 및 특정 잔기 및/또는 반응 부위 상에서의 효소 작용에 기초하여 만성 상처 또는 감염된 상처의 진단 및/또는 검출에서 이들 조성물, 키드 및 시스템을 이용하는 방법에 관한 것이다. 개시된 기술은 또한 상처 부위에서 병원성, 예를 들어 세균성 및/또는 바이러스성 물질, 예를 들어 효소 및 기질의 검출에 관한 것이다. 부가적인 개시내용은 복수의 마커의 발현에 기초하여 상처를 특성화하고 만성 상처 또는 감염된 상처가 있는 환자를 치료, 관치 및 추적 조사하기 위한 이 같은 정보를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

상처에서 미생물 감염의 검출 방법
관련 출원의 교차 참고
본 출원은 2016 년 3 월 30 일자로 출원된 미국 가출원 제 62/315,546 호 및 2016 년 3 월 30 일자로 출원된 미국 가출원 제 62/315,556 호에 개시되어 있으며, 이들 개시 내용은 본원에 참고 문헌으로 포함되어 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본원에 기재된 실시형태는 일반적으로 상처 치유에 관한 것이며, 특히 상처의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
포유류에서 피부 손상은 상처의 치유를 야기하는 세포적 및 생화학적 사건의 조직화되고 복잡한 케스케이드를 유발한다. 상처 치유는 해부학적 연속성 및 기능의 회복을 야기하는 복잡한 동적 과정입니다: 이상적으로 치유 된 상처는 정상적인 해부학적 구조, 기능 및 외관으로 복귀한 상처이다. 전형적인 상처는 "삼출성" 단계, 증식 단계, 회복 단계 및 상피세포 성숙(문헌{Hatz et al., Wound Healing and Wound Management, Springer-Verlag, Munich, 1994}) 또는 지혈, 염증, 증식 및 개질 단계(문헌{Nwomeh et al., Clin. Plast. Surg. 1998, 25, 341})로 이루어진 모델을 통해 치료된다. 염증 단계는 상처 치유 과정에서 특히 중요하며, 이때 상처 부위에서의 생화학적 반응은 치유를 촉진하지만, 과도한 프로테아제 생산으로 인한 조직 파괴를 야기한다.
병원성 감염은 상처 치유의 가장 흔한 장애 중 하나이다. 식민지 상처에 대한 청결한 상처의 점진적인 악화는 종종 병원성 미생물에 의해 부과 된 증가 된 생물학적 부담과 관련된다. 문헌{Ovington et al., Ostomy Wound Management, 49.7A : 8-12, 2003}를 참고한다. 감염된 상처는 황색 외관, 쓰라림, 발적, 고름과 같은 감염의 임상 징후를 특징으로 하는 중간 단계인 반면, 콜로니화된 상처는 만성 병원성 감염을 특징으로 하며, 치유가 어렵다. 상처의 감염은 치유 과정을 중단시킬 수 있다. 예를 들어, 상처의 병원균은 독소를 생성하거나(예를 들어, 클로스트리듐 종), pH를 높이는 암모니아와 같은 유해한 대사산물을 생성하거나(예를 들어, 프로 테우스 종), 프로테아제와 같은 조직 용해 효소를 활성화 또는 생성하거나, 조직 침습을 촉진하여 상처의 크기 또는 심각성을 증가시킨다.
상처의 만성 상태를 억제하기 위해, 다양한 평가 기법 및/또는 도구가 임상 및 수의학 환경에서 사용된다. 감염된 상처를 평가하는 현재의 방법은 주로 상처와 연관된 다양한 매개 변수에 대한 분석에 기반을 두고 있다. 예를 들어, 시각적으로 상처를 평가할 수 있고, 길이 및 깊이에 대한 측정이 이루어질 수 있으며, 상처의 시각적 상태 및 크기를 추적하기 위해 디지털 사진을 사용할 수 있다(문헌{Krasner et al., supra}). 임상 실습에서, 감염에 대한 진단은 악취, 국소 통증의 존재, 열, 부종, 퇴원 및 발적과 같은 2차 매개 변수의 측정에 기반을 두고 있다. 염증 및 퇴원과 같은 상당수의 임상 지표는 상처 감염에 대한 예측치가 낮다. 기타 경우, 상처 부위에서 병원성 세균의 개수(들) 및 유형(들)은 실험실 및/또는 임상 진단 절차를 사용하여 결정될 수 있다. 상처를 닦은 후 병원 실험실에서 미생물학 시험의 실시는 세균의 콜로니화의 확인 및 감염과 연관된 균주의 동정을 위한 옵션이며, 따라서 정확한 항생제 처방을 가능케 한다. 그러나, 이러한 과정은 많은 시간이 걸리고, 노동 집약적이다. 감염 진단에서의 지연은 항생제 투여를 지연시킬 수 있으며, 패혈증이 발생할 위험성을 증가시킬 수 있다.
기존 임상 진단과 연관된 가장 큰 단점 중 하나는 감염의 시작 및 검출 시기와 연관된 지연이다. 예를 들어, 면봉 채취 절차(swabbing procedure)를 이용한 감염을 확인는 것은 종종 상처 부위에서의 미생물의 "임계 질량 (critical mass)"에 의존하기 때문에 검출 가능한 수준에 도달 할 때까지 조기 발견이 이루어질 수 없다. 또한, 면봉은 주변 조직의 군체(flora)에 의해 오염될 수 있어 진단 과정을 복잡하게 만들 수 있다. 다른 단점으로는 샘플링 오류, 면봉의 이송 지연, 분석 절차의 오류 및/또는 보고 오류 등이 있다. 문헌{Bowler et al., Clin Microbiol Rev. 14 (2): 244-269, 2001)}을 참고한다.
따라서, 임상적 감염의 조기 진단을 가능하게 하는, 바람직하게는 감염의 임상적 징후가 나타나기 전에 임상 진단을 허용하는 진단 시약 및 방법에 대한 요구가 절박하지만 충족되지 않았다. 또한 임상 증상의 증상이 나타나기 전에 상처의 임상적 감염을 예측하는데 도움이 될 수 있는 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다. 이 같은 예후적 원조는 상처가 악화되기 전에 적절한 치료(예를 들어, 항균 치료)에 의한 조기 간섭을 허용할 수 있게 하고, 추가적인 감염을 예방하기 위해 수술 또는 기타 상당한 개입이 요구된다. 또한, 임상의가 가능한 한 조기에 상처 감염에 대응할 수 있는 경우, 감염은 최소한의 항생제 사용으로도 치료될 수 있다. 이는 입원 필요성을 줄이고, 기타 질병에 걸린 개체와의 접촉으로 인한 2차 감염의 위험을 감소시킨다.
본원에 개시된 기술은 감염 및/또는 만성적인 상처를 검출하는 조성물 및 방법을 제공한다. 개시된 기술은 감염된 상처의 검출의 민감성, 정확성 및 특이성을 증가 시키고; 정성적 및 정양적 측정 능력을 제공하고; 원 위치(in situ)에서 실시간으로 감염된 상처의 검출 속도를 증가시킴으로써 기존의 검정을 개선시킨다. 본원에 개시 검정 및 방법은 부분적으로는 감염 또는 만성적인 상처에 존재하는 바이오 마커 및/또는 탐침을 검출하는 특정 시약의 사용에 기초한다. 검출 과정은 감염된 상처에 존재하지만 비-감염 또는 비-만성적인 상처에 존재하지 않는 마커에 특이적인 시약의 사용을 포함할 수 있으며, 검출 단계는 마커에 의해 탐침이 작용하는 경우에 생성되는 신호(들)의 정성적 또는 정량적 측정을 포함할 수 있다. 검출 방법이 상처에 존재하는 효소의 검출을 포함하는 실시형태에서, 탐침은 임의로 증폭될 수 있는 신호를 생성하는 효소에 특이적인 개질된 효소 기질을 포함한다. 이는 검출 효율성 및 특이성을 크게 개선시킨다. 또한, 하나 이상의 표적에 각각 특이적인 복수의 검출 탐침, 예를 들어 상처에 특이적인 효소가 사용될 수 있다. 이는 진단 검정의 효율성 및 정확성을 최대화하는 동시에 위양성(false positives; 예를 들어, 비특이적 상호작용 및/또는 표적 중복성)의 발생을 최소화하는 데 크게 도움이 된다. 또한, 본원에 개시된 실험 결과에 따르면 신규한 탐침 및 이에 기초한 검정 기법이 다양한 유형의 상처를 검출하고 특성화할 수 있는 것으로 확인된다. 마지막으로, 개시된 기술의 시약은 만성적인 상처의 치료 및 관리를 모니터하고 평가하기 위해 항생제, 항진균제 등과 같은 치료용 분자와 함께 사용될 수 있다.
본원에 개시된 실시형태는 부분적으로 면역계에 의해 생성되는 효소를 비롯한 상기 면역계의 세포가 상처의 조기 진단에서 마커로서 작용할 수 있다는 발견에 기초한다. 이러한 세포, 예를 들어 호중구는 감염을 막기 위해 상처 부위에 모이게 되며, 세균(및 다른 병원균)를 함입하고/하거나 이들을 효소로 중화시킨다. 일부 효소는 단백질(예를 들어, 엘라스타아제(elastase), 카텝신 G(cathepsin G), 리파아제(lipase))에 대해 특이적이고, 기타 효소는 세포벽 성분(예를 들어, 라이소자임(lysozyme))에 대해 특이적이며, 또 다른 효소는 단백질(예를 들어, NADPH 산화효소, 크산틴 산화효소, 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase; MPO) 및 기타 퍼옥시다아제)의 변성을 매개한다. 이러한 세포, 예를 들어 호중구는 일반적으로 수명이 짧기만 하고, 이들이 감염 부위에서 용해되는 경우에 효소를 비롯한 이들 리소좀의 내용물을 방출하며, 이어 상처의 상태에 대한 신뢰 가능한 측정을 제공하기 위해 검출될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 다양한 실시형태는 효소 마커의 검출을 이용하며, 이는 관련 생물학적 샘플, 예를 들어 상처 조직에서 골수 세포 및 특히 호중구의 존재의 지표이다. 따라서, 상처 유액(wound fluid)에서 이러한 효소의 수준 또는 활성 증가는 세균 챌린지(bacterial challenge)의 증가 및 침입성 세균을 위해 장애가 있는 숙주/세균 평형의 발현에 상응한다.
하나의 양태에서, 본원에서는 체액으로부터 효소 활성을 검출할 수 있는 화학적 실체(chemical entity)가 제공되며, 이때 상기 실체는 하나 이상의 앵커(anchor) 영역, 효소 인식 영역, 효소 불안정 영역 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 인식 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역 중 적어도 3개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 인식 영역 중 하나, 효소 불안정 영역 또는 효소 반응성 영역 중 하나 및 지표 영역 중 하나 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역을 통해 지지 물질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 적어도 2개의 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 인식 영역은 효소 불안정 영역 또는 효소 반응성 영역과 부분적으로 또는 완전히 중첩한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역과 부분적으로 또는 완전히 중첩한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지표 영역과 부분적으로 또는 완전히 중첩한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역과 부분적으로 또는 완전히 중첩한다. 일부 실시형태에서, 표적 효소 활성에 의해 화학적 실체로부터 일단 분리된 지표 영역은 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 보조 효소와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은
냅신(Napsin; 아스파틸 프로테아제(aspartyl protease)), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제(glucosylceramidase glucuronidase), 팔미토일 단백질 티오에스테라아제(palmitoyl protein thioesterase), 카텝신(카텝신) A, B, D, G, L, S, Z, 산 세라미다아제, 락토페린(LF), 라이소자임, 미엘올퍼옥시다아제(마이엘로퍼옥시다아제; MPO), 엘라스타아제, 카텝신 및 프로테이나아제-3 엘라스타아제, 라이소자임, 에스테라아제, 리파아제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 보조 효소와 상호작용한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역가 하나 이상의 표적 효소와 상호작용할 때 가시적 색 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기를 포함하며, 상기 잔기는 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노페놀, 페놀, 퀴논, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자, 양자점, 콜로이드성 금 입자 또는 이들의 동족체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 p-아미노페놀, ABTS(2,2-이노페놀, ABTS(속도는 금 산으로부터 선택됨) 디암모늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리실산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 인독실, 인디고(indigo), 패스트 블루 RR(패스트 블루 RR), 4-클로로-7-니트로벤조푸란 및 이들의 동족체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 아닐린 동족체다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 6개 이상의 탄소 단위를 갖는 패스트 블루 RR의 N-알킬 유도체이다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역이 하나 이상의 표적 효소와 상호작용할 때 가시적 색 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기를 포함하며, 이때 상기 잔기는 인독실 동족체, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자 및 콜로이드성 금 입자로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 가시적 색 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기는 하전된 염료 또는 루미놀 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 톨루이딘 블루(toluidine blue), 반응성 블랙 5(reactive black 5), 레마졸 브릴리언트 블루(Remazol Brilliant Blue), 반응성 바이올렛 5(reactive violet 5) 및 반응성 오렌지 16(reactive orange 16)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 라이소자임에 대해 불안정하거나 반응성이며, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 다당류, 글루코사민 또는 펩티도글리칸을 포함하며, 상기 다당류, 글루코사민 또는 펩티도글리칸은 라이소자임에 대해 불안정하거나 반응성이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 펩티도글리칸을 포함하며, 펩티도글리칸은 라이소자임에 대해 불안정하거나 반응성이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 페놀, 나프톨, 인독실 또는 퀴논을 포함하며, 상기 페놀, 카복시아미노페닐, 인독실 또는 퀴논은 마이엘로퍼옥시다아제에 대해 불안정하거나 반응성이며, 헴(heme)에 대해서는 비반응성이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질을 포함하며, 상기 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질은 엘라스타아제에 대해 불안정하거나 반응성이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 XyAAPXy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택되는 수이고, L은 연결 잔기이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 XyAAPVXy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 0 내지 50으로부터 선택되는 수이고, L은 에스테르 또는 아미드와 같은 연결 잔기이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질을 포함하며, 이때 상기 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질은 카텝신 G에 대해 불안정하거나 반응성이다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 XyN4N3N2N1Xy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고; 각각의 y는 독립적으로는 0 내지 6으로부터 선택되는 수이고; N4는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고; N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고; N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌 으로부터 선택되고; L은 연결 잔기이고; Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도체화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아지드, 에폭시드, 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 다중 환형 또는 다중 방향족 고리 시스템, 친유성 기 및 이들의 조합 으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 단기간의 UV 조사 이후에 지지 물질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지지 물질에 결합하기 위한 이온성 화학기(ionic chemical group)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지지 물질에 대한 공유적 부착을 위한 반응성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역 및 효소 불안정 영역은 폴리펩타이드고, 앵커 영역은 중합체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 영역은 프로테아제에 대해 불안정하고, 중합체 결합 도메인은 소수성 결합 도메인으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 영역은 카텝신 또는 엘라스타아제에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 소분자 실체 또는 개질된 중합체로부터 선택된다.
하나의 양태에서, 본원에서는 감염의 검출을 위한 화학적 실체가 제공되며, 이때 상기 화학적 실체는 가시적 색 변화를 나타내는 pH 민감성 잔기를 포함하는 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 고상에 대한 반응을 허용하는 반응성 기를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 브로모티몰 블루(bromothymol blue), 페놀 레드, 브로모페놀 레드, 클로로페놀 레드, 티몰 블루(thymol blue), 브로모크레졸 그린(bromocresol green), 브로모크레졸 퍼플; 또는 기타 설포프탈레인 염료이다.
일부 실시형태에서, 앵커 영역은 단기간의 UV 조사 이후에 지지 물질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지지 물질에 결합하기 위한 이온성 화학기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지지 물질에 공유적 부착을 위한 반응성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 수계에서 용해성을 거의 야기하지 않는 소수성 잔기를 포함하며, 따라서 상기 물질이 고상과 결합하게 된다.
일부 실시형태에서, 반응성 영역은 세균 효소 β-락타마아제와 상호작용한다. 이는 일반적인 항균제를 분해할 수 있는 세균 효소이며, 이의 존재는 치료 의사의 관심 분야이다. 일반적으로, 기타 바이오 마커에 대해 보고된 시약 이외에도 발색성 β-락타마아제 기질이 유용하다.
일부 실시형태에서, 반응성 영역은 바이러스 프로테아제 또는 숙주 퓨린 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시형태에서, 개열된 생성물의 검출에는 다중 이온성 트랩(polycationic trap)이 요구된다. 특정 실시형태에서, 이들은 가교 결합될 수 있다. 가교 결합의 정도 및 유형에 따라 이들은 또한 수퍼 흡수제(superabsorber)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 효소 기질은 전자적으로 검출될 수 있는 산화/환원 활성 종을 생성할 수 있다. 기타 실시형태에서, 고상인 효소 생성물의 전자적 검출은 반사광에 의해 이루어진다. 본원에서는 단량체, 올리고머 또는 폴리머 특성을 나타낼 수 있은 화학적 실체가 개시되어 있다. 이들은 달리 감염이 나타나기 전에 상처 또는 체액에서의 감염에 대해 선택된 마커의 검출을 위한 매개체로서 작용하도록 개질된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 포유류에서 감염을 검출하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 하나 이상의 감염 바이오 마커를 검출하고, 하나 이상의 바이오 마커의 존재 하에 가시적인 변화를 야기한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오 마커는 백혈구 효소이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오 마커는 엘라스타아제, 라이소자임, 마이엘로퍼옥시다아제, 백혈구 퍼옥시다아제, 에스테라아제, 리파아제, 냅신 (아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제, 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신 A, B, D, G, L, S, Z, 산 세라미다아제, 락토페린(LF) 및 프로테이나아제-3, β-락타마아제 및 기타 유사한 효소 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 특정 pH 범위를 검출한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 하나 이상의 백혈구 효소 및 특정 pH 범위를 검출하고; 상기 하나 이상의 백혈구 효소 및 특정 pH 범위의 존재 하에 가시적인 변화를 야기한다. 일부 실시형태에서, 가시적인 변화는 상처 또는 체액에서 공통적인 색상(예를 들어, 적색, 황색, 분홍색 또는 갈색)과 용이하게 구별되는 색 변화이다. 일부 실시형태에서, 가시적인 변화는 형광성 또는 발광성이거나, 굴절, 기체 방출 또는 중합체 상태의 변화와 같은 물리적 수단을 통해 매개된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 인식 영역, 효소 불안정 영역 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 객담, 소변 또는 상처 삼출물이다. 바람직한 실시형태에서, 체액은 상처 삼출물이다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체가 상처 드레싱(wound dressing)과 접촉하는 상처 삼출물과 반응하는 경우에 화학적 실체는 상처 드레싱에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체가 상처 드레싱을 통해 화학적 실체를 포함하는 시약 층까지 끌어 올라간 상처 삼출물과 반응하는 경우에 화학적 실체는 상처 드레싱에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 감염 바이오 마커가 존재하는 경우 색 또는 기타 가시적인 마커를 생성하는 지표 접합체이다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 포유류에서 감염된 상처를 진단하기 위한 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 포유류의 상처를 치료하기 위한 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 포유류에서 상처를 진단 및 치료하기 위한 방법에 사용된다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체가 장치 내의 삽입물과 접촉하는 진공 삼출물과 반응하는 경우에 화학적 실체는 배관 또는 기타 성분을 통해 진공 상처 치료 시스템에 혼입된다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체가 화학적 실체와 접촉하는 흡인물, 에어로졸 또는 객담 삼출물과 반응하는 경우 화학적 실체는 배관 또는 기타 성분을 통해 환기 시스템에 혼입된다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체가 외부 면봉 또는 유사물을 사용하여 평가 될 유체가 도포된 후에 화학적 실체가 반응하는 경우에 화학적 실체는 딥스틱(dipstick)에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 반사광, 전류법(amperometry) 또는 유사한 전기 화학적 과정을 통해 전자적으로 검출될 수 있은 변화를 야기한다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체의 사용으로 인해 포유류 또는 환자의 감염 상태에서의 변화가 달리 명백하게 되기 전에 이들 변화를 검출할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 개선된 요법 또는 선행 요법을 위한 기반이 되며, 여기서 포유류 또는 환자의 건강 상태의 악화를 예방하기 위한 요법을 선택하기 위해 후속적인 치료의 변화 또는 보다 상세한 진단의 적용이 후속적으로 사용된다.
화학적 실체
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 소분자의 화학적 실체 또는 개질된 중합체이며, 이들은 앵커 영역, 효소 인식 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 효소에 의해 반응되는 구조이다. 일부 실시형태에서, 효소 인식 부위는 효소에 대한 결합을 허용하는 구조이다.
특정 실시형태에서, 화학적 실체는 개질된 중합체이다. 특정 양태에서, 화학적 실체는 소분자 화학적 실체다. 본원에는 앵커 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역, 효소 인식 영역 및 지표 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 화학적 실체가 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 적어도 하나의 앵커 영역, 적어도 하나의 효소 인식 영역, 적어도 하나의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 적어도 하나의 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역을 통해 지지 물질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 지표 접합체이다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 적어도 하나의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역, 적어도 하나의 효소 인식 영역 및 적어도 하나의 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 적어도 하나의 앵커 영역 및 적어도 하나의 지표 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 인식 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 효소 인식 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 인식 영역 및 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 효소 인식 영역, 앵커 영역 및 2개의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 효소 인식 영역, 앵커 영역, 2개의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 2개의 지표 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 효소 인식 영역, 2개의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 2개의 지표 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 앵커 영역 및 하나 이상의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 서로 부분적으로 중첩한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역 및 효소 인식 영역 또는 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 서로 부분적으로 또는 완전히 중첩한다. 일부 실시형태에서, 효소 인식 영역 및 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 서로 부분적으로 또는 완전히 중첩된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 앵커 영역은 하나 이상의 효소 불안정 영역 또는 효소 반응성 영역 내에 있다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 내에 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하나 이상의 앵커 영역 내에 있다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 앵커 영역 내에 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체의 앵커 영역은 화학적 실체를 지지 물질에 결합시킨다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 이온성 화학기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온 성 화학 기는 지지 물질과 이온 결합을 형성한다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소수성 잔기는 지지 물질과 상호작용하여 화학적 실체를 지지 물질에 결합시킨다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 친수성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친수성 잔기는 지지 물질과 상호작용하여 화학적 실체를 지지 물질에 결합시킨다.
일부 실시형태에서, 앵커 영역은 비드, 중합체, 이온성 화학기를 갖는 물질, 친수성 잔기를 갖는 물질 또는 소수성 잔기를 갖는 물질이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 비드이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 중합체이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 이온성 화학기를 갖는 물질이며, 여기서 이온성 화학기는 양전하를 띤다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 이온성 화학기를 갖는 물질이며, 여기서 이온성 화학기는 음전하를 띤다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 친수성 잔기를 갖는 물질이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 지방족 사슬 또는 지방족 알코올과 같은 소수성 잔기를 갖는 물질이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 광활성 페닐아지드 또는 에폭시드기와 같은 지지 물질에 대한 공유적 부착을 위한 반응성 잔기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 앵커 영역은 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스드 비드, 다당류, 유도체화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 반응성 기 또는 펩티도글리칸 유도체 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 단기간의 UV 조사 이후에 지지 물질에 결합한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제, 라이소자임, 마이엘로퍼옥시다아제, 백혈구 퍼옥시다아제, 에스테라아제, 리파아제, 냅신(아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신 A, B, D, G, L, S, Z, 산 세라미다아제, 락토페린(LF) 및 프로테이나아제-3, b-락타마아제 및 기타 유사한 효소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 효소와 반응한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제와 반응한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 라이소자임과 반응한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 카텝신 G와 반응한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 마이엘로퍼옥시다아제와 반응한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제 또는 카텝신 G에 대해 불안정한 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제에 대해 불안정한 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 카텝신 G에 대해 불안정한 펩타이드, 펩타이드 모방체 또는 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 효소 불안정 또는 효소 활성 영역은 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 0 초과의 정수이거나 각각의 y는 1 내지 50의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, L은 연결 잔기이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이고; 펩타이드는 엘라스타아제에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산 하나가 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 활성 영역은 XyAAP(V/F/A)Xy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기이고; 펩타이드는 엘라스타아제에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산 하나가 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 상기 효소 불안정 또는 효소 반응 영역은 XyAAPXy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택되는 수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, L은 연결 잔기이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이고; 펩타이드는 엘라스타아제에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산들 중 하나는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 상기 효소 불안정 또는 효소 반응 영역은 XyAAPXy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택되는 수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이고; 펩타이드는 엘라스타아제에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산들 중 하나는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응 영역은 XyUUUUy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택되는 수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, U는 아르기닌, 리신, 글리신 또는 알라닌으로부터 선택되는 아미노산을 나타내고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있는 잔기이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응 영역은 XyUUUUUUy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택되는 수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 10의 정수이거나, 각각의 y는 독립적으로는 1 내지 6의 정수이고, U는 LEVLFQ로부터 선택되는 아미노산을 나타내고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 카텝신 G에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 활성 영역은 XyN4N3N2N1Xy-L-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고; 각 y는 독립적으로는 0 내지 6으로 선택되는 수이고; N4는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고; N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고; N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌 으로부터 선택되고; L은 연결 잔기이고, Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이고; 펩타이드는 카텝신 G에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산들 중 하나는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 활성 영역은 XyN4N3N2N1Xy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고, 각각의 y는 독립적으로는 0 내지 6으로 선택된 수이고; N4는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고; N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고; N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌으로부터 선택되고; Z는 가시적 색 변화 또는 검출 가능한 전자 변화를 야기할 수 있은 잔기이고; 펩타이드는 카텝신 G에 대해 불안정하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 Fmoc 기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산들 중 하나는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, Z는 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노페놀, 아미노페닐 에테르, 인독실, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자 또는 콜로이드성 금 입자이다. 일부 실시형태에서, Z는 퍼옥시다아제 기질이다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 p-아미노페놀, ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)디암모늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리실산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 인독실, 인디고, 패스트 블루 RR, 4-클로로-7-니트로벤조푸란으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Z는 아릴아민이다. 일부 실시형태에서, Z는 아미노페놀이다. 일부 실시형태에서, Z는 아미노페놀 에테르이다. 일부 실시형태에서, Z는 인독실이다. 일부 실시형태에서, Z는 중성 염료이다. 일부 실시형태에서, Z는 하전된 염료이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 및 반응성 오렌지 16 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 톨루이딘 블루이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 블랙 5 또는 이의 가수분해 또는 암모니 일 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 바이올렛 5 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 오렌지 16 또는 그의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다.
일부 실시형태에서, Z는 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료이다. 일부 실시형태에서, 디클로로트리아진계 반응성 염료는 흑색으로 보인다.
일부 실시형태에서, Z는 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 반응성 염료이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 레마졸 브릴리언트 블루이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루 또는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5 또는 레마졸 브릴리언트 블루이다.
일부 실시형태에서, Z는 나노입자다. 일부 실시형태에서, Z는 콜로이드성 금 입자이다.
일부 실시형태에서, Z는 하전된 염료, 인돌 유도체 또는 루미놀 유도체이다. 일부 실시형태에서, Z는 인돌 유도체이다. 일부 실시형태에서, Z는 루미놀 유도체이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 라이소자임과 반응한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 펩티도글리칸을 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 베타 락탐이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 페놀, 아미노페놀, 아미노페닐 에테르, 인독실 또는 퀴논을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노페놀 에테르를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 인독실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퀴논을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 마이엘로퍼옥시다아제와 반응하지만 헴과 반응하지 않는다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노페놀, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자 또는 콜로이드성 금 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퍼옥시다아제 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 p-아미노페놀, ABTS(2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 디암모늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리실산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 및 4-클로로-7-니트로벤조푸란, 패스트 블루 RR, N-(2-하이드록시)테트라데실-패스트 블루 RR로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아릴아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 중성 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하전된 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 및 반응성 오렌지 16 또는 이들 각각의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 톨루이딘 블루이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 블랙 5 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 바이올렛 5, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 오렌지 16 또는 그의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진 기반 반응성 염료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, Z는 콜로이드성 금 입자이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하전된 염료, 인돌 유도체 또는 루미놀 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 인돌 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 루미놀 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 정상적인 주위 조명에서 가시적 색 변화를 나타내는 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료는 일반적으로 적색, 황색 또는 갈색을 갖는 상처 관리 제품에 대해 대비 색상을 갖는다. 다른 실시형태에서, 염료는 보라색, 청색 또는 암녹색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 보라색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 청색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 암녹색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 작은 분자량을 갖고, 하전되며, 반응성 또는 연결 가능한 기를 함유하고, 감마 조사에 대해 안정하고, 깊게 착색된다. 일부 실시형태에서, 염료는 시브라크론 시리즈의 염료, 아조 염료 및 레마졸 염료 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 시브라크론 시리즈의 염료로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 아조 염료로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 레마졸 염료 또는 그의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 로다민, 쿠마린, 시아닌, 크산텐, 폴리메틴, 피렌, 디피로메텐 브로모디플루오라이드, 나프탈이미드, a 피코빌리단백질, 페리디니눔 클로로필 단백질s, 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드, 캘리포니아 레드, iFluor594, 테트라메틸로다민, a 카복시로다민, 카복시로다민 6F, 카복시로돌, 카복시로다민 110, 캐스케이드 블루, 캐스케이드 예로우, 쿠마린, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, Cy-Chrome, DyLight 350, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800, 피코에리트린, PerCP (페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE (6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX (5-(and-6-)-카복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우, 마리나 블루, 오렌지 그린 488, 오렌지 그린 500, 오렌지 그린 514, Alexa Fluor® 350, Alex Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR 및 디메틸아미노아조벤젠설폰산 (dabsyl) 또는 이들의 접합체 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 디클로로트리아진계 반응성 염료는 흑색으로 보인다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 반응성 염료의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 레마졸 브릴리언트 블루이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루 또는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5 또는 레마졸 브릴리언트 블루이다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 정상적인 주변 조명에서 색 변화를 나타내는 입자(예를 들어, 콜로이드 금속 또는 양자점)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 콜로이드성 금 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 자외선 하에 가시적 색 변화를 나타내는 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 형광 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 발광성 염료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 효소 반응성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 육안으로 보이거나 전자 수단에 의해 검출 가능한 생성물을 생성하기 위해 보조 효소와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 상호작용하여 육안으로 볼 수 있은 생성물을 생성한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 수단과 상호작용하여 전자 수단에 의해 검출 가능한 생성물을 생성한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 사용 된 말단 당에 따라 글루쿠로니다아제, 글루코시다아제 또는 갈락토시다아제에 의해 절단되어 인디고를 생성하는 인독실 글리코시드 또는 갈락토시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 보조 효소에 의해 산화되어 시각용 제품을 생성하는 페놀 또는 나프탈렌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 퍼옥시다아제에 의해 산화되어 시각용 제품을 생성하는 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 전자 수단에 의해 검출 가능한 금속 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 전자 수단에 의해 검출 가능한 페로센 또는 페로센 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제 및 글루코시다아제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 상처 유체에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 상처 유체에 존재한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 상호작용하여 자외선 하에서 볼 수 있은 생성물을 생성한다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 필수적으로 적어도 하나의 앵커 영역, 적어도 하나의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 적어도 하나의 지표 영역으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 필수적으로 적어도 하나의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 적어도 하나의 지표 영역으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 필수적으로 적어도 하나의 앵커 영역 및 적어도 하나의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 앵커 영역 없이 지지 물질에 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 유체에 의해 습윤될 수 있고 모세관 작용을 나타내는 여과지 또는 직포 또는 부직포 재료와 같은 지지 물질 상에 또는 그 내부에 인쇄된다. 일부 실시형태에서, 보고 실체 또는 화학적 실체는 상처 유체에 의해 습윤될 수 있고 모든 차원에서 유사한 모세관 작용을 나타내는 여과지 또는 직포 또는 부직포 재료와 같은 지지 물질 상에 또는 그 내부에 화학적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 여과지 또는 상처 유체에 의해 습윤될 수 있고 모세관 작용을 나타내는 직포 또는 부직포 재료와 같은 지지 물질 상 또는 그 내부에 이온 결합된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 유체에 의해 습윤될 수 있고 모세관 작용을 나타내는 여과지 또는 직포 또는 부직포 재료와 같은 지지 물질 상에 또는 그 내부에 공유결합된다. 지지 물질은 셀룰로오스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트, 및 섬유로서 유용한 기타 유사한 중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 셀룰로오스이다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리아미드다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리에스테르다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리아크릴레이트다.
경우에 따라, 상처의 pH는 혈관 신생, 프로테아제 활성, 산소 방출 및 세균 독성과 같은 많은 상처 치유 인자에 영향을 줄 수 있다. 만성적이고 치유가되지 않는 상처는 알칼리 환경이 높아져 있다. 상처가 치유됨에 따라 상처의 pH는 중성으로 이동한 한 산성이 된다. 상처의 pH를 모니터링하는 것은 상처의 상태(예를 들어, 감염 또는 감염 없음)를 평가하고 치료에 대한 상처의 반응을 결정하는데 도움이 되는 방법을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 pH 민감성 부분은 적색 브로모티몰 블루, 페놀, 브로모페놀 레드, 클로로페놀 레드, 티몰 블루, 브로모크레졸 퍼플, 브로모크레졸 그린이거나; 다른 설포프탈레인 염료이다.
일부 실시형태에서, MPO 반응성 지표는 459 Da보다 큰 분자량을 갖는 알킬 아닐린 아미드를 혼입한다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 지표는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3이고;
X는 -C(=O)-, -S(=O)2-이고;
R2는 -C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만 이에 한정되지 않고,
알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 페로센, 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 5개의 치환기로 임의적으로 치환되고;
R4 및 R5는 독립적으로,
-(C1-C12)알킬
-(C1-C12)알케닐
-(C1-C12)알키닐
-(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알킬
-(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알케닐
-(C6-C10)아릴-(C1-C5)알킬
-(C2-C9)헤테로아릴-(C1-C5)알킬일 수 있지만, 이에 한정되지 않고;
알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 및 헤테로아릴은 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 5개의 치환기로 임의적으로 치환되거나,
N(R4R5)는 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판 또는 아조칸, 1-치환 피페라진 또는 모르폴린 잔기이고;
Y는 -NH-CH2-CH(OH)-,-NH-, -NH-C(=O)-NH-, -NH-C(=S)-NH-이고;
R3은:
-C6-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만, 이에 한정되지 않고;
알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 페로센, 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, 시아노(-CN), 아지도(-N3), -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-로부터 독립적으로 선택되는 1개 내지 5개의 치환기에 의해 임의적으로 치환된다.
일부 실시형태에서, 지표 기질이 적소에 잔류하고 적소에서 반응하는 것이 바람직하다. 따라서, 수계에서의 제한된 용해도가 바람직하다. 고상의 적소에 잔류할 수 있은 능력은 내수성으로 정의되며, 이를 측정하는 수단은 실시예 114에 기록되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 기재의 내수성은 1보다 크며, 더욱 바람직한 실시형태에서는 이는 2보다 크다.
일부 실시형태에서, 본원에는 하기 화학식(화학식 D)의 화합물이 개시되어 있다:
[화학식 D]
Figure pct00002
상기 식에서,
R1은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3이고;
X는 -C(=O)-, -S(=O)2-이고;
R2는 -C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 페로센, 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 5개의 치환기에 의해 임의적으로 치환되고;
R4 및 R5는 독립적으로는 -(C1-C12)알킬 -(C1-C12)알케닐 -(C1-C12)알키닐 -(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알킬 -(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알케닐 -(C6-C10)아릴-(C1-C5)알킬 -(C2-C9)헤테로아릴-(C1-C5)알킬일 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 및 헤테로아릴은 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 5개의 치환기에 의해 임의적으로 치환되거나, N(R4R5)는 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피페리딘, 아제판 또는 아조칸, 1-치환 피페라진 또는 모르폴린 잔기이고; Y는 -NH-CH2-CH(OH)-,-NH-, -NH-C(=O)-NH-, -NH-C(=S)-NH-이고;
R3은 -C6-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 페로센, 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br, I일 수 있음), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, 시아노 (-CN), 아지도 (-N3), -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-으로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 5개의 치환기에 의해 임의적으로 치환된다.
일부 실시형태에서, 본원에 하기 화학식(화학식 A)의 화합물이 개시되어 있다:
[화학식 A]
Figure pct00003
상기 식에서,
Y는 O 또는 N이고;
Ar은,
Figure pct00004
이거나;
페로센이고;
R은 -C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 또는 알킬헤테로아릴이고;
α는 A, V, F, G, M, R 또는 L이고;
β는 결합이거나, 독립적으로는 P, F, A, R, L 또는 G이고;
γ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
δ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G 또는 V이고;
ε는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V 또는 E 이고;
φ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
β, γ, δ, ε 및 φ가 각각 결합인 경우, α의 N 말단은 X에 결합되고;
X는 0 내지 14개의 아미노산을 함유하는 펩타이드 사슬이고;
PG는 -C(=O)-O-R1(여기서, R1은 C1-C30 알킬, t-부틸 또는 메틸플루오레닐임) 또는 -C(=O)-R2(여기서, R2는 -C1-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 또는 알킬헤테로아릴임)이다.
일부 실시형태에서, 본원에 하기 화학식(화학식 B)의 화합물이 개시되어 있다:
[화학식 B]
Figure pct00005
상기 식에서,
L은 A, AA, V 또는 트리아졸릴이고,
Z는 페로센, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 및 반응성 오렌지 16, 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 또는 반응성 브라운 10이고;
α는 A, V, F, G, M, R 또는 L로부터 선택되고;
β는 결합이거나, 독립적으로는 P, F, A, R, L 또는 G이고;
γ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
δ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G 또는 V이고;
ε은 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V 또는 E이고;
φ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
β, γ, δ, ε 및 φ가 각각 결합인 경우에 α의 N 말단은 X에 결합되고;
X는 0 내지 14개의 AA를 포함하는 펩타이드 사슬이며, 여기서 AA는 아미노산, 폴리아민 또는 폴리옥시알킬렌이고;
PG는 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스드 비드, 다당류, 유도체화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아지드, 에폭시드, 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 지방족 아민, 메르캅토에틸, 다중 환형 또는 다중 방향족 고리 시스템, 친유성 기 또는 이들의 조합, -C(=O)-O-R1(여기서, R1은 C1-C30 알킬, t-부틸, 메틸플루오레닐임), -C(=O)-R2(여기서, R2는 -C1-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 또는 알킬헤테로아릴임)이다.
일반적으로, 엘라스타아제 기질은 a-b-c-d-e-f의 화학식을 가지며, 여기서,
하나의 실시형태에서,
a는 A, V, F, G, M, R, L로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A, R, L, G로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V로부터 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V, E로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 엘라스타아제 기재는 a-b-c-d-e-f의 화학식을 가지며, 여기서,
a는 A, V, F, G, M, R, L로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A, G로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V 중에서 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G, V, E로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 엘라스타아제 기재는 a-b-c-d-e-f의 화학식을 가지며, 여기서,
a는 A, V, F, G, M, R, L로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A, G로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, L, G로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, L, G, V로부터 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G, V, E로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 엘라스타아제 기재는 화학식 abcdef를 가지며, 여기서,
a는 A, V, F, G로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A, G로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, A, G로부터 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G, V로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G로부터 선택된다.
특히, 다른 실시형태에서, 엘라스타아제 기재는 a-b-c-d-e-f의 화학식을 가지며, 여기서,
a는 A, V, F로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G로부터 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A, G로부터 선택된다.
바람직하게는, 엘라스타아제 기질은 a-b-c-d-e-f의 화학식을 가지며, 여기서,
a는 다음으로부터 선택된다 : A, V, F로부터 선택되고;
b는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 P, F, A로부터 선택되고;
g는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A로부터 선택되고;
d는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A로부터 선택되고;
e는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A로부터 선택되고;
f는 아미노산이 없거나, 독립적으로는 A로부터 선택된다.
도 1은 본원에 개시된 화합물의 예시적인 실시형태다.
도 2는 MPO 및 엘라스타아제 (예를 들어 실시예 9, 메틸-3-Fmoc-AAPV-아미드-4-아미노페놀 또는 메틸-3-아미노-4-Fmoc-AAPV-아미드벤조에이트)에 대한 다중 반응 요건과 함께 본원에 기재된 화합물의 예시적인 실시형태이다.
도 3a는 엘라스타아제에 대한 다중 반응 요건과 함게 본원에 개시된 화합물의 예시적인 실시형태이다.
도 3b는 엘라스타아제에 대한 다중 반응 요건과 함게 본원에 개시된 화합물의 예시적인 실시형태이다.
도 4a는 엘라스타아제에 대한 반응과 함께 본원에 개시된 화합물의 예시적인 실시형태이며, 여기서 앵커에 대한 중첩 기능이 엘라스타아제 기질에 대한 것이다.
도 4b는 MPO에 대한 반응과 함께 본원에 개시된 화합물의 예시적인 실시형태이며, 여기서 지표 및 반응성 영역에 대한 중첩 기능이 MPO 기질에 대한 것이다.
도 5는 인독실 에테르를 β-락타마아제 기질에 대한 합성 경로이다.
도 6은 인독실 발색단을 함유하는 에스테라아제 및 리파아제 기질이다.
도 7a는 실시예 103 및 104의 방법을 통해 형성된 X-Gal, X-Gluc 펩티도글리칸 및 키토산 부가물이다.
도 7b는 실시예 103 및 104의 방법을 통해 형성된 X-Man, 펩티도글리칸 및 키토산 부가물이다.
도 7c는 실시예 103의 스즈키 생성물(Suzuki product)을 통해 펩티도글리칸, 키토산 또는 펩타이드에 결합된 인독실 발색단을 함유하는 에스테라아제 기질이다.
도 8은 펩티도글리칸의 카복시메틸화 및 후속적인 유도체화를 위한 반응식이다.
도 9a는 관심 있는 기관(기도, 혈액, 소변 등)에서 나오는 조직 또는 체액에서의 감염을 검출하는데 사용기 위한 지표 기질을 함유하는 튜브이다. 튜브는 실시예 18의 기재로 인쇄된 부직포가 삽입되는 PVC 물질이다.
도 9b는 실시예 10 또는 실시예 18의 기질과 같은 하나 이상의 기질를 함유하는 편평한 여과지 시리즈를 수용하기 위해 설계된 배관 삽입물이며, 실시예 95의 기질은 양성 대조군(중앙)로서 기능을 한다.
도 9c는 실시예 11의 기질용 캐리어로서 작용하는 폴리올레핀 내부 실린더를 포함하는 배관이다. 이러한 재료는 중공 실린더 내의 라이닝(lining)으로서 역할을 한다(오른쪽).
도 9d는 예시적인 형태의 PVC 배관에 대한 중공 라이닝의 적용예이다.
도 10a는 실시예 10 및 18의 지표 기질을 함유하는 스틱을 사용하여 상처의 음압 처리로부터 유도된 유체의 반응을 검출 할 수 있다는 것을 보여준다.
도 10b는 동일한 스틱 형식을 사용하여 기도 또는 객담의 흡인을 모니터링하여 초기 감염을 감지 할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 이미지에서 엘라스타아제 또는 MPO에 대한 반응을 나타내는 스틱의 교정이 표시된다.
도 11은 카복시 페로센 펩티도글리칸 접합체의 제조를 위한 반응식이다.
도 12는 실시예 10의 생성물인 황산염 및 패스트 블루 RR이다.
도 13은 MPO와 실시예 10의 생성물의 반응 생성물 및 패스트 블루 RR의 일례이다.
상세한 설명
이제 다양한 양상들이 보다 상세히 설명 될 것이다. 그러나, 이러한 양상들은 많은 다른 형태로 구현될 수 있으며, 여기에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며; 오히려 이들 실시예는 본 개시내용이 철저하고 완전하게 되도록 제공되며, 그 범위를 당업자에게 완전히 전달할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 특허, 특허 출원 및 간행물이 인용된다. 이들 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 본 명세서의 개시 시점에서 당업자에게 공지된 최신 기술을 더욱 완전하게 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 이 러한 개시내용은 인용된 특허, 특허 출원 및 간행물과 이러한 개시내용 사이에 임의의 불일치가 있는 경우에 우선할 것이다.
I. 정의
값의 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 이러한 기술된 범위내 임의의 다른 기술되거나 개재된 값은 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 1㎛ 내지 8㎛의 범위가 기술된 경우, 2㎛, 3㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 및 7㎛가 또한 자명하게 개시되며, 1㎛ 이상의 갑의 범위 및 8㎛ 이하의 값의 범위가 또한 자명하게 개시된 것으로 의도된다.
단수 형("a", "an" 및 "the")은 내용에서 명확하게 달리 지적하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체"에 대한 언급은 단일 중합체뿐만 아니라 2개 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하며, "부형제"에 대한 언급은 단일 부형제뿐만 아니라 2개 이상의 동일하거나 상이한 부형제 등을 포함한다.
"약"이란 단어는 본 개시내용이 달리 지적하지 않거나 이러한 해석과 불일치하지 않는 한, 수치 값의 바로 앞에 있는 경우 수치 값의 + 또는 -10%의 범위를 의미하는데, 예를 들어 "약 50"은 45 내지 55를 의미하고 "약 25,000"은 22500 내지 27,500을 의미하는 등이다. 예를 들면 "약 49, 약 50, 약 55" 와 같은 수치 값의 목록에서, "약 50"은 앞서와 값과 후속적인 값 사이의 간격(들)의 1/2 미만으로 연장된 값을 의미하는데, 예를 들어, 49.5 초과 내지 52.5 미만이다. 또한, 어구 "약 미만" 또는 "약 초과" 값은 본원에 제공된 용어 "약"의 정의의 관점에서 이해되어야 한다.
"실질적으로" 또는 "필수적으로"는 거의 전체 또는 완전하게를 의미하는데 예를 들면, 일부 제공된 양의 80% 내지 95% 이상, 예를 들어, 중량당 또는 용적 또는 측정되는 어떠한 다른 매개변수당 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9% 이상을 의미한다. "실질적으로 없는"은 일부 제공된 양의 약 1% 내지 약 20% 미만, 예를 들어, 중량당 또는 용적 또는 측정되는 어떠한 다른 매개변수당 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만의 수준으로 존재하는 것과 같이, 일부 제공된 양의 거의 전체적으로 또는 완전한 부재를 의미한다. 일부 실시형태에서, "실질적으로 없는"은 약학 조성물의 중랑당 1 내지 5% 이하의 수준에서의 존재를 의미한다.
II. 개요
상처의 치료요법 및 진단 및 상처 관리를 위한 조성물 및 시스템이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은, 사용 시에 상처의 원 위치에서 상승된 효소 수준의 존재를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "상처"는 조직 구조의 연속성 또는 완전성의 물리적 붕괴를 말한다. "상처 치유"는 조직 통합성의 회복을 말한다. 이는 조직 통합성의 부분적이거나 완전한 회복을 지칭할 수있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 상처의 치료는 상처 치유 과정과 관련된 하나 이상이 단계 또는 과정들의 촉진, 개선, 진행, 가속화 또는 달리는 진전을 지칭한다.
상처는 급성 또는 만성일 수 있다. 욕창, 정맥 다리 궤양 및 당뇨병성 족부 궤양을 포함하는 만성 상처는 치유할 수 없는 상처로 단순히 기술될 수 있다. 만성 상처의 정확한 분자적 병리학은 충분히 이해되어 있지 않지만, 이는 다수-요인인 것으로 알려져 있다. 급성 손상 동안 정주성 세포(resident cell) 및 이주성 세포의 정상 반응이 손상되므로, 이들 상처는 연장된 염증 반응, 결함이 있는 상처 세포외 매트릭스(ECM) 리모델링 및 재상피화의 실패에 의해 특징화된다.
상처는 내부 상처일 수 있는데, 예를 들어, 피멍 또는 내부 궤양과 같이 피부의 외부 구조적 통합성이 유지되는 어떠한 내부 상쳐, 또는 외부 상처, 특히 피하 상처일 수 있으며, 후속적으로 조직은 어떠한 내부 또는 외부 체 조직일 수 있다. 하나의 실시형태에서 조직은 피부(예를 들면, 인간 피부)일 수 있는데, 즉, 상처는 진피 또는 표피 상처와 같은 피부 상처이다.
인간 피부는 2개의 명확한 층, 상피 및 진피로 구성되며, 그 아래에 피하 조직이 놓여있다. 피부의 주요 기능은 내부 기관 및 조직에게 외부 외상 및 병원체 감염으로부터의 보호, 감각 및 열조절을 제공한다. 대부분의 포유동물의 피부 조직은 유사하게 구성된다.
피부의 최외부 층인 상피는 두께가 대략 0.04 mm이며, 무혈관이고, 4개의 세포 유형(각질형성세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 및 촉각 세포(Merkel cell)을 포함하며, 수개의 상피 세포 층내로 계층화되어 있다. 상피의 최내부 상피 층은 기저 막이며, 이는 진피와 직접 접촉하고 있으며, 상피를 진피에 고정(anchoring)시킨다. 피부에서 일어나는 모든 상피 세포 분열은 기저 막에서 일어난다. 세포 분열 후, 상피 세포는 상피의 외부 표면을 향해 이주한다. 이러한 이주 동안, 세포는 각질화(keratinization)로 알려진 과정을 겪으며, 이로 인해 핵이 손실되고 세포는 거칠고, 평편하며, 내성인 죽은 세포로 변환된다. 이주는 세포가 상치 구조의 최외부인, 각질층, 건조하고 방수성의 평편 세포 층에 도달하면 완료되며, 이러한 세포 층은 하부 조직의 건조를 방지하는데 도움을 준다. 죽은 상피 세포의 층은 지속적으로 벗겨져서 기저 막으로부터 표면으로 이동하는 각질화된 세포에 의해 교체된다. 표피의 상피가 무혈관이므로, 기저 막은 이의 영양 공급을 위해 진피에 의존한다.
진피는 진피에 영양분을 공급하는 고도로 혈관화된 조직 층이다. 또한, 진피는 신경 종말, 림프관, 콜라겐 단백질 및 연결 조직을 함유한다. 진피는 두께가 대략 0.5 mm이며 주로 섬유아세포 및 대식세포로 구성되다. 이들 세포 유형은 피부를 포함하여 모든 동물 연결 조직에서 발견되는 단백질인 콜라겐의 생산 및 유지에 크게 관여한다. 콜라겐은 주로 피부의 탄력성, 탄성 특성에 관여한다. 콜라겐이 풍부한 진피 아래에서 발견되는 피하 조직은 피부 이동성, 단열, 칼로리 저장, 및 혈액을 위에 있는 조직에 제공한다.
상처는 2개의 일반적인 범주인 부분적인 두께 상처 또는 완전한 두께 상처중 하나로 분류될 수 있다. 부분적인 두께 상처는 진피 혈관에 대한 손상이 없이 상피 및 표면 진피로 한정된다. 완전한 두께 상처는 진피의 붕괴를 포함하며 진피 혈관의 붕괴를 포함하는, 보다 깊은 피부 층으로 확장된다. 부분적인 두께 상처의 치유는 상피 조직의 단순한 재생으로 일어난다. 완전한 두께 상처에서 상처 치유는 보다 복잡하다. 본원에서 고려된 피하 상처는 부분적인 두께 또는 전체 두께 상처일 수 있다.
본원에 고려된 상처는 자상 및 궤양, 외과적 절개 또는 상처, 구멍, 찰과상, 긁힘, 압축 상처, 마모, 마찰 상처(예를 들어, 기저기 발진, 마찰 물집), 욕창성 궤양(압박 또는 욕창), 열상 상처(냉원 및 열원에서 직접 또는 전도, 대류 또는 조사 및 전원을 통한 화상), 화학적 상처(산 또는 알칼리 화상) 또는 개방형 또는 온전한 종기(intact boil), 피부 발진, 반점 및 여드름, 궤양을 포함하는 병원성 감염(예를 들어, 바이러스, 세균 또는 진균), 만성 상처(하지 및 족 궤양, 정맥 다리 궤양 및 욕창과 같은 당뇨병 관련 상처를 포함함), 피부 이식편/이식 기증자 및 수혜자 부위, 면역 반응 상태, 예를 들어, 건선 및 습진, 위 또는 장 궤양, 입의 궤양을 포함하는 경구 상처, 손상된 연골 또는 뼈, 절단 상처 및 각막 병변을 포함한다.
화학적 실체 및 이의 합성물
본원에 기술된 실시형태는 화학적 실체를 제공하며, 이를 사용하여 만성 상처를 진단하고/하거나 치료할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은, 화학적 실체 및 이의 조성은 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은, 화학적 실체 및 이의 조성물은 포유동물에서 만성 상처를 진단하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 화학적 실체 및 이의 조성물은 포유동물에서 감염된 상처를 진단하는 방법에서 사용된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 화학적 실체 및 이의 조성물은 포유동물에서 상처를 치료하는 방법에서 사용된다. 추가의 실시형태에서, 본원에 기술된 화학적 실체 및 이의 조성물은 포유동물에서 감염되거나 만성인 상처를 치료하기 위한 방법에서 사용된다.
기타 실시형태에서, 본원에 개시된 화학적 실체 및 이의 조성물은 미생물에 특이적인 하나 이상의 바이오 마커의 검출에 기초하여 하나 이상의 병원성 미생물, 예를 들어, 세균 또는 바이러스를 진단하는데 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본원에서는 체액으로부터 효소 활성을 검출할 수 있는 화학적 실체가 제공되며, 상기 화학적 실체는: 앵커 영역(A), 효소 인식 부위(R) 및 지표 영역(I)을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 화학적 실체는 기본적인 화학 구조 A-R-I(화학식 I)(여기서, A는 앵커 영역이고; R은 효소 인식 부위이고 I는 지표 영역임)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 앵커 영역(A)는 효소 인식 부위(R)를 통해 지표 영역(I)와 관련된다. 이러한 실시형태에서, 효소 인식 부위는 효소에 결합하도록 하는 구조 또는 모티프이다.
하나의 실시형태에서, 효소 인식 부위(R)는 자연적으로 앵커 영역에 존재한다. 앵커 영역의 골격이 효소에 의해 개열되면 단편이 이동(mobilisation)하며, 이어 이는 효소의 기질이 될 수 있다.
다른 실시형태에서, 효소 인식 부위(R)는 화학적 변형을 통해 앵커 영역(A) 내로 도입된다. 또한, 효소 인식 부위(R)는 자연적으로 지표 영역(I) 내에 존재할 수 있거나 하나 이상의 화학적 변형을 통해 지표 영역(I) 내에 합성적으로 도입된다.
하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화학적 실체는 공유결합적 또는 비공유결합적으로 지표(I)과 결합된 앵커(A)를 포함하며, 여기서 인식 부위(R)는 (예를 들어, 공유결합을 통해) 회합 잔기에 위치할 수 있다. 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 공유결합은 결합된 원자사이의 전자의 공유를 포함한다. 대조적으로, 비-공유결합은 예를 들면, 이온 상호작용, 전전기 상호작용, 수소 결합 상호작용, 물리화학적 상호작용, 반 데르 바알스 힘(van der Waal forces), 루이스(Lewis-acid)/루이스 염기(Lewis-base) 상호작용 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 앵커(A)는 공유결합성 상호작용을 통해 지표(I)와 회합하여 인식 부위(R)를 형성한다. 다른 실시형태에서, 앵커(A)는 인식 부위(R)의 일부가 아닌 공유결합성 상호작용을 통해 지표(I)와 회합된다. 제 2 실시형태에서, R은 지표 분자의 일부를 전체적으로 구성할 수 있거나, 지표 영역이 회합된 별도의 모티프 또는 잔기를 구성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역을 추가로 포함한다.
하나의 실시형태에서, 인식 부위(R)는 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 효소와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 냅신(아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신 A, B, D, G, L, S, Z; 산 세라미다아제, 락토페린(LF), 라이소자임, 마이엘로퍼옥시다아제(MPO), 엘라스타아제, 카텝신 및 프로테이나아제-3 엘라스타아제, 라이소자임, 에스테라아제, 리파아제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 효소와 상호작용한다.
앵커 영역(A)
화학식 I의 화학적 실체의 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 다당류, 셀룰로오스드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 앵커(A)는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, D-갈락토피라노시드 또는 이의 유도체로부터 선택되는 다당류를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 앵커(A)는 펩티도글리칸 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함한다. 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 무레인(murein)으로도 공지된 펩티도글리칸은 대부분의 세균의 원형질막 외부에 메쉬 유사 층을 형성하여, 예를 들어 세균의 세포벽을 형성하는 당 및 아미노산으로 이루어진 중합체이다. 당 성분은 β-(1,4) 연결된 N-아세틸글루코사민 및 N-아세틸무람산의 교대 잔기로 이루어진다. N-아세틸무람산 에는 3개 내지 5 개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 사슬이 부착된다. 펩타이드 사슬은 3D 메쉬 유사 층을 형성하는 다른 가닥의 펩타이드 사슬에 가교 결합될 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 상기 펩티도글리칸은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc 또는 NAG) 및 N-아세틸무람산(MurNAc 또는 NAM) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 이상의 교대 아미노 당의 단위를 포함할 수 있다. 펩티도글리칸(이의 보다 짧은 단편을 포함함)은 천연 또는 합성 공급원으로부터 생성될 수 있다. 문헌{Lee et al., Chembiochem., 11(18):2525-9, 2010))을 참고한다.
또 다른 실시형태에서, 앵커(A)는 펩티도글리칸 또는 다당류 유도체를 포함한다. 펩티도글리칸의 예는 펩티도글리칸 염, 수용성 펩티도글리칸, 카복실화 펩티도글리칸 등을 포함한다. 이 같은 유도체의 대표적인 예로는, 예를 들어 카복시메틸, 카복시에틸, 카복시프로필기(들)를 포함하고 임의적으로 하나 이상의 할로겐, 알코올, 에스테르 또는 아미드기를 포함하는 펩티도글리칸을 들 수 있다. 다른 특정한 예는 하나 이상의 염소기를 포함하는 할로겐화 펩티도글리칸을 포함한다. 가용성 펩티도글리칸, 및 노카르디애(Nocardiae)의 세균 또는 세균 벽으로부터 유래한 펩티도글리칸의 가용성 단편을 함유하는 분획이 미국 특허 제 5,017,359 호에 재시되어 있다.
다당류 유도체는, 예를 들어 하이드록시에틸 셀룰로오스(HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(EHEC), 카복시메틸 셀룰로오스, 카복시메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(CMHEC), 하이드록시프로필 하이드록시에틸 셀룰로오스(HPHEC), 메틸 셀룰로오스(MC), 메틸 하이드록시프로필 셀룰로오스(MHPC), 메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(MHEC), 카복시메틸 셀룰로오스(CMC), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 acetate succinate(HPMC-AS), 소수성으로 개질된 하이드록시에틸 셀룰로오스(hmHEC), 소수성으로 개질된 하이드록시프로필 셀룰로오스(hmHPC), 소수성으로 개질된 에틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(hmEHEC), 소수성으로 개질된 카복시메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(hmCMHEC), 소수성으로 개질된 하이드록시프로필 하이드록시에틸 셀룰로오스(hmHPHEC), 소수성으로 개질된 메틸 셀룰로오스(hmMC), 소수성으로 개질된 메틸 하이드록시프로필 셀룰로오스(hmMHPC), 소수성으로 개질된 메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(hmMHEC), 소수성으로 개질된 카복시메틸 메틸 셀룰로오스(hmCMMC), 설포에틸 셀룰로오스(SEC), 하이드록시에틸 설포에틸 셀룰로오스(HESEC), 하이드록시프로필 설포에틸 셀룰로오스(HPSEC), 메틸 하이드록시에틸 설포에틸셀룰로오스(MHESEC), 메틸 하이드록시프로필 설포에틸 셀룰로오스(MHPSEC), 하이드록시에틸 하이드록시프로필 설포에틸 셀룰로오스(HEHPSEC), 카복시메틸 설포에틸 셀룰로오스(CMSEC), 소수성으로 개질된 설포에틸 셀룰로오스(hmSEC), 소수성으로 개질된 하이드록시에틸 설포에틸 셀룰로오스(hmHESEC), 소수성으로 개질된 하이드록시프로필 설포에틸 셀룰로오스(hmHPSEC) 또는 소수성으로 개질된 하이드록시에틸 하이드록시프로필 설포에틸 셀룰로오스(hmHEHPSEC)를 포함한다. 특히 바람직한 셀룰로오스드 유도체로는 물에 열적 응집점(thermal flocculation point)을 갖는 셀룰로오스 에테르, 예를 들어 메틸 셀룰로오스, 메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 하이드록시프로필 셀룰로오스가 있다. 미국 특허 제 8,465,586 호를 참고한다.
하나의 양태에서, 본원에 사용된 바와 같이, "펩티도글리칸 유도체" 및 "다당류 유도체"는 펩티도글리칸 또는 다당류의 염, 아미드, 에스테르, 에놀 에테르, 에놀 에스테르, 아세탈, 케틸, 오르토에스테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 산, 염기, 용매화물, 수화물 또는 프로드럭(prodrug)을 포함한다. 이러한 유도체는 이러한 유도체화를 위한 공지된 방법을 사용하여 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유도체는 실질적인 독성 효과없이 동물 또는 인간에게 투여될 수 있으며 약제학적으로 활성이거나 프로드럭이다.
다른 실시형태에서, 유도체는 펩티도글리칸 또는 다당류 화합물의 염, 예를 들어 Li+, Na+, K+, Rb+, Mg2+, Ca2+, Sr2+ 또는 Ba2+, 바람직하게는 Na+, K+, Mg2+, Ca2+의 염이다. 나트륨 또는 칼슘 염과 같은 하전된 펩티도글리칸 또는 다당류의 염은 하기 정의에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, 유도체 앵커 화합물은 할로겐화 앵커 화합물, 예를 들어 할로겐화 다당류, 할로겐화 폴리펩타이드, 할로겐화 폴리아크릴레이트, 할로겐화 폴리에틸렌이민, 할로겐화 폴리펩타이드 아미드, 할로겐화 폴리펩티도글리칸 또는 할로겐화 키토산 또는 이의 단량체, 예를 들어 할로겐화 N-아세틸글루코사민(GlcNAc 또는 NAG) 및/또는 할로겐화 N-아세틸무람산(MurNAc 또는 NAM)이다. 할로겐은 Cl, Br, I로 이루어진 군으로부터 선택되고; 특히 할로겐은 Cl이다.
일부 실시형태에서, 유도체 화합물은 앵커 화합물의 이성질체이다. "이성질체"란 용어는 동일한 화학식을 갖지만 분자 내 원자의 상이한 배열을 갖는 화합물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화합물의 이성질체는 화합물의 "호변 이성질체(tautomer)" 또는 "입체 이성질체"이다. "입체 이성질체"란 용어는 하나 이상의 입체 중심의 키랄성이 상이한 화합물을 지칭한다. 입체 이성질체는 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체를 포함한다. 용어 "호변 이성질체"는 에놀-케토 및 이민-에나민 호변 이성질체와 같은, 양성자의 위치에 있어서 상이한 화합물의 대안 형태, 또는 앵커 화합물의 호변 이성질체형을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 앵커 화합물은 하나 이상의 전술한 화합물의 조합 또는 혼합물을 함유할 수 있다. "조합"이란 용어는 하나 이상의 성분을 함유하는 화합물을 포함하며, 이는 서로 접합되거나 접합되지 않을 수 있다. 하나의 실시형태에서, 앵커 화합물은, 예를 들어 공유결합 또는 비공유결합성 상호작용을 통해 서로 접합된 하나 이상의 전술한 화합물의 조합을 포함한다. 특정 예로서, 앵커는 키토산과 펩티도글리칸의 조합을 포함할 수 있다. 미국 특허 공보 제2007/0167400 호를 참고한다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 시판중인 펩티도글리칸의 제제 및 다당류 혼합물(PG/PS; 문헌{Lee Labs Inc., Grayson, GA}; 미국 특허 제 8,129,518 호 참조)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 화합물은 상술한 중합체 화합물의 혼합물을 포함한다. "혼합물"이란용어는 이에 의해서 2개 이상의 물질이 자체 개개 특성을 상실할 수 있는 반응의 발생 없이 이들 물질의 함께 섞임(mingling)을 지칭한다. 예를 들어, 화합물 A 및 화합물 B의 혼합물은 특정 중량비의 화합물 A 및 화합물 B를 포함함으로써, 혼합물의 총 중량이 100%에 이를 수 있는데, 예를 들어 99:1 중량비의 화합물 A/화합물 B 또는 1:99 중량비의 화합물 A/화합물 B. 대표적인 혼합물은 약 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 전술한 중합체 화합물을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 앵커(A)는 또한 이온성 화학기, 친수성 잔기를 갖는 물질 또는 소수성 잔기를갖는 물질, 예를드렁 지방족 사슬 또는 지방족 알코올을 포함한다. 앵커가 이온성 화학기를 포함하는 실시형태에서, 이온성 화학기는 양성으로 또는 음성으로 하전될 수 있다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 광활성 페닐아지드 또는 에폭시드기와 같은 지지 물질에 대한 공유결합을 위한 반응성 잔기를 포함한다. 미국 특허원 공보 제2016/0159777호를 참고한다.
펩티도글리칸 및/또는 다당류, 셀룰로오스, 글리칸 등의 기타 글리코시드 화합물에 반응기를 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 미국 특허 출원 공보 제 2005/011261 호를 참조한다.
지표
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 하나 이상의 지표, 예를 드렁 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 이상의 지표를 포함한다. 이러한 조성물은, 예를 들어 동일한 겔 중합체 또는 상이한 겔 중합체에 접합된 다수의 기질을 포함한다.
특정의 실시형태에서, 지표는 표지된다. 본원에 사용된 바와 같이 "표지"란 용어는 에피토프 결합제, 또는 다른 기질 물질에 부착된 임의의 물질도 지칭하며, 여기서 물질은 검출 방법에 의해 검출 가능하다. 적합한 표지의 비제한적 예는 발광성 분자, 화학발광성 분자, 형광단, 형광성 켄칭제(fluorescent quenching agent), 색소 분자, 방사선 동위원소, 신틸런트(scintillant), 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, Myc 태그, 중금속 및 효소(알칼린 포스파타제, 퍼옥시다아제 및 루시퍼라제를 포함함)를 포함한다. 표지를 앵커 화합물에 부착시키기 위한 방법은 실시예에 개시되어 있다.
특정의 실시형태에서, 지표는 표지로 표지되며, 이때 상기 표지는 검출 가능한 표지이다. 검출 가능한 표지는 잔기이며, 이의 존재는 직접 또는 간접적으로 추정될 수 있다. 일반적으로 표지의 검출은, 예를 들어 에너지 방출과 같은 검출 가능한 신호의 생성을 수반한다. 표지는 화학적 실체, 펩타이드 또는 핵산 특성일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 사용된 표지의 특성은 수행되는 분석의 특성, 사용된 에너지원 및 검출기의 유형, 중합체, 분석물, 탐침 및 1차 및 2차 분석물 특이적 결합 파트너를 포함한 다양한 인자에 의존할 것이다.
특수한 실시형태에서, 표지는 이것이 결합된 성분, 예를 들어 앵커 영역과 입체적 및 화학적으로 양립 가능하다. 특히, 표지는 효소 인식 부위(S) 및/또는 효소 반응성 영역(R)을 방해하지 않는 형태 및 크기이다.
다른 실시형태에서, 앵커에 부착된 표지 또는 모티프는 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제, 글루쿠로니다아제, 프로테아제, 락타마아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제 또는 이들의 조합체에 대한 기질이다.
하나의 실시형태에서, 앵커에 부착된 지표 또는 내부의 모티프는 글리코시다아제에 대한 기질이다. 특히, 앵커에 부착된 지표 또는 내부의 모티프는 라이소자임에 대한 기질이다.
다른 실시형태에서, 앵커에 부착된 지표 또는 내부의 모티프는 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 마이엘로퍼옥시다아제 (MAO) 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 대한 기질이다.
다른 실시형태에서, 앵커에 부착된 지표 또는 내부의 모티프는 라이소자임인 글리코시다아제, 및 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 마이엘로퍼옥시다아제(MAO) 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 대한 기질이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 냅신(아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신 A, B, D, G, L, S, Z; 산 세라미다아제, 락토페린(LF), 라이소자임, 마이엘로퍼옥시다아제(MPO), 엘라스타아제, 카텝신 및 프로테이나아제-3C로부터 선택되는 하나 이상의 표적 효소와 상호작용한다.
하나의 실시형태에서, 앵커에 부착된 지표(I) 또는 내부의 모티프는 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노페놀, 아미노페닐 에테르, 인독실, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자, 또는 콜로이드성 금 입자이다.
일부 실시형태에서, 앵커에 부착된 내부의 모티프 또는 지표(I)는 퍼옥시다아제 기질이다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 p-아미노페놀, ABTS(2,2이노페놀, ABTS (strate. 일부 실시형태에서, 산) 디암모늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, 3,4 디아미노벤조산, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리실산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 인독실, 인디고, 패스트 블루 RR, 4-클로로-7-니트로벤조푸란으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 아릴아민이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 아미노 페놀이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 아미노페놀 에테르이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 인독실이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 중성 염료이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 하전된 염료이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 블릴리언트 블루, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5, 및 반응성 오렌지 16 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 톨루이딘 블루이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 블랙 5, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 바이올렛 5 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 오렌지 16 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료이다. 일부 실시형태에서, 디클로로트리아진계 반응성 염료는 흑색으로 보인다.
일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 반응성 염료이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 블릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 레마졸 블릴리언트 블루이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루 또는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5 또는 레마졸 브릴리언트 블루이다.
일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 나노입자이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 콜로이드성 금 입자이다. 일부 실시형태에서, 지표(I) 또는 이에 부착된 표지는 하전된 염료, 인돌 유도체 또는 루미놀 유도체이다.
특히, 앵커에 부착된 지표 또는 내부의 모티프는 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기, 예를 들어 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16, 또는 이의 조합을 함유하는 염료; 또는 디클로르트리아진 반응성 기, 예를 들어 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10 또는 이의 조합을 함유하는 염료를 포함한다.
앵커-지표 접합체
다양한 효소에서, 앵커(A)는, 예를 들어 글리코시드 결합을 통해 지표(I)와 직접 접합된다. 접합체의 앵커 부분은, 예를 들어 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되고; 지표(I)는 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 염료 또는 디클로르트리아진 반응성 기을 함유하는 염료로 이루어진 군으로부터 선택된다.
마커
본원에 개시된 실시형태에서는 만성 또는 감염된 상처에 존재하는 다양한 생물학적 마커에 대해 검정하는 화학적 잔기가 이용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 마커는 상처 특이적 마커이며, 이는 하이드롤라아제, 프로테아제, 에스테라아제 및 퍼옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소이다.
본원에 사용된 바와 같이, "상처 특이적 효소"는 상처에서 차등적으로 발현되는 효소이다. "차등적 발현"은 효소의 수준 또는 활성이 다른 부위, 예를 들어 정상 조직 또는 주변 조직과 비교하여 상처 미세환경 속에서 더 높거나 낮은 것을 의미한다. 특히, 차등적 발현은 정상 조직 또는 손상되지 않은 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 보다 높은 효소의 발현 또는 활성 수준을 의미한다. 효소의 차등적 발현은 통상의 수단으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 샘플 내의 효소의 수준은 ELISA 검정 또는 다른 면역검정으로 분석할 수 있다. 효소의 활성은, 예를 들어 기질의 손실율 및/또는 생성물의 형성율을 질량 분광기 또는 HPLC를 사용하여 측정함으로써 분석할 수 있다. 이러한 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 실시예 단락에 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 마커는 하이드롤라아제이다. 본원에 사용된 바와 같이, "하이드롤라아제" 또는 "가수분해 효소"는 화학적 결합에 대한 가수분해를 촉매하는 효소, 예를 들어 에스테라아제 및 뉴클레아제(에스테르 결합을 파괴함); 글리콜라아제(글리코시드성 링커를 파괴함); 펩티다제(펩타이드 결합을 파괴함) 등이다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 상처 특이적 글리코시드 하이드롤라아제는 라이소자임이다. 라이소자임(UNIPROT 수탁 번호 제P61626호[인간] 및 제P08905호[마우스])은 글리코시드 하이드롤라아제이며, 이의 주요 기능은 세균의 세포벽을 파괴하는 것이다. 이는 펩티도글리칸 내 N-아세틸무람산과 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이 및 키토덱스트린 속의 N-아세틸-D 글루코사민 잔기 사이의 (1→4)-β-연결을 가수분해한다. 라이소자임에 대한 천연 기질은 세균 세포 벽의 펩티도글리칸 층이다. 그러나, 무레인 분해 생성물을 포함하는 다양한 저분자량 기질 및 합성 화합물이 다양한 광도계, 동위원소 및 면역학적 라이소자임 검정에 사용되어 있다. 문헌{Holtje et al., EXS, 75: 105-10, 1996}을 참고한다. 또한 시그마 제품 번호 제M5639호 및 시그마 제품 번호 제N8638호를 참고한다.
하나의 실시형태에서, 화학적 잔기의 개개 성분은 상처 특이적 하이드롤라아제, 예를 들어 상처 특이적 라이소자임에 의한 인식에 적합하다.
대안적이거나 추가로, 화학적 잔기의 개개 성분은 다른 상처 특이적 효소에 의한 인식을 위해 개질될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 추가의 상처 특이적 효소는 프로테아제이다. 본원에 사용된 바와 같이, "상처 특이적 프로테아제"는 상처에서 차등적으로 발현되는 프로테아제이다. "차등적 발현"은 프로테아제의 수준 또는 활성이 다른 부위, 예를 들어 정상 조직 또는 주변 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 더 높거나 낮다는 것을 의미한다. 특히, 차등적 발현은 손상되지 않은 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 프로테아제의 보다 높은 발현 또는 활성 수준을 의미한다. 프로테아제의 차등적 발현은 통상의 수단으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 샘플 내의 프로테아제의 수준은 ELISA 검정 또는 다른 면역검정으로 분석할 수 있다. 프로테아제의 활성은, 예를 들어 펩타이드의 손실율 및/또는 생성물의 형성율을 질량 분광법 또는 HPLC를 사용하여 측정함으로써 분석할 수 있다. 이러한 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 실시예 단락에 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 상처 특이적 프로테아제는 카텝신 G(UNIPROT 수탁 번호 제P08311호[인간] 및 제P28293호[마우스])이며, 이는 아주르 과립(azurophil granule) 내에 저장되는 키모트립신 계열의 3개의 세린 프로테아제 중 하나이다. 카텝신 G 특이적 기질은 서열 Ala-Ala-Pro-Phe 또는 Ala-Ala-Pro-Met(시그마 알드리히 제품 번호 제S7388호 및 제M7771호)을 갖는다.
다른 실시형태에서, 상처 특이적 프로테아제는 엘라스타아제(예를 들어, 인간 호중구 엘라스타아제 또는 HNE)(UNIPROT 수탁 번호 제P08246호[인간] 및 제Q3UP87호[마우스])이다. HNE는 키모트립신과 동일한 계열의 세린 프로테아제이며, 광범위한 기질 특이성을 갖는다. 이는 염증 도중에 호중구 및 대식세포에 의해 분비되어, 세균 및 숙주 조직을 파괴한다. 하나의 실시형태에서, HNE를 검출하기 위한 기질은 코어 서열인 알라닌-알라닌-프롤린-발린(AAPV)을 갖는다. 다른 실시형태에서, HNE에 대한 기질은 Ala-Pro-Glu-Glu-Ile/Met-Arg-Arg-Gln(APEEI/MRRQ)이다(문헌{Kasperkiewicz et al., PNAS USA, 111(7): 2518-2523, 2014}; 문헌{Korkmaz et al., Methods Mol Biol., 844:125-138, 2012}).
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 영역은 엘라스타아제에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 엘라스타아제에 대한 발색 지표는 높은 콘트라스트(contrast)를 가지며, 따라서 의약품에서 원 위치로 사용될 때 명확한 지표로서 작용한다.
이상적인 기질은 청색, 보라색 또는 진한 녹색을 나타낸다. 이는 또한 높은 회전율을 갖는 입체적으로 허용되는 위치에 고정될 수 있다. 당해 기술분야의 상태는 반대이다. 이용 가능한 기질은 분자량이 작지만 황색 용해성 발색단을 생성하는 p- 니트로 페놀기를 함유한다. 대부분의 숙련된 연구자들은 상기 기질이 물 속에서 용해성일 수 있다는 것을 고려하는데, 이는 이것이 기질이 활성 부위로 이동하는 방향을 찾을 가능성이 가장 높기 때문이다.
대조적으로, 본원에 개시된 실시형태는 일반적인 이론적 근거에서 벗어난다. 엘라스타아제는 고상 기질, 즉 정의 상 가용성이 아닌 구조 단백질을 분해하고, 이에 특이적인 기질이 상응하게 채택되어야 하는 것으로 고려한다. 따라서, 지표의 색상 및 이들이 사용할 수 있는 시스템, 예를 들어 전자적 검출 둘 모두는 상처 환경에 대해 적합하였다.
따라서, 가용성 기질을 사용하는 당해 기술분야의 기술과는 대조적으로, 본원에 개시된 실시형태는 청색, 보라색 또는 녹색을 생성하는 낮은 수용성의 엘라스타아제 기질의 사용을 고려한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 상처 특이적 효소는 퍼옥시다아제, 보다 구체적으로는 마이엘로퍼옥시다아제(MPO)이다. MPO(UNIPROT 수탁 번호 제P05164호[인간] 및 제P11247호[마우스])는 호중구 과립구에서 발견되는 퍼옥시다아제이다. 과산화수소(H2O2) 및 할로겐화물(가장 흔하게는 염화물)의 존재 하에 이는 항미생물 물질인 차아염소산염, 단일선 산소(1O2), 염소(Cl2) 및 하이드록실 라디칼(OH·)을 생산한다. MPO는 테트라메틸벤지딘 또는 4-벤조일아미노2,5-디메톡시아닐린을 사용하여 검출할 수 있다. 문헌{Andrews et al., Anal Biochem, 127(2): 346-50, 1982}; 문헌{Klebanoff et al., J. Leukocyte Biol., 77, 598-625, 2005}을 참고한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 상처 특이적 효소는 세균 효소, 보다 구체적으로는 베타-락타마아제(β-락타마아제)이다. β-락타마아제(수탁GO: 0008800)는 페니실린, 세파마이신 및 카바페넴(에르타페넴)과 같은 β-락탐 항생제에 대해 다중 내성을 제공하는 세균에 의해 생성되는 하이드롤라아제 효소(EC 3.5.2.6)( 페니실리나아제로도 공지됨)이다. 가수분해를 통해 락타마아제 효소는 β-락탐 고리를 분해하여 개방한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 상처 특이적 효소는 바이러스 효소, 보다 구체적으로는 프로테아제 3C이다. 이들 프로테아제는 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 아프토바이러스 및 카디오바이러스에 의해 암호화되어 있고, 이들 속은 인간 및 기타 포유류에 대해 모두 광범위한 감염을 야기한다. 따라서 프로테아제 3C는 상처 감염에 대한 마커로 사용할 수 있다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 상처 특이적 효소는 MPO(UNIPROT 수납 번호 P05164 [인간] 및 P11247 [마우스])이며, 이는 호중구 과립구에서 발견되는 퍼옥시다아제다. 과산화수소(H2O2) 및 할로겐화물(가장 흔하게는 염화물)의 존재 하에 이는 차아염소산염, 단일선 산소(1O2), 염소(Cl2) 및 하이드록실 라디칼(OH·)을 생산한다. MPO는 테트라메틸벤지딘 또는 4-벤조일아미노2,5-디메톡시아닐린을 사용하여 검출할 수 있다. 문헌{Andrews et al., Anal Biochem, 127(2): 346-50, 1982}; 문헌{Klebanoff et al., J. Leukocyte Biol., 77, 598-625, 2005}을 참고한다.
효소 인식 부위(R)
본원에 개시된 실시형태가 상처 특이적 마커의 특이적인 검출에 관한 것인 한, 본원에서는 상처 특이적 마커에 대한 효소 인식 부위(R)를 함유하는 기질이 개시된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 화학적 잔기는 상처 특이적 효소, 예를 들어 앵커 영역(A) 또는 효소 절단 부위에 대한 인식 부위를 포함하는 지표(I)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 효소 인식 부위는 글리코시드 결합을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "글리코시드 결합"은 당류(또는 당류로부터 유래한 분자)의 헤미아세탈 또는 헤미케탈기와 알코올과 같은 일부 화합물의 하이드록실기 사이에서 형성된다. 글리코시드 결합을 함유하는 물질은 글리코시드이다. "글리코시드"란 용어는 현재 당의 헤미아세탈(또는 헤미케탈)기와, -SR (티오글리코시드), -SeR (셀레노글리코시드), -NR1R2(N-글리코시드) 또는 심지어는 -CR1R2R3(C-글리코시드)와 같은 하이드록실기를 제외한 다수의 화학기 사이에 형성된 결합을 갖는 화합물을 포함하도록 확장된다.
하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 화학적 잔기는 글리콜라아제에 의해 절단되는 하나 이상의 글리코시드 결합을 함유한다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 화학적 잔기는 앵커(A) 및 지표(I)를 직접 또는 다른 그룹을 통해 연결하는 글리코시드 결합을 포함한다. 특히, 앵커(A) 및 지표(I)는 하나 이상의 글리코시드 결합을 통해 직접 연결되며, 이 경우에 화학적 실체는 글리코실라아제에 의해 절단되므로 글리코실라아제를 검출하는데 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 지표 분자는 펩타이드 결합을 포함하는 효소적으로 절단 가능한 펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드 결합"은 2개의 아미노산 사이의 축합 반응에 의해 형성되며, 여기서 하나의 산 잔기는 다른 펩타이드의 아미노 잔기와 반응하여 2개의 아미노산 사이에 펩타이드 결합(-CO-NH-)을 생성한다. 개개의 펩타이드는 서열 특이적 프로테아제에 의한 인식을 위한 모티프를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "서열 특이적 프로테아제"란 용어는 펩타이드의 분해를 위해 이의 특이적인 서열을 인식하는 프로테아제(예를 들어, 카스파제)를 의미하며, 이의 하나의 말단으로부터 펩타이드를 순차적으로 분해하거나 서열 비특이적인 방식으로 펩타이드를 분해하는 일반적인 프로테아제(예를 들어, 트립신)과는 구별된다. 서열 특이성에 있어서, 펩타이드 기질의 아미노산 서열은 4개 이상의 아미노산(a.a.) 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드"란 용어는 직쇄 또는 측쇄 아미노산을 포함하는 천연 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetic) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 전형적으로, 펩타이드는 공유결합, 예를 들어 펩타이드 결합을 통해 서로 결합된 복수의 아미노산 잔기, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개, 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. "아미노산 잔기"는 본 발명의 펩타이드 내로 혼입되는 개개의 아미노산 단위를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"이란 용어는 자연적으로 존재하는 아미노산 또는 합성 아미노산뿐만 아니라 아미노산 동족체, 입체 이성질체 및 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 모사체(mimetic)를 의미한다. 이러한 정의에 의해 (1) 히스티딘(His) (2) 이소루이신(Ile) (3) 루이신(Leu) (4) 리신(Lys) (5) 메티오닌(Met) (6) 페닐알라닌(Phe) (7) 트레오닌(Thr) (8) 트립토판(Trp) (9) 발린(Val) (10) 아르기닌(Arg) (11) 시스테인(Cys) (12) 글루타민(Gln) (13) 글리신(Gly) (14) 프롤린(Pro) (15) 세린(Ser) (16) 타이로신(Tyr) (17) 알라닌(Ala) (18) 아스파라긴(Asn) (19) 아스파르트산(Asp) (20) 글루탐산(Glu) (21) 셀레노시스테인(Sec)과 같은 천연 아미노산; (a) 시트룰린; (b) 시스틴; (c) 감마-아미노 부티르산(GABA); (d) 오르니틴; (f) 테아닌 및 베타인; 카르니틴; 카르노신 크레아티닌; 하이드록시트립토판; 하이드록시프롤린; N-아세틸 시스테인; S-아데노실 메티오닌(SAM-e); 타우린; 타이라민과 같은 아미노산 유도체와 같은 비천연 아미노산이 포함된다. 이들 중에서, 반응성 측쇄를 함유하는 아미노산, 예를 들어 시스테인, 세린, 트레오닌, 리신, 아스파르테이트/아스파라긴, 글루타메이트/글루타민, 글리신, 알라닌 등이 특히 기질의 개질을 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 특이적 효소의 검출을 위한 하나 이상의 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역(R)을 함유한다.
효소가 라이소자임과 같은 글리코시다아제인 하나의 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 적어도 3개의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민 또는 펩티도글리칸 단위의 아실 키토산을 포함하며, 이들은 임의로 아세틸화된다. 효소 반응성 부위는, 예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20개 이상의 단위의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민 또는 펩티도글리칸 단위를 함유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, R은 적어도 3 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민 또는 이의 조합을 포함하며, 여기서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민은 임으로 아세틸화된다. 다른 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 펩티도글리칸을 포함하고, 여기서 펩티도글리칸은 임의로 아세틸화된다.
일부 실시형태에서, 화학적 잔기는 상술한 하나 이상의 상처 특이적 프로테아제, 예를 들어 카텝신 G, 및 마이엘로퍼옥시다아제, 엘라스타아제 또는 이의 조합에 대한 효소 반응성 부위(R)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "프로테아제에 대한 반응성 부위"란 용어는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 의미하며, 이는 이의 프로테아제 활성에 대한 기질, 예를 들러 하나 이상의 생성물로 개열될 수 있는 기질로서 프로테아제에 의해 인식된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 복수의 아미노산을 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 영역을 포함한다. "복수"란 용어는 개개 단위가 구조적 및/또는 기능적으로 상이할 필요는 없을지라도 2개 이상의 단위, 예를 들어 아미노산을 의미한다. 전형적으로, 화학적 실체의 지표 영역(I)은 상처 특이적 프로테아제에 대한 효소 반응 부위로서 제공되는 펩타이드를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 엘라스타아제, 카텝신 G, 마이엘로퍼옥시다아제 또는 이의 조합에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 영역은 엘라스타아제에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 엘라스타아제에 대한 발색성 지표는 높은 콘트라스트일 수 있으므로 의약 생성물에서 원 위치에서 사용되는 경우 명확한 지표로서 제공된다.
이상적인 기질은 청색, 보라색 또는 진한 녹색을 나타낼 수 있다. 이는 또한 높은 회전율을 갖는 입체적으로 허용되는 위치에 고정될 수 있다. 당해 기술분야의 상태는 반대이다. 이용 가능한 기질은 p-니트로페놀기를 포함하며, 이는 분자량이 낮지만 황색의 가용성 발색단을 생성한다. 대부분의 숙련된 연구자들은 상기 기질이 물 속에서 용해성일 수 있다는 것을 고려하는데, 이는 이것이 기질이 활성 부위로 이동하는 방향을 찾을 가능성이 가장 높기 때문이다.
대조적으로 본원에 개시된 실시형태는 일반적인 근거에서 벗어난다. 엘라스타아제는 고상 기질, 즉 정의 상 가용성이 아닌 구조 단백질을 분해하고, 이에 특이적인 기질이 상응하게 채택되어야 하는 것으로 고려한다. 따라서, 지표의 색상 및 이들이 사용할 수 있는 시스템, 예를 들어 전자적 검출 둘 모두는 상처 환경에 대해 적합하였다.
따라서, 가용성 기질을 사용하는 당해 기술분야의 기술과는 대조적으로, 본원에 개시된 실시형태는 청색, 보라색 또는 녹색을 생성하는 낮은 수용성의 엘라스타아제 기질의 사용을 고려한다.
펩타이드 서열은 종종 프로테아제 기질에 중요한 것을 간주되지만, 엘라스타아제는 매우 일반적인 가수분해 가능성을 가지며, 매우 많은 기질을 수용한다. 이는 많은 조직에서 항균 방어 및 면역 세포 전이에도 관여하기 때문이다. 이와 관련하여, 이는 다수의 다른 펩타이드를 절단할 수 있다. 이는 A, F, V 또는 M과 곁사슬 복잡성이 제한된 단순한 아미노산 사이에서 잘 절단된다. AAPV, AAPF, AAAA는 모두 잘 알려진 목표의 일례이다. 명백한 것은, N-말단 상의 거리가 증가함에 따라 아미노산의 역할이 덜 중요하다는 것이다. 절단 부위의 C-말단에는 명백한 공통서열(consensus)이 없지만, 복잡성이 낮은 것이 바람직한 것으로 보인다.
이 경우에 두 가지 인자가 보다 중요하다.
앵커와의 거리
발색단의 특성
앵커 부위가 너무 가까우면, 효소의 작용이 억제된다. 따라서 이상적으로는 절단 부위와 앵커 사이에는 4 개 이상의 아미노산이 존재한다.
발색단 및 특히 이의 전하가 중요하다. 중성 발색단은 양으로 하전된 잔기에 대해 바람직하며, 이는 음으로 하전된 발색단 또는 염료에 대비하여 바람직하다. 절단 부위 주변의 높은 농도의 음전하는 효소를 억제한다. 따라서, 음전하 염료가 사용되는 경우, 이들은 바람직하게는 절단 부위로부터 C 말단으로 2개 이상의 아미노산이 이격된다.
보다 긴 아미노산 서열은 일반적으로 방해가 적지만 경제적이지 못하다.
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyAAPXy-Z(서열 번호 1)
상기 식에서, 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고,
y는 각각 독립적으로 0 내지 200의 정수이고,
Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2),
여기서, 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고,
y는 각각 독립적으로 0 내지 200의 정수이고,
Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyAAP(V/F/A)Xy- Z (서열 번호 3),
여기서, 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고,
y는 각각 독립적으로 0 내지 200의 정수이고,
Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4),
여기서, 각각의 X는 독립적으로는 임의의 아미노산이고,
y는 각각 독립적으로 0 내지 200의 정수이고,
L은 연결 잔기이고,
Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
다른 구체적인 실시형태에서, 반응성 영역(R)은 펩타이드 서열 XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)(여기서, X, L 및 Z는 각각 상기 기술한 바와 같고, y는 각각 독립적으로 1 내지 50의 정수이다)를 포함한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 반응성 영역(R)은 펩타이드 서열 XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)(여기서 X, L 및 Z는 각각 위에서 기술한 바와 같고, y는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수임)를 포함한다.
특히, 반응성 영역(R)은 펩타이드 서열 XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)(여기서 X, L 및 Z는 각각 위에서 기술한 바와 같고, y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수임)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 서열 XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)를 포함하는 전술한 펩타이드 각각은 서로 독립적으로 엘라스타제에 대해 불안정하다.
일부 실시형태에서, 아미노산 서열 XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)내 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 아민 보호 그룹, 예를 들어 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 카텝신 G에 대해 불안정한 펩타이드를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyN4N3N2N1Xy-Z (서열 번호 5)
여기서, X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고;
y는 각각 독립적으로 0 내지 6으로부터 선택되는 수이고;
N4는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고;
N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고;
N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고;
N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌 으로부터 선택되고;
Z는 검출 가능한 표지를 포함하고; 펩타이드는 카텝신 G에 대해 불안정하다.
일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 t-boc기로 보호된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열 내의 아미노산들 중 하나는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함한다:
XyN4N3N2N1Xy-L-Z (서열 번호 6)
여기서, X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고;
y는 각각 독립적으로 0 내지 6으로 선택된 수이고;
N4는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고;
N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고;
N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고;
N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌으로부터 선택되고;
L은 연결 잔기이고;
Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 서열 XyN4N3N2N1Xy-Z (서열 번호 5) 및 XyN4N3N2N1Xy-L-Z (서열 번호 6)를 포함하는 상술한 펩티드 각각은 개별적으로는 카텝신 G에 대해 불안정하다.
일부 실시형태에서, 아미노산 서열 XyN4N3N2N1Xy-Z (서열 번호 5) 및 XyN4N3N2N1Xy-L-Z (서열 번호 6) 내의 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 아민 보호기, 예를 들어 플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc)로 보호된다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 (a) XyUUUUy-Z의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하며, 여기서 X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고; y는 각각독립적으로는 1 내지 50으로부터 선택된 수이고; U는 LEVLFQ으로부터 선택된 아미노산이고, Z는 표지이다. 특히 이러한 실시형태에서, y는 1 내지 10으로부터 선택된 수이다.
일부 실시형태에서, 아미노산 서열 (a) XyUUUUy-Z 내의 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 t-boc 기 또는 Fmoc 기로 보호된다.
일부 실시형태에서, 아미노산 서열 XyUUUUy-Z는 바이러스 3C 프로테아제에 대해 불안정하다.
검출 가능한 표지(Z)
일부 실시형태에서, Z는 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노페놀, 아미노페닐 에테르, 인독실, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자 또는 콜로이드성 금 입자이다.
일부 실시형태에서, Z는 p-아미노페놀, ABTS(2,2이노페놀, ABTS (s, 퍼옥시다아제 기질 산) 디암모늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, 3,4 디아미노벤조산, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리사이클산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 인독실, 인디고, 패스트 블루(Fast Blue) RR, 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, Z는 아릴아민, 아미노 페놀, 아미노페놀 에테르, 인독실, 천염 염료, 레마졸 블릴리언트 블루, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 및 반응성 오렌지 16 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된 하전된 염료이다. 특히, Z는 레마졸 브릴리언트 블루; 톨루이딘 블루; 반응성 블랙 5 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된 하전된 염료이다.
일부 실시형태에서, Z는 반응성 바이올렛 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료이다. 일부 실시형태에서, 디클로로트리아진계 반응성 염료는 검정색으로 나타난다. 일부 실시형태에서, Z는 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 반응성 염료이다.
일부 실시형태에서, Z는 나노입자이다. 일부 실시형태에서, Z는 콜로이드성 금 입자이다.
일부 실시형태에서, Z는 하전된 염료, 인돌 유도체, 또는 루미놀 유도체이다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 페놀, 아미노 페놀, 아미노페닐 에테르, 인독실, 또는 퀴논을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노 페놀 에테르를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 인독실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퀴논을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 마이엘로퍼옥시다아제와 반응하나 헴과는 반응하지 않는다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퍼옥시다아제 기질, 아릴아민, 아미노 페놀, 중성 염료, 하전된 염료, 나노입자, 또는 콜로이드성 금 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 퍼옥시다아제 기질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시다아제 기질은 p-아미노페놀, ABTS(2,2-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)디암노늄 염), 3,3'-디아미노벤지딘, 3,4 디아미노벤조산, DCPIP, N,N-디메틸-p-페닐렌디아민, o-디아니시딘, p-페닐렌디아민, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민 N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀, 3-아미노-9-에틸카바졸, 4-아미노프탈하이드라지드, 5-아미노살리사이클산, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), 및 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔, 패스트 블루 RR(Fast Blue RR), N-(2-하이드록시)테트라데실-패스트 블루 RR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아릴아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 아미노 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 중성 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하전된 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5, 및 반응성 오렌지 16, 또는 이들 각각의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 레마졸 브릴리언트 블루, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 톨루이딘 블루를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 블랙 5, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 바이올렛 5, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하전된 염료는 반응성 오렌지 16, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, Z는 콜로이드성 금 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 하전된 염료, 인돌 유도체, 또는 루미놀 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 인돌 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역은 루미놀 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 정상의 주위 광 속에서 가시적인 색상 변화를 나타내는 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료는 상처 생성물에 대한 대조색상(contrasting color)을 가지며, 이는 일반적으로 적색, 황색 또는 갈색이다. 추가의 실시형태에서, 염료는 보라색, 청색 또는 암녹색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 보라색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 청색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 암녹색이다. 일부 실시형태에서, 염료는 저 분자량을 가지면, 하전되어 있고, 반응성 또는 연결가능한 그룹을 함유하고, 감마 조사에 대해 안정하며, 짙은 색상이다. 일부 실시형태에서, 염료는 시브라크론 시리즈(cibracron series) 염료, 아조 염료, 및 레마졸 염료, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 시브라크론 시리즈 염료로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 아조 염료로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 레마졸 염료, 또는 이의 가수분해성 또는 암모늄 분해성 유도체로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 염료는 로다민, 코우마린, 시아닌, 크산텐, 폴리메틴, 피렌, 디피롤메텐 보로디플루오라이드, 나프탈이미드, 피코브릴리프로테인, 피리디늄 클로로필 단백질, 플루오레세인, 6-FAM, 로다민, 텍사스 블루(Texas Red), 캘리포니아 레드(California Red), iFluor594, 테트라메틸 로다민, 카복시메틸로다민, 카복시로다민 6F, 카복시로돌, 카복시로다민 110, 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), 캐스캐이드 옐로우(Cascade Yellow), 코우마린, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, Cy-크롬(Chrome), DyLight 350, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE (6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), NED, ROX (5-(및-6-)-카복시-X-로다민), HEX, 루시페르 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, Alexa Fluor® 350, Alex Fluor® 430, Alexa Fluor®488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, 7-아미노-4-메틸코우마린-3-아세트산, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, 및 디메틸아미노아조벤젠설폰산(dabsyl), 또는 이의 접합체, 또는 조합이다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 및 반응성 브라운 10과 같은 디클로로트리아진계 반응성 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 디클로로트리아진계 반응성 염료는 검정색으로 보인다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 설포닐에틸-하이드로젠설페이트 반응성 기를 함유하는 반응성 염료의 반응성 생성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 레마졸 브릴리언트 블루이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 오렌지 16이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5, 레마졸 브릴리언트 블루, 또는 반응성 바이올렛 5이다. 일부 실시형태에서, 반응성 염료는 반응성 블랙 5 또는 레마졸 브릴리언트 블루이다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 정상의 주위 광 속에서 색상 변화를 나타내는 입자(예를 들어, 콜로이드성 금속 또는 양자점)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 나노입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 콜로이드성 금 입자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 자외선 하에 가시적인 색상 변화를 나타내는 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 형광성인 염료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 발광성인 염료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지표 영역은 효소 반응성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 반응하여 나안에 가시적이거나 전자 수단에 의해 검출 가능한 생성물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 상호작용하여 눈으로 볼 수 있는 생성물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 반응하여 전자 수단에 의해 검출 가능한 생성물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 사용된 말단 당에 따라 헥사아미니다제, 글루쿠로니다제 글루코시다아제 또는 갈락토시다제에 의해 분할되는 인독실 글리코시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 보조 효소에 의해 산화되어 가시적인 생성물을 생산하는 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 락카아제(laccase)에 의해 산화되어 가시적인 생성물을 생산하는 페놀을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 전자 수단에 의해 검출 가능한 메탈로 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지표 영역은 전자 수단에 의해 검출 가능한 페로센 또는 페로센 동족체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 리파아제, 에스테라아제, 헥소스아미니다아제, 퍼옥시다아제, 글리코시다아제, 글루코시다아제 및 락카아제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 상처 유액 속에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 보조 효소는 상처 유액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 효소 반응성 잔기는 보조 효소와 상호작용하여 자외선 하에 가시적인 생성물을 생산한다.
복수의 효소 인식 부위(R)를 함유하는 화학적 실체
추가의 실시형태에서, 개별적으로 다수의 효소 인식 부위(R)을 포함하는, 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 개시된다. 전형적으로, 이러한 화학적 실체는 복수의 효소, 예를 들어 적어도 하나의 프로테아제 및 적어도 하나의 글리코시다아제를 포함하는 조합을 검정하는데 사용된다.
하나의 실시형태에서, 개별적으로 또는 함께 복수의 효소 인식 부위(R)를 포함하는 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 반응 부위는 글리코시다아제, 예를 들어 라이소자임에 대해 특이적이며; 적어도 하나의 효소 반응 부위는 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제, 냅신(아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신A, B, D, G, L, S, Z; 산 세라미다아제, 락토페린(LF), 리소자임, 마이엘로퍼옥시다아제(MPO), 엘라스타아제, 락타마아제, 카텝신및 프로테이나아제-3C 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 대해 특이적이다. 이들 효소에 대한 개개의 반응 부위 및 인식 부위는 앞서 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 개별적으로 또는 함께 복수의 효소 인식 부위(R)를 포함하는 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 반응 부위는 프로테아제 엘라스타아제에 대해 특이적이며; 적어도 하나의 효소 반응 부위는 마이엘로퍼옥시다아제(MPO), 카텝신 및 프로테이나아제-3C로부터 선택된 프로테아제에 대해 특이적이다. 이들 효소에 대한 개개의 반응 부위 및 인식 부위는 앞서 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 개별적으로 또는 함께 복수의 효소 인식 부위(R)를 포함하는 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 반응 부위는 프로테아제 엘라스타아제에 대해 특이적이며; 적어도 하나의 효소 반응 부위는 베타-락타마아제 및 프로테이나아제-3C으로 이루어진 군으로부터 선택된 미생물 효소에 대해 특이적이다. 이들 효소에 대한 개개의 반응 부위 및 인식 부위는 앞서 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 개별적으로 또는 함께 복수의 효소 인식 부위(R)를 포함하는 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 반응 부위는 엘라스타아제에 대해 특이적이고; 적어도 하나의 효소 반응 부위는 MPO로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대해 특이적이다. 이들 효소에 대한 개개의 반응 부위 및 인식 부위는 앞서 기술되어 있다.
하나의 실시형태에서, 개별적으로 또는 함께 복수의 효소 인식 부위(S) 및 효소 반응 부위 (R)를 포함하는 앵커(A), 지표(I)를 함유하는 화학적 실체가 본원에 제공되며, 여기서 적어도 하나의 반응 부위는 프로테아제 엘라스타아제에 대해 특이적이며; 적어도 하나의 효소 반응 부위는 프로테이나아제 3C로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 대해 특이적이다. 이들 효소에 대한 개개의 반응 부위 및 인식 부위는 앞서 기술되어 있다.
효소 기질의 조합을 사용하는 보다 큰 예측력으로 인하여, 상기 요약한 바와 같이, 복수의 반응 및 인식부위를 포함하는 화학적 실체의 진단적 유용성은 반응 및 인식 부위의 통합성(예를 들어, 단일 유형)을 포함하는 실체와 비교하여 크게 향상될 것이다. 적어도, 복수의 반응/인식 부위를 포함하는 실체는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 이상의 마커를 동시에 진단하도록 할 것이다. 예를 들어, 상처 부위에서 숙주 엘라스타아제 및/또는 MPO 활성이 검출될 수 있으며, 본원에 기술된 멀티플렉스 화학적 실체를 사용하여 병원균 유래 마커 (예를 들어, 베타-락타마아제 또는 바이러스 프로테아제 3C 특이적 반응 부위)와 동시에 모니터링할 수 있다.
지지 물질
일부 실시형태에서, 화학적 실체의 앵커 영역(A)은 화학적 실체를 지지 물질에, 예를 들어 공유결합적 상호작용, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 정전기 상호작용, 수소 결합 상호작용, 물리화학적 상호작용, 반 데르 바알스 힘, 루이스/루이스 염기 상호작용 또는 이의 조합을 통해 결합한다.
일부 실시형태에서, 지지체 매트릭스는 덱스트란, 아가로즈, 실리카, 합성 중합체, 또는 덱스트란, 아가로즈, 실리카, 또는 항체, 리간드, 또는 에피토프 태그에 커플링된 합성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 앵커 영역은 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도체화된 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 반응성 기, 펩티도글리칸, 또는 키토산 유도체 또는 이의 조합이다. 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 단기간의 UV 조사 이후 지지 물질에 결합한다.
일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 유액에 의해 습식될 수 있고 모세관 작용을 나타낼 수 있는 여과지 또는 직포 또는 부직포 물질과 같은 지지 물질 상에 또는 내부에 인쇄된다. 일부 실시형태에서, 지지 실체 또는 화학적 실체는 상처 유액에 의해 습식될 수 있고, 모든 치수에서 유사한 모세관 작용을 나타내는 여과지 또는 직포 또는 부직포 물질과 같은 지지 물질 상에 또는 내부에 화학적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 유액에 의해 습식될 수 있고 모세관 작용을 나타내는 여과지 또는 직포 또는 부직포 물질과 같은 지지 물질 상에 또는 내부에 이온적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 화학적 실체는 상처 유액에 의해 습식될 수 있고 모세관 작용을 나타낼 수 있는 여과지 또는 직포 또는 부직포 물질과 같은 지지 물질 상에 또는 내부에 공유결합된다. 지지 물질은 셀룰로오스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리아크릴레이트 및 섬유와 같이 유용한 유사한 중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 셀룰로오스다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리아미드이다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리에스테르이다. 일부 실시형태에서, 지지 물질은 폴리아크릴레이트이다.
추가의 잔기
일부 예에서, 상처의 pH는 혈관형성, 프로테아제 활성, 산소 방출, 및 세균 독성과 같은 상처 치유의 많은 요인에 영향을 미칠 수 있다. 치유되지 않는 만성의 상처는 상승된 알칼리성 환경을 가질 수 있다. 상처가 치유를 향해 진행되면서, 상처의 pH는 중성으로 이동한 후 산성이 된다. 상처의 pH의 모니터링은 상처의 상태(예를 들어, 감염 또는 비감염)를 평가하고 치료에 대한 상처 반응을 측정하는데 보조한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 상처에서 감염의 검출을 위한 화학적 실체는 가시적인 색상 변화를 나타내는 pH 민감성 잔기를 포함하는 지표 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 알칼리성 pH, 예를 들어 pH 7.2 내지 9.5; pH 7.2 내지 9.0; pH 7.2 내지 8.5; pH 7.2 내지 8.0; pH 7.5 내지 8.5; pH 7.5 내지 9.0; pH 8.0 내지 9.0에서 가시적인 색상 변화를 나타낸다. 다른 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 pH 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 또는 9.5, 또는 이의 0.1 증분에서 가시적인 색상 변화를 나타낸다.
일부 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 중성 pH 범위, 예를 들어 pH 6.9, 7.0, 또는 7.1, 또는 이의 0.05 증분에서 가시적인 색상 변화를 나타낸다.
일부 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 산성 pH, 예를 들어 pH 4.5 내지 6.8; pH 4.5 내지 6.5; pH 5.0 내지 6.8; pH 5.4 내지 6.8; pH 5.4 내지 6.5에서 가시적인 색상 변화를 나타낸다. 다른 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 pH 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9, 또는 이의 0.1 증분에서 가시적인 색상 변화를 나타낸다.
일부 실시형태에서, pH 민감성 잔기는 브로모티몰 블루, 페놀 레드, 브로모페놀 레드, 클로로페놀 레드, 티몰 블루, 브로모크레졸 그린, 브로모크레졸 퍼플; 니트라진 옐로우; 및 설포프탈레인 염료 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물
본원에 기술된 실시형태는 또한 화학식 I의 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 통상의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
일단 제형화되면, 수득되는 화학식 I의 화합물의 스톡 조성물(stock composition)을 바람직한 형태, 예를 들어 겔, 향유, 로션, 크림, 페이스트, 연고 등으로 통상의 방법, 예를 드렁 담체, 겔화제, 연화제, 표면활성제, 습윤제, 점도 향상제, 유화제 등을 사용하여 추가로 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 제WO 2013/004953호를 참고한다.
조성물에서 사용하기 위한 담체는 물, 글리세린, 디글리세린, 글리세린 유도체, 글리콜, 글리콜 유도체, 당, 에톡실화되고/되거나 프로폭실화된 에스테르 및 에테르, 우레아, 나트륨 PCA, 알코올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시형태에서, 담체는 프로필렌 글리콜이다. 전형적으로, 조성물은 조성물의 약 1 중량% 내지 조성물의 약 99.9 중량%, 보다 전형적으로 조성물의 약 2 중량% 내지 조성물의 약 95중량%, 및 보다 전형적으로 조성물의 약 5중량% 내지 조성물의 약 90중량%의 양의 담체를 함유한다.
열 가역적 겔화제는 50℃와 같은 승온에서, 친수성 담체 속에서 가용성, 부분적으로 가용성 또는 혼화성인 성분으로 정의되며, 여기서 제제는 25℃로 냉각되는 경우 점성을 나타내는 능력을 갖지만, 기질에 대한 도포가 요구되는 경우 50℃에서 점성이 낮다. 적합한 친수성 담체는 물, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜을 포함한다. 조성물에서 사용하기 위한 열 가역적 겔화제는 스테아르산나트륨, 팔미트산나트륨, 스테아르산칼륨과 같은 지방산의 염을 포함할 수 있다. 이들 염은 조성물에 첨가될 수 있거나 지방산의 첨가 및 적절한 염기를 사용한 중화로 자체내에서 생성될 수 있다. 조성물의 자체내 형성의 예는 스테아르산 및 수산화나트륨을 제공함으로써 스테아르산나트륨을 생산하기 위함이다. 다른 일반적인 헤르모스 가역적(hermos-reversible) 겔화제는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 및 PEG-20, PEG-150 디스테아레이트, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라스테아레이트, 디스테아레쓰-75 IPDI, 디스테아레쓰-100 IPDI, 지방 알코올, 예를 들어 세틸 알코올, 스테아르산, 하이드록시스테아르산과 같은 지방산 및 이의 유도체 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
담체 및 헤르모스 가역적 겔화제 이외에도, 조성물은 다양한 다른 성분 및 요소를 함유할 수 있다. 조성물 속에 포함될 수 있는 다른 성분의 예는 연화제, 스테롤 또는 스테롤 유도체, 천연 및 합성 지방 또는 오일, 점도 향상제, 유동학 개질제, 폴리올, 표면활성제, 알코올, 에스테르, 실리콘, 점토, 전분, 셀룰로오스, 미립자, 습윤제, 필름 형성제, 슬립 개질제(slip modifier), 표면 개질제, 피부 보호제, 보습제, 자외선차단제 등이다.
약학 조성물 및/또는 제제:
본원에 기술된 실시형태는 하나 이상이 상술한 화학식 I의 화합물 및 담체를 포함하는 약학 조성물 및/또는 제제에 관한 것이다. "약학적으로 허용 가능한"란 문구는 화합물, 염, 조성물, 투여량 형 등을 지칭하기 위해 본원에 사용되며, 이들은 건전한 의학적 판단 범위내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및/또는 다른 포유동물과 접촉하여 사용하기 적합하며, 충분한 이익/위험 비를 보증한다. 일부 양태에서, "약학적으로 허용 가능한"은 연방 정부 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 포유류(예를 등러, 동물)에서, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되어 있다.
약학 조성물은 당해 기술분야에 공지된 어떠한 적합한 수단으로도 제조할 수 있다. 이러한 조성물의 예는: (a) 국소 적용, 예를 들어 물품(예를 들어, 거즈, 패드, 면봉, 드레싱), 크림, 연고, 겔, 로션 등; (b) 멸균 용액 또는 현탁액으로서 비경구 투여, 예를 들어 피하, 근육내 또는 정맥내 주사; (c) 경구 투여, 외부 적용(예를 들어, 수성 및 비수성 용액 또는 현탁액을 포함하는 물약), 정제, 거환(bolus), 분말, 과립, 사료와 혼합하기 위한 펠렛(pellet), 혀에 적용하기 위한 페이스트(paste) 등에 적합한 것을 포함한다.
특정의 실시형태에서, 약학 조성물은 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "항생제" 또는 "항미생물제"란 용어는 미생물의 성장을 억제하거나 이를 파괴하는 물질을 의미한다. 바람직하게는, 항생제는 감염성 제제의 발병력을 제한하고/하거나 감염성 질환을 치료하는데 유용하다. 항생제는 또한 반합성 물질을 의미하며 여기서 미생물, 예를 들어 효모 또는 진균에 의해 생산된 천연 형태가 구조적으로 개질되어 있다.
바람직하게는, 항생제는 β-락탐(β-락타마제 억제제 및 세팔로스포린을 포함함), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 테트라사이클린 및/또는 글리실사이클린 및/또는 폴리믹신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항생제의 어떠한 조합도 또한 임의로 아미노글리코시드 등과 함께 사용될 수 있는데, 예를 들어 적어도 하나의 β-락탐 및 적어도 하나의 플루오로퀴놀론; 적어도 하나의 아미노글리코시드 및 하나의 세팔로스포린; 적어도 하나의 β-락탐 및 하나의 β-락탐 억제제를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "β-락탐" 억제제란 용어는 천연 및 반합성 페니릴린 및 페니실린 유도체, 예를 들어 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린(페니실린 G), 페녹시메틸페니실린(페니실린 V), 프로카인 페니실린 및 옥사실린; 메티실린, 디클록산실린 및 플루클록사실린; 테목실린; 아목실클린 및 암피실린; 아즐로실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린 및 피페라실린; 베아페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 이미페넴, 메로페넴, 파니페넴 및 PZ-601; 세팔렉신, 세팔로틴, 세파졸린, 세파클로르, 세푸록심, 세파만돌, 세포테탄, 세폭시틴, 세포탁심, 및 세프포독심; 세페핌 및 세프피롬; 세파드록실, 세픽심, 세프프로질, 세팔렉신, 세팔로틴, 세푸록심, 세파만돌, 세페핌 및 세프리롬; 세폭시틴, 세포테탄, 세프메타졸 및 프로목세프; 티게모남, 노카르디신 A 및 타브톡신; 클라불란산, 목살락탐 및 플로목세프를 포함한다. 플루오로퀴놀론은 시프로플록사신, 가레녹사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 레보플록사신 및 목시플록사신을 포함한다. 아미노글리코시드는, 예를 들어 가나마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 겐타마이신, 시소마이신, 네틸마이신, 네오마이신 B, 네오마이신 C, 네오마이신 E(파로모마이신) 및 합성 유도체 클라리트로마이신 및 아지트로마이신을 포함하는, 스트렙토마이신을 포함한다. 테트라사이클린은 천연적으로 존재하는 화합물(예를 들어 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린) 또는 반합성제(예를 들어 라이메사이클린, 메클로사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 롤리테트라사이클린)을 포함한다. 글리사이클린(예를 들어 미노사이클린/티게사이클린)은 테트라사이클린으로부터 유도된다. 폴리믹신은 예를 들어 폴리믹신 B 및 폴리믹신 E(콜리스틴)를 포함한다.
특정의 실시형태에서, 조성물은 항생제를 0.1 mg/mL, 0.5 mg/L, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL 44 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/m, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL 이상의 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 이미페넴 및 에르타페넴은 50, 30, 20, 15, 10, 5 및 1 mg/mL의 농도로 사용될 수 있다.
상처 드레싱:
특정의 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질, 예컨대 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱이 본원에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 상처 드레싱은 본원에 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질, 예를 들어 화학식 I의 화합물 화합물로 필수적으로 이루어진다.
하나의 실시형태에서, 본원에 기술된 상처 드레싱은 생체 적합성, 생분해성, 비면역원성일 수 있으며, 용이하게 상업적으로 이용가능하다.
하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 임의로 약제를 함유하는 섬유 입자 또는 분말 입자와 같은 입자의 형태로 제공된다. 특히, 물질은 바람직하게는 PG 섬유를 함유한다.
조성물은 바람직하게는 드레싱 물질 및 다른 화합물의 친밀한 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, 친밀한 혼합물은 드레싱 물질과 용매와 같은 적합한 비히클의 분산액, 또는 이러한 용액 또는 분산액을 제거함으로써 생산된 고체 조성물을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 드레싱 물질은 물질의 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 90% 또는 그 이상의 중량%의 물질을 포함한다. 특정의 바람직한 실시형태에서, 물질은 드레싱 물질로 필수적으로 이루어진다.
물질의 기타 성분은 0 내지 25중량%, 예를 들어 약 1 내지 약 20중량%의 하나 이상의 다른 생체 적합성 다당류, 예를 들어 알긴산나트륨 또는 알긴산칼슘과 같은 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트와 같은 전분 유도체, 메틸 셀룰로오스 또는 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체, 또는 하이알루론산 또는 이의 염과 같은 글리코스아미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트 또는 헤파란 설페이트를 포함할 수 있다. 물질은 또한 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 구조 단백질을 약 25중량%, 예를 들어 약 1 내지 약 20중량%로 포함한다. 바람직하게는 단백질은 콜라겐을 포함하며, 보다 바람직하게는 이는 필수적으로 콜라겐으로 이루어진다. 물질은 또한 약 20중량% 이하, 바람직하게는 약 2% 내지 약 10중량%의 물을 포함할 수 있다. 물질은 또한 0 내지 40중량%, 예를 들어 약 5 내지 약 25중량%의 가소제, 바람직하게는 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 다가 알코올을 포함할 수 있다.
특정의 실시형태에서, 물질은 또한 약 10중량% 이하, 예를 들어 약 0.01 내지 약 5중량%, 전형적으로 약 0.1 내지 약 2중량%의 비스테로이드성 소염 약물(예를 들어, 아세트아미노펜), 스테로이드, 국소 마취제, 항미생물제, 또는 성장 인자(예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 또는 혈소판에서 유래한 성장 인자)와 같은 하나 이상의 치료학적 상처 치유제를 포함할 수 있다. 항미생물제는, 예를 들어 소독제, 항생제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 항생제는 테트라사이클린, 페니실린, 테라마이신, 에리트로마이신, 박시트라신, 네오마이신, 폴리마이신 B, 무피로신, 클린다마이신 및 이의 혼합물을 포함한다. 바람직한 소독약은 콜로이드성 은을 포함하는 은, 물질을 구성하는 하나 이상의 음이온성 중합체의 염을 포함하는 은 염, 은 설파디아진, 클로르헥시딘, 포비돈 요오드, 트리클로산, 수크랄페이트, 4급 암모늄 염 및 이의 혼합물을 포함한다. 개시된 기술에 따른 이들 의약처리된 상처 드레싱은 사용시 상처 드레싱 물질이 파됨에 따라 치료제의 지속적인 방출을 제공한다.
상술한 비율(%) 모두는 무수 중량 기준이다. 바람직하게는, 상처 드레싱 물질 대 기타 보조제 및 물질의 중량비는 약 1:99 내지 약 99:1이다. 보다 바람직하게는, 상기 중량비는 약 1:9 내지 약 9:1의 범위이고, 보다 바람직하게는 이는 약 4:1 내지 약 1:4의 범위, 여전히 보다 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:2의 범위이다.
물질은 분말, 미세구, 플레이크, 매트(mat) 또는 필름과 같은 어떠한 편리한 형태일 수 있다.
특정의 실시형태에서, 물질은 국소 적용을 위한 반고체 또는 연고의 형태이다.
특정의 실시형태에서, 물질은 만성 상처에 적용하기 위한 동결 건조되거나 용매 건조된 생흡수성 스폰지의 형태이다. 바람직하게는, 스폰지의 평균 공극 크기는 10 내지 500㎛, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300㎛의 범위이다. 적합한 스폰지는 화학식 I의 화합물을, 적합한 치료제와 함께 포함하는 수성 분산액을 동결 건조시키거나 용매 건조시켜 제조하였다.
또 다른 실시형태에서, 물질은 가요성 필름의 형태이며, 이는 연속적이거나 차단(예를 들어, 천공)될 수 있다. 가요성 필름은 바람직하게는 필름을 가요성으로 만들기 위해 가소제, 예를 들어 글리세롤을 포함한다.
조절 가능한 특성의 범위를 갖는 겔 형성 중합체, 예를 들어 셀룰로오스 유도체 둘 다의 용이한 이용 가능성은 본 기술에 개시된 조성물의 특성이 예외적으로 조절될 수 있음을 의미한다. 특히, 물질의 생물학적 흡수 속도, 다공성 및 밀도는 조절될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물의 활성층을 포함하는, 시트(sheet) 형태의 상처 드레싱 물질이이다. 활성층은 일반적으로 사용시 상처 접촉 층일 수 있지만, 일부 실시형태에서 이는 액체-투과성 상단 시트에 의해 상처로부터 분리될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 활성층의 부위는 약 1 cm2 내지 약 400 cm2, 특히 약 4 cm2 내지 약 100 cm2의 범위이다.
다른 실시형태에서, 상처 드레싱 물질은 또한 활성층의 측면에 접하는 상처에 대해 반대쪽의 활성층 위에 확장된 배면 시트(backing sheet)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 배면 시트는 활성층보다 더 커서, 너비가 1 mm 내지 50 mm, 바람직하게는 5 mm 내지 20 mm인 가장자리 영역이 활성층 주변으로 확장되어 소위 섬 드레싱을 형성하도록 한다. 이러한 경우에, 배면 시트는 바람직하게는 적어도 이의 가장자리 영역에서 감압성 의료 등급의 접착제로 코팅된다.
드레싱 물질이 배면 시트를 포함하는 실시형태에서, 배면 시트는 실질적으로 액체-투과성이다. 다른 실시형태에서, 배면 시트는 투과성이며, 예컨대, 배면 시트는 바람직하게는 물, 증기에 대해 투과성이지만, 액체 물 또는 상처 삼출물에 대해서는 투과성이 아니다. 바람직하게는, 배면 시트는 또한 미생물-불투과성이다. 적합한 연속 형성가능한 배면 시트는 바람직하게는 37.5℃에서 100% 내지 10%의 상대 습도 차이에서 300 내지 5000 g/m2/24시간, 바람직하게는 500 내지 2000 g/m2/24시간의 배면 시트 만의 습윤 증기 투과율(MVTR)을 갖는다. 배면 시트 두께는 바람직하게는 10 내지 1000 마이크로미터, 보다 바람직하게는 100 내지 500 마이크로미터이다.
배면 시트를 형성하기에 적합한 중합체는 폴리우레탄 및 폴리알콕시알킬 아크릴레이트 및 메타크릴레이트이다. 바람직하게는, 배면 시트는 주로 밀폐형 셀(closed-cell)인 고밀도의 차단된 폴리우레탄 발포체의 연속 층을 포함한다. 적합한 배면 시트 물질은 폴리우레탄 필름이다.
접착제를 포함하는 백킹 층(backing layer)을 포함하는 상처 드레싱에서, 접착 층은 습윤 증기 투과성이고/이거나 패턴이어서 수증기의 통과를 허용하여야 한다. 접착 층은 바람직하게는 섬-형 상처 드레싱(island-type wound dressing)에 편리하게 사용된 유형의 연속적인 습윤 증기 투과성, 감압성 접착 층, 예를 들면, 아크릴레이트 에스테르 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 폴리우레탄을 기반으로 한 감압성 접착제이다. 폴리우레탄계 감압성 접착제가 선택적으로 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 드레싱은 또한 활성층과 보호 시트 사이에 구축될 수 있는 다층 흡수성 물품의 추가 층을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 층은 천공된 플라스틱 필름을 포함함으로써 사용시 활성층에 대한 지지체를 제공하며, 여기서 필름 속의 구멍은 바람직하게는 하이드로겔 층 속의 구멍에 맞게 정렬된다.
여전히 추가로, 다른 실시형태에서, 드레싱은 특히 드레싱이 삼출되는 상처에 사용하기 위한 경우, 활성층과 보호 시트 사이에 흡수층을 포함할 수 있다. 임의의 흡수층은 거즈, 부직포, 수퍼 흡수제, 하이드로겔 및 이의 혼합물을 포함하는, 상처 치유 분야에서 상처 유액, 혈청 또는 혈액을 흡수하기 위해 편리하게 사용된 층 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 흡수층은 개방형 셀의 친수성 폴리우레탄 발포체와 같은 흡수성 발포체의 층을 포함한다. 다른 실시형태에서, 흡수층은 부직 섬유상 웹(web), 예를 들어 점성 스테이플 섬유(staple fiber)의 카딩된 웹(carded web)일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상처 드레싱은 제거 가능한 커버 시트에 의해 보호될 수 있다. 커버 시트는 일반적으로 가요성 열가소성 물질로부터 형성된다. 적합한 물질은 폴리에스테르 및 폴리올레핀을 포함한다. 바람직하게는, 커버 시트의 접착제와 접하는 표면은 이형 표면(release surface)이다. 즉, 이러한 표면은 배면 시트 상의 활성층과 접착제에 대해서만 약하게 접착하여 커버 시트로부터 하이드로겔 층의 박리를 보조한다. 예를 들어, 커버 시트는 플루오로중합체와 같은 비접착성 플라스틱으로부터 형성될 수 있거나, 이는 실리콘 또는 플루오로중합체 이형 코팅과 같은 방출 코팅과 함께 제공될 수 있다.
한 실시형태에서, 상처 드레싱은 미생물-불투과성 용기 속에서 멸균되고 포장된다.
키트(kit):
특정의 실시형태에서, 개시된 기술은 하나의 또는 별도의 구획 내에 임의로 부형제, 담체 또는 오일과 함께 화학식 I의 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 또한 추가의 성분, 예를 들어 겔화제, 연화제, 표면활성제, 습윤제, 점도 향상제, 유화제 등을 하나 이상의 구획 내에 포함한다. 키트는 임의로 상처, 예를 들어 만성 또는 감염된 상처를 진단, 검출 또는 치료하기 위한 물품을 제형화하는 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 상처의 치료시 개별적으로 또는 함께 성분을 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
관련 실시형태에서, 개시된 기술은 패키지 및 상술한 조성물을 포함하는 적어도 하나의 흡수성 물품(상술한 바와 같음)을 포함하는 키트를 포함한다. 또한, 키트는 임의로 포장 내에 또는 포장과 함께 사용 가능한 제2 정보와 함께 개개의 성분을 별도로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 다른 실시형태는 상처의 치료를 위한 드레싱의 제조용 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상처는 만성 상처, 예를 들어 정맥 궤양, 와위 궤양(decubitis ulcer) 및 당뇨병성 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된 상처이다.
표면:
개시된 기술의 실시형태는 또한 상술한 화학식 I의 화합물을 포함하는 표면을 제공하며, 여기서 리포터(reporter) 또는 펩타이드가 배향되어 파트너(partner), 예를 들어 효소에 대한 결합을 허용한다. 바람직하게는, 표면은 고체 지지체의 표면이다. 다수의 다양한 고체 지지체는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 유용한 고체 지지체는 한천, 아가로즈, 가교 결합된 알긴산, 특히 질산 및 카복실산과 치환된 알긴산, 및 가교 결합된 구아 검, 셀룰로오스 에스테르, 혼합된 셀룰로오스 에스테르, 및 셀룰로오스 에테르와 같은 천연 중합체 탄수화물 및 이들의 합성적으로 개질되거나, 가교 결합되거나 치환된 유도체; 가교결합되거나 개질된 젤라틴을 포함하는 단백질 및 유도체와 같은 질소 함유 천연 중합체; 라텍스 및 고무와 같은 천연 탄수화물 중합체; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐아세테이트 및 이의 부분적으로 가수분해된 유도체, 폴리아크릴 아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드와 같은 다른 중축합물, 및 폴리우레탄 또는 폴리에폭시드와 같은 다른 중합체의 공중합체 및 테르중합체를 포함하는, 비닐 중합체와 같은 적합한 다공성 구조로 제조될 수 있는 합성 중합체; 황화바륨, 황화칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 및 마그네슘의 설페이트 또는 카보네이트, 알칼리 및 알칼리 토금속, 알루미늄 및 마그네슘의 실리케이트; 및 점토, 알루미나, 활석, 카올린, 제올라이트, 실리카 겔, 또는 유리와 같은 알루미늄 또는 규소 산화물 또는 수화물(이들 물질은 상기 중합체 물질과 함께 필터로서 사용될 수 있음); 및 기존의 천연 중합체 위에 합성 중합체의 중합을 개시함으로써 수득된 그래프트 공중합체와 같은 상기 부류의 혼합물 또는 공중합체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 지지체는 배열 플레이트의 웰(well), 예컨대, 미세배열이다. 이러한 배열을 구축하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌{Cao et al., Appl Environ Microbiol., 77(23): 8219-8225, 2011}). 각각의 화학식 I의 화합물(또는 펩타이드 지표 단독)은 3회 스폿팅(spotting)되어 배열내 물리적 결함으로 인한 불규칙적인 데이타를 제거할 수 있다.
시스템:
개시된 기술의 실시형태는 상술한 조성물 및/또는 키트를 포함하는 진단 시스템을 추가로 제공한다.
진단 시스템의 다양한 성분은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물 (예를 들어, 펩타이드 리포터를 함유하는 화합물)은 동결 건조된 시약으로서 제공될 수 있다. 이들 동결 건조된 시약은 동결 건조 이전에 예비 혼합에 의해 재구성되는 경우 이들은 검정 시 사용하도록 준비된 성분 각각의 적절한 비율을 갖는 완전한 혼합물을 형성한다. 또한, 개시된 기술의 진단 시스템은 키트의 시약을 재구성하기 위한 재구성 시약을 함유할 수 있다.
핵산
하나의 실시형태에서, 본원에는 하기 펩티드를 암호화하는 핵산이 포함된다:
XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6)(여기서, X, N1, N2, N3, N4, L 및 Z는 각각 위에서 정의한 바와 같음).
하나의 실시형태에서, 본원에는 하기 펩티드인 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)를 암호화하는 핵산이 포함되며, 여기서 X, y, U 및 Z는 각각 위에서 정의한 바와 같다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 문구는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 펩타이드 핵산(PNA) 또는 다른 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 대해 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈성 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA에 대한 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 임의의 단편을 또한 지칭한다. 이와 관련하여, "단편"은 길이가 약 10개 뉴클레오타이드보다 킨 핵산 서열을 지칭하며, 가장 바람직하게는 길이가 적어도 약 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 약 300개의 뉴클레오타이드이다.
본원에 개시된 실시형태는 또한 상술한 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이다.
하나의 실시형태에서, 예를 들면, 다음의 펩타이드를 암호화하는 핵산에 대해 동일성 비율(% identity)이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로는 이러한 서열로 이루어진 상술한 핵산의 변이체가 본원에 포함된다: XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6)(여기서 X, N1, N2, N3, N4, L 및 Z는 각각 위에서 기술한 바와 같음).
하나의 양태에서, 본원에는 하기 펩타이드 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)를 암호화하는 핵산에 대해, 예를 들어 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 동일성 비율을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 대안적으로는 이러한 서열로 이루어진 상술한 핵산의 변이체가 포함되며, 여기서 X, y, U 및 Z는 각각 위에서 기술한 바와 같다.
당해 기술분야의 숙련가는 통상의 소프트웨어, 예를 들어 Three-to-One Sequence Manipulation Suite(이는 각각의 투입된 폴리펩타이드 서열에 대해 3개의 잠재적인 핵산 서열을 생성함)를 사용하여 암호화 핵산 서열에 도달할 수 있다. Three-to-One 소프트웨어는 bioinformatics. org로부터 자유로이 이용 가능하다.
"동일성 비율" 또는 "동일성 %"란 문구는 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열의 비교시 발견되는 서열 유사성의 비율(%)을 지칭한다. 동일성 비율은, 예를 들어 MEGALIGN 프로그램(LASERGENE 소프트웨어 패키지, DNASTAR)를 사용함으로써 전자적으로 측정할 수 있다. MEGALIGN 프로그램은 상이한 방법, 예를 들어 클러스터 방법(Clustal Method)(문헌 {Higgins et al., Gene 73: 237-244, 1988})에 따라 2개 이상의 서열 사이의 정렬을 생성한다. 클러스터 알고리즘 그룹은 모든 쌍들 사이의 거리를 실험함으로써 클러스터내로 서열화한다. 클러스터는 쌍 형태로 정렬한 후 그룹 내에 정렬한다. 2개의 아미노산 서열, 예를 들어 서열 A와 서열 B 사이의 유사성 비율은 서열 A의 길이에서 서열 A내 갭 잔기(gap residue)의 수를 감하고, 서열 B 내 갭의 수를 감하고, 서열 A와 서열 B 사이의 잔기 일치의 합으로 나누어, 100을 곱해 계산한다. 2개의 아미노산 서열 사이에 상동성이 낮거나 없는 갭은 유사성 비율을 측정하는데 포함되지 않는다. 핵산 서열 사이의 동일성 비율은 또한 클러스터 방법 또는 조턴 하인법(Jotun Hein Method)(예를 들어, 문헌{Hein et al. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645} 참고)과 같은 다른 방법으로 계산할 수 있다. 서열 사이의 동일성은 또한 당해 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해, 예를 들어 하이브리드화 조건을 변경함으로서 측정할 수 있다.
다른 실시형태에서, 엄격한 하이브리드화 조건 또는 보다 낮은 엄격성 조건 하에 하나 이상의 핵산으로 하이브리드화하는 변이체 폴리뉴클레오타이드가 본원에 포함된다. 본원에 사용된 용어로서 "하이브리드화"는 핵산의 가닥을 염기쌍 형성을 통해 상보성 가닥과 결합시키는 임의의 방법을 또한 지칭한다. 예를 들어, 고도의 엄격성 조건 하에서의 하이브리드화는 약 37℃ 내지 42℃에서 약 50% 포름아미드 중에서 일어날 수 있다. 하이브리드화는 약 30℃에서 약 35% 내지 25% 포름아미드 속의 감소된 엄격성 조건 하에 일어날 수 있다. 특히, 하이브리드화는 50% 포름아미드, 5 x SSPE, 0.3% SDS, 및 200 μg/ml의 절단되고및 변형된 연어 정자 DNA에서 42℃에서 고도의 엄격성 조건 하에 일어날 수 있다. 하이브리드화는 상술한 바와 같이 감소된 엄격성 조건 하에, 그러나 35℃의 감소된 온도에서 35% 포름아미드에서 일어날 수 있다. 특수한 수준의 엄격성에 상응하는 온도 범위는 또한 목적하는 핵산의 퓨린 대 피리미딘 비를 계산하고 상응하는 온도를 조절함으로써 추가로 좁힐 수 있다. 상기 범위 및 조건에서의 변화는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "하이브리드화 복합체"란 용어는 상보성 염기 사이에 수소 결합의 형성으로 인해 2개의 핵산 서열 사이에 형성된 복합체를 지칭한다. 하이브리드화 복합체는 용액에서 형성되거나 용액에 존재하는 하나의 핵산과 고체 지지체(예를 들어, 종이, 막, 필터, 칩(chip), 핀 또는 유리 슬라이드, 또는 이에 대해 세포 또는 이들의 핵산이 고정된 어떠한 다른 적절한 기판) 상에 고정된 다른 핵산 서열 사이에 형성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에는 상기 핵산의 폴리 누클레오티드 단편인 변이체가 포함된다.
또한, 하나 이상의 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 PCR 프라이머(primer)가 본원에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 적어도 약 6개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 20개 내지 25개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 지칭하며, 이는 PCR 증폭에서 또는 하이브리드화 검정 또는 미세배열에서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 이들 용어가 당해 분야에서 일반적으로 정의하는 바와 같은 "앰플리콘", "프라이머", "올리고머" 및 "탐침"이란 용어와 실질적으로 동일하다.
본원에는 PNA와 같은 변형된 핵산이 또한 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드 핵산(PNA)"은 리신을 암호화하는 아미노산 잔기이 펩타이드 골격에 연결된 길이가 적어도 약 5개인 뉴클레오타이드로서 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 분자 또는 항-유전자제(anti-gene agent)를 지칭한다. 말단 리신은 조성물에 가용성을 부여한다. PNA는 우선적으로 상보성 단일 가닥 DNA 및 RNA에 결합하여 전사체 연장을 중단시키며, 페길화하여 세포내에서 이의 수명을 연장시킬 수 있다(예를 들어, 문헌{Nielsen, P. E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8: 53-63} 참고).
벡터
본원에는 하나 이상의 상술한 핵산을 함유하는 벡터가 포함된다. 하나의 실시형태에서, 벡터는 핵산, 예를 들어 XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음); 또는 이의 효소-개열 가능한 단편 및/또는 이의 면역원성 단편에 대한 폴리펩티드 서열을 하나 이상의 추가의 서열과 작동가능한 연결로 암호화하는 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 단백질를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동적으로 회합된" 또는 "작동적으로 연결된"이란 용어는 기능적으로 연관된 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 이러한 프로모터가 암호화된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는 경우 암호화된 서열과 작동적으로 회합되거나 작동적으로 연결되는 것으로 지칭된다. 작동적으로 회합된 또는 작동적으로 연결된 핵산 서열은 연속성일 수 있으며, 판독 프레임 내에서, 특정의 게놈성 요소, 예를 들어 리포터 유전자는 암호하된 폴리펩타이드에 연속적으로 연결되지 않짐나, 여전히 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 오퍼레이터 서열에 결합한다.
코돈 최적화된 서열
상술한 핵산 서열 및 벡터의 코돈 최적화된 서열이 본원에 포함된다. 숙주 세포, 예를 들어 대장균(E. coli) 또는 곤충 Hi5 세포와 같은 숙주 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화는 Integrated DNA Technologies, Inc.(아이오와주 코랄빌 소재)로부터의 용이하게 이용 가능한 코돈 최적화 도구(Codon Optimization Tool)( CodonOpt)를 사용하여 통상적으로 수행할 수 있다.
숙주 세포
상술한 핵산 서열 및 벡터를 함유하는 숙주 세포가 본원에 포함된다. 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 표준 배양 조건 하에 벡터 내에 함유된 유전자 서열을 재조합적으로 발현하여 폴리펩타이드 생성물, 예를 들어 XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음); 또는 이의 효소-개열 가능한 단편 및/또는 이의 면역원성 단편에 대한 폴리펩티드 서열을 생성할 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 대장균이다.
폴리펩타이드
하나의 실시형태에서, 본원에는 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다: XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음).
다른 실시형태에서, 예를 들어 하기 폴리펩티드 서열, 즉 XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음)에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 대안적으로는 이러한 서열로 이루어진 상술한 폴리펩티드의 변이체가 본원에 포함된다. 특히, 단편은 본원에 개시된 효소, 예를 들어 라이소자임, 엘라스타아제, 카텝신 G, MAO, 프로테이나아제 3C 또는 이의 조합에 대한 효소 인식 부위(R)에 대한 최소의 구조적 모티프를 포함한다. 대안적이고 부가적으로는, 단편 펩타이드는 항체 또는 이의 항원 결합 도메인에 의해 인식될 수 있는 면역원성 분자이다.
동족체
다른 실시형태에서, 상술한 펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 대한 동족체가 본원에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "동족체"란 용어는 상동성 정도를 지칭한다. 부분 상동성 또는 완전한 상동성이 존재할 수 있다. "동일성"이란 용어는 "상동성"이란 용어로 대체될 수 있다. 표적 핵산에 대한 하이브리드화로부터 동일한 서열을 적어도 부분적으로 억제하는 부분적으로 상보성인 서열은 "실질적으로 상동성"으로 지칭된다. 표적 서열에 대해 완전히 상보성인 서열의 하이브리드화의 억제는 감소된 엄격성 조건 하에서 하이브리드화 검정(서던(Sourthern) 또는 노던 블롯(Northern blot), 용액 하이브리드화 등)을 사용하여 실험할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 하이브리드화 탐침은 감소된 엄격성 조건 하에서 표적 서열에 대해 완전히 상동성인 서열에 대해 경쟁하고 이와 결합할 것이다. 이는 감소된 엄격성 조건이 서로에 대해 2개의 서열의 결합이 특이적인(즉, 선택적인) 상호작용임을 필요로 하므로, 감소된 엄격성의 조건은 비-특이적인 결합이 허용됨을 말하지는 않는다. 비-특이적인 결합의 부재는 심지어 부분적인 정도의 상보성(예를 들어, 약 30% 미만의 상동성 또는 동일성)을 결여한 제2의 표적 서열의 사용에 의해 시험될 수 있다. 비-특이적인 결합의 부재하에서, 실질적으로 상동성인 서열 또는 탐침은 제2의 비-상보성 표적 서열에 하이브리드화하지 않을 것이다.
돌연변이체
다른 실시형태에서, XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음); 또는 이의 효소-절단 가능한 단편에 대한 코어 폴리펩타이드 서열내 돌연변이를 포함하는 변이체 펩타이드가 본원에 포함된다.
하나의 실시형태에서, 돌연변이는 1 내지 3개의 아미노산의 치환, 결실, 첨가이다. 바람직하게는, 돌연변이는 이렇게 형성된 돌연변이체 펩타이드 내의 효소 인식 부위를 변화시키지 않는다. 돌연변이가 인식 부위 또는 절단 부위의 조성에 있어서의 변화를 야기하는 경우, 이러한 돌연변이는 보존된 아미노산 치환에 기인한 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, "삽입" 또는 "첨가"란 용어는는 천연적으로 발생하는 분자에서 발견된 서열에 대해 각각 하나 이상의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드의 첨가를 생성하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 내의 변화를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "치환"은 상이한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 각각에 의한 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 대체를 지칭한다.
항체
본원에 개시된 실시형태는 하나 이상의 상술한 면역원성 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합한다: XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음). 또 다른 실시형태에서, 항체는 이들 폴리펩타이드 단편에 결합한다. 이러한 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어 합성적으로 생성된 항체(예를 들어, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여)를 포함하는 F(ab) 도메인, F(ab)2 도메인, scFv 도메인이 본원에 고려된다.
하나의 실시형태에서, 항체는 XyAAPXy-Z(서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, y, N1-N4, L, Z 및 U는 앞서 개시되어 있음); 또는 이의 효소-절단 가능한 단편 및/또는 이의 면역원성 단편에 대한 폴리펩타이드 서열에 결합한다. 이러한 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어 합성적으로 생성된 항체(예를 들어, 파아지 디스플레이 기술을 사용함)를 포함하는 F(ab) 도메인, F(ab)2 도메인, scFv 도메인이 본원에 고려된다.
정제된 분자
이의 접합체를 포함하는, 정제된 생물분자, 예를 드렁 핵산, 단백질, 펩타이드 및/또는 항체 분자가 본원에 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된"이란 용어는 이들의 천연 환경으로부터 제거되고 단리되거나 분리되며, 이들이 천연적으로 회합된 다른 성분으로부터 적어도 약 60% 유리되고, 바람직하게는 약 75% 유리되며, 가장 바람직하게는 약 90% 유리된 핵산, 아미노산 또는 항체를 지칭한다.
본원에 기술된 실시형태에서, 생물분자는 화학적 실체, 예를 들어 앵커 영역 및/또는 지표 영역의 다양한 요소와 조합시킴으로써 변경될 수 있어, 이들의 형태 및/또는 기능성이 어떠한 천연 대응물과 비교하여 유의적으로 변경되도록 할 수 있다.
화학식 I의 화합물의 제조 방법:
본원에 제공된 실시형태는 화학식 I의 화합물(이의 전구체를 포함함)에 관한 것이다. "전구체"란 용어는 중간 또는 최종 생성물을 생성하기 위한 반응물로서 사용되는 임의의 화합물도 포함한다.
하나의 실시형태에서, 구조 A-R-I(여기서, A는 상기 기술한 바와 같은 앵커이고, I는 상기 기술한 바와 같은 지표임)의 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 본원에 제공되며, 이때 상기 방법은, 예를 들어 공유 결합을 통해 앵커를 지표 분자와 접합시키는단계를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 앵커 또는 지표는 상처 특이적 마커, 예를 들어 하이드롤라아제와 같은 상처 특이적 효소, 보다 구체적으로 앞서 기술한 바와 같은 프로테아제 또는 글리코시다아제에 대한 인식 부위(R)를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상처 특이적 마커에 대한 기질은, 예를 들어 가수분해 가능한 기질, 예를 들어 아미노산, 당, 펩타이드, 다당류, 핵산, 지질, 락탐 또는 이의 조합을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 앵커는 펩타이드 연결, 글리코시드 연결, 아미드 연결, 에스테르 연결, 에테르 연결, 무수물 연결 또는 유사한 연결을 통해 수용체 분자에 접합된다. 본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드 결합"은 2개의 아미노산 사이의 축합 반응에 의해 형성되며, 여기서 하나의 산 잔기는 다른 잔기의 아미노 잔기와 반응하여 2개의 아미노산 사이에 펩타이드 결합(-CO-NH-)을 생성한다. 하나의 실시형태에서, 펩타이드 결합은 상처 특이적 프로테아제, 예를 들어 엘라스타제, 카텝신 G, 프로테이나아제 C 또는 MAO, 또는 이의 조합에 의해 개열된다. 본원에 사용된 바와 같이, "글리코시드 결합"은 이당류(또는 이당류로부터 유도된 분자)의 헤미아세탈 또는 헤미케탈기와 알코올과 같은 일부 화합물의 하이드록실기 사이에 형성된다. 하나의 실시형태에서, 펩타이드 결합은 상처 특이적 글리코시다아제, 예를 들어 라이소자임에 의해 개열된다. 락탐 결합은 아미드와 락톤 사이에 형성되며, 다수의 항생제의 코어 구조에서 발견된다. 하나의 실시형태에서, 락탐 결합은 베타-락타마아제에 의해 개열된다.
반응성 잔기를 접합시켜 글리코시드, 펩타이드, 에스테르, 옥시에스테르, 아미드, 아미도, 옥시아미도, 에테르, 설포닐, 설피닐, 설폰아미드 또는 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노 등과 같은 다른 연결을 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 실시예에서 추가로 기술된다.
다른 실시형태에서, 구조식 A-I(여기서, A 및 I는 각각 앞서 기술한 바와 같음)를 포함하는 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 본원에 제공된다.
하나의 실시형태에서, A는 글리코시드 연결또는 펩타이드 결합을 통해 I에 접합된다.
다른 실시형태에서, A는 친수성 또는 소수성 연결을 통해 I에 접합된다.
하나의 실시형태에서, 구조식 A-I를 갖는 화학식 I의 화합물은 먼저 앵커 영역 A를 지표 영역 I와 접합시켜 화학식 I의 화합물을 생성함으로써 합성된다.
다른 실시형태에서, 지표는 먼저 합성 재조합 기술을 통해, 예를 들어 적합한 숙주 세포 내에서 지표 영역을 암호화하는 핵산을 발현시키고, 지표를 앵커 영역과 결합시킴으로써 합성된다. 이러한 실시형태에서, 일례로 지표 영역은 앵커 영역에 친수성으로 또는 소수성으로 결합하는 핵산 서열을 함유하도록 설계된다. 친수성 상호작용의 한 가지 대표적인 예는 극성 그룹, 예를 들어 지표 분자에서 극성 아미노산과 상호작용하는 부분적으로 카복실화된 당 또는 펩티도글리칸을 함유하는 앵커의 사용을 포함한다. 소수성 상호작용의 다른 대표적인 예는 극성 기, 예를 들어 지표 분자에서 소수성 아미노산 잔기와 상호작용하는 아미드화 도는 에스테르화된 측쇄(또는 이의 유도체)를 함유하는 앵커의 사용을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 펩타이드 지표, 예를 들어 하기 아미노산 서열: XyAAPXy-Z(서열 번호: 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호: 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호: 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호: 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호: 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호: 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, N1, N2, N3, N4, L 및 Z는 앞서 개시되어 있음) 을 포함하는 폴리펩타이드(변이체 폴리펩타이드를 포함함)는 숙주-세포 발현 시스템을 통해 합성될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 하나 이상의 상술한 폴리펩타이드 또는 변이체를 암호화하는 작제물을 생성시키는 단계, 이러한 작제물을 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바큘로바이러스 벡터 내에 위치시키는 단계, 숙주 세포, 예를들어 대장균 또는 곤충 Hi5 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계; 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하여 상기 벡터의 발현을 허용하는 단계, 및 임의적으로는 배양물로부터 발현된 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 펩타이드 지표, 예를 들어 하기 아미노산 서열: XyAAPXy-Z(서열 번호: 1), XyAAPXy-L-Z(서열 번호: 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z(서열 번호: 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z(서열 번호: 4); XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호: 5) 또는 XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호: 6) 또는 XyUUUUy-Z(서열 번호 7)(여기서, X, N1, N2, N3, N4, L 및 Z는 앞서 개시되어 있음)을 포함하는 폴리펩타이드(변이체 폴리펩타이드를 포함함)는 고상 펩타이드 합성을 사용하여 합성할 수 있다(문헌{Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154} 참고).
더욱이, 구조식 A-R-1를 갖는 화학식 I의 화합물은 단일 반응 챔버 또는 다중 반응 챔버 속에서 합성할 수 있다.
진단 및 치료 방법:
하나의 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물, 드레싱 물질, 물품, 키트 및 시스템은 상처, 특히 만성 또는 감염된 상처를 진단하거나 치료하는데 유용하다. 임의의 유형의 상처도 진단하고/치료할 수 있지만, 실시형태는 특히 삼출되는 상처 유액을 진단하고 치료하는데 적합하다. 예를 들어, 상처는 만성 또는 급성 상처일 수 있다. 만성 상처의 대표적인 예는, 예를 들어 정맥 궤양, 욕창, 와위 궤양, 당뇨병성 궤양 및 알려지지 않은 병인학의 만성 궤양을 포함한다. 급성 상처의 대표적인 예는 의도된 수술적 절개로부터 생성되는 급성 외상성 열상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "상처 유액"이란 용어는 상처의 표면에 존재하거나, 흡입, 흡수 또는 세척에 의해 상처 표면으로부터 제거된 다른 유액(적절하게는 실질적으로 혈액을 포함하지 않음), 임의의 상처 삼출액 또는 다른 유액(적절하게는 실질적으로 혈액을 포함하지 않음)을 지칭할 수 있다. 결정, 측정 또는 정량화는 환자의 신체로부터 제거된 상처 유액에서 적절하게 수행되지만, 상체 유액 자체 내에서도 수행될 수 있다. "상처 유액"이란 용어는 포유류 상처 유액, 적절하게는 인간 상처 유액이다.
하나의 실시형태에서, 진단 방법은 상처를 본원에 기술된 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 적어도 하나의 조성물, 이러한 화합물을 포함하는 드레싱 물질, 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 물품, 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 키트, 또는 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 시스템과 접촉시키는 단계; 및 상처와 관련된 매개변수를 측정하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 측정되는 매개변수는 상처 특이적 하이드롤라아제의 수준 또는 활성이다. 특히, 측정되는 매개변수는 하이드롤라아제의 활성이다.
상술한 실시형태에서, 측정은 원 위치 또는 현장 외에서 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "원 위치"란 용어는 주변 환경, 예를 들어 조성물, 물품, 시스템 또는 장치가 접촉하는 생물학적 물질을 포함하는, 시스템 또는 장치와 관련하여 존재하거나 나타나는 공정, 현상, 대상 또는 성분을 지칭한다. 일례로서, 원 위치 반응은 인간 피부 조직(예를 들어, 효소를 함유하는 상처 삼출물)에 의해 제공된 성분을 포함하는, 장치(예를 들어, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물) 내속에 존재하는 다양한 성분의 반응을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 환경의 외부를 지칭하는 현장 외와는 대조적이다.
제2 실시형태에서, 측정은 현장 외, 예를 들어 개시된 기술의 기구 또는 장치 속에서 분석을 위한 상처로부터 유액을 제거함으로써 수행한다.
적합하게는, 측정은 현장 외 에서 수행된다.
하나의 진단 실시형태에서, 상기 방법은 리포터, 예를 들어 상처 특이적 효소에 의해 작용하는 기질의 생성물의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 하이드롤라아제 효소 생성물의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "측정하기"란 용어는 상기 하이드롤라아제의 활성 또는 수준의 수치를 측정하는 단계; 활성 또는 수준이 소정의 범위보다 높거나 작은지를 확립하는 단계; 및/또는활성 또는 수준의 수치를 대조군 표준과 비교하는 단계를 포함한다. 대조군 표준은 상처가 없는 부위로부터 또는 건강한 개체로부터 수득된 생검 물질 내의 하이드롤라아제의 수준 또는 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 실시형태에서, "측정하기"란 용어는 리파아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 옥시다아제, 글리코시다아제, 글루쿠로니다아제, 글루코시다아제, 갈락토시다아제, 냅신(아스파틸 프로테아제), 글루코실세라미다아제 글루쿠로니다아제, 팔미토일 단백질 티오에스테라아제, 카텝신A, B, D, G, L, S, Z; 산 세라미다아제, 락토페린(LF), 리소자임, 마이엘로퍼옥시다아제(MPO), 엘라스타아제, 카텝신 및 프로테이나아제-3 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 상처 특이적 효소의 매개변수(예를 들어, 활성 또는 수준)을 측정하는 단계; 상기 매개변수가 제1의 소정의 역치(threshold)를 초과하는지를 확립하는 단계; 및/또는 매개변수의 수치를 대조군 표준과 비교하는 단계를 포함한다. 대조군 표준은 상처가 없는 부위로부터 또는 건강한 개체로부터 수득된 생검 물질 내에서 프로테아제의 매개변수를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 관련 실시형태에서, "결정하기"란 용어는 복수의 상술한 프로테아제와 관련된 매개변수의 가중 평균(가중 합)이 상기 가중 평균의 소정의 역치값을 초과하는지의 여부를 확립하는 단계를 포함한다.
하나의 특수한 실시형태에서, 매개변수는 상처 유액 속에서의 분석물(예를 들어, 프로테아제)의 활성 수준이다. 전형적으로, 개개 분석물의 활성은 단위/mL라는 용어로 나타낸다.
다른 실시형태에서, 매개변수는 상처 유액 속에서 분석물(예를 들어, 프로테아제)의 수준이다. 전형적으로, 양이란 용어는 또한 특수한 분석물의 활성의 지표이다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "조합된 양" 또는 "조합된 활성"은 복수의 값, 예를 들어 개개 분석물의 수에 대해 수득된 양에 대한 수학적 함수의 적용으로부터 수득한 단일 수치를 지칭한다. 예를 들어, "조합된 양" 또는 "조합된 활성"이란 용어는 개개 값의 그룹의 합 또는 곱을 지칭한다. 전형적으로, "조합된 양" 또는 "조합된 활성"이란 용어는 개개 값의 그룹의 합에 관한 것이다. 예를 들어, 적절한 실시형태에서, 엘라스타제의 양은 엘라스타제 유사 활성(예를 들어, U/mL)을 지칭하며, 메탈로프로테이나제(MMP)이 양은 각각의 분석물의 총 농도(예를 들어, ng/mL)를 지칭한다.
본원에 사용된 경우, "정량화"란 용어는 실험 오차의 한계 범위 내에서 샘플 중의 특수한 분석물(들) 또는 기질(들)의 절대값을 측정하는 것을 지칭한다.
"마커" 또는 "분석물"이란 용어는 본원에 정의된 기구, 장치, 키트 또는 방법을 사용하여 확인하거나 측정하는 임의의 화학적 실체를 지칭한다. 개시된 기술의 기구, 장치, 키트 또는 방법에 의해 측정되거나 확인된 마커 또는 분석물은 상술된 효소의 개열 생성물이다.
본원에 사용된 경우, "소정의 범위"란 용어는 숙련가가 이해할 수 있는 데이타 범위 또는 프로파일이 환자의 특정 소부류의 지표임을 지칭한다. 예를 들어, 소정의 범위는 항생체 요법과 같은 특정 상처 치료에 대해 잘 반응할 수 있는 상처의 대표적인 데이타 범위 또는 프로파일일 수 있다. 또한, 소정의 범위는 항생제 요법과 같은 특정 상처 치료에 대해 잘 반응하지 않을 수 있는 상처의 대표적인 데이타 범위를 적합하게 지칭한다.
본원에 사용되는 경우, "소정의 역치"란 용어는 숙련가가 이해하는 최소 수준이, 예를 들어 상기 추가로 설명된 바와 같이, 공지의 치유 및 치유되지 않은 상처에 대해 측정된 값의 통계적 분석을 기반으로 한 치유되지 않은 상처의 지표이다. 시험이 임상적으로 유용하게 되기 위해서는, 역치를 적절한 수준으로 설정함으로써 높은 프로테아제 활성으로 치유되지 않는 상처를 정확하게 확인하여야 한다. 역치의 증가는 역치를 넘는 치유되지 않은 상처만의 기회를 증가시킬 것이다. 그러나, 역치가 너무 높은 경우, 높은 수준의 프로테아제로 인해 치유되지 않은 상처가 확인되지 않을 수 있고, 임상적으로 이는 이들이 필요한 프로테아제 조절 치료를 수용하지 않을 수 있음을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우, "대조군 표준" 또는 "대조군"이란 용어는 다른 데이타 점 또는 데이타 세트를 정의하거나 표준화하기 위하여 참고 또는 비교로서 사용될 수 있는 데이타 세트 또는 프로파일을 지칭한다. 예를 들어, "대조군" 또는 "대조군 표준"이란 용어는 특히 환자의 소부류의 지표인 데이타 세트 또는 프로파일일 수 있다. 적절하게는, 대조군 표준은 치유 또는 비치유 상태에 대한 데이타 세트 또는 프로파일 지표일 수 있다.
적절하게는, 개시된 기술의 기타 양태 또는 실시형태에서, "대조군" 또는 "대조군 표준"은 상처가 항생제 요법과 같은 상처 치료에 대해 반응성이거나 비반응성인 경향이 있는지의 여부를 숙련가가 측정하도록 하는 비교 도구로서 사용될 수 있는 데이타 세트 또는 프로파일일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 대조군 표준은 상처 치료에 대해 잘 반응하지 않는 환자에 대한 데이타 세트 또는 프로파일 지표이다. 전형적으로, 대조군 표준은 상처 치료에 대해 잘 반응하는 환자에 대한 데이타 세트 또는 프로파일 지표이다. 본원에 개시된 바와 같이 상처 치료에 잘 반응하는 경향이 있는 환자는 치료에 대해 잘 반응하지 않는 경향이 있는 환자보다 낮은 하이드롤라아제의 조합된 양 또는 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, 상처 치료에 대해 잘 반응하는 경향이 있는 환자는 적어도 하나의 상처 특이적 하이드롤라아제의 보다 적은 조합된 양을 나타낸다.
일 실시형태에서, 예를 들어 약 6 U/mL, 약 7 U/mL, 약 8 U/mL, 약 9 U/mL, 약 10 U/mL, 약 11 U/mL, 약 12 U/mL, 약 13 U/mL, 약 14 U/mL, 약 15 U/mL, 약 16 U/mL, 약 17 U/mL, 약 18 U/mL, 약 19 U/mL, 약 20 U/mL, 약 21 U/mL, 약 22 U/mL, 약 23 U/mL, 약 24 U/mL, 약 25 U/mL 이상 및 이들 사이의 모든 값을 포함하는, 약 5 U/mL 내지 약 30 U/mL의 인간 호중구 엘라스타제의 역치 활성은 만성 상처 감염을 나타낸다.
하나의 구체적인 실시형태에서, 적어도 9.6의 사람 호중구 엘라스타제의 역치 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 적어도 22.9 U/mL의 사람 호중구 엘라스타제의 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
일 실시형태에서, 예를 들어 약 1100 U/mL, 약 1200 U/mL, 약 1300 U/mL, 약 1400 U/mL, 약 1500 U/mL, 약 1600 U/mL, 약 1700 U/mL, 약 1800 U/mL, 약 1900 U/mL, 약 2000 U/mL, 약 2100 U/mL, 약 2200 U/mL, 약 2300 U/mL, 약 2400 U/mL, 약 2500 U/mL, 약 2600 U/mL, 약 2700 U/mL, 약 2800 U/mL, 약 2900 U/mL, 약 3000 U/mL, 약 3250 U/mL, 약 3500 U/mL, 약 3750 U/mL, 약 4000 U/mL, 약 4250 U/mL, 약 4500 U/mL, 약 4750 U/mL, 약 5000 U/mL, 약 5250 U/mL, 약 5500 U/mL, 약 5750 U/mL, 약 6000 U/mL 이상 및 그 사이의 모든 값을 포함하는, 약 1000 U/mL 내지 약 10000 U/mL의 라이소자임의 역치 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 적어도 4800 U/mL의 라이소자임의 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
일 실시형태에서, 예를 들어 약 15 U/mL, 약 20 U/mL, 약 25 U/mL, 약 30 U/mL, 약 35 U/mL, 약 40 U/mL, 약 45 U/mL, 약 50 U/mL, 약 55 U/mL, 약 60 U/mL, 약 65 U/mL, 약 70 U/mL, 약 75 U/mL, 약 80 U/mL, 약 85 U/mL, 약 90 U/mL, 약 95 U/mL, 약 100 U/mL, 약 110 U/mL, 약 120 U/mL 이상 및 그 사이의 모든 값을 포함하는, 약 10 U/mL 내지 약 100 U/mL의 카텝신 G의 역치 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 적어도 50 U/mL, 적어도 40 U/mL, 적어도 30 U/mL, 적어도 20 U/mL, 적어도 15 U/mL 또는 적어도 10 U/mL의 카텝신 G의 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
본원에 또한 개시된 실시형태는 본원에 개시된 조성물, 물질, 물품, 드레싱, 키트 및/또는 시스템을 사용하여 만성 또는 감염된 상처의 치료에 관한 것이다. 치료용 실시형태는 개시된 기술의 조성물, 물질, 물품, 드레싱, 키트, 시스템 또는 장치를 이를 필요로 하는 개체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 개체가 치료에 대해 반응하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
숙련가는 상처가 치료에 대해 반응성인지 아닌지를 용이하게 확인할 수 있다. 특히, 숙련가는 상처 치료, 특히 산화된 셀룰로오스를 포함하는 상처 드레싱을 사용하는 치료에 대해 우수한 반응 또는 불량한 반응의 예측 또는 지표인 본 청구범위에서 확인된 프로테아제의 수준을 용이하게 결정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "반응성" 및 "반응인자(들)"란 용어는 상처 치료, 특히 약학적 제제, 예를 들어 항생제를 사용한 치료에 대해 잘 반응하는 것으로 고려되는 상처를 지칭한다. 유사하게는, "비반응성" 및 "비반응인자(들)"은 상처 치료, 특히 약학적 제제, 예를 들어 항생제를 사용한 치료에 대해 잘 반응하는 것으로 고려되지 않은 상처를 지칭한다. 예를 들어, 상처 치료 4주 후 50% 초과의 상처 봉합을 나타내는 환자는 상기 치료에 대해 반응성인 것으로 고려된다.
특정의 실시형태에서, 환자는 본원에 개시된 조성물, 물품, 시스템 또는 장치에 의해 동시에 진단되고 치료될 수 있다. 본원에 사용된 경우, "동시"란 용어는 명시된 목적, 예를 들어 진단 및 치료를 함께 수행한다는 것을 의미한다.
특정의 실시형태에서, 환자는 본원에 개시된 조성물, 물품, 시스템 또는 장치에 의해 순차적으로 진단되고 치료될 수 있다. 본원에 사용된 경우, "순차적으로"란 용어는 명시된 목적, 예를들어 진단 및 치료가 일시적 또는 공간적으로 분리된다는 것을 의미하며, 예를 들어 치료 전 진단 또는 치료 후 진단 또는 이의 조합, 예를 들어 1번째 진단 ==> 치료 ==>2번째 진단을 의미한다.
본원에 개시된 실시형태는 또한 보호자 또는 환자가 상처가 치유되지 않는 경향이 있는지를 신속하고 신뢰 가능하게 결정하고, 이러한 결정을 바탕으로 적절한 요법을 선택할 수 있도록 한다. 예를 들어, 치유되지 않는 상처는 특수 치료제를 포함하는 상처 드레싱과 같은 특수한 상처 트레싱을 적용하여 치유를 촉진하는 것을 요구할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 실시형태는 추가로 상처가 치유되는지 또는 치유되지 않는지를 결정하는 단계, 이어 치유되지 않는 경우 상처에 치료제를 포함하는 상처 드레싱을 적용시키는 단계를 포함하는, 상처, 예를 들어 만성 또는 감염된 상처의 치료 방법을 포함한다.
본원에 기술된 실시형태는 감염된 상처의 진단 또는 검출을 위한 방법 및 검정을 제공한다. 상기 방법은 세균 감염성 제제의 검출에 적합하다. 하나의 실시형태에서, 상처는 그람 음성 세균으로 감염된다. 대표적인 그람 음성 세균은 대장균, 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 헬리코박터(Helicobacter)와 같은 프로테오박테리아, 및 시아노박테리아(cyanobacteria)를 포함한다. 약제와 관련하여 분류하는 경우, 이들은 호흡계의 교란을 유발하는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 뇨 시스템의 교란을 유발하는 대장균 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 소화계의 교란을 유발하는 바실러스 가에르트너(Bacillus Gaertner) 및 나이세리아 메닝기?스(Neisseria meningitidis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 및 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)와 같은 미구균(micrococci)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 상처는 그람 양성 세균으로 감염된다. "그람 양성 세균"은 이의 세포 벽내에서 테이코산(예를 들어, 리포테이코산 및/또는 벽 테이코산), 또는 기능적으로 등가물인 당 중합체(예를 들어, 람모다당류, 테이코산, 아라비노갈락탄, 리포만난 및 리포아라비노만난)을 함유하는 세균 또는 세균들을 의미한다. 기능적으로 등가물인 당중합체의 비제한적 예는 문헌{Weidenmaier et al., Nature, 6: 276-287, 2008}에 개시되어 있다.
세균은 포유동물 숙주(예를 들어, 소, 쥐, 말, 영장류, 고양이, 개 및 사람 숙주)를 감염시키는 병원성 세균을 포함한다. 이러한 병원성 세균의 예는, 예를 들어 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 해모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 에스케리키아(Escherichia), 살로넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 비브리오(Vibrio) 또는 리스테리아(Listeria)와 같은 세균 종의 구성원을 포함한다. 사람 숙주에서 질환을 유발하는 일부 임상적으로 관련있는 병원성 세균의 예는 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보루스(Brucella aborus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 프시타키(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라콘마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 파에칼리스(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 대장균, 엔테로톡시게닉 에스케리키아 콜라이(enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC), 엔테로파토게닉 에스케리키아 콜라이(enteropathogenic Escherichia coli), 대장균 O157:H7, 프란키셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케챠 리키치(Rickettsia rickettsii), 살로넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파이피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미스(Staphylococcus epidermis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA), 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: VSA), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브릭 콜레라에(Vibrio cholerae) 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 실시형태에서, 감염성 세균은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 카르페넴 내성 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)(CR-크렙시엘라 아종(Klebsiella spp); CR-대장균) 및 나이세리아 고노세리아(Neisseria gonorrhoeae)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 감염성 세균은 다중 약물 내성 악시네토박터(Acinetobacter), 약물 내성 캄필로박터(Campylobacter), 광범위한 스펙트럼의 β-락타마제(ESBL) 생산 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 반코마이신 내성 엔테로코쿠스(enterococcus), 다중 약물 내성 슈도모나스 아에루기노사(pseudomonas aeruginosa), 약물 내성 비장티푸스 살모넬라(Salmonella), 약물 내성 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피(Salmonella enterica serovar Typhi), 약물 내성 시겔라, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 약물 내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 및 약물 내성 투베르쿨로시스(Tuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 감염성 세균은 반코마이신 내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로마이신 내성 그룹 A 스트렙토코쿠스, 클린다마이신 내성 그룹 B 스트렙토코쿠스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정의 실시형태에서, 만성 또는 감염된 상처는 숙주 개체에서 발견된다. 바람직하게는, 숙주는 포유류, 예를 들어 설치류, 사람, 가축 동물, 반려 동물, 또는 비사육 또는 야생 동물이다. 일 실시형태에서, 개체체는 설치류, 예를 들어 마우스, 랫트, 기니아 피그 등일 수 있다. 다른 실시형태에서, 개체는 가축 동물일 수 있다. 적합한 가축 동물의 비제한적 예는 돼지, 소, 말, 염소, 양, 라마 및 알파카(alpaca)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 개체는 반려 동물일 수 있다. 반려 동물의 비제한적 예는 개, 고양이, 토끼, 및 새와 같은 애완 동물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 개체는 동물원 동물일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "동물원 동물"은 동물원에서 찾아볼 수 있는 동물을 지칭한다. 이러한 동물은 비인간 영장류, 큰 고양이, 늑대 및 곰일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 개체는 사람이다.
하나의 양태에서, 포유류 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 개시된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처에 놓는 단계; (b) 포유류 상처와 접촉하는 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유류 상처와 접촉하는 상처 드레싱 물질 내의 리포터 분자의 농도의 정성적인 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 진단 및 치료는 원 위치에서 수행된다. 따라서, 본원에 개시된 실시형태는 용이하면서 비침입적인 방식으로 상처의 진단 및 치료를 가능케 한다. 예를 들어, 진단은 실시간으로 이루어질 수 있고, 치료는 감염된 상처 또는 환자에 (전신적으로) 적용될 수 있으며, 상처 치료의 진행은 실시간으로, 예를 들어 상처 치유로 인해 리포터 분자에 의해 생성된 신호의 소멸에 의해 모니터된다.
다른 양태에서, 화학적 실체를 사용하여 상처에서 프로테아제 활성을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 이때 상기 화학적 실체는 앵커 영역, 효소 불안정 또는 효소 반응성 영역 및 지표 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 MPO, 엘라스타제, 라이소자임, 포스포리파아제 및 카탈라제에 대한 기질을 고체 표면에 배치함로써 임의의 반응이 나안으로 볼 수 있도록 하는 단계를 모색한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 상처, 눈물, 유리체, CSF, 기도 흡인액 또는 객담, 활액, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 복강액, 사이질, 피하, 담즙, 장 또는 유사한 유액을 포함하는 다양한 체액을 기질을 함유하는 물질과 접촉시키고, 이후에 상기 기질의 변화를 평가함으로써 상기 체액을 평가하는 역할을 한다.
또 다른 양태에서, 본원에는 기도에서 감염을 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 특정 샘플링을 통해 또는 환기 장치와의 장기간 접촉을 통해 감염된 기관으로부터의 유체와 화학적 실체를 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시예
본원에 기재된 구조, 재료, 조성물 및 방법은 대표적인 실시예가 되도록 의도되었으며, 본 발명의 범위는 실시예의 범위에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 실시예 및 개시된 기술이 개시된 구조, 재료, 조성물 및 방법의 변형으로 실시될 수 있으며, 그러한 변형은 본 개시 내용의 범위 내로 간주된다는 것을 알 수 있을 것이다.
모든 이온 화합물은 최종 단계에 따라 다양한 상대 이온과 함께 염으로 취급되고 분리되었다.
　폴리-p-니트로페닐아크릴레이트의 "분자량"은 DMF에서 에탄올아민과의 반응 및 405 nm에서 1N NaOH에서 방출된 니트로페놀의 정량에 의한 가상 분자량으로 결정되었다. 가상 분자량 = 물질 g/반응 자리.
"H-RBB"는 암모니아와 레마졸 브릴리언트 블루 R®의 반응 생성물을 말하고 (실시예 29 참조), "RBB"는 각각 라디칼 종단, "H-"는 화합물 명칭에서 수소를 의미하고 히스티딘이 아니며; "정상 조건"은 실내 온도, 대기압, 습도 또는 산소에 대한 보호 수단이 없음을 의미한다. 펩타이드 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 합성되고; 모든 펩타이드는 한 문자 코드를 통해 기술되고; 그럼에도 불구하고 단일 문자는 헤테로 원자를 지칭할 수 도 있다. "CV"는 크리스탈 바이올렛의 유도체인 비스-(4-디메틸아미노페닐)-(4-[N-피페라지노]페닐)-카르베늄 이온을 의미한다.
실시예 1. Fmoc-AAPV-인독실 에스테르
Figure pct00006
Fmoc-AAPV-OH (43.47 g, 75.12 mmol) 및 CDI (14.62 g, 90.19 mmol)를 분말 깔때기를 통해 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 직접 칭량 하였다. DCM (무수, 120 mL)을 플라스크에 직접 첨가하고, 추가의 DCM (무수, 30 mL)을 사용하여 분말 깔때기를 세척하고 플라스크에도 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 15분 동안 교반한 다음, 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 추가로 45분 동안 교반하였다. 이어서, 분말 깔때기를 사용하여 인독실을 한 번에 첨가하였으며; 깔때기를 DCM (무소 10 mL)으로 세척하고, 이를 반응 혼합물에 또한 첨가하였다. 반응 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 추가의 DCM (무수, 20 mL)을 첨가하고, 아르곤을 통과시키면서 실온에서 교반하면서 10분 동안 유지하였다. 그 후, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과지가 있는 부크너-깔때기를 통해 여과하고 분리 깔때기에 채웠다. 반응 플라스크를 DCM (30 mL)으로 세척하고, 세척-DCM을 부크너 깔때기로 또한 여과하고 분리 깔때기에 채웠다. 물 (350 mL)을 분리 깔때기에 첨가하였고; 추출 후 유기상을 수집하였다. 분리 깔때기는 더 이상 색이 씻겨지지 않을 때까지 아세톤으로 씻어 준 다음 물로 완전히 채우고 다시 비웠다. 유기상을 분리 깔때기에 다시 채우고 물 (350 mL)로 한번 더 세척하였다. 상 분리 후, 유기상을 깨끗한 삼각 플라스크에 수집하고, 건조시키고 (Na2SO4, 40.56g), 농축 건조시켰다. 조 생성물을 디에틸에테르 (600 mL)에 현탁시키고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 고체를 유리 프릿을 통해 여과하였다. 일부 고체가 플라스크에 달라 붙었다. 이를 DCM (50 mL)에 용해시키고, 농축 건조시키고 나머지 고체에 첨가하였다. 모든 고체를 디에틸에테르 (600 mL)에 재용해시키고 밤새 실온에서 교반하였다. 그 후 고체를 유리 프릿을 통해 다시 여과하였다. 플라스크에 붙은 고체를 DCM (50 mL)에 용해시키고, 건조될 때까지 농축시키고 나머지 고체와 합하였다. 생성물을 7 일 동안 구멍이 있는 여과지로 덮고 실온에서 유지시킨 다음, 오일 펌프 (RT, 2시간, 0.008 mbar)에서 건조시켜 41.4 g (79.4 %)의 생성물을 수득하였다.
실시예 2. Fmoc-AAPV-5-브로모-4- 클로로-인독실 에스테르
Figure pct00007
Fmoc-AAPV-OH (117 mg, 0.20 mmol) 및 CDI (39 mg, 0.24 mmol)를 DCM (무수, 3 mL)에 용해시키고 실온에서 아르곤 분위기 하에 5분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 5분 동안 실온에서 교반하면서, 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키고, 5-브로모-4-클로로-인독실 (50mg, 0.20mmol)을 한번에 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 5분 동안 유지하고, 추가의 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 3.5시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 아르곤 분위기 하에 냉동기에서 18 일 동안 저장하였다. 조 생성물을 크로마토그래피 하였다: 15.8 g 실리카 겔, 용리액: DCM 중 2 % MeOH. 여전히 오염된 청색 고체 (42 mg)를 수득하였다. 생성물을 2 회 크로마토그래피 하였다: 13.7 g 실리카 겔, 용리액: 출발 용리액: EtOAc/사이클로헥산 (3: 1, 200 mL)을 사용하여 순수한 EtOAc로 변화시켰다. 거의 무색의 고체 (32 mg)를 얻었다. ESI-MS (positive): [M+H]+: 805, [M+Na]+: 828, [M+K]+: 844
실시예 3 Fmoc-AAAPV-인독실 에스테르
Figure pct00008
FMOC-AAAPV-OH (361 ㎎, 0.56 mmol) 및 HOBt와 ·H 2 O (127 ㎎, 0.94 밀리몰)을 아르곤 분위기 하에 실온에서 DCM (3 ㎖)에 용해시켰다. DIPEA (190 μL, 0.90 mmol) 및 EDCI·HCl (179 mg, 0.93 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 아르곤을 혼합물 통과시키면서 인독실 (indoxyl) (55 mg, 0.41 mmol)을 한꺼번에 첨가하고, 아르곤을 반응 혼합물에 통과시켜 5분 이상 더 유지하였으며; 추가의 DCM (2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. DCM (20 mL)을 첨가하고 혼합물을 수성 포화 NaHCO3 로 추출하였다 (상분리의 가속을 위해 염수 (5 mL)을 첨가하였다). 유기상을 염수 (15 mL)로 세척하고, 건조하고 (Na2SO4), 농축 건조시켰다. 조 생성물을 용매로서 DCM으로 시작하는 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔 15.0 g, 40-63 ㎛)로 정제하였다. 칼럼을 모든 청색 및 분홍색이 칼럼 아래로 씻어낼 때까지 DCM으로 용출시켰다. 이어서, 용리액을 DCM 중 5 % MeOH로 변경하였다. 무색의 생성물 (88mg) 및 약간 분홍색의 (오염된) 고체 (49mg)를 수집하였다.
실시예 4: Fmoc-AAAPV-( N- 아세틸)-인독실 에스테르
Figure pct00009
FMOC-AAAPV-OH (305 ㎎, 0.428 mmol) 및 HOBt와 ·H 2 O (97.5 ㎎, 0.47 밀리몰)을 아르곤 분위기 하에 실온에서 DMF (2 mL) 중에 용해시켰다. 5분 후, DIPEA (145.6 μL, 0.86 mmol) 및 EDCI·HCl (138 mg, 0.72 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (혼합물 1). 동시에, 아르곤 분위기 하에 실온에서 인독실아세테이트 (50 mg, 0.285 mmol)를 DMF (2 mL)에 용해시켰다. 아르곤을 NaOMe (15 mg, 0.270 mmol)을 첨가하기 전에 5분 동안 용액에 통과시켰다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키는 것을 추가로 20분 동안 계속하였다 (혼합물 2). 혼합물 1을 몇 초 내에 혼합물 2에 첨가하였다. 반응 혼합물을 통해 아르곤 스트림을 2시간 동안 퍼징한 다음, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 건조될 때까지 농축시키고, EtOAc (50 mL)에 재용해시키고, 수성 포화 NaHCO3 (2X 30 ㎖), 물 (1X 20 mL) 및 염수 (1X 30 ㎖)로 세척하였다. 유기상을 (Na2SO4) 건조시키고 농축 건조시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔 15.0 g, 40-63 ㎛, 용리액: DCM)로 정제하여 33 mg의 고체 생성물을 수득하였다. ESI-MS (양성): [M+H]+: 807; [M+ Na]+: 829.
실시예 5: Fmoc-AAPV-3-인돌아미드
Figure pct00010
Fmoc-AAAPV-OH 및 HOBt*H2O를 아르곤 분위기 하에 실온에서 25 mL 2구 둥근 바닥 플라스크에서 DCM (무수)에 용해시켰다. DIPEA 및 EDCI * HCl을 첨가하였다. 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 1시간 동안 교반하고; 아르곤을 혼합물에 5분 동안 통과시켰다. 1H-인돌-3-아민을 한 번에 첨가하고, 혼합물을 통과하는 아르곤을 5분 동안 유지하였다. 이어서, 추가의 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. DCM (25 mL)을 첨가하고, 혼합물을 포화 NaHCO 3-용액으로 추출하였으며; 추출 후, 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하였다. 모아진 수성상을 EtOAc (30 ml)로 추출하였다. (DCM: EtOAc에서 5 % MeOH로 EtOAc 및 DCM 상들의 TLC: 1 스폿; DCM. 3 스폿). 두 유기상을 건조시키고 (Na2SO4) 개별적으로 농축 건조시켰다. DCM 상으로부터의 조 생성물을 용매로서 DCM으로 시작하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 모든 청색 및 분홍색이 칼럼에서 씻어낼 때까지 칼럼을 DCM으로 플러싱하였다. 이어서, 용리액을 DCM 중 5 % MeOH로 변경하였다. 회수: 34 mg의 갈색 고체 ESI-MS (양성): [M + H] +: 764; [M + Na] +: 786.
실시예 6: Fmoc-AAPV-4- 메톡시-1- 나프톨 에스테르
Figure pct00011
아르곤 분위기 하에 실온에서 Fmoc-AAPV-OH (169 mg, 0.29 mmol) 및 CDI (59 mg, 0.36 mmol)를 DCM (무수, 3 mL)에 용해시켰다. 10분 후, 4-메톡시-1-나프톨 (50 mg, 0.29 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. DCM (30 mL) 및 물 (20 ml)을 첨가하였으며; 추출 후, 유기상을 나트륨 2 SO 4로 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액: DCM 중 5 % MeOH)로 정제하여 58 mg의 베이지 색 고체를 수득하였다. ESI-MS (양성): [M + H] +: 735; [M + Na] +: 757.
실시예 7: Fmoc-AAPV-1-나프톨 에스테르
Figure pct00012
Fmoc-AAPV-OH (241 mg, 0.42 mmol) 및 HOBt*H2O (107 mg, 0.70 mmol)를 DCM (무수, 4 mL)에 현탁하였하였다. 5분 후 DIPEA (119 μL, 0.70 mol) 및 EDCI * HCl (134 mg, 0.7 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 1- 나프톨 (50mg, 0.35mmol)을 한번에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 주말 동안 교반하였다. DCM (20 mL) 및 물 (20 mL)을 첨가하고 혼합물을 추출하였다. 상 분리가 매우 느리기 때문에 염수 용액 (10 mL)을 첨가하고 혼합물을 다시 추출하였다. 유기상을 건조시키고 (Na2SO4) 농축 건조시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액: DCM 중 5 % MeOH)로 정제하여 106 mg의 생성물을 수득하였다. ESI-MS (양성): [M + H] +: 705; [M + Na] +: 727.
실시예 8. Fmoc-AAPV-(2-나프톨)
Figure pct00013
합성: FMOC-AAPV-OH (241 ㎎, 0.42 mmol) 및 HOBt*H2O (107 ㎎, 0.42 밀리몰)을 RT에서 아르곤 분위기 하에서 건조 DCM (3 mL) 중에 현탁시켰다. 5분 후, DIPEA (119 μL, 0.7 mmol) 및 EDCI * HCl (134 mg, 0.7 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 이어서, 2-나프톨 (50mg, 0.35mmol)을 한번에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 2시간 동안 교반하였다. DCM (30 mL) 및 물 (30 mL)을 첨가하였으며; 추출 후, 유기상을 염수 (30 mL)로 세척하고, Na2SO4 로 건조하고, 농축 건조하여 거의 무색의 고체 250 mg을 수득하였다. 정제를 위해, 조 생성물을 실리카 겔의 짧은 칼럼에서, 용리액: DCM 중 5 % MeOH상에서 플래싱하였다. 수율: 168 mg의 무색 고체 (68 %). ESI-MS (양성) [M + H]-: 853.
실시예 9: 메틸-3-Fmoc-AAPV-아미드-4-아미노벤조에이트 및 메틸-3-아미노-4-Fmoc-AAPV-아미도벤조에이트
Figure pct00014
FMOC-AAPV-OH (214 ㎎, 0.37 mmol) 및 HOBt*H2O (91 ㎎, 0.6 밀리몰)을 RT에서 아르곤 분위기 하에서 건조 DCM (무수, 2 mL) 중에 현탁시켰다. 5분 후, DIPEA (105 μL, 0.6 mmol) 및 EDCI * HCl (115 mg, 0.6 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 이어서, 메틸-3,4-디아미노벤조에이트 (50 mg, 0.3 mmol)를 한꺼번에 첨가하고, 이어서 추가의 DCM (무수, 1 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. DCM (20 mL) 및 물 (10 mL)을 첨가하였으며; 추출 후 유기상을 sat. NaCl- 졸. (10 ㎖)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 건조 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 용리액: 2 % MeOH/DCM (약 120 mL)로 시작하고 DCM 중의 5 % MeOH로 변경하였다. 수율: 97mg은 양쪽 이성질체의 혼합물 및 10mg은 단지 하나의 이성질체를 함유한다. ESI-MS (양성): [M + H] +: 727; [M + Na] +: 749.
실시예 10. N -(1-[2-하이드록시]테트라데카닐) 패스트 블루 RR (N -4-(1,3-디메톡시-2- N' -벤조일아미도페닐)- N` -락-(2-하이드록시-N-데실)-아민)
Figure pct00015
패스트 블루 RR 염료 (7.3 mmol)를 3구 둥근 바닥 플라스크에 넣고 주변 온도에서 교반하면서 (마그네틱 교반기, 500 rpm) 클로로포름 (30 ml)에 용해시켰다. 30분 후, 1,2- 에폭시테트라데칸 (11 mmol)을 첨가한 다음, 황산 (촉매)으로 처리하였다. 온도를 환류로 올리고 12시간 동안 일정하게 교반하였다. 프로세스 콘트롤에서 (ESI-MS (+ p))가 출발 물질의 완전 소비를 알리면, 고형물을 여과해 내고 기류 중에서 건조시켰다. 몇 가지 재결정화 단계 (에탄올)는 충분히 순수한 형태로 원하는 생성물을 얻기 위해 필요했다. 수율: 600mg. ESI-MS (양성 모드) [M + H] +: 485.
실시예 11. Fmoc-AAAPV-(디아미노 벤조산)
Figure pct00016
Fmoc-AAAPV-OH (710 mg)를 DMF (5 mL)로 용해시켰다. 이어서, HOBt (210mg) 및 DCC (240mg)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 3,4-디아미노벤조산 (160 mg) 및 피리딘 (100 μL)을 DMF (1 mL)에 용해시키고, 교반하면서 반응 혼합물에 첨가하였다. 14시간 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 0.5 % 포름산을 함유하는 사이클로헥산/DCM/메탄올 (4/2/1)을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 400 mg의 생성물을 수득하였다. ESI-MS (양성) [M + H] = 784.
실시예 12. Fmoc-AAPF-인독실 에스테르
Figure pct00017
Fmoc-AAPF-OH (994 mg, 1.59 mmol) 및 CDI (308 mg, 1.90 mmol)를 무수 DCM (4 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 10분간 및 추가로 20분 동안 상기 혼합물에 아르곤을 통과시킨 후, 추가의 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하였다. 아르곤을 반응 혼합물에 통과시키면서 교반하면서 2분 동안 유지한 다음, 인독실 (208mg, 1.56mmol)을 한 번에 첨가하였다. 용액에 아르곤을 통과시키면서 교반하면서 15분 동안 유지한 후, 추가로 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 분리 깔때기에 채우고, 플라스크를 DCM (20 mL)으로 세척하고, 세척-DCM을 분리 깔때기에 또한 첨가하였다. 혼합물을 물 (30 ml)로 세척하고 유기상을 수성상 사이의 슬러리와 함께 수집하였다. 유기상을 물 (30 mL)로 다시 세척하고 Na2SO4로 건조시키고 건조 농축시켰다. 조 생성물을 Et2O (50 ㎖)에 현탁시키고, 90분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서 고체를 여과하고, 밤새도록 RT에서 신품 Et2O (40 mL) 중에 재현탁시키고 교반하였다. 고체를 여과하고 오일 펌프에서 건조시켜 444 mg (38 %)의 생성물을 수득하였다.
ESI-MS (양성): [M + H] +: 742; [M + Na] +: 764
실시예 13: Fmoc-AAA-인독실 에스테르
Figure pct00018
Fmoc-AAA-OH (103 mg, 0.52 mmol) 및 CDI (102 mg, 0.23 mmol)를 DCM (무수, 6 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 15분간 및 추가로 10분 동안 아르곤을 통과시키면서 교반하였다. 이어서, 인독실 (30 mg, 0.23 mmol)을 한번에 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 교반하면서 10분 동안 유지한 후, 추가로 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하였다 (많은 고체가 유기상과 수성상 사이에 놓여 있었다). 유기상을 수집하여, 한번 더 물로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 건조될 때까지 (단지 33 mg) 농축시켰다.
조 생성물을 Et2O (5 mL) 중에 용해시키고 2분 동안 진탕하였다. 액체를 따라 내고 원하는 생성물 7 mg (5 %)을 얻을 수 있었다.
[M+Na]+: 591
실시예 14: Fmoc-AAPA-인독실 에스테르
Figure pct00019
Fmoc-AAPA-OH (285 mg, 0.52 mmol) 및 CDI (102 mg, 0.63 mmol)를 25 mL의 2구 둥근 바닥 플라스크에서 DCM (무수, 5 mL)에 용해하였다 (열선총(heat gun)으로 진공 중 가열하고 아르곤 분위기 하에서 냉각) 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 5분 동안 교반하고, 추가로 10분 동안 아르곤을 혼합물에 통과시키면서 교반하였다. 이어서, 인독실 (71 mg, 0.53 mmol)을 한꺼번에 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 교반하면서 15분 동안 유지한 후, 추가로 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고 아르곤 분위기 하에서 실온에서 2일 동안 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고 물로 2 회 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 로 건조시키고, 건조물로 농축하였다. 조 생성물을 Et2O (20 ㎖)에 용해시키고, 30분 동안 RT에서 교반하였다. 이어서, 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액: DCM 중 2 % MeOH)로 정제하여 25 mg (7 %)의 목적하는 생성물을 수득하였다.
ESI-MS (양성): [M + Na] +: 688
실시예 15. Fmoc-V-인독실 에스테르
Figure pct00020
Fmoc-V-OH (501 mg, 1.48 mmol) 및 CDI (291 mg, 1.79 mmol)를 DCM (무수, 6 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 10분간 및 추가로 10분 동안 아르곤을 혼합물에 통과시키면서 교반하였다. 이어서, 추가의 DCM (무수, 2 ml)을 첨가한 다음, 인독실 (199 mg, 1.49 mmol)을 한번에 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 아르곤을 통과시키면서 10분 동안 유지한 후, 추가로 DCM (무수, 2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 2 회 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 건조 상태로 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.
용리액: (모든 청색과 분홍색을 칼럼으로 씻어낼 때까지 압력을 가한 후 DCM으로 칼럼을 세척 후) DCM에서 용리액을 DCM 중 5 % MeOH로 교체하였다.
생성물은 첫 번째 분획물로 칼럼을 따라 내려간다.
생성물을 용리액으로서 DCM으로 2 회 크로마토그래피 하였다.
수집된 분획물: 25-35 (130 mg)
36-44 (92 mg)
45-52 (81 mg)
총 수율: 222 mg (33 %)
분획물 36-44만이 무게를 측정할 수 있는 고체를 제공하기 때문에 이들 분획물을 시험에 사용하였다.
[M + Na] +: 477
실시예 16: Fmoc-AAAA-인독실 에스테르
Figure pct00021
Fmoc-AAAA-OH (503 mg, 0.95 mmol) 및 CDI (191 mg, 1.18 mmol)를 DCM (무수, 10 mL)에 현탁시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 10분간 및 추가로 10분 동안 아르곤을 혼합물에 통과시키면서 교반하였다. 이어서, 인독실 (125 mg, 0.94 mmol)을 한꺼번에 첨가하고, 이어서 추가의 DCM (무수, 5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 15분 동안 교반한 후, 다시 추가의 DCM (무수, 5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 교반을 2분 더 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 모든 용매를 밤새 증발시켰기 때문에 DCM (25 mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 5분간 교반한 후 물 (2 x 25 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조하고, 농축 건조시켰다. 단지 57 mg의 조 생성물이 수득되었다. 많은 고체가 수성상에 유지되기 때문에 이 고체를 여과하고 건조시켰다. 이 고체를 상기에서 얻은 57 mg과 혼합하였다. 모아진 고체를 Et2O (20 ㎖)에 현탁하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고, 229 mg (39 %)의 생성물 및 출발 물질 (FmocA-AAA-OH) 함유 고체를 얻었다.
[M+ H]+: 640; [M+Na]+: 662
실시예 17: FMOC-APV-인독실 에스테르
Figure pct00022
Fmoc-APV-OH (482 mg, 0.92 mmol) 및 CDI (191 mg, 1.18 mmol)를 DCM (무수, 10 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 10분간 및 추가로 10분 동안 아르곤을 혼합물에 통과시키면서 교반하였다. 이어서, 인독실 (125 mg, 0.94 mmol)을 한꺼번에 첨가하고, 이어서 추가의 DCM (무수, 5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 실온에서 15분 동안 교반한 후, 다시 추가로 DCM (무수, 5 mL)을 첨가하고, 아르곤을 통과시키면서 교반하면서 2분간 교반한 후, RT에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (2 x 20 mL)로 세척하고, 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 농축 건조시켰다. 조 생성물을 Et2O (20 ㎖)에 현탁하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 플라스크에 부착된 작은 고체만 남았다. 액체를 따라 내고 고체를 수집하였다 (76 mg, 17 %)
[M+Na]+: 645
실시예 18: Fmoc-Phe-인독실 에스테르
Figure pct00023
Fmoc-Phe-OH (2.9 g, 7.5 mmol) 및 CDI (1.47 g, 9.0 mmol)를 100 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 직접 칭량한다. DCM (무수, 50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 아르곤을 통과시키면서 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 후 추가의 DCM (무수, 4 mL)을 첨가한 다음 인독실 (1.00 g, 7.6 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 통해 아르곤 스트림을 통과시키면서 실온에서 교반하면서 30분 동안 유지하였다. 이어서, 추가의 DCM (무수, 10 mL)을 첨가하고, 다시 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 마지막으로, 이를 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 분리 깔때기에 채우고, 플라스크를 DCM (30 mL)으로 세척하고, 세척-DCM을 분리 깔때기에 또한 채웠다. 물 (100 mL)을 첨가하고, 추출 후 유기상을 수집하고 깨끗한 분리 깔때기에 재충전시켰다. 유기상을 물 (100 mL)로 다시 세척하고, 건조시키고 ((Na2SO4), 농축 건조시켰다. 조 생성물을 정제를 위해 디에틸에테르 (100 mL) 중에 용해시켰다. 완전히 용해되었기 때문에 다시 건조될 때까지 농축시키고 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (용리액: DCM)로 정제했다. 수집: 분획물:
28 및 29: 152 mg
22 내지 27
30 내지 48
분획물 22 내지 27은 농축 건조시켰다. 그런 다음 DCM (20 mL)을 첨가하여 청색의 일부를 용해시켰다. 고체를 여과하고, 재용해시키고 다시 건조시켜 농축시켜 132 mg의 생성물을 수득하였다.
여액을 분획물 30-48과 혼합하여 1.00g의 불순한 생성물을 수득하였다. 전체 수율: 1.284g (26.5 %).
[M + Na] +: 525
실시예 19: Ac-Phe-인독실 에스테르
Figure pct00024
Ac-Phe-OH (1.55 g, 7.5 mmol) 및 CDI를 100 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 직접 칭량한다. DCM (무수, 50 mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 그런 다음 15분 동안 실온에서 아르곤을 통과하면서 교반시켰다. 15분 후 인독실을 첨가하였다 (1.01 g, 7.6 mmol). 혼합물을 통해 아르곤을 통과시키면서 교반을 20분 동안 계속하였다. 그 시점에서, 더 많은 DCM (무수, 5 mL)을 첨가하고 교반 (아르곤 스트림 존재)을 23분 동안 계속하였다. 다시 한번 DCM (무수, 8 mL)을 첨가하고 5분 동안 실온에서 교반하였다 (아르곤 스트림 존재). 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기에 채우고, 플라스크를 분리 깔때기에 또한 채워진 DCM (20 mL)으로 세척하였다. 물 (80 mL)로 세척한 후, 유기상을 수집하고 깨끗한 분리 깔때기에 재충전시켰다. 혼합물을 다시 물로 세척하고, 유기상을 수집하고, 건조하고 (Na2SO4) 농축 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 용리액: 대부분의 청색 및 분홍색이 씻겨질 때까지 DCM (가압 하에서)으로 시작한 다음 용매를 DCM 중 2 % MeOH로 교체하고 크로마토그래피를 압력 없이 계속하였다. 거의 순수한 분획물 만이 수집되었다: 196 mg (8 %).
[M+Na]+: 345
실시예 20: Fmoc-FVT (Bzl)-F-
Figure pct00025
Fmoc-FVT (Bzl)-F-OH (1.228 mg, 1.49 mmol)를 DCM (무수, 10 mL)에 현탁시켰다. CDI (291 mg, 1.79 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고 실온에서 추가 15분 동안 아르곤을 통과시키면서 교반하였다. DCM (무수, 3 ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 (아르곤 스트림 존재)에서 추가로 2분 동안 교반한 후 인독실 (200 mL, 1.50 mmol)을 한번에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반하였다 (아르곤 스트림 존재). 이후 추가의 DCM (무수, 8 mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 더 교반한 후 아르곤 라인을 제거하고 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기 하에 밤새 교반하였다. DCM (20 mL)을 첨가하고, 남아있는 청색 고체를 여과하고 DCM (20 mL)으로 세척하였다. 여액을 분리 깔때기에 채우고 물로 2 회 세척하였다. 유기상을 건조시키고 (Na2SO4) 농축 건조시켰다. 조 생성물을 DCM (7 mL)에 용해시키고, 디에틸에테르를 첨가하였다 (20 mL). 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 침전물 (58 mg, 5 %)을 여과하고 디에틸에테르 (20 mL)로 세척하였다.
[M+Na]+: 962
실시예 21: β-락탐 인독실 에테르
Figure pct00026
25 mL의 3구 둥근 바닥 플라스크에 인독실 (327 mg, 2.46 mmol)을 칭량하였다 (플라스크를 열선총으로 진공 가열하고 아르곤 분위기 하에서 냉각시켰다). THF (무수, 6 mL)를 첨가하고 혼합물을 10분 동안 혼합물을 통해 아르곤을 흘리면서 실온에서 교반하였다. 이어서, 칼륨 tert-부톡시드 (228 mg, 2.03 mmol)를 한꺼번에 첨가하고, 계속적인 아르곤 스트림 존재에서 실온에서 15분 동안 계속 교반하였다. 이 시점에서 4-메톡시벤질 3-클로로메틸-7-(2-페닐아세트아미도)-3-세펨-4-카르복실 레이트 (1.01 g, 2.05 mmol)를 한번에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 안정한 아르곤 스트림 존재 하에 교반하여 추가로 30분 동안 계속하였다. 생성물을 ESI-MS를 통해 검출하였다. ESI-MS (양성): [M + Na] + = 606; [M + K] + = 622.
실시예 22. N -(프로파르길)-(RBB)
Figure pct00027
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R, 1,3-쌍극자성 [3 + 2] 첨가환화 ( "클릭 화학")를 기본으로 한 염료 복합체
합성: 프로파르길아민 염산염과의 레마졸 브릴리언트 블루 R의 반응은 포화 수성 NaHCO3의 정상 조건 하에서 NaHCO3 에서 수행되었다. 반응 모니터링은 ESI-MS (-p)로 수행하였다. 생성물을 수성상으로부터 에틸 아세테이트로 추출하고 후속 반응 (1,3-쌍극자성 [2 + 3]- 첨가환화)에 사용하기 위해 적절한 순도로 침전시켰다. ESI-MS (음성) [MH]-: 538.
실시예 23. Fmoc 보호된 시약 (Fmoc-N-{2-하이드록시-3-[1-(5-( N -RBT- 메틸) 1,2,3-트리아졸릴)}프로필아미드) (Fmoc-V- 트리아졸-RBB)
실시예 22를 클릭 화학 조건 (Hunig 베이스, 구리 촉매)을 사용하여 FMOC-발린-N-(2-하이드록시-3-아지도프로필, 아마이드)와 반응시켰다. 반응 생성물은 하기의 추가 실시예에서 사용된다.
실시예 24. HV- {2-하이드록시-3- [1- (5- ( N -RBT- 메틸) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (HV- 트리아졸-RBB)
Figure pct00028
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위인 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로 한 염료 복합체.
합성: 메탄올 중 피 페리딘과 Fmoc 보호된 시약 (Fmoc-V-트리아졸-RBB, 실시예 23)의 반응을 정상 조건하에 수행하였다. 반응 모니터링은 ESI-MS (-p)로 수행하였다. 생성물은 후속 반응 (아미드화)에 사용하기 위해 적절한 순도로 진공 건조한 후에 침전되었다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [M-H]-: 753.
실시예 25. Fmoc-AAPVAV- {2-하이드록시-3- [1- (5- ( N -RBT- 메틸) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (Fmoc-AAPVAV- 트리아졸-RBB)
Figure pct00029
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로하는 염료-펩타이드 복합체
합성: 펜타 FMOC-AAPVA-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt?2O (1.2 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1.2 당량)으로 처리하였다. HV- {2-하이드록시-3- [1- (5- (N-RBB- 메틸)) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (1 당량; 실시예 24)를 한 번에 첨가하고, ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 실온에서 수행하였다. 진공 하에 휘발성 물질을 간단히 제거하여 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 83 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1385.
실시예 26. Fmoc-AAPV-{2-하이드록시-3- [1- (5-(N-RBB-메틸) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (Fmoc-AAPV-트리아졸-RBB)
Figure pct00030
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 트리펩타이드 FMOC-AAP-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt?2O (1.2 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1.2 당량)으로 처리하였다. HV- {2-하이드록시-3- [1- (5- (N-RBB- 메틸)) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (1 당량; 실시예 24)를 한 번에 첨가하고, ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 실온에서 수행하였다. 수성 후 처리로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 90 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1214.
실시예 27. H-AAPVAV- {2-하이드록시-3- [1- (5- (N-RBB- 메틸) 1,2,3- 트리아졸릴)} 프로필아미드 (H-AAPVAV- 트리아졸-RBB)
Figure pct00031
Fmoc-AAPVAV- {2-하이드록시-3- [1- (5- (N-RBB- 메틸)) 1,2,3- 트리아졸릴}} 프로필아미드 (1 당량; 실시예 25)를 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1162.
실시예 28. H-AAPV- {2-하이드록시-3-[1-(5-(N-RBB-메틸) 1,2,3-트리아졸릴)} 프로필아미드) (H-AAPV-트리아졸-RBB)
Figure pct00032
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: Fmoc-AAP V- {2-하이드록시-3- [1- (5- (N-RBB- 메틸)) 1,2,3-트리아졸릴}} 프로필아미드 (1 당량; 실시예 26) 메탄올/피페리딘 (2: 1)을 주위 온도에서 45분 동안 교반하면서 첨가하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 992.
실시예 29. RBB-아민 (H-RBB)
Figure pct00033
아민화/아미드화의 출발 물질
합성: 레마졸 브릴리언트 블루 R과 수산화암모늄 용액의 반응은 정상 조건 하에서 얼음 조에서 초기 냉각하면서 수행되었다. 반응은 ESI-MS (-p)를 통해 모니터링 하였다. 생성물을 수상으로부터 여과하고 후속 반응 (아미드화)에 사용하기에 적절한 순도로 침전시켰다. 수율:> 64 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 500.
실시예 30. (RBB)-아미도-Fmoc-알라닌 (Fmoc-A-RBB)
Figure pct00034
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위인 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로 한 염료 복합체.
합성: H-RBB (실시예 29)와 Fmoc-알라닌 펜타플루오로페닐 에스테르의 반응을 에탄올 중에서 정상 조건하에 수행하였다. 반응 모니터링은 ESI-MS (-p)로 수행하였다. 생성물을 디클로로메탄 (DCM)으로 수성상으로부터 추출하고 후속 반응 (탈보호/아미드화)에 사용하기 위해 적절한 순도로 진공 건조시킨 후 침전시켰다. 수율: > 90 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 793.
실시예 31. RBB-아미도-알라닌-NH 2 (HA-RBB)
Figure pct00035
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반으로 한 염료 복합체, 아미노산 구성 단위 펩타이드 합성.
합성: 메탄올 중 피페리딘과 Fmoc-A-RBB (실시예 30)의 반응을 정상 조건하에 수행하였다. 반응 모니터링은 ESI-MS (-p)로 수행하였다. 생성물은 후속 반응 (아미드화)에 사용하기 위해 적절한 순도로 진공 건조한 후에 침전되었다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 571.
실시예 32. Fmoc-AAPVAA-RBB
Figure pct00036
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R에 기초한 염료-펩타이드 복합체
합성: 펜타 FMOC-AAPVA-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt?2O (1.2 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1.2 당량)으로 처리하였다. HA-RBB (1 당량, 실시예 31)를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 교반하였다. 수성 후 처리로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 58 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1202.
실시예 33. H-AAPVAA-RBB
Figure pct00037
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 교반하면서, 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-AAPVAA-RBB (1 당량, 실시예 32)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 980.
실시예 34. 아크릴아미도-AAPVAA-RBB
Figure pct00038
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: H-AAPVAA-RBB (1 당량; 실시예 33)를 메탄올에 용해시키고 교반하면서 주위 온도에서 아크릴산 펜타플루오로페닐 에스테르 (1.2 당량)로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 약 12시간 후 (밤새) 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 간단한 증발은 다음 단계를 위해 충분히 순수한 청색 비결정성 고체로서 조 생성물을 생성하였다. 수율: > 95 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 599.
실시예 35. Fmoc-VA-RBB
Figure pct00039
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위인 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로 한 염료 복합체.
합성: 메탄올 중 HA-RBB (1 당량; 실시예 31)의 용액을 주변 온도에서 교반하면서 Fmoc-발린-OPfp 에스테르로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 표시한 후, 반응 혼합물을 수성 후 처리하고 DCM으로 추출하였다. 진공 하에 DCM을 증발시켜 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 48 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 892.
실시예 36. H-VA-RBB
Figure pct00040
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R, 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위를 기본으로 한 염료 복합체;
합성: 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-VA-RBB (1 당량; 실시예 35)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에서의 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 670.
실시예 37. Fmoc-AAPFA-RBB
Figure pct00041
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 테트라 FMOC-AAPF-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt?2O (1 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 주위 온도에서 DCC (1 당량)으로 처리하였다. HA-RBB (0.8 당량; 실시예 31)를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 교반하였다. 수성 후 처리 및 진공 하에 휘발성 물질의 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 98 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1179.
실시예 38. H-AAPFA-RBB
Figure pct00042
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-AAPFA-RBB (1 당량) (실시예 37)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 957.
실시예 39. Fmoc-AAPVA-RBB
Figure pct00043
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 펜타 FMOC-AAPVA-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1.2 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1.2 당량)으로 처리하였다. H-RBB (1 당량, 실시예 29)를 한번에 첨가하고, ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 혼합물을 실온에서 교반하였다. 수성 후 처리로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 23 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1131.
다른 합성 1: 트리펩타이드 FMOC-AAP-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1 당량)으로 처리하였다. H-VA-RBB (0.8 당량; 실시예 36)을 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비 (약 15시간, 밤새)를 나타낼 때까지 교반하였다. 수성 후 처리 및 진공 하에 휘발 물질의 증발은 충분히 순수한 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 70 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1131.
대안 합성 2: Fmoc-AAPVA-OH (110mg) 및 HOBt (50mg)를 DMF (10mL)에 현탁시켰다. DCC (50mg)를 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, DMF (3 mL) 중에 용해된 H-RBB (100 mg; 실시예 29)를 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, MS에 의해 지시된 바와 같이 반응이 완료되었다. 조 혼합물을 Fmoc 탈보호를 위해 앞에서 취했다 (실시예 40의 대안 합성 참조). ESI-MS (음성) [MH]-: 1131.
실시예 40. H-AAPVA-RBB
Figure pct00044
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-AAPVA-RBB (1 당량; 실시예 39)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공에서 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 909.
대체 합성: Fmoc-AAPVA-RBB의 조 DMF 혼합물 (실시예 39의 대안 합성 2로부터)을 사용하여, 피페리딘 (200㎕)을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 메탄올 (약 50 mL)에 재용해시켰다. 10 ㎖로 농축시킨 후, 짙은 청색 상등액을 디에틸에테르 (200 ㎖)에 부었다. 침전물을 분리하고 건조시켜 145 mg의 미세한 청색 분말 (H-AAPVA-RBB)을 수득하였다. ESI-MS (음성) [MH]-: 909.
실시예 41. Fmoc-V-RBB
Figure pct00045
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위인 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로 한 염료 복합체.
합성: 메탄올 중 H-RBB (1 당량; 실시예 29)의 용액을 주변 온도에서 교반하면서 Fmoc-발린-OPfp 에스테르로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링 결과, 출발 물질의 소비가 확인된 후, 반응 혼합물을 수성 후 처리하고 DCM으로 추출하였다. 진공 하에 DCM 을 증발시켜 조 생성물을 백색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 31 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 821.
실시예 42. HV-RBB
Figure pct00046
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위인 레마졸 브릴리언트 블루 R을 기본으로 한 염료 복합체.
합성: Fmoc-V-RBB (1 당량, 실시예 41)를 주변 온도에서 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 45분 동안 교반하면서 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 599.
실시예 43. Fmoc-AAPV-RBB
Figure pct00047
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 트리펩타이드 FMOC-AAP-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 상온에서 DCC (1 당량)으로 처리하였다. HV-RBB (0.8 equiv; 실시예 42)를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비 (약 15시간, 밤새)를 나타낼 때까지 교반하였다. 수성 후 처리 및 진공 하에 휘발 물질의 증발은 충분히 순수한 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 70 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1060.
실시예 44. H-AAPV-RBB
Figure pct00048
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-AAPV-RBB (1 당량; 실시예 43)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발 물질의 단순 증발은 청색 비결 정성 고체로서 충분히 순수한 조 생성물을 산출하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 838.
실시예 45. Fmoc-AAPF-RBB
Figure pct00049
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 테트라펩타이드 FMOC-AAPF-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 주위 온도에서 DCC (1 당량)로 처리하였다. H-RBB (0.8 당량; 실시예 29)를 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 교반하였다. 수성 후 처리 및 진공 하에서의 휘발성 물질의 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 98 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 1108.
실시예 46. H-AAPF-RBB
Figure pct00050
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: 교반하면서 주위 온도에서 45분 동안 메탄올/피페리딘 (2: 1)의 혼합물로 Fmoc-AAPF-RBB (1 당량) (실시예 45)를 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발로 조 생성물을 청색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 886.
실시예 47. 아크릴아미도-AAPF-RBB
Figure pct00051
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: H-AAPF-RBB (1 당량; 실시예 46)를 메탄올에 용해시키고 주위 온도에서 교반하면서 아크릴산 펜타플루오로페닐 에스테르 (3 당량)로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 약 12시간 후 (밤새) 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에 휘발성 물질의 단순 증발은 조 생성물을 생성시키고, DCM에 다시 용해시켜 불용성 백색 부산물을 남겼다. 이어서 여과하여 진공 증발시켜 다음 단계에서 충분히 순수한 청색 비정질 고체로서 생성물을 수득하였다. 수율: 약 98 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 94
실시예 48. Fmoc-발린-(3-아지도-2-하이드록시)-프로필아미드
Figure pct00052
등급: 펩타이드 합성을 위한 아미노산 구성 단위, 1,3-쌍극자 [3 + 2]-첨가환화의 기질.
합성: Fmoc-N-(2-에폭시프로필-1-아미도)-발린 (1 당량)을 DCM에 용해시켰다. 아지드화나트륨 (과량)를 물에 용해시키고 수성상을 주위 온도에서 교반하면서 (> 1000 rpm) 유기 용액에 첨가하였다. 테트라-n-부틸 황산수소암모늄 상전이 촉매의 촉매량 첨가에 이어 황산 촉매량을 후속 첨가하였다. 후자는 시간에 따라 소모되었고 ESI-MS (+ p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 완전한 전환을 나타낼 때까지 정기적으로 다시 채워야 한다. 수성 후 처리 및 진공 하에 휘발 물질의 증발은 비정질 고체로서 조 질의 무색 내지 베이지 색 생성물을 산출하였다. 수율: 66 % (조 생성물). ESI-MS (양성) [M + Na] +: 460.
실시예 49. 아크릴아미도-AAPVA-RBB
Figure pct00053
등급: 레마졸 브릴리언트 블루 R 기반의 염료-펩타이드 복합체
합성: H-AAPVA-RBB (1 당량; 실시예 40)를 메탄올에 용해시키고 주위 온도에서 교반하면서 아크릴산 펜타플루오로페닐 활성 에스테르 (1.2 당량)로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 약 12시간 후 (밤새) 출발 물질의 소비를 나타냈다. 진공 하에서의 휘발성 물질의 간단한 증발은 다음 단계를 위해 충분히 순수한 청색 비결정성 고체로서 조 생성물을 생성하였다. 수율:> 95 % (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 963.
실시예 50. 비스-아미노에틸-(레마졸 블랙 B)
Figure pct00054
등급: 레마졸 블랙 B를 기본으로 한 염료 복합체, 아민화/아미드화 기질
합성: 레마졸 블랙 B (1 당량)를 물에 용해시키고 주위 온도에서 교반하면서 암모니아수 (28-30 %, 과량)로 처리하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 약 20시간 후 (밤새) 출발 물질의 완전한 전환을 나타냈다. 진공 하에서의 휘발 물질의 간단한 증발은 조 생성물을 약간의 보라색 광택이 있는 검은색 비정질 고체로서 생성하였고, 다음 단계를 위해 충분히 순수하다. 수율: 정량적 (조 생성물). ESI-MS (음성) [MH]-: 740.
실시예 51. 아미노에틸-레마졸 브릴리언트 바이올렛
Figure pct00055
등급: 레마졸 브릴리언트 바이올렛 5R을 기본으로하는 아조-염료 복합체, 아민화/아미드화 기질.
합성: 레마졸 브릴리언트 바이올렛 5R (1 당량)을 물에 용해시키고 주변 온도에서 교반하면서 수성 암모니아 (28 내지 30 %, 과량)로 처리하였다. ESI-MS 이온화에서 출발 물질도 생성물도 검출할 수 없었기 때문에 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 불가능하다. 완전한 전환을 보장하기 위해 연장된 반응 시간 (9일) 후에, 휘발 물질을 진공 하에 간단히 증발시켜 조 생성물을 어두운 보라색 비정질 고체로서 수득하였다. 수율: 약 82 % (조 생성물).
실시예 52. Fmoc-AAPF-아미노에틸-(레마졸 블랙 B)
Figure pct00056
등급: 레마졸 블랙 B를 기본으로 한 염료 복합체, 테트라펩타이드 구성 단위, 카텝신 기질.
합성: 테트라펩타이드 FMOC-AAPF-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 주위 온도에서 DCC (1 당량)으로 처리하였다. 비스-아미노에틸-(레마졸 블랙 B) (0.8 당량; 실시예 50)을 한번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 교반하였다. 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용한다.
실시예 53. Fmoc-AAPF-아미노에틸-(레마졸 블랙 B)-( N'- 아세틸)-에틸아미드
Figure pct00057
등급: 레마졸 블랙 B를 기본으로 하는 염료-펩타이드 복합체, 카텝신 기질.
합성: Fmoc-AAPF-아미노에틸-(레마졸 블랙 B)에 대한 교반 반응 혼합물 (실시예 52)을 주위 온도에서 4시간 동안 과량의 아세트산 무수물로 처리하였다. ESI-MS에 의한 반응 모니터링 (-p/+ p)이 출발 물질의 소비를 나타낼 때, 반응 혼합물을 여과하고 여액을 진공 하에 증발시켜 검은색 비정질 분말을 조 생성물로서 수득하였다. 이어서, 조 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다. 엘라스타아제와 반응하여 모노-아세틸화-레마졸 블랙 B-아미노 유도체를 산출하는 것으로 확인된다.
실시예 54. CMC 9M31F-AAPFA-RBB
등급: 전체 원형 어셈블리 (골격/절단 유닛/염료), 카텝신 기질.
합성: 블라노오스 CMC 9M31F (1 당량)를 물에 용해시키고 상온에서 교반하면서 0.5시간 동안 HOBt (1.2 당량), 이어서 EDC·HCl (1.2 당량)로 처리하였다. H-AAPFA-RBB (0.1 당량; 실시예 38)을 첨가하고 밤새 교반을 계속하였다 (14시간 초과). 다음날, 투석에 의해 반응 혼합물을 정제하여 조 생성물로서 블루 젤리를 수득하였다. 수율: 치환도에 의존하고; 1g의 블라노오스는 대략 1 g의 생성물을 제공한다. 얻어진 생성물은 중합체이고 분광학으로 쉽게 특성 분석되지 않았다. 그러나 그것은 청색이었고, 청색은 10 kDa 막에서 투석 후 고분자량 분획과 관련되어 있다. 엘라스타아제와의 반응을 ESI MS를 사용하여 검출하여 염료의 방출을 검출하였다.
실시예 55. CMC 9M31F-AAPF-RBB
Figure pct00059
등급: 전체 원형 어셈블리 (골격/절단 유닛/염료), 카텝신 기질.
합성: 블라노오스 CMC 9M31F (1 당량)를 물에 용해시키고 상온에서 교반하면서 0.5시간 동안 HOBt (1.2 당량), 이어서 EDC·HCl (1.2 당량)로 처리하였다. H-AAPF-RBB (0.1 당량; 실시예 46)을 첨가하고 밤새 교반을 계속하였다 (14시간 초과). 다음날, 투석에 의해 반응 혼합물을 정제하여 블루 젤리를 조 생성물로서 수득하였다. 수율: 치환도에 따라 다르다. 1g의 블라노오스는 약 1 g 생성물을 제공한다. 얻어진 생성물은 중합체이고 분광학으로 쉽게 특성 분석되지 않았다. 그러나 그것은 청색이었고, 청색은 10 kDa 막에서 투석 후 고분자량 분획과 관련되어 있다. 엘라스타아제와의 반응은 ESI MS를 사용하여 검출하고 염료의 방출을 검출한다.
실시예 56. 페이퍼 막에 결합된 AAPVA-RBB
Figure pct00060
등급: 표면 또는 고체 상 "6651"(앵커 영역/효소 분해성 또는 효소 반응성 영역/지표 영역)의 완전한 원형 어셈블리, 엘라스타아제 기질.
합성: 페이퍼 막 (1 당량)을 DMF에 침지하고 이어 HOBt·H2O (약 1.2 당량), DCC (약 1.2 당량)과 H-AAPVA-RBB (약 1 당량; 실시예 40)로 주위 온도에서 교반하면서 처리하였다. 2일의 반응 시간 후, 페이퍼 막을 여과하고, 물, 포화 수성 NaHCO3, 에탄올, 에틸 아세테이트로 세척하고, 디에틸에테르로 건조시켰다. 처리 후, 막은 약간의 녹색을 띄며 매우 낮은 수준의 로딩을 나타낸다. 수율: 해당 없음. 수득된 생성물은 중합체이고 분광학으로 쉽게 특성 분석되지 않았다.
실시예 57. Fmoc-M-RBB
Figure pct00061
등급: 레마졸 브릴리언트 블루를 기본으로하는 메티오닌 염색 복합체, 아민화/아미드화 기질을 위한 추출물.
합성: H-RBB (1 당량; 실시예 29)를 메탄올에 용해시키고, 교반하면서 주위 온도에서 Fmoc-메티오닌 펜타플루오로페닐 에스테르 (3 당량)를 첨가하였다. ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타내었고, 반응은 진공 하에 임의의 휘발성 물질의 증발에 의해 중단되었다. 청색의 비정질 고체가 조 생성물로서 수득되었고, 다음 단계를 위해 충분히 순수하였다. 수율: 정량적 (염료 기준). ESI-MS (음성) [MH]-: 853.
실시예 58. HM-RBB
Figure pct00062
등급: 레마졸 브릴리언트 블루를 기본으로 하는 메티오닌 염색 복합체, 아민화/아미드화 기질.
합성: 교반하면서 주위 온도에서 메탄올과 피페리딘 (2: 1 v/v)의 혼합물에 Fmoc-M-RBB (1 당량; 실시예 57)를 용해시켰다. 짧은 시간 (1시간 미만) 후에, ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타내었고, 반응은 진공 하에 임의의 휘발성 물질의 증발에 의해 중단되었다. 아세토니트릴에서 취한 조 생성물로서 청색 비정질 고체가 잔류 하였다. 불용성 백색 부산물을 여과하고, 다시 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 수득된 청색 비정질 생성물은 다음 단계에서 충분히 순수했다. 수율: 정량적. ESI-MS (양성) [M + H] +: 633.
실시예 59. Fmoc-AAAPM-RBB
Figure pct00063
등급: 레마졸 브릴리언트 블루를 기본으로 한 염료 복합체, 펜타펩타이드 구성 단위, 카텝신 기질.
합성: 테트라펩타이드 FMOC-AAAP-OH (1 당량) 및 DCM에서의 HOBt·H2O (1.2 당량)의 교반 혼합물을 15분 동안 주위 온도에서 DCC (1.2 당량)으로 처리하였다. HM-RBB (1 당량; 실시예 58)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비를 나타낼 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 추가로 희석하고, 우레아 종을 여과하고, 여액을 수성 후 처리하였다. 진공 하에서의 휘발성 물질을 황산나트륨 증발로 건조시킨 후, 다음 단계를 위해 충분히 순수한 조 생성물로서 청색 비정질 고체를 수득하였다. 수율: > 85 %. ESI-MS (음성) [MH]-: 1163.
실시예 60. H-AAAPM-RBB
Figure pct00064
등급: 레마졸 브릴리언트 블루를 기본으로 한 염료 복합체, 펜타펩타이드 구성 단위, 카텝신 기질.
합성: Fmoc-AAAPM-RBB (1 당량, 실시예 59)을 주위 온도에서 메탄올 및 피페리딘 (2: 1 v/v)의 혼합물에 교반하면서 용해시켰다. 짧은 시간 (1시간 미만) 후에, ESI-MS (-p)를 통한 반응 모니터링은 출발 물질의 소비를 나타내었고, 반응은 진공 하에 임의의 휘발성 물질의 증발에 의해 중단되었다. 아세토니트릴에서 취한 조 생성물로서 청색 비정질 고체가 잔류 하였다. 불용성 백색 부산물을 여과하고, 다시 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 추가 조사를 위해 충분히 순수한 청색 비정질 생성물을 수득하였다. 수율: 정량적. ESI-MS (음성) [MH]-: 941.
실시예 61. 폴리-N-아크로일-S-트리틸시스테인
Figure pct00065
무수 DMF (6 mL) 중의 폴리-p-니트로페닐아크릴레이트 (PAA) (722 mg)의 용액에 H-Cys (Trt)-OH (1030 mg) 및 트리에틸아민 (450 μL)을 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 반응 혼합물을 때로 초음파로 조심스럽게 이동(즉, 롤링)하였다. 그런 다음 혼합물을 가끔 흔들어 주면서 54 °C로 15시간 동안 가온시켰다. MS에 의한 반응 모니터링이 H-Cyst (Trt)-OH의 소멸을 나타낼 때, 에탄올아민 (250 μL)을 첨가하여 미반응 부위를 켄칭시키고 추가로 30분 동안 가온을 계속하였다. 혼합물을 메탄올 (80 mL)에 부었다. 모든 침전물을 분리하고, DMF (5 mL)로 재용해하고, 포름산 (100 mL) 또는 포화 수성 염화칼슘 용액 (100 μL)을 첨가하여 메탄올 (100 mL)로 재침전시켰다. . 침전물을 분리하고, 메탄올 (100 mL)로 2시간 동안 교반하고 여과하였다. 메탄올 및 디에틸에테르로 세척한 후, 생성물 540mg을 분리하였다.
상층액의 조합, 니트로페놀의 색소가 사라질 때까지의 포름산 첨가 및 상기한 바와 같은 침전물의 재침전에 추가로 405 mg의 생성물이 수득되었다. 총 수율: 약 70 %. (재료의 중합 성질로 인해 특별한 특성화가 가능하지 않았다. 그러나, 트리틸-시스테인의 소실은 제안된 구조에 대한 강력한 지지이다).
이 절차를 사용하여 다른 아민을 활성화된 폴리아크릴레이트에 로딩한다 (표 1 참조). 소량으로 수행되는 경우, DMF 중 조 반응 혼합물의 겔 크로마토그래피가 적합한 정제 방법인 것으로 판명되었다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
[표 1]
Figure pct00066
실시예 62. 펩타이드 -염료 복합체를 중합체 ( 폴리 -( N- 아크로일- Boc - Lys - OH )-코-(아크로일-Cys(Trt)-OH)에 연결
단계 A:
Figure pct00067
H-AAPVA-RBB (52 mg; 실시예 40)를 DMF (1 mL)에 용해시키고 에틸 디이소프로필아민 (10 μL)과 혼합하였다. 클로로아세트산 무수물 (10.8 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 추가의 클로로아세트산 무수물 (8.5 mg)을 첨가하였다. 추가 2시간 동안 교반한 후, MS는 우세한 전환율을 나타냈다. 500μL의 이 용액을 폴리-(N-아크로일-Boc-Lys-OH)-코-(아크로일-Cys (Trt)-OH) (104 mg, 표 1의 항목 4) 및 에틸 디이소프로필아민 (70 μL)과 혼합하였다. 혼합물을 밤새 60 °C로 가열한 다음, 40분 동안 80 °C로 가열하였다. 반응 혼합물 정제를 위해 세파덱스 LH 20 ® 칼럼에 적용하였으며; 전면 용리 청색 구역을 분리하여 85 mg의 생성물을 수득하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다). MS-분석 (m/z = 571, 음성 모드)에 의해 발견되는 바와 같이, 엘라스타아제 처리는 Ala-RBB를 방출하였다.
단계 B:
Figure pct00068
단계 A의 생성물을 DCM (1 mL) 및 메탄올 (0.5 mL)로 용해시키고 트리플루오로 아세트산 (0.5 mL)으로 40분 동안 처리하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 생성물을 디에틸에테르 (100 mL)를 첨가하여 침전시켰다. 생성물은 청색 중합체 고체이며, m/z = 1200 이하의 음성 모드에서 관찰 가능한 것은 없다. MS- 분석 (m/z = 571, 음성 모드)에 의해 발견되는 바와 같이, 엘라스타아제 처리는 A-RBB를 방출하였다.
단계 C:
Figure pct00069
폴리-N-아크로일시스테인 및 530 mg의 폴리-N-아크로일-S-트리틸시스테인을 18 ㎖의 디클로로 메탄, 1 ㎖의 트리이소프로필실란 및 2 ㎖의 트리플루오로아세트산의 혼합물과 함께 용해시켰다. 0.5 mL의 물을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 증발시키고 물 및 디에틸에테르로 세척하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화가 불가능하였다).
실시예 63. 중합체에 연결된 고-로딩 아미노-펩타이드-염료 복합체의 예시적인 구성
Figure pct00070
a) H-AAPVA-RBB (68 mg; 실시예 40)를 DMF (1 mL)로 용해시켰다. 클로로아세트산 무수물 (16 mg), 이어서 에틸 디이소프로필아민 (100 μL)을 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, Jeffamine ® 900 (80mg)을 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 70 °C로 가온시켰다. 폴리-p-니트로페닐아크릴레이트 (75mg) 및 디이소프로필아민 (100μL)을 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 중합체의 잔류 반응 자리를 n- 부틸 아민으로 켄칭시켰다. (150 μL) 청색 중합체 생성물을 세파덱스 LH 20 ®상에서 겔 크로마토그래피로 분리하여 105 mg을 수득하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나, 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이어서 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
Figure pct00071
b) (단계 A에서 제조한) 500 μL의 클로로아세트아미도-AAPVA-RBB 58 mM 용액과 4 μL의 에틸렌디아민을 합쳐 60℃에서 밤새 80℃로 1시간 동안 가열한다. 72mg의 폴리-(4-니트로페닐)아크릴레이트를 500μL의 DMF에 용해시키고 70μL의 트리에틸아민을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 300 μL의 1M KOH의 수용액을 첨가하고, 혼합물을 추가로 45분 동안 롤링한다. 침전물을 원심 분리에 의해 분리하고, 이어서 0.1M KOH로 용해시키고 포름산으로 침전시켰다. 침전물을 1 ㎖의 포화 수성 NaHCO3에 용해시키고 6 g의 세파덱스 LH20 칼럼을 통과시켰다. 진공 건조하여 84 mg의 푸르스름한 고체를 수득하였다.
Figure pct00072
c) R = H, CH2C(=O)-AAAPV-RBB. 190 mg의 H-AAAPV-RBB (실시예 68c)를 3 mL의 DMF에 용해시키고 40 mg의 클로로아세트산 무수물을 첨가하였다. 디이소프로필 에틸 아민 40 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 클로로아세트산 무수물 (17 mg) 및 디이소프로필 에틸 아민 (20 μL)의 2 차 배치가 각각 첨가되고, 1시간 동안 교반을 계속한다. 반응 혼합물을 실리카 겔에 적용하고, 포름산 0.2 %를 함유하는 사이클로헥산-메탄올-디클로로 메탄의 구배 (16-3-3 내지 3-1-1)로 크로마토그래피 하였다. 생성물 분획은 69mg을 함유하고, 이를 DMF 1mL에 용해시켰다. 20 ㎕의 디이소프로필 에틸 아민을 첨가한 다음, 12 ㎕의 Jeffamine EDR 176을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 질량 분석기로 분석 한 결과 펩타이드가 아민에 1, 2 또는 3 회 첨가된 알킬화 생성물의 혼합물이 나타났다 (음성 모드, m/z = 1125 = 모노 알킬, 단일 전하, m/z = 1038 = 이중 전하; m/z = 1513 = 삼중 알킬, 이중 전하; 및 m/z = 1009 = 삼중 알킬, 삼중 전하). 반응 혼합물에 38 mg의 폴리-p-니트로페닐아크릴레이트를 공급하고 실온에서 1시간 동안 교반한 다음 54 °C에서 90분간 유지하였다. 250 μL의 N , N- 디 옥틸 아민을 첨가하고 때때로 혼합물을 54 °C에서 3시간 동안 때때로 진탕하면서 유지한다. 생성물을 아세톤으로 침전시키고, 물-메탄올 3-1 (가장 높은 분자량 분율을 수집함)을 갖는 세파덱스 LH 20 6 g의 칼럼을 통해 메탄올 중 용액 후 침전물의 크로마토그래피에 의해 분리하여 31 mg의 수용성 물질을 수득한다. 동일한 절차가 H-AAAPVV-RBB에 적용될 수 있다 (실시예 68c).
실시예 64. Fmoc-AAAPV-(디아미노벤조산)
Figure pct00073
Fmoc-AAAPV-OH (710 mg)를 DMF (5 mL)로 용해시켰다. 이어서, HOBt (210mg) 및 DCC (240mg)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 3,4-디아미노벤조산 (160 mg) 및 피리딘 (100 μL)을 DMF (1 mL)에 용해시키고, 교반하면서 반응 혼합물에 첨가하였다. 14시간 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 0.5 % 포름산을 함유하는 사이클로헥산/DCM/메탄올 (4/2/1)을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 400 mg의 생성물을 수득하였다.
ESI-MS (양성) [M + H] = 784.
실시예 65. H-AAAPV- (디아미노 벤조산)
Figure pct00074
DMF (3 mL) 중 Fmoc-AAAPV- (디아미노 벤조산) (400 mg; 실시예 64)의 용액에 피페리딘 (0.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하고, 증발 (1 mbar, 55℃)에 의해 농축시켰다. 잔류물을 디에틸에테르 (25 mL) 및 중간 여과로 2 회 교반하였다. 형성된 생성물은 후속 사용을 위해 충분히 순수했다. ESI-MS (양성) [M + H] = 562.
실시예 66. 폴리(AAAPV- {디아미노 벤조산} 아크릴아미드)
Figure pct00075
시스테아민 염산염 (11mg)를 아르곤으로 전처리한 DMF (5mL)에 용해시켰다. 폴리-4-니트로페닐 아크릴레이트 (120mg) 및 트리에틸아민 (200㎕)을 첨가하였다. 전체 공정 중에 산소를 배제하도록 주의를 기울였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 교반하였다. H-AAAPV- (디아미노 벤조산) (230 mg; 실시예 65)를 DMF (3 mL)에 용해시키고, 아르곤으로 처리하고 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 밤새 교반하였다. 생성물을 0.5 % 포름산을 함유하는 메탄올 (100 mL)로 아르곤 스트림 하에 침전시켰다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되어 있음을 증명한다.)
실시예 67. 폴리-코- [(N- 메르캅토에틸 아크릴아미드)-(AAAPV- {RBB}-아크릴아미드)]
Figure pct00076
a) 시스테아민 염산염 (2 mg)을 아르곤으로 전처리된 DMF (5 mL)에 용해시켰다. 폴리-4-니트로페닐 아크릴레이트 (36 mg) 및 트리에틸아민 (50 μL)을 첨가하였다. 전체 공정 중에 산소를 배제하도록 주의를 기울였다. 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 교반하였다. H-AAAPV-RBB (125 mg, 실시예 68c)를 DMF (2 mL)로 용해시키고, 아르곤으로 처리하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 65℃에서 밤새 교반하였다. 생성물을 세파덱스 LH 20 ®(6 g)의 칼럼을 통해 물과 메탄올의 혼합물 (4/1, 아르곤으로 전처리)과 반응 혼합물 1 ㎖를 통과시켜 용리시켰으며; 바로 정면에 있는 청색 용리액을 모으고 진공 농축시켰다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
b) 9.5 mL의 DMF에 용해된 95 mg의 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트 용액 2.2 mL를 아르곤으로 세척해 내고 32 mg의 메르캅토에틸아민 염산 용액46 μL과 739 μL의 아르곤 세정 DMF에 트리메틸아민 용액45 μL과 조합한다. 30분 동안 교반한 후, 45 mg의 H-AAAPV-RBB (실시예 68c) 및 100 ㎕의 트리에틸아민을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 54℃에서 90분간 유지 한 후, 100㎕의 에탄올 아민을 첨가하고, 반응물을 54℃에서 90분간 더 유지시켰다. 생성물을 물-메탄올을 3:1로 갖는 세파덱스 LH 20 6 g의 칼럼에 통과시켜 분리하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
동일한 절차가 H-AAAPVV-RBB에 적용될 수 있다 (실시예 68c).
폴리-코-[( N -2- {3- (4- 아지도페닐)프로피오닐}아크릴아미드)-(AAAPV- {RBB-아크릴아미드)
Figure pct00077
c) DMF 9.5 mL 중의 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트 95 mg의 용액 2.2 mL를 2.2 mg의 4- 아지도페닐알라닌 및 5.8 μL의 트리메틸 아민과 혼합하였다. 실온에서 30분 동안 교반한 후, H-AAAPV-RBB 43mg을 트리에틸아민 100㎕와 함께 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 54℃에서 90분간 유지 한 후, 100㎕의 에탄올 아민을 첨가하고, 반응물을 54℃에서 90분간 더 유지시켰다. 생성물을 물- 메탄올 3-1을 사용하여 6 g의 세파덱스 LH 20 칼럼을 통과시켜 분리하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
동일한 절차가 H-AAAPVV-RBB에 적용될 수 있다. (상기와 같은 R = Ala-Ala-Ala-Pro-Val-Val-RBB의 구조).
비드에 결합되는 AAAPV-RBB
Figure pct00078
또는
Figure pct00079
d) 30 ㎎의 H-AAAPV-RBB을 세파비즈 ECEP 93 mg (활성화 에폭시) 및 DMF 50 μL에 조합하였다. 혼합물을 54℃에서 72시간 동안 유지시키고, 더 이상 용출되지 않을 때까지 디클로로메탄-메탄올 혼합물 (3-1)로 그리고 나서 DMF로 세척하였다.
동일한 절차가 H-AAAPV-RBB 대신 H-AAAPVV-RBB에 적용될 수 있다.
Figure pct00080
E) Chemicell SiCore 아민 비드 50 mg을 DMF로 4 회 세척하고, 800 μL의 DMF에 현탁시켰다. 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트 90mg을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 진탕시켰다. 32 mg의 H-AAAPVV-RBB (실시예 68c) 및 50 ㎕의 트리에틸아민을 첨가하였다. 60℃에서 진탕을 16 시간 동안 계속하였다. 비드를 원심 분리하고, 상청액을 따라 내고, 실시예 67g에 사용하고, 비드를 100 ㎕의 DMF 중 10 ㎕의 에탄올 아민으로 처리하였다. 1.5 mL의 DMF로 5 회 세척한 후, 비드를 1.5 mL의 물로 2 회 세척하였다. 비드는 청색으로 씻을 수 없다.
Figure pct00081
f) 33 mg의 H-AAAPVV-RBB 및 19 mg의 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트를 0.5 mL의 DMF와 50 ㎕의 트리에틸아민과 혼합하고 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. e)에서 제조한 비드 (50 mg)를 첨가하고 60℃에서 진탕을 16 시간 동안 계속하였다. 비드를 원심 분리하고, 상청액을 따라 내고, 실시예 67g에 사용하고, 비드를 100 ㎕의 DMF 중 10 ㎕의 에탄올 아민으로 처리하였다. 비드를 1.5 mL의 DMF로 5 회 세척한 다음, 1.5 mL의 물로 2 회 세척하였다. 비드는 청색을 획득하고 씻을 수 없다.
비-비드 결합 중합체 물질의 분리
Figure pct00082
g) e) 및 f)의 조합된 상청액에 120㎕의 에탄올아민을 첨가하였다. 혼합물을 54℃에서 밤새 유지하였다. 1 % 포름산을 함유하는 250 mL의 디에틸에테르에 부은 후, 불용 물을 원심 분리에 의해 분리하고, DMF 2 mL로 용해시키고, 물- 메탄올 (4-1)을 사용하여 6 g의 세파덱스 LH 20 칼럼을 통과시켰다. 2 mg의 청색 고분자량 분획을 분리할 수 있다.
실시예 68. 소수성 앵커가 있는 중합체 결합 염료와 엘라스타아제의 절단 부위
Figure pct00083
R1은 Ala-Ala-Ala-Pro-Val-(RBB이고 R2는 H이거나,
R 1은 n-옥틸이고 R2는 H이거나,
R 1 및 R 2 모두 n-옥틸이다.
a) H-AAAPV-RBB (240mg; 실시예 68c) 및 폴리-(4-니트로페닐) 아크릴레이트 (103mg)를 혼합하고 DMF (5ml)에 용해시켰다. 트리에틸아민 (600μL)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. N, N-디옥틸 아민 (130 μL)을 첨가하고 혼합물을 때때로 5시간 동안 진탕시키면서 54℃에서 유지시켰다. n-옥틸 아민 (150 μL)을 첨가하고, 혼합물을 54℃에서 밤새 유지시켰다.
혼합물을 1 % 포름산을 함유하는 물 (50 mL) 중에 부었다. 침전된 물질을 원심 분리에 의해 수집하고 따뜻한 메탄올 (10 mL)로 재용해시켰다. 물로 2 차 침전시킨 후 (200 mL, 0.5 % 포름산), 침전물이 나타나고 여과에 의해 분리되었다. 청색 물질을 건조시키고, 따뜻한 메탄올 (10 mL)로 재용해시키고, 디에틸에테르로 침전시켰다. 여과 및 건조시킨 후, 청색 분말을 잔류시켰다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화가 불가능하였다).
Figure pct00084
b) Fmoc-AAAPV-RBB의 합성: DMF 10ml 중의 테트라펩타이드 Fmoc-AAAP-OH (740mg) 및 HOBt·H2O (200mg)의 교반된 혼합물을 주위 온도에서 15분 동안 DCC (198mg)로 처리하고 HV-RBB (680mg; 실시예 42)를 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 ESI-MS (음성 모드)를 통한 반응 모니터링이 출발 물질의 소비 (약 15시간, 밤새)를 나타낼 때까지 실온에서 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 감압 제거하였다. 고체 잔류물을 10 g의 실리카 겔에 적용하고 7-2-1 내지 11-6-5의 사이클로헥산-에틸 아세테이트-메탄올의 구배 (각각 0.1 % 포름산을 함유함)로 크로마토그래피 하였다. 수율: 342mg. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 1131.
Figure pct00085
Fmoc-AAAPVV-RBB는 Fmoc-AAAPVV-OH로부터 출발하여 실시예 68b와 유사한 절차를 사용하여 제조하였다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 1230.
Figure pct00086
c) H-AAAPV-RBB의 합성: Fmoc-AAAPV-RBB (342 mg, 실시예 68 b)를 DMF (약 12 mL)로 용해시켰다. 피페리딘 (0.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안, MS 로의 반응 모니터링이 출발 물질의 소비 (m/z = 1131, 음성 모드) 및 생성물 (m/z = 909, 음성 모드)을 나타낼 때까지 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔류물을 DCM 및 메탄올 (5: 1, 5 ml)의 혼합물로 30분 동안 교반한 다음, 디에틸에테르 (20 mL)를 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 여과로 단리하고, 격렬히 교반하면서 디에틸에테르 (25 mL)로 60분 동안 처리하였다. 흡인 여과하고 54℃에서 3시간 동안 건조시킨 후, 288 mg의 강한 청색 미세 분말을 분리하였다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 909.
Figure pct00087
H-AAAPVV-RBB의 합성은 실시예 68c에 기재된 바와 유사한 절차를 사용하여 제조하였다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 1008.
d) 40 mg의 AAAPV-RBB 및 14 mg의 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트를 1 mL의 DMF에서 혼합하였다. 모든 것이 용해되었을 때, 100μL의 트리메틸아민을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 20 ㎕의 N, N- 디옥틸아민을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올-물 혼합물 (1 + 3)을 사용하여 6 g의 세파덱스 LH 20의 칼럼을 2 회 통과시켜 짙은 청색 중합체 분말 13 mg을 수득하였다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되었음을 증명한다).
Figure pct00088
e) N-[(3-트리에톡시실릴)프로필]-N '- [AAAPVV-RBB]우레아의 합성 및 이어서 실리카 겔에 대한 화합물의 결합: H-AAAPVV-RBB (49 mg; 실시예 68c) DMF (2 mL)로 처리하였다. (이소시아나토프로필)트리에톡시실란 (80 μL; 건조 DMF 중의 10 % 용액으로서)을 첨가하고 혼합물을 주변 온도에서 교반하였다. 2시간 후, (이소시아나토프로필)트리에톡시실란의 제 2 부분 (80 μL; 건조 DMF 중 10 % 용액으로서)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. ESI-MS에 의한 반응 모니터링이 완전한 전환 (음성 모드) [MH]-: 1255)을 나타낼 때 실리카 겔 (Reprosil 100, Dr. Maisch, 5μm, 기공 크기: 100옹스트롱(Å), 비표면: 280m2/g) 35mg을 100 ㎕의 반응 혼합물과 합하고 진탕하면서 75℃에서 밤새 배양하였다. 생성물을 원심 분리에 의해 단리시키고, DMF (5x1mL) 및 물 (2 x 1mL)로 세척하였다. 그것은 진한 청색 분말로 구성되어 있었고 5시간 이내에 물이나 DMF가 함유된 청색을 나타내지 않았다.
실시예 69. Fmoc-A-( N- 페닐피페라지닐)아미드
Figure pct00089
Fmoc-A-OH (1.69 g) 및 HOBt (1.2 g)를 DCM (25 mL)에 현탁시켰다. 1-에틸-3- (3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 (EDCI) (1.12 g)을 첨가하고 혼합물을 10분 동안 교반하였다. N- 페닐피페라진 (605 mg)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 추가로 60분 동안 교반하였다. 혼합물을 1N 수성 HCl 및 1N 수성 K2CO3 (각각 2 Х), 염수로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 증발시켜 1.3g의 충분히 순수한 생성물을 수득하였다. ESI-MS (양성) [M + H] = 456.
실시예 70. (4- 디메틸아미노페닐)-(4-[4- N -{ N -Fmoc-알라닐}] 피페라지노페닐)-카르베늄이온 [Fmoc-A-(CV)] (a) 및 비스-(4-디메틸아미노페닐) (4-[ N- 피페라지노]페닐)-카르베늄이온 (CV) (b)
Figure pct00090
조질의 Fmoc-A- N- 페닐피페라진 아미드 (2.52g, 실시예 69) 및 4,4'- 비스 (N, N- 디메틸 아미노) 벤조페논 (Michler 케톤, 1.92g)의 혼합물에 포스포러스 (V) 옥사이클로라이드 (1.6 mL)을 첨가하고, 모든 것이 균질하게 습윤될 때까지 시약을 혼합하였다. 혼합물을 2시간 동안 100℃로 가열하고, 냉각시키고 아세톤 및 물의 혼합물 (1: 1)로 용해시켰다. 실리카 겔 (8 g)을 흑청색 용액에 적용하고, 혼합물을 증발 건조시켰다. 사이클로헥산-에틸 아세테이트-메탄올 (8/1/1, 0.5 % 포름산을 3/1/1이 되게 함유한 후, 0/1/1이 되게 3 % 트리에틸아민을 함유함)의 구배로 용리하여 1.22 g의 (a) (m/z = 706) 및 720mg의 (b) (m/z = 413)을 염으로서 얻었다. ESI-MS (양성) [M] = 706 및 413.
실시예 71. 4-([4-{H-Ala-Ala-Pro-Val-Ala}아미도 N -피페라지노페닐)-비스-(4-디메틸-아미도페닐)-카르베늄이온 (H-AAPVA-CV) 및 4-([4-{H-Ala-Ala-Pro-Val-Ala}아미도 N -피페라지노페닐)-비스-(4-디메틸-아미도페닐)-카르베늄이온 폴리아크릴아미드
Figure pct00091
A. Fmoc-A-CV (980 mg; 실시예 70a)를 DCM (40 mL)으로 용해시켰다. 과량의 피페리딘 (2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 잔류 피페리딘을 30 mbar/50℃ 미만에서 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 사이클로헥산 (3x)로 세척하고, 건조시키고 DCM (10 mL)으로 용해시켰다. 생성물을 MS (m/z = 484)에 의해 확인하였다.
B. Fmoc-Val-Pfp (870 mg)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 DCM (20 mL) 중 피페리딘 (2 mL)으로 처리하였다. 모든 휘발성 물질을 제거하고, 혼합물을 사이클로헥산 (3x)으로 세척하고 <30 mbar/50℃ 에서 진공 건조시켰다. 혼합물을 HPLC로 정제하여 110 mg의 목적하는 중간체를 수득하였다.
C. Fmoc-AAP-OH (110mg)를 HOBt (50mg)와 혼합하고 DMF (20mL)에 현탁시켰다. EDCI (50mg)를 첨가하고, 혼합물을 추가로 10분 동안 교반하였다. 단계 B로부터의 중간체 (110mg)를 첨가하고, 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. MS (m/z = 1044)에 의한 반응 모니터링은 예상되는 생성물의 형성을 나타냈다.
D. 반응 혼합물을 피페리딘 (0.5 mL)으로 처리하고 밤새 교반하였다. MS는 표적 화합물 (ESI-MS (양성) [M] = 822)의 형성을 나타냈다. 모든 휘발성 물질을 <30 mbar/50℃에서 진공 제거하였다. MS- 분석 (m/z = 484, 양성 모드)에 의해 발견되는 바와 같이, 엘라스타아제로 물질을 처리하면 A-CV를 방출하였다.
E. 579 mg의 폴리-p-니트로페닐 아크릴레이트를 6 ml의 DMF로 용해시킨다. D의 잔류물을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. MS는 m/z = 822에서의 피크의 소실을 나타낸다. 500㎕의 에탄올 아민을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 7 시간 동안 교반하였다. CV-양이온의 청색은 산 처리에 의해 재형성될 수 있다. 1 mL의 조제품을 세파덱스 LH 20 (20 mL, 물/메탄올 2 + 1) 칼럼을 통과시킨다. 정면에서 용리되는 청록색 분획을 수집하고 건조시킨다 돼지와 인간 엘라스타아제로 처리하면 m/z = 484에 질량 피크가 나타나는 것으로 입증된 것처럼 A-CV가 방출된다. (재료의 고분자 특성으로 인해 특별한 특성화는 불가능하다. 그러나 세파덱스를 통과한 물질은 고분자량 및 청색이므로 중합체에 염료가 부착되어 있음을 증명한다. 또한, 반응 중에 질량 스펙트럼에서 m/z = 822에서의 피크가 사라지는 것이 이것을 뒷받침한다).
실시예 72. 비스-(4-디메틸아미노페닐)-(4-[4- N -{6- N -발리노일) 아미노헥사노일}]피페라지노페닐)-카르베늄이온 (Fmoc-Val-아미노헥실-CV 또는 Fmoc-V-Ahx-CV)
Figure pct00092
DCM (15 mL) 중 CV (720 mg; 실시예 70b)의 용액에 Fmoc-6-아미노 헥산산 펜타플루오로페닐 에스테르 (1.18 g)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 피페리딘 (1 mL)을 첨가하였다. 1 일 동안 교반한 후, 모든 휘발성 물질 을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 사이클로헥산 (3x)으로 추출하고 DCM (15ml)로 재용해시켰다. Fmoc-Val-Pfp (1.13 g)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 제거하고, 잔류물을 메탄올 (22 mL) 및 물 (3 mL) (3 % 포름산 함유)의 혼합물로 용해시켰다. 조제물을 3 % 포름산 (50 mL)으로 물로 침전시키고 원심 분리하였다. 잔류물을 예비 HPLC로 분리하여 검은색-청색 물질 160 mg을 수득하였다. 물질을 DCM (5 mL)으로 용해시키고 피페리딘 (250 μL)으로 밤새 처리하였다. HPLC로 농축하고 정제하여 40 mg의 목적 생성물을 수득하였다. ESI-MS (양성) [M] = 847.
실시예 73. H-AAPV-Ahx-CV
Figure pct00093
실시예 42, 단계 D에 기재된 바와 같은 Fmoc-V-Ahx-CV (실시예 71)의 처리에 의해 H-AAPV-Ahx-CV가 생성되었다. ESI-MS (양성) [M] = 864
실시예 72의 생성물을 엘라스타아제로 처리하면 MS 분석 (no m/z = 526, 양성 모드)에 의해 확인 된 바와 같이 Ahx-CV가 방출되지 않는다.
실시예 74. Jeffamine EDR176-변형된 하이프로멜로오스
Figure pct00094
하이프로멜로오스 (89 kDa, 5 g)를 NMP (150 mL)에 용해시켰다. 용해시킨 후, 톨루엔 (100 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 딘-스타크 (dean-starck) 트랩으로 1시간 동안 환류시켜 공비 증류로 물을 제거하였다. 건조된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 토실 클로라이드 (1.45 g)를 첨가한 후, 피리딘 (30 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 유지시켰다. 마지막으로 Jeffamine EDR 176 (15 g)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음 혼합물을 1시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응이 완료된 후, 휘발 물질을 증발시켜 제거하였다. 생성된 용액을 물 (MWCO 10.000-20.000 Da)에 대해 투석하였다. 용액을 증발 건조시켰다. 생성된 생성물을 에탄올에 용해시키고 에틸 아세테이트/사이클로헥산 (3x)으로 침전시켰다. 생성물은 암갈색 중합체 필름이었다. 수율: 1.7 g; 0.34 mmol/g N.
실시예 75. EDA 변형된 하이프로멜로오스
Figure pct00095
하이프로멜로오스 (89 kDa, 5 g)를 NMP (120 mL)에 용해시켰다. 용해 후, 톨루엔 (50 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 딘-스타크 (dean-starck) 트랩으로 1시간 동안 환류시켜 공비 증류로 물을 제거하였다. 건조된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 염화 메실 (1.9 mL)을 첨가한 후, 피리딘 (20 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 유지시켰다. 마지막으로, 에틸렌 디아민 (EDA, 100 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음 혼합물을 1시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응이 완료된 후, 휘발 물질을 증발시켜 제거하였다. 생성된 용액을 물 (MWCO 10.000- 20.000 Da)에 대해 투석하였다. 용액을 증발 건조시키고, 생성된 생성물을 에틸 아세테이트 (5x)로 추출하였다. 약간 황색 필름. 수율: 2.9 g; 0.67 mmol/g N.
실시예 76. EDA 변형된 하이드록시에틸 셀룰로오스
Figure pct00096
하이드록시에틸 셀룰로오스 (90 kDa, 10 g)를 NMP (250 mL)에 용해시켰다. 용해시킨 후 톨루엔 (200 ml)을 첨가하였다. 혼합물을 딘-스타크 트랩으로 1시간 동안 환류시켜 공비 증류로 물을 제거하였다. 건조된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서 염화토실 (8.8g)을 첨가한 후, 피리딘 (3.75g)을 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 그리고 실온에서 5시간 동안 유지시켰다. 마지막으로 에틸렌 디아민 (30 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후 혼합물을 2시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응이 완료된 후, 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였다. 그런 다음 휘발 물질을 증발로 제거하였다. 생성된 용액을 물 (MWCO: 10.000 내지 20.000 Da)에 대해 투석하였다. 용액을 증발 건조시키고, 생성된 생성물을 에틸 아세테이트/에탄올 (3: 1, 3x)로 추출하였다. 황색 필름. 수율: 3.85 g; 0.45 mmol/g N.
실시예 77. Jeffamine EDR 176 변형된 하이드록시에틸 셀룰로오스
Figure pct00097
하이드록시에틸 셀룰로오스 (250 kDa, 5 g)를 NMP (160 mL)에 용해시켰다. 용해시킨 후, 톨루엔 (100 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 딘-스타크 트랩으로 2시간 동안 환류시켜 공비 증류로 물을 제거하였다. 건조된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 염화 토실 (4.2g)를 첨가한 후, 피리딘 (1.75g)을 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 2시간 동안 그리고 실온에서 2시간 동안 유지시켰다. 마지막으로, Jeffamine EDR 176 (20 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후 혼합물을 2시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응이 완료된 후, 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였다. 그런 다음 휘발 물질을 증발로 제거하였다. 생성된 용액을 물 (MWCO: 10.000 내지20.000 Da)에 대해 투석하였다. 용액을 증발 건조시키고, 생성된 생성물을 에틸 아세테이트 (3x)로 추출하였다. 황색 필름. 수율: 4.1 g, 고 분자량 부분에서 0.99 mmol/g N.
실시예 78. 트리옥사트리데칸디아민 변형된 하이드록시에틸 셀룰로오스
Figure pct00098
하이드록시에틸 셀룰로오스 (90 kDa, 5 g)를 NMP (200 mL)에 용해시켰다. 용해시킨 후, 톨루엔 (150 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 딘-스타크 트랩으로 2시간 동안 환류시켜 공비 증류로 물을 제거하였다. 건조된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 온도에서, 염화 토실 (4.2g)를 첨가한 후, 피리딘 (1.75g)을 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 3시간 동안 그리고 실온에서 4시간 동안 유지시켰다. 마지막으로 O, Oal 비스 (3-아미노프로필)디에틸렌 글리콜 (50 g)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후 혼합물을 3시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응이 완료된 후, 불용성 물질을 여과에 의해 제거하였다. 그런 다음 휘발 물질을 증발로 제거하였다. 물 (100 mL)을 첨가한 후, 생성된 용액을 물 (MWCO 10.000- 20.000 Da)에 대해 투석하였다. 용액을 증발 건조시키고, 생성된 생성물을 에틸 아세테이트 (3x)로 추출하였다. 끈적한 갈색 덩어리를 P4O10 로 건조시키고, 다시 아세트산 에틸/에탄올로 추출하였다 (3: 1). 어두운 갈색 필름. 수율: 5.6g; 높은 MW 분율에서 0.98 mmol/g N.
실시예 79. HEC-EDR176- N- 프로피오닐-AAPVA-RBB
Figure pct00099
Jeffamine EDR 176 변형된 하이드록시에틸 셀룰로스 (0.05 g, 실시예 77) H 2 O (10 ㎖) 및 메탄올 (10 ㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 MeOH (3 mL) 중의 아크릴아미도-AAPVA-RBB (실시예 49) (21 mg)를 첨가하였다. 혼합물을 NaHCO3을 사용하여 pH 8.0으로 조정하고, 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 청색 침전이 형성되었다. 이 혼합물을 NaHCO3, 물 (2x), (MWCO 12 - 14 kDa)에 대해 투석하였다. 여과 후, 밝은 청색 용액을 증발시켜 청색의 필름을 수득하였다. 수율: 45 mg, 고분자량 분획에서 청색.
실시예 80. HEC-PEG200- N- 프로피오닐-AAPF-RBB
Figure pct00100
트리옥사트리데칸디아민 변형된 하이드록시에틸 셀룰로스 (0.22 g, 실시예 78) H 2 O (20 ㎖) 및 메탄올 (10 ㎖)에 용해시켰다. 이 용액에, MeOH (5 mL) 중 아크릴아미도-AAPF-RBB (실시예 47 0.085 g)를 첨가하였다. 혼합물을 NaHCO3을 사용하여 pH 8.0으로 조정하고, 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 청색 침전이 형성되었다. 이 혼합물을 NaHCO3, 물 (2x)에 대해 투석하였다. 여과 후, 밝은 청색 용액을 증발시켜 청색의 필름을 수득하였다. 수율: 137 mg, 고분자량 분획에서 청색.
실시예 81. HEC-EDA- N- 프로피오닐-AAPF-RBB
Figure pct00101
EDA 변형된 하이드록시에틸 셀룰로오스 (실시예 76; 0.54 g)을 H2O (50 ㎖)에 용해하였다. 이 용액에, ACN (30 mL) 중의 아크릴아미도-AAPF-RBB (실시예 47) (0.085 g)를 첨가하였다. 혼합물을 NaHCO3을 사용하여 pH 8.0으로 조정하고, 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시켰다. 청색 침전이 형성되었다. 이 혼합물을 NaHCO3, 물에 대해 투석하였다. 여과 후 밝은 청색 용액을 증발시켜 엷은 청색 필름을 얻었으며 세척시 색상을 방출하지 않았다. 수율: 400mg.
실시예 82. PEI- N- 프로피오닐-AAPF-RBB
Figure pct00102
폴리에틸렌이민 (0.2 g, MW 60- 75 kDa)을 H2O (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 ACN (1 mL) 중 아크릴아미도-AAPF-RBB (15 mg) (실시예 47)를 첨가하였다. 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 NaHCO3 및 물에 대해 투석하였다. (12-14 kDa의 MWCO) 여과 후, 용매를 증발시켰다. 청색의 끈적 끈적한 잔류물을 얻었다. 수율: 140mg.
실시예 83. 아크릴아미도-AAPV-RBB
합성: 420 mg의 H-AAPV-RBB (실시예 44) 및 200 mg의 중탄산 나트륨을 25 mL의 DMF에 현탁시킨다. 아크릴로일 클로라이드 45 μL를 첨가한다. 2시간 후, 추가로 40 μL의 아크릴로일 클로라이드를 첨가한다. 반응을 밤새 끝낸 후, 혼합물을 농축시키고 에틸 아세테이트로 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 부 생성물 및 불순물을 제거한 다음 메탄올로 생성물을 추출시킨다. 수율 125 mg, ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 892.
실시예 84. α,ω-비스( N- 프로피오닐-AAPV-RBB)PEG (24k)
Figure pct00103
α,ω-비스-아미노 PEG (0.3 g; MW 24 kDa, 0,106 mmol/g N)를 H2O (5 ㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 ACN (20 mL) 중의 아크릴아미도-AAPV-RBB (33 mg) (실시예 83)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용액을 물/에탄올 (9: 1, 2x) 및 물 (2x) 중 NaHCO3에 대해 투석 (MWCO 12-14 kDa) 하였다. 여과 후, 용매를 증발시켰다. 염료가 고분자량 분획과 결합된 청색 수용성 고체 중합체가 수득되었다. 수율: 140mg.
실시예 85. α,ω-Bis ( N- 프로피오닐-AAPV-RBB) PEG (11k)
Figure pct00104
α,ω-비스-아미노 PEG (0.25 g; MW 11.4 kDa, 0,190 mmol/g N)를 H2O (5 ㎖)에 용해시켰다. 이 용액에 ACN (20 mL) 중의 아크릴아미도-AAPV-RBB (30 mg) (실시예 83)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 그런 다음 용액을 물/에탄올 (9: 1, 2x) 및 물 (2x) 중 NaHCO3에 대해 투석 (MWCO 12-14 kDa) 하였다. 여과 후, 용매를 증발시켰다. 청색이 고분자량 분획과 관련되어 있는 청색 수용성 고체가 얻어졌다. 수율: 120mg.
실시예 86. 프로필아미노 풀루란
Figure pct00105
시아노에틸 풀루란 (3.5 g)을 H2O (200 ml)에 용해시켰다. THF (200 mL)를 첨가하였다. 이 용액에 6.0 g의 CoCl2*6 H2O를 첨가하였다. 보라색 용액을 얼음 조에서 냉각시켰다. 이 온도에서 6.8 g의 NaBH4 를 6 시간에 걸쳐 첨가하였다. 검은색 침전이 형성되었다. 반응 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반하였다. 혼합물을 아세트산 (10 mL)으로 산성화시켰다. 1 일 후에 검은색 침전물을 용해시키고 생성된 보라색 용액을 투석 (MWCO 12-14 kDa, 물 3 x)에 적용시켰다. 백색 점성의 현탁액이 형성되었다. 생성물을 유리 아민으로 단리하기 위해, NaOH (약 2 g)를 첨가하였다. 점성이 적은 생성물이 물로 투석되었다. 증발시킨 후, 갈색 고체가 형성되었고, 이는 물에 불용성이었다. 갈색 고체, 1.85 mmol/g N. 수율: 2.4 g.
실시예 87. 프로필아미노 HEC
Figure pct00106
HEC (5.0 g; 90 kDa의 분자량)를 H2O (50 ㎖)에 용해시켰다. NaOH (0.16g)를 첨가하였다. 이 용액에 아크릴로니트릴 (0.8 mL)을 4시간 내에 첨가하고 (0.2 mL 분량으로) 실온에서 12시간 더 교반하였다. 황색 용액을 물 (MWCO 10-20 kDa, 2x)에 대해 투석하였다. 생성된 용액 (150 mL)을 THF (75 mL)로 희석시켰다. CoCl2·6 H2O (6.3 g)를 첨가하였다. 4시간 이내에 NaBH 4 (6.8g)를 첨가하여 환원시켰다. 검은색 침전이 형성되었다. 혼합물을 아세트산 (5 mL)으로 산성화시켰다. 침전물의 용해 후 (2d), 용액을 물에 대해 투석하였다 (MWCO 10-20 kDa, 2 x). 증발시킨 후, 황색의 수용성 고체를 얻었다. 수율: 3.5 g, 1.02 mmol/g N.
실시예 88. N -(프로피오닐-AAPV-RBB)-프로필아미노 HEC
Figure pct00107
프로필아미노 HEC (500 mg을 실시예 87)를 H2O (50 ㎖)에 용해시켰다. 아크릴아미도-AAPV-RBB (75mg) (실시예 83)를 ACN (25mL)에 용해시켰다. 용액을 합하고 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 54℃에서 2일 동안 유지시켰다. 생성된 어두운 청색 용액은 물/EtOH (9:1, 2x) 및 물 (2x)에서 NaHCO3 에 대하여 투석하였다. 15 mL로 부분 증발시킨 후, 매우 점성의 청색 용액을 수득하였다. 격렬하게 교반하면서, 이 용액을 ACN (80 mL)에 첨가하였다. 생성된 청색 침전물을 상청액에서 더 이상 미반응 염료가 검출되지 않을 때까지 ACN으로 추출하였다. 생성물을 ACN에 보관하였고 물/MeOH에 용해되는 푸른 고무상 고체였다.
실시예 89. 프로필아민 HEC (낮은 농도의 코발트 및 촉매로 실시예 87의 스케일 업)
Figure pct00108
하이드록시에틸 셀룰로오스 (50g; 90 kDa의 분자량)를 H2O (500 ㎖)에 용해시켰다. NaOH (1.6 g)를 첨가하였다. 이 용액에 아크릴로니트릴 (9.0 mL)을 6 시간 내에 넣고 (2.0 mL 분량으로) 실온에서 12시간 더 교반하였다. 혼합물을 물/THF (1: 1, 200 mL)로 희석하고 추가의 아크릴로니트릴 (2 mL)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 황색 용액을 물 (MWCO 10-20 kDa, 2x, 36 시간)에 대해 투석하였다. 이 용액 (1160 mL)을 THF (250 mL)로 희석시켰다. CoCl2·6 H2O (25 g)를 첨가하였다. 환원은 0 내지 5℃에서 18시간 이내의 NaBH4 (44g)를 첨가함으로써 달성되었다. 검은색 침전이 형성되었다. 혼합물을 아세트산 (50 mL)으로 산성화시켰다. 3 일 이내에 검은색 침전물이 용해되었다. 침전물이 용해된 후, 용액을 물 (MWCO 10 내지 20 kDa, 2x)에 대해 투석하였다. 용매를 부분 증발시킨 후, 점성 황색 용액을 수득하였다. 고형분: 약 30 g. 수율: 30 g; 건조 물질 중 0.85 mmol/g N.
실시예 90. 아크릴로일화 장쇄 PEG (2000)-AAPV-RBB 링커
100 mg의 비스-아미노 PEG 2000을 DMF (10 mL)에 용해시켰다. DMF (1 mL) 중의 아크릴로일화 AAPV-RBB (실시예 83) 12 mg을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 54℃에서 18시간 동안 유지시켰다. 용매를 증발시킨 후, 디에틸에테르를 첨가하여 과량의 비스-아미노 PEG를 추출하고 생성물을 침전시켰다. 침전물을 에테르 (2x)로 세척하고, 건조시키고 ACN (25ml)에 재용해시켰다. NaHCO3 (50 mg) 및 아크릴로일 클로라이드 (20 μL)을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 증발 건조시켰다. 에테르로 추출한 후, 잔류물을 물/ACN (1: 1, 1 mL)에 용해시켰다. 생성물, 어두운 보라색 용액을 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 91. [N -3- (트리에톡시실릴)프로필아미노]-AAPV-RBB
211 ㎎의 H-AAPV-RBB (실시예 44)를 10 ㎖의 DMF에 용해시켰다. 3-(트리에톡시실릴)프로필 이소시아네이트 63 ㎕를 한번에 첨가하고 10분 동안 교반을 계속하였다. 용매를 제거하고 생성물을 에테르로 침전시켰다. 에테르로 세척한 후, 어두운 보라색 분말을 얻었다. 수율: 120mg; m/z = 1085 (MH).
실시예 92. AAPV-RBB 표식 실리카 겔
Figure pct00109
[N-3-(트리에톡시실릴) 프로필아미노카르보닐]-AAPV-RBB (실시예 91) 14mg을 1.2mL의 DMF에 용해시켰다. 이 용액에 실리카 겔 100mg을 분산시켰다. 그 다음, 1 μL의 황산을 첨가하고 반응 혼합물을 75℃로 가열하였다. 혼합물을 이 온도에서 2일 동안 유지시켰다. 진한 청색 실리카 겔을 칼럼으로 옮기고 아세토니트릴 (200 mL), 물/아세토니트릴 (1: 1, 500 mL), 물/메탄올 (1: 1) 500 mL 및 물 (500 mL)로 세척하였다. 결과: 진청색 분말 65mg (추가 특성 규명을 위한 효소 분석 참조).
실시예 93. 장쇄 링커를 가진 펩타이드-표지된 beadBALL 아민 마이크로 스피어
아크릴로일 장쇄 PEG (2000)-AAPV-RBB 링커 (0.5 mL; 실시예 90)를 1 ml beadBALL 아민 마이크로 스피어 분산액에 첨가하였다. 반응은 60℃에서 2.5 일 동안 수행되었다. 마이크로 스피어를 원심 분리하고 물/ACN (1: 1, 8x) 및 물 (2x)로 세척하였다. 생성된 담황색의 침전물을 물 (1 mL)에 재현탁시켜 담황색 분산액을 얻었다.
실시예 94. 디아니시딘을 이용한 Fmoc-AAPV의 아미노화
Figure pct00110
Fmoc-AAPV (116mg) 및 HOBt (40mg)를 DCM (20mL)에 용해시켰다. 용액을 얼음조에 넣고 DCC (45 mg)를 첨가하였다. 0℃에서 30분간 교반하고, 실온에서 30분간 교반을 계속하였다. 그 다음, 5 배 과량의 o- 디아니시딘 (250mg)을 첨가하였다. 121시간의 반응 시간 후, 생성물을 ESI-MS (양성 모드) [M + H] +: 805, [M + Na] +: 827)에 의해 관찰하였다.
실시예 95: O- 알릴 클로로페놀 레드 합성
Figure pct00111
클로로페놀 레드 (2.76g), 알릴 브로마이드 (1.29mL) 및 탄산 칼륨 (1.8g)을 무수 아세톤 (50mL)에서 합하고 96 시간 동안 환류 하에 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 모든 고체를 여과하고 아세톤으로 세척하였다. 조합된 여액 (약 70 mL)을 격렬히 교반하면서 디에틸에테르 (350 mL)에 부었다. 교반을 20분 동안 유지한 다음, 침전물을 여과로 수집하고 재용해시키고 (아세톤 50 mL) 침전시켰다 (400 mL의 디에틸에테르). 30분 동안 교반한 후, 침전물을 여과 수집하고 54℃에서 건조시켜 2.72g을 수득하였다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 461; 물질은 더 이상 pH에 따라 색깔이 변화하지 않았다.
브로모페놀 레드를 사용한 동일한 절차는 유사한 생성물을 제공한다. (ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 551, 2 Br의 동위 원소 패턴, 64 %)
실시예 96: C- 알릴 클로로페놀 레드 합성
Figure pct00112
O- 알릴 클로로페놀 레드 (2 g, 실시예 95)를 니트로 벤젠 (10 mL)에 현탁시키고, 210℃의 오일 조에서 70분 동안 가열하였다. TLC 대조군 (실리카 겔, 클로로포름-메탄올 10-3, 2 % 포름산)은 완전한 전환율을 나타내었다 (추출물: Rf = 0.65, 생성물: Rf = 0.55, 출발 물질은 암모니아에 노출 시에 색이 변하지 않음, 암모니아에 노출 시ㅇ 어두운 보라색으로), 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음 디에틸에테르 (50 mL)로 희석시켰다. 침전물을 경사 분리로 수집하고, 메탄올 (25 mL)로 재용해시키고, 격렬하게 교반된 디에틸에테르 (300 mL)에 부어 침전시켰다. 용액-침전 과정을 니트로벤젠의 냄새가 검출되지 않을 때까지 반복 하였다 (2-3x). 생성물을 54℃에서 건조시켜 목적 화합물 (1.39 g)을 얻었다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 461; 염기로 처리하면 색이 진한 보라색으로 변했다.
실시예 97: C- 알릴 브로모페놀 레드 합성
Figure pct00113
O-알릴 브로모페놀 레드 (690 mg, 실시예 95)를 니트로 벤젠 (10 mL)에 현탁시키고 210℃의 오일 조 내에서 60분 동안 가열하였다. TLC 대조군 (실리카 겔, 클로로포름-메탄올 10-3, 2 % 포름산)은 완전한 전환율을 나타낼 때 (추출물: Rf = 0.59, 생성물: Rf = 0.45, 암모니아에 노출 시에 유색이 변하지 않음, 암모니아에 노출 시 어두운 바이올렛), 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음 디에틸에테르 (50 mL)로 희석시켰다. 침전물을 클로로포름-메탄올-사이클로헥산 (6-1-4)으로 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 210 mg의 표적 화합물을 수득하였다. ESI-MS (음성 모드) [MH]-: 551 (2 Br의 동위 원소 패턴); 색깔은 암모니아로 보라색으로 바뀌었다.
실시예 98: pH 민감성 모이오티를 함유하는 화학적 실체
브로모티몰 블루, 페놀 레드, 브로모페놀 레드, 클로로 페놀 레드, 티몰 블루, 브로모 크레졸 그린, 브로모 크레졸 퍼플으로부터 선택된 pH에 민감한 잔기를 포함하는 화학적 실체; 및 다른 술포프탈레인 염료는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 앵커 영역에 연결된다. 예를 들어, pH 민감성 부분은 앵커 영역 (폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오즈 비드, 다당류, 유도화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 이민, 폴리 아크릴아미드, UV- 활성화 그룹, 및 펩티도글리칸 유도체 및 이들의 조합에서 선택)을 단일 결합, 알킬렌 링커, 알케닐렌 링커 및 알키닐렌 링커, 아미드 링커 또는 아민 링커를 통해 커플링시킴으로써 제조될 수 있다.
실시예 99: ELA 및 CATG 기질의 효소 가수 분해 시험
상기 실시예의 기질은 가수 분해 속도 및 ELA 및 CAT 활성 검출을 위한 시험에서 유용성에 대해 시험하였다.
엘라스타아제: 백혈구에서 췌장 돼지 엘라스타아제 및 인간 엘라스타아제를 사용한 분석은 1 U/mL의 효소, 1 mg/mL 내지 5 mg/mL의 기질 (분자량과 로딩 염료의 양에 따라 다름)을 함유하는 25 μL의 총 부피에서 100 mM 인산 칼륨 완충액, pH 7 (또는 택일적으로 500 mM NaCl, 100 mM 아세트산나트륨 pH 7)에서 수행되었다. 분석 혼합물의 외관은 효소 기질의 특성에 따라 맑은 용액, 현탁액 또는 겔 중 하나이다. 배양은 37℃에서 수행하였다. 3 및 20시간 후, 10 ㎕ 샘플을 취하고 각 샘플에 10 ㎕ MeOH를 첨가하여 효소를 변성시켰다. 혼합하고 20분 동안 -20℃에서 배양한 후, 샘플을 13.000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 각각의 분석은 효소가 없는 대조군을 포함하여 1mg/mL 내지 5mg/mL의 기질을 함유하고 분석은 효소 함유 분석법과 동일한 방법으로 그리고 동시에 수행되었다. MeOH 침전 후 상등액을 분자 및 예상되는 절단 산물의 성질에 따라 [M + H] + 또는 [MH]- 이온 트랩 MS를 통해 분석하였다.
카텝신: 0.5 U/mL를 함유하는 25 μL의 총 부피에서 카텝신 G를 사용한 분석을 수행하고, 절단이 관찰되면, 추가 분석에서 100 mM Tris-HCl, pH 7 (또는 대안적으로 500 mM NaCl, 100 mM 아세트산나트륨 혼합 pH 7)에서 0.1 U/mL의 효소, 1 mg/mL 내지 5 mg/mL의 기질 (분자량 및 고정상의 로딩 염료 양에 따라 달라짐)에 대하여 수행된다. 분석 혼합물의 외관은 효소 기질의 특성에 따라 맑은 용액, 현탁액 또는 겔 중 하나이다. 배양, 대조, 샘플링 및 분석은 위와 같다.
이 연구의 결과는 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
엘라스타아제 및 카텝신 G에 의한 특정 기질의 절단 속도 요약
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
실시예 100: 가교-결합 트랩
폴리DADMAC와 같은 4급 아민 중합체를 제제에 따라 폴리에틸렌 이민 중합체와 19: 1 내지 5: 1의 비율로 혼합하였다. 용매는 물과 아세토니트릴 (1: 1 V/V)의 혼합물이었고 폴리아민 중합체의 최종 농도는 20 %이었다. 여기에 제제에 따라, 3, 6, 9 또는 12 % V/V 중 어느 것에 상응하는 부피의 에피클로로히드린을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 환류 하에 반응시켰다. 그 후, 혼합물을 응축기없이 가열하여 미반응 에피클로로히드린을 제거한다. 여기에 과량의 암모니아수를 첨가하고 추가로 반응시켜 확인되지 않은 모든 에폭시드를 켄칭시켰다 (이 후자의 단계는 또한 반응성 결합 트랩 물질에 대해 생략될 수 있다). 혼합물을 진공 하에 농축시켜 아세토니트릴 및 에피클로로히드린 (켄칭되지 않은 경우)을 제거하고 증발된 물을 대체하였다. 최종 혼합물은 10 내지 40 % 폴리아민 W/V를 함유하였다. 점도는 가교도에 비례한다.
실시예 101: 물 흡수원 또는 염료 트랩으로서 UV 개시된 양이온성 흡수제
폴리DADMAC와 같은 4급 아민 중합체는 (3-아크릴아미도 프로필) 트리메틸 암모늄 클로라이드, [2-(아크릴로 일옥시)에틸] 트리메틸 암모늄 클로라이드 또는 [2-(아크릴로 일옥시)에틸] 트리메틸 암모늄 클로라이드와 같은 4급 암모늄기를 함유하는 단량체와 5: 1, 7.5: 1, 10: 1 또는 15: 1의 비율로 혼합되었다. 이 혼합물에 벤조페논, 페난트렌 퀴논 또는 벤조일퍼옥사이드로부터 선택된 라디칼 개시제를 첨가하였다. 또한, 디(트리메틸올)프로판테트라 아크릴레이트와 같은 가교 결합제를 콜린 아크릴레이트 단량체 몰 당량의 1 %로 첨가하였다. 상기 용액을 25 % 이소프로판올로 희석하였다. 염료 트랩의 경우 약 1 μL의 용액을 고무 스탬프를 사용하여 15 mm2의 부직포에 종이 영역에 적용했다. 이어서 254 nm에서 UV 조사 하에 20분 동안 조사하였다. 기능은 종이 또는 부직포를 따라 그려진 블리리언트 블랙 0.5 % W/V를 함유한 수용액을 사용하여 증명되었으며 4급 아민 그룹에 포획되었다.
물 흡수원 또는 수퍼 흡수제로서, 더 두꺼운 중합체 베드가 형성되었다. 도트 또는 직경 4mm 또는 4μL가 유리, 폼 또는 종이와 같은 소수성 표면에 침착되었다. 침전물을 수동 UV 램프를 사용하여 254 nm에서 30분 동안 UV 경화시켰다. 그런 다음 화려한 검은색 염료 또는 브로모페놀 블루 염료의 물 현탁액에 넣었다. 팽창 및 염료 결합의 정도는 수퍼 흡수제 또는 염료 트랩으로서의 가능성을 나타내었다. 수퍼 흡수기는 물에서 건조 중량의 100 배 이상을 흡수하는 능력을 통해 지정된다.
상기 조성물: 콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액) 1mL, 디(트리메틸올프로판) 테트라아크릴레이트 70μL, 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v) 50μL, HEPES (4-(2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산) (50%w/v) 용액 60μL 및 0.3 mL의 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) (분자량 400,000- 500,000, 수중 20 %)을 사용하여, 유리 표면 상에 침적 및 후속적인 조사 결과 평탄한 디스크가 된다. 4, 6, 10, 20 또는 30 μL을 적용하면 거의 비슷한 중량의 디스크가 된다. 수분 흡수는 다음 표와 같다:
Figure pct00118
실시예 102: UV 개시된 교차-결합 트랩 및 수퍼 흡수기
아크릴레이트의 중합에 의한 양이온 트랩의 합성
콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액) 1mL, 디(트리메틸올프로판) 테트라 아크릴레이트 70μL, 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v) 50μL, HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄 술폰산) (50 % w/v) 용액60μ 및 1.77 mL의 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수 중 20 %)을 혼합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고 254nm의 빛을 20분간 조사하였다.
1mL의 (아크릴아미도) 프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 70μL의 디(트리메틸올프로판) 테트라아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산) (50 % w/v) 용액 및 1.77 mL의 폴리(디알릴 디메틸암모늄 클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수 중 20 %)을 혼합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액), 70μL의 디(트리메틸올프로판) 테트라 아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4-(2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄 술폰산) (50 % w/v) 용액 및 3.54 mL의 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) (분자량 400,000- 500,000, 수 중 20 %)을 혼합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 혼합물을 고체 담체(유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 (아크릴아미도) 프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 70μL의 디(트리메틸올프로판) 테트라아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산) (50%w/v) 용액 및 3.54 mL의 폴리(디알릴 디메틸암모늄 클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수 중 20 %)을 혼합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체(유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액) 1mL, 디(트리메틸올프로판)
70μL의 트라아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v) 및 60μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산) (50 % w/v) 용액 을 조합하고 격렬히 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 (아크릴아미도)프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 70μL의 디(트리메틸올프로판) 테트라 아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄 술폰산) (50 % w/v) 용액을 조합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 혼합물을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액), 120μ의 글리세롤 1,3- 디글리세롤 디 아크릴레이트 L, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4-(2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄 술폰산) (50 % w/v) 용액 및 1.77 mL의 폴리(디알릴디메틸 암모늄클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수 중 20 %)을 혼합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 혼합물을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 (아크릴아미도) 프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 500μL의 트리메틸올프로판에톡실레이트 트리아크릴레이트 (평균 Mn 692), 200μL의 2-프로판올 중의 4,4'-디하이드록시벤조페논 (10%w/v) 용액, 60μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산)의 용액 (50 % w/v)을 혼합하여 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액), 150μL의 디(트리메틸올 프로판) 테트라 아크릴레이트, 40μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v) 및 30㎎의 트리에탄올 아민을 혼합하고, 350㎕의 2- 프로판올로 희석하여 격렬히 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1mL의 (아크릴아미도) 프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 300μL의 글리세롤 1,3-디글리세롤 디아크릴레이트, 200μL의 2-프로판올 중 4,4'- 디하이드록시벤조페논 용액 (10 % w/v) 및 90μL의 HEPES (4- (2-하이드록시에틸) 피페라진-1- 에탄 술폰산)의 용액 (50 % w/v)을 조합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
1 mL의 (아크릴 아마이도) 프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 (75 % 수용액), 1 mL의 트리메틸올프로판에톡실레이트 트리아크릴레이트 (평균 분자량: 692), 200 μL의 2-프로판올 4,4'-디하이드록시벤조페논 용액 (10 % w/v), 150μL의 HEPES (4-(2-하이드록시에틸) 피페라진-1-에탄술폰산)의 용액 (50 % w/v) 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수중 20 %)를 조합하고 격렬하게 혼합하였다. 1μL의 상기 용액을 고체 담체 (유리판, 여과지, 부직포)에 도포하고, 254nm의 빛을 20분간 조사했다.
염료 트랩으로 상술한 약 1 μL의 용액을 고무 스탬프를 사용하여 15 mm2의 종이 또는 부직포에 적용했다. 이어서 254 nm에서 UV 조사 하에 20분 동안 조사하였다. 기능은 종이 또는 부직포를 따라 그려진 블리리언트 블랙 0.5 % w/v를 함유한 수용액을 사용하여 증명되었으며 4급 아민 그룹에 포획되었다.
최적의 포획 효과는 물 또는 단백질 용액이 트랩 영역을 통과할 수 있게 하면서 가시적 화합물 양을 포획하기에 충분한 침착 정도를 사용하여 얻어졌다. 1mL의 콜린 아크릴레이트 (80 % 수용액), 70μL의 디(트리메틸올프로판) 테트라아크릴레이트, 50μL의 2-프로판올 중 벤조페논 용액 (20 % w/v), 60μL의 HEPES (4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산) (50 % w/v) 용액 및 0.3 mL의 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드) (분자량: 400,000 내지 500,000, 수 중 20 %)를 포함하는 조성물의 사용이 효과적이지만 로딩이 과한 경향이 있다. 20% 또는 40 % 희석 및 비스코스 함유 부직포에 12 mm2 당 0.2 내지 0.6 μL의 침착 후 수동 UV 램프로 254 nm에서 30분간 조사하여 적절한 유체 이동으로 적절한 포획을 초래했다. 이러한 4 차 아민은 점성 도포되는 용액으로 가장 이상적으로 적용된다. 이를 위해, 다음과 같이 제형화할 수 있다: 15 %의 3.3 % Exilva 현탁액을 탈염수 중에 제조하였다. 탈염수 중의 4 % 폴리DADMAC 용액 12.5g을 연속적으로 교반하면서 단계적으로 첨가하였다. 이어서, 연속적으로 교반하면서 10.0g의 탈염수를 단계적으로 첨가하였다. 그 다음, 50g의 수성 Aerosil 200 겔을 탈염수 (10 % W/W)에서 Aerosil 200의 수화에 의해 제조하였다. 탈염수 중의 4 % 폴리DADMAC 용액 5g을 Aerosil 겔에 단계적으로 첨가하였다. Aerosil/폴리DADMAC 겔을 Exilva/폴리DADMAC 겔에 소량 첨가하고 혼합했다. 마지막으로 7.5 %의 4 % 폴리DADMAC를 혼합물에 첨가하였다. 생성된 100g 용액은 5 % Aerosil200, 0.5 % Exilva 및 1 % 폴리DADMAC를 함유하였다. 이 잉크 제제는 UV254nm에서의 표시를 위해 0.002 % Fluorescein W/W로 표식할 수 있다.
실시예 103. 5- (p-아미노메틸)페닐-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노시드
Figure pct00119
5-브로모-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노시드 (XGal , 100mg, 0.25mmol)를 p-아미노벤질 보론산 (38mg, 0.25mmol)과 함께 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 종들을 주변 온도에서 교반하면서 (아세토니트릴 (3 mL) 및 물 (약 0.5 mL)로 부분적으로 희석시켰다 (자기 교반기, 300 rpm). 교반하면서 디이소프로필아민 (DIPA, 78 μL, 0.55 mmol),이어서 팔라듐 (II) 아세테이트 ( Pd (OAc) 2 3 mg, 0.0125 mmol) 및 트리페닐포스핀 종 ( TPPTS , 21.3 mg, 0.0375 mmol)을 첨가하였다. 시스템을 80℃로 가열하고 48시간 동안 처리를 계속하였다. 반응 진행은 ESI-MS에 의해 모니터링되었다. 실온으로 냉각시킨 후, 임의의 침전물을 여과하고 (원하는 생성물은 용액에 잔류한다), 반응 혼합물을 ω-브로모 알킬화 펩티도글리칸 유도체의 추가 처리에 직접 사용하였다.
실시예 104: 5-(p-아미노메틸)페닐-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노시드 PG 부가물
Figure pct00120
건조된 ω- 브로모 알킬화 펩티도글리칸 (55 ㎎)을 에펜도르프 튜브에 넣고 5-(p-아미노메틸-)페닐-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노시드 (1.5 mL, 과량)의 아세토니트릴/물 (6:1) 용액에 주위 온도에서 현탁시킨다. 반응 시스템을 72시간 동안 진탕하였다. 그 후 침전물을 물과 에탄올로 순차적으로 세척한 다음 투석 정제 (물, 72시간)하여 소분자 XGal 종의 제거를 확실히 하였다. 투석 시에 생성물을 동결 건조시켜 황색 분말을 수득하였다.
실시예 105: 에피브로모히드린을 사용한 펩티도글리칸의 O- 알킬화
Figure pct00121
건조된 펩티도글리칸 (PG) (1.0g)을 3구 둥근 바닥 플라스크에 넣고 천천히 교반하면서 마그네틱 교반기를 사용하여 주위 온도에서 1,4-디옥산 (3ml)에 현탁시켰다. 에피브로모히드린 (300 μL, 3.5 mmol)을 첨가한 다음 과염소산 70 % (30 μL)를 첨가하였다. 주변 조건에서의 처리를 3시간 동안 계속하였다. 그 후, 반응 혼합물을 종이 필터에 붓고 이어서 물, 1,4-디옥산 및 디에틸에테르로 세척하였다. 여과 후 알킬화된 PG를 진공 건조시키고 추가 처리를 위해 냉장고에 보관하였다. 수율: > 106 g. (전체 수율을 정확하게 결정할 수는 없음).
제조를 위한 용도는 실시예 104 및도 7a-C에서와 같은 발색 기질의 고정화를 포함한다. 또한, 활성화된 PG는 글루코시다아제, 갈락토시다제, 만노시다제, 에스테라아제 또는 포스파타아제와 같은 2 차 효소를 결합 시키는데 사용될 수 있다.
이러한 물질을 만드는 일반적인 방법은 PG와 에피브로모히드린의 새로운 활성 생성물을 취한 다음 몇 차례 물과 완충액으로 씻어내는 것이다. 그런 다음 제한 량의 글루코시다아제, 갈락토시다제, 만노시다제, 퍼옥시다아제, 에스테라제 또는 포스파타아제와 혼합하고 교반하면서 반응시킨다. 반응 후 아세트산 암모늄 완충액에서 세척하여 남아있는 Br 그룹을 소멸시키고 고정화되지 않은 효소를 제거한다.
라이소자임에 대한 분석을 수행하기 위해, 공유결합된 기질을 함유하는 PG는 동족 부속 효소에 결합된 PG와 혼합된다. 라이소자임에 의한 분해에서, 부속 효소는 또한 결합된 기질을 활성화시키는데 이용 가능하며, 결합된 기질은 또한 라이소자임의 작용에 의해 더 용해된다. 따라서, PG-X-Gal 복합체는 B- 갈 락토시다아제에 결합된 PG와 혼합된다.
실시예 106: 염소화 β-락탐 전구체의 형성
Figure pct00122
3-글로로메틸-7-(2-페닐아세트아미도)-3-세펨-4-카르복실레이트 (1.04 g, 2.14 mmol)을 DCM (무수, 40 mL)에 현탁시키고, m-클로르퍼벤조산 (77 %, 1.09 g, 4.88 mmol)을 실온에서 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 주말 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 DCM (30 mL)으로 세척하고; 여액을 농축 건조시켰다. 조 생성물을 Et2O (40 mL)로 취한 후 2시간 동안 얼음조에서 교반하였다. 이어서 고체를 여과하고 Et2O (40 mL)로 세척하였다. 생성물 (811 mg, 73 %)을 백색 고체로서 수득하였다.
ESI-MS (양성): [M + Na] + = 541
실시예 107: β-락탐 인독실 에테르의 형성
Figure pct00123
실온에서 3-클로로메틸-7-(2-페닐아세트아미도)-3-세펨-4-카르복실레이트 (488 mg, 2.00 mmol)를 아세톤 (무수, 5 mL)에 현탁시키고 혼합물을 실온에서 교반하면서 10분 동안 아르곤을 통과시켰다. 이어서, 5-브로모-4-클로로 인독실 (231mg, 1mmol)을 실온에서 한 번에 첨가하였다. 아르곤 스트림으로 5분 동안 교반한 후, 실온에서 탄산칼륨 (278 mg, 2 mmol)을 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤을 통과시키면서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 추가의 아세톤 (무수, 2 mL)을 첨가하였다. 실온에서 아르곤 스트림으로 2분 동안 교반한 후, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. DCM (50 mL) 및 물 (40 mL)을 첨가하였으며; 추출 후 전체 혼합물을 플루트 필터 (fluted filter)를 통해 여과하였다. 여과 유기 및 수성상을 분리시킨 후, 유기상을 건조시키고 (Na2SO4), 농축 건조시켰다. 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리액: DCM 중 2 % MeOH)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 수집하여 228 mg의 짙은 갈색 고체를 수득하였다.
ESI-MS (양성): [M + Na] + = 718
실시예 108: 메톡시 아닐린 유도체 염
실시예 10의 물질은 MPO의 직접 기질일 수 있지만, 알킬화된 반응 생성물 및 메톡시 아닐린 및 2가 음이온의 이온 쌍으로서 제제화 될 때 가장 신속한 반응을 제공한다 (도 12 참조). 이상적인 질량비는 2: 8 아닐린: 실시예 10의 생성물이다. 가장 효과적인 반응은 2가 음이온이 황산인 경우 발생하지만, 디설폰산 치환된 방향족계 및 인산도 감소된 비율로 사용될 수 있다. HCl은 제한된 반응만을 제공한다. 반응에서 MPO 산화 생성물 중 하나는 두 가지 아닐린 성분의 이량 체로 나타난다 (그림 13 참조).
이러한 기질의 주요 요건은 헴과 반응성이 없다는 것이다. 다양한 메톡시 아닐린은 패스트 블루의 대안으로 사용될 수 있지만, 이들 (3,4-디메톡시아닐린 2,5-디메톡시 아닐린)은 발색단에만 헴과 퍼 옥사이드와 함께 반응하는 경향이 있다. 이를 피하기 위해서는 아미드를 통한 비활성화가 필요하다. 다양한 치환체가 가능하다. 알킬 앵커 잔기는 직접 알킬화 또는 실시예 10의 에폭시화 반응의 변형에 의해 다른 유사한 친유성 그룹으로 대체될 수 있다. 유사하게, 아미드기는 다양할 수 있다
Markush 다이어그램 삽입- 패스트 블루
실시예 109: 종이 또는 부직 재료와 같은 고체 재료상의 기질의 제조
엘라스타아제 검출: 필터 종이 원 (6 mm)을 0.05 M 붕산염 완충액 pH 8에서 1-2분 동안 함침 분산 혼합물 (0.25 % (w/w) Nonidet, 2 % (w/w) 데카놀)으로 함침시켰다. 여과지를 유리판에 놓고 54℃에서 1-2시간 동안 건조시켰다. 건조 후, 실시예 1의 엘라스타아제-기질 FmocAAPV 인독실 에스테르 (메탄올 중 20 mg/mL)를 시험 원 (20 mm2) 당 최종 양이 80 μg이 될 때까지 2 μL 단계로 2 회 원에 피펫팅 하였다.
달리, 엘라스타아제 기질 FmocAAPV 인독실 에스테르 (실시예 1)를 메탄올 중에서 4-디아조-3-메톡시디페닐아민술포에트 및 2-메톡시-4-모르폴리노벤젠디아조늄염고 혼합되어 최종 농도가 10 mg/mL인 FmocAAPV 인독실 에스테르 및 각각의 디아조늄 염 5 내지 10 ㎎/㎖ (또는 이둘의 조합)을 포함하는 것이다. 혼합물을 함침된 시험 원에 2 μL 단계로 2 회 피펫팅 하였다.
MPO 검출: DMSO: 메탄올 (DMSO 1 부, MeOH 2 부) 중 실시예 108의 물질의 40 mg/mL 용액 2 μL를 피펫팅하여 여과 종이 원을 함침시킨 후 건조시킨다 (48시간, 실온). 여기에 10 μg의 글루코스와 3 μL의 수 중 0.1 % 글루코스 산화 효소(3 μg)가 첨가된다.
수분 접촉을 나타내는 양성 대조군은 글루타르알데히드를 함유한 키토산에서 브로모 티몰 블루의 제조에 기초한 pH 지시약이다. 혼합물을 건조 후, 짙은 황색 지표로 유도하는 지시 영역에서 피펫팅한다.
또는 에탄올 중 0.1 % 브로모크레졸 퍼플 용액을 사용할 수 있다. 1.4μL를 여과지 디스크 (직경 6mm)에 피펫팅하고 50℃ 내지 60℃에서 1.5시간 건조한다.
이러한 다양한 여과지를 스틱에 올려 놓으면 관리 시점에서 체액을 동시에 평가할 수 있다. 이것을 딥스틱 (dipstick)이라 칭한다.
실시예 110: 기도 흡인물의 임상 평가
실시예 109의 딥스틱은 적절한 보관을 통해 활성 상태로 유지되고 테스트를 위해 임상 시설로 전달된다. 기도 흡인물에서의 감염 상태를 평가하는 데 사용할 수 있다. 이 물질에서 감염을 탐지하는 능력을 시험하기 위해 스틱을 사용하여 중환자 치료 절차의 일부로 삽관되는 환자의 흡인물을 평가한다. 흡인물은 일상적인 치료의 일부로 사용된다. 흡인 후, 얻어진 물질을 딥스틱과 접촉시키고 최대 6분 동안 반응시킨다. 반응의 정도에 따라, 바이오 마커 효소의 추정 농도를 나타내는 다양한 차단값을 얻을 수 있다. 배경 수준 이상의 흡인물에서 엘라스타아제 또는 MPO의 존재는 잠재적 인 감염의 지표이다. 이러한 데이터의 유용성을 해석하기 위해 딥스틱에 대한 반응을 샘플에 대해 임상적으로 알려진 것과 비교했다. 어떤 경우에는 샘플이 감염 치료를 받는 환자에게서 채취된 것으로 알려졌다. 다른 경우 환자는 기도 감염이 없는 것으로 간주되었다. 어떤 경우에는 2일 이내에 감염이 발생한 환자에서 샘플을 채취했다. 이 샘플은 채취 당시의 임상 진단이었기 때문에 "감염되지 않은"것으로 간주되었다. 그러나 앞으로의 연구에서 2일 이내에 감염을 일으키는 환자의 샘플을 "감염된" 것으로 분류할 것이다.
총 52명의 환자가 117개의 샘플을 통해 평가되었다. 각 바이오 마커에 대한 반응의 정도와 감염을 나타내는데 사용된 차단값에 따라 데이터를 표로 작성할 수 있다. 이 데이터는 다음 데이터 세트에 요약되었다.
117명의 환자 샘플에서 엘라스타아제 반응 분석.
Figure pct00124
두 가지 바이오 마커를 사용하는 52명의 환자 분석
Figure pct00125
이 데이터는 바이오 마커가 반응 시간 및 사용된 차단값과 함께 보고되는 바이오 마커 반응의 분석이다. 따라서, HNE 6, 2, 3은 반응이 6분 동안 관찰되었고, 도 10b의 실시예의 네 번째 지점에서의 반응 정도가 양성 샘플의 존재를 나타내는 데 사용되었다는 것을 의미한다. MPO (3,4)에 대해 더 높은 차단값을 사용하는 것은 확인을 뒷받침한다.
그러나 감염이 진행됨에 따라 많은 환자가 채취되어 "감염되지 않은"것으로 분류되었다. 이러한 현상의 예시가 아래에 설명된다. 다음 그래프에서 임상 감염이 진단된 날을 T0로 표시한다. T-1과 T-2는 감염 전 임상 채취일이다.
Figure pct00126
이 데이터는 ICU 직원에게 임상적으로 명백해지기 전에 바이오 마커의 반응이 임박한 감염을 나타낼 수 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 또한 발색 기질이 감염 상태와 일치하는 기도 흡인 물의 비정상적인 수준의 효소 마커를 유용하게 나타낼 수 있다고 제안한다.
실시예 111: 부압 치료 유체의 임상 평가
상처 치유는 상처 부위에 진공을 적용하여 가능할 수 있다. 이것은 상처를 통해 체내에서 장액을 채취하여 성장 인자, 면역 세포 및 영양소를 가져 오는 등 많은 효과가 있을 수 있다. 또한 과립 조직이 증식하도록 촉진하거나 자극할 수 있다. 이 과정에서 나오는 유체는 상처 부위의 상태를 나타내는 지표이다. 감염 바이오 마커의 존재를 평가하면 상처가 드레싱이나 스펀지를 제거하지 않고 양호한 상태인지 알 수 있다.
이러한 접근법의 타당성을 평가하기 위해 그러한 공기 흡입 유체에서 샘플을 채취하고 딥스틱 응답을 테스트했다. 그 결과는 상처에 대하여 알려진 것과 실시예 110에서 관찰된 것과 일치한다. 즉, 진단 또는 의심되는 감염의 경우에는 명확한 바이오 마커 반응이 있다 (도 10a 참조).
실시예 112: 의료 기기에 사용되는 튜브에 지표 물질 배치
상기 두 실시예에서 유체는 소스에서 채취하여 바이오 마커 반응을 추정하기 위해 탭스틱 시스템을 사용하여 분석했다. 그러나 의료 기기에 마커가 포함된 물질을 현장 배치하는 것도 가능하다. 이러한 물질은 모니터링 시스템의 한 형태로 간주될 수 있다. 이러한 응용 경우, 물질은 살균에 적합해야 하며 적절한 시간 규모에 따라 반응해야 한다. 예를 들어 상처 또는 인공 호흡기의 진공 처리와 같은 많은 용도의 경우 상태 변화 가능성을 나타내는데 24시간이면 충분하다. 이를 위해 팁스틱의 신속한 반응은 요구되지 않다.
형식도 상이하다. 도 9에서 다양한 형식이 표시된다. 도 9b에는 실시예 109에 기술된 여과지 원을 수용할 수 있는 형식이 도시된다. 그러나 튜브 및 원통형 홀더는 반응성 기질을 위한 담체 또는 고체 지지체인 다른 불활성 물질의 종이 또는 부직포 재료, 폴리올레핀 또는 셀룰로오스를 보유하기 위해 전환될 수 있다는 점에서 보다 간단 할 수 있다 (도 9a, C 및 D 참조).
이 개념을 테스트하기 위해 실시예 109에 기술된 물질로 처리되는 종이 또는 부직포 재료, 폴리올레핀 또는 셀룰로오스를 준비하였다. 특히, 엘라스타아제 기질은 인쇄되거나 디아조늄염으로 도포되지 않았다. 이것은 이 설정에서 빠른 반응이 필요하지 않기 때문이다. 인독실의 발색단으로의 전환은 통상 산화를 통해 이루어지며, 디아조늄염은 산소에 대한 필요성 없이 직접적인 반응을 제공한다. 모니터링 설정에서 반응 시간은 중요하지 않다. 마찬가지로, MPO의 경우 산소가 중요하며, 이것이 제한적인 경우 반응 속도가 제한적이다.
이러한 형식에서, 유체의 통과는 지지 물질의 습윤 및 기질의 전환을 야기한다. 전환된 기질은 스트라이프로서 가시화된다. 특정 기간 내에 스트라이프가 존재하면 유체의 공급원이 감염되었을 수 있다는 사실을 나타내는 지표가 된다. 이러한 색 지시기는 체액과 접촉하는 진공 라인에 위치할 수 있다. 또한 흡입 라인이나 인공 호흡기에 설치할 수도 있다.
실시예 113: 바이오 마커의 전자 모니터링
색 생성 기질은 장치의 사용 없이 바이오 마커 반응의 해석을 허용하는 수단이다. 그러나 특정 상황에서 온라인 모니터링 또는 정량화는 전자적 평가를 요구할 수 있다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 모드의 범위가 있다.
색 감지는 반사광의 색을 판독하고 시약의 변화율을 판독할 수 있는 센서의 한 가지 방법이다. 그러나 센서를 사용한 색상 측정은 배경색이 제한적이거나 샘플 색상에 비해 콘트라스트가 높은 유체에 의존한다. 색상 감지를 달성하기 위해 전자 보드가 댑스틱 또는 칩 시스템의 시약 반대편에 배치된다. 보드에는 광원(예를 들어, 적색 녹색 및 청색의 작은 LED)과 감지 칩이 들어 있다. 시간에 따른 신호 변화를 기록하여 샘플의 활성을 추정한다.
또 다른 모드는 전류 측정이다. 이것은 인독실 (라이소자임, 엘라스타아제) 또는 퍼옥시드 (MPO)와 같은 REDOX 활성 생성물을 생산하거나 소비하는 기질과 관련이 있다. 기질의 산화는 적절한 전극에 의해 측정될 수 있는 전류를 발생시킨다. 효소에 의해 방출된 REDOX 활성제의 예시로는 본 명세서에서 여러 번 언급된 인독실뿐만 아니라 도 11에서와 같은 페로센 (ferrocene)을 포함한다.
실시예 114: 지시제 기재의 용해도
효소 기질이 종이와 같은 고체상에 부착된 상태로 유지되는 능력은 그 기능에 중요하다. 건조된 기질이 수성상으로 재-용해되는 것에 저항하는 정도를 시험하기 위해, 적절한 용매 (아세톤, 메탄올, DMSO 등, 실시예 109 참조)를 사용하여 기질을 고체상에 도포하고, 실온에서 최대 48시간 건조시킨다. 그 후, 종이 또는 부직포 재료를 물 또는 인위적 상처액 (염화칼슘을 함유하는 인산염 완충액 중 2 % 소 혈청 알부민, 요소 pH 7.2) 50mL 중에서 회전에 의해 완만하게 교반하면서 2분 동안 인큐베이션 하고, 그 후에 그것은 유체의 연속적인 변화, 예를 들어 50 mL의 4 회 변화로 다시 세척된다. 기질의 용해 또는 손실은 여러 가지 방법으로 추정된다. 여기에는 용해 용액의 LCMSMS 분석 또는 효소 반응 또는 LCUV 또는 LCMSMS에 의한 직접 분석에 의한 고체상 물질의 잔류 분석이 포함된다. LCMS 방법은 다음과 같다.
HPLC 등급 메탄올, 아세토니트릴, 물 DMSO 및 THF를 스톡 제조에 사용되고 이동상으로 사용하였다. 정량은 ABSciex API 4000 질량 분석기를 검출기로 사용하는 Agilent 1260 시리즈 HPLC 시스템에서 수행되었다. 사용 칼럼은 45℃에서 작동되는 ReproSil Pur Phenyl 3μm 60x2mm이었다. 이동상은 물 + 0.1 % 포름산 및 아세토니트릴이었다. 크로마토그래피 분석은 유속 500㎕/분의 구배였다. 주입량은 5㎕였다. 검출된 원 (parent)/ 단편 종들은 실시예 1의 생성물에 대해 694/561, 실시예 10의 생성물에 대해 485/467 및 패스트 블루에 대해 273/258이었다.
Figure pct00127
각각의 분석물에 대해 메탄올, DMSO: 메탄올의 1: 3 혼합물 및 DMSO: 메탄올의 1: 1 혼합물에서 각각의 화합물들에 대하여 10 mg/ml 스톡 표준 용액을 제조하였다. 스톡을 THF에 1: 100으로 용해시키고 0.1 내지 10000 ng/mL의 보정 범위를 위해 THF에서 1:10 희석물을 추가로 제조하였다.
효소 반응에 의한 분석은 실시예 109에 따르며, 여기에서 다른 필수 시약은 기질을 헹구고 건조시킨 후에 물질에 첨가한다. 일단 필요한 보조 시약 (완충제, 활성화제)이 첨가되면, 과량의 효소가 첨가된다. 그런 다음 반응은 씻지 않은 샘플과 비교된다. 이상적인 기질 또는 기질 조제물은 반응성을 실질적으로 잃지 않고 50 mL의 물의 2 회 이상 변화에 저항성을 가진다.
이 실험 시스템은 여과지에서 말릴 때 기질의 "내수성"을 정의한다. 따라서 1의 내수성은 50 mL의 인공 상처액이 1 회 변한 후에도 여전히 신호가 보임을 의미한다. 2의 내수성은 인공 상처액 50 mL를 2 회 변경한 후에도 신호가 여전히 보임을 의미한다.
실시예 115: 프로테아제 기질
카텝신에 대한 기질은 펩타이드 인독실 커플링에 대한 이전의 실시예의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 서열 변동은 효소 선택성을 변화시키는데 사용된다.
실시예 116: 프로테아제 기질 제조
본원에 설명된 것과 같은 펩타이드 기질은 디-펩타이드를 커플링하여 가장 효율적으로 제조할 수 있다. 보호된 형태의 디펩타이드 AA 및 PV의 제조는 후속의 직접 커플링으로 하여금 원하는 AAPV 생성물을 형성하게 한다.
실시예 117: 바이러스성 프로테아제 기질 제조
어떤 경우에는 병원체가 박테리아가 아니라 바이러스이다. 상부 기도에서 대부분의 감염은 성격상 바이러스 성이다. 어떤 경우에는 박테리아 중복 감염을 일으키지 않고 바이러스 감염이 해결된다. 그러나 박테리아가 바이러스 감염의 맥락에서 또한 촉진된다는 것은 일반적이다. 이는 바이러스가 감염되는 동안 종종 면역계를 억제하고 염증 반응을 촉진하여 (점액, 기침 및 재채기) 더 잘 분비하기 때문이다.
바이러스는 자기 코딩된 프로테아제 또는 숙주 프로테아제를 사용한다. 자신의 프로테아제를 암호화하는 바이러스 유형은 3C 프로테아제의 동족체를 사용한다.
따라서 3C 프로테아제에 대한 공통 인식 모티프는 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Glnon morif 또는 LEVLFQu-Va이다. 따라서 바이러스 신호의 존재에 대한 점액 샘플을 평가하는 한 가지 방법은 바이러스성 프로테아제에 대한 합성 기질을 이용하는 것이다. 하나의 그러한 예는 C-말단이 인독실로 에스테르화 된 펩타이드 LEVLFQ-인독실이다.
대조적으로 많은 바이러스 유형은 자체 단백질 분해 기능을 인코딩하지 않지만 호스트 기능을 사용한다. 공통점은 바이러스에 의한 푸린 프로테아제의 사용이다. 공통의 푸린 절단 부위 (-RRRR 또는-RRKR 또는 RLGR 또는 LLGR 또는 LLAR)는 매우 염기성이다. 합성 푸린 기질은 폴리아르기닌으로 편리하게 형성할 수 없으며 대신 리신 대체물을 사용한다. 발색 기질의 한 예는 LLAR-인독실 또는 LLAL-인독실이다. 또는, 아르기닌은 아르기닌에 대하여 가능한 보호 그룹 중에서 입체적으로 가장 복잡한 토실 (Tosyl) 그룹으로 보호된다.
개시된 기술의 바람직한 실시예가 본 명세서에 도시되고 설명되었지만, 당업자에게는 그러한 실시예가 단지 실시예로서 제공된다는 것이 명백할 것이다. 개시된 기술을 벗어나지 않으면 서 당해 기술분야의 숙련자에게 다양한 변형, 변화 및 대체가 가능할 것이다. 본원에 기재된 개시된 기술의 실시예에 대한 다양한 대안이 개시된 기술을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 이하의 청구 범위는 개시된 기술의 범위를 정의하고, 이들 청구 범위의 범위 내에 있는 방법 및 구조 및 그 균등물에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> SYNOVO GMBH <120> DETECTING MICROBIAL INFECTION IN WOUNDS <130> 43247-728.601 <140> <141> <150> 62/315,556 <151> 2016-03-30 <150> 62/315,546 <151> 2016-03-30 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(200) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(200) <223> /note="This region may encompass 0-200 residues" <220> <221> MOD_RES <222> (204)..(403) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(403) <223> /note="This region may encompass 0-200 residues" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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Claims (80)

  1. 화학식 I의 화합물을 포함하는 화학적 실체:
    [식 I]
    A-R-I
    상기 식에서,
    A는 앵커이고;
    R은 효소 인식 부위이고;
    I는 지표 영역이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 앵커(A)가 지표 I와 공유결합 또는 비공유결합되어 있는, 화학적 실체.
  3. 제 2 항에 있어서, R이 상처-특이적 가수 분해 효소에 특이적인, 화학적 실체.
  4. 제 1 항에 있어서, A가 다당류, 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  5. 제 4 항에 있어서, 앵커(A)가 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC),하이드록시에틸 셀룰로오스,하이드록시메틸 셀룰로오스, D-갈락토피라노시드 또는 이의 유도체로부터 선택된 다당류를 포함하는, 화학적 실체.
  6. 제 4 항에 있어서, 앵커(A)는 펩티도글리칸 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  7. 제 6 항에 있어서, 펩티도글리칸의 단량체가 당 및 아미노산, 이의 올리고머 또는 이의 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 펩티도글리칸이 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc 또는 NAG) 및 N-아세틸무라민산 (MurNAc 또는 NAM) 또는 이의 조합으로부터 선택되는 교대 아미노 당의 적어도 2 단위를 포함하는, 화학적 실체.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 펩티도글리칸 유도체가 카르복실화 펩티도글리칸을 포함하는, 화학적 실체.
  10. 제 9 항에 있어서, 펩티도글리칸 유도체가 하나 이상의 할로겐, 알코올, 에스테르 또는 아미드기를 임의로 포함하는 카르복시메틸, 카르복시에틸, 카르복시프로필기를 포함하는, 화학적 실체.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 펩티도글리칸 유도체가 하나 이상의 카르복시메틸기를 포함하는, 화학적 실체.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 펩티도글리칸 유도체가 할로겐화 되는, 화학적 실체.
  13. 제 4 항에 있어서, 앵커(A)가 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC),하이드록시에틸 셀룰로오스,하이드록시메틸 셀룰로오스, D-갈락토피라노시드; N-아세틸글루코사민 (GlcNAc 또는 NAG) 및 N-아세틸 무라민산 (MurNAc 또는 NAM); 또는 이의 올리고머 또는 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물을 포함하는, 화학적 실체.
  14. 제 1 항에 있어서, 반응성 부위 (R)가 프로테아제를 위한 부위를 포함하는, 화학적 실체.
  15. 제 14 항에 있어서, 반응성 부위 (R)가 엘라스타아제인 프로테아제 부위를 포함하는, 화학적 실체.
  16. 제 15 항에 있어서, 반응성 부위 (R)가 아미노산 서열 (a) XyAAPXy-Z; (b) XyAAPXy-L-Z; (c) XyAAP(V/F/A)Xy-Z 또는 (d) XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z를 포함하고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고; y는 각각 독립적으로 0 내지 200에서 선택된 수이고; L은 연결 잔기이고; Z는 표지인, 화학적 실체.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 50의 정수인, 화학적 실체.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수인, 화학적 실체.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수인, 화학적 실체.
  20. 제 16 항에 있어서, 각각의 펩타이드 (a) - (d)는 엘라스타아제에 대해 불안정한, 화학적 실체.
  21. 제 14 항에 있어서, 반응성 부위 (R)가 3C 프로테아제 인 프로테아제를 위한 부위를 포함하는, 화학적 실체.
  22. 제 21 항에 있어서, 3C 프로테아제 반응성 부위 (R)는 아미노산 서열 (a) XyUUUUy-Z를 포함하고, X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고; y는 각각 독립적으로 1 내지 50으로 선택된 수이고; U는 LEVLFQ로부터 선택된 아미노산이고, Z는 표지인, 화학적 실체.
  23. 제 22 항에 있어서, (a)의 각각의 펩타이드가 3C 프로테아제에 대해 불안정한, 화학적 실체.
  24. 제 14 항에 있어서, 반응성 부위 (R)가 카텝신 G인 프로테아제 부위를 포함하는, 화학적 실체.
  25. 제 21 항에 있어서, 카텝신 G 프로테아제 반응성 부위 (R)가 아미노산 서열 (a) XyN4N3N2N1Xy-Z; 또는 (b) XyN4N3N2N1Xy-L-Z를 포함하고 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고; 각각의 y는 독립적으로 0 내지 6으로 선택된 수이고; N4 는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고; N3 은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린에서 선택되고; N2는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고; N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌에서 선택되고; L은 연결 잔기이고, Z는 표지인, 화학적 실체.
  26. 제 21 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수인, 화학적 실체.
  27. 제 25 항에 있어서, 각각의 펩타이드 (a) - (b)는 카텝신 G 프로테아제에 대해 불안정한, 화학적 실체.
  28. 제 1 항에 있어서, 지표는 설포닐에틸-수소황산염-반응성기를 함유하는 염료 또는 디클로르트리아진 반응성기를 함유하는 염료를 포함하는, 화학적 실체.
  29. 제 28 항에 있어서, 설포닐에틸-수소황산염-반응성기를 함유하는 염료는 반응성 블랙 5, 리마졸 브릴리언트 블루(Remazol Brilliant Blue), 반응성 바이올렛 5 또는 반응성 오렌지 16 또는 이의 조합인, 화학적 실체.
  30. 제 28 항에 있어서, 디클로르트리아진 반응성기를 함유하는 염료는 반응성 청블루4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 또는 반응성 브라운 10 또는 이의 조합인, 화학적 실체.
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 지표는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 켄칭제, 지질, 착색 분자, 방사성 동위 원소, 섬광체, 바이오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 표지를 포함하는, 화학적 실체.
  32. 제 1 항에 있어서, 효소 반응성 부위 (R)가 앵커와 지표 사이의 결합을 통해 제공되는, 화학적 실체.
  33. 제 32 항에 있어서, R이 락타마제에 특이적인, 화학적 실체.
  34. 제 33 항에 있어서, R이 복합된 락톤 및 아미드를 포함하는 락탐 결합을 포함하는, 화학적 실체.
  35. 제 33 항에 있어서, R이 글리코시다아제에 특이적인, 화학적 실체.
  36. 제 33 항에 있어서, 글리코시다아제가 β-락탐아제인, 화학적 실체.
  37. 하기 서열을 포함하는 폴리펩타이드:
    (a) XyAAPXy-Z (서열 번호 1),
    (b) XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2),
    (c) XyAAP(V/F/A)Xy- Z (서열 번호 3), 또는
    (d) XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4),
    여기에서, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고,
    y는 각각 독립적으로 0 내지 200의 정수이고,
    L은 연결 잔기이고,
    Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 50의 정수인, 폴리펩타이드.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수인, 폴리펩타이드.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수인, 폴리펩타이드.
  41. 제 37 항에 있어서, XyAAPXy-Z (서열 번호 1), XyAAPXy-L-Z (서열 번호 2), XyAAP(V/F/A)Xy-Z (서열 번호 3) 또는 XyAAP(V/F/A)Xy-L-Z (서열 번호 4)를 포함하는 각각의 펩타이드는 독립적으로 각각 엘라스타아제에 대해 불안정한, 폴리펩타이드.
  42. 제 37 항에 있어서, 아민 보호기를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  43. 제 37 항에 있어서, 플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 인 아민 보호기를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  44. 제 37 항에 있어서, Z는 미엘로페록시다제(myeloperoxidase, MPO)에 의해 활성화되는, 폴리펩타이드.
  45. 제 37 항에 있어서, Z가 인독실 화합물을 포함하는, 폴리펩타이드.
  46. 제 44 항의 폴리펩타이드를 포함하는 앵커 영역(A) 및 지표 영역(I)을 포함하는 화학적 실체.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 앵커 영역은 다당류, 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  48. 제 46 항에 있어서, 앵커 영역이 펩티도글리칸 또는 이의 단량체, 또는 단량체(들)의 올리고머를 포함하는, 화학적 실체.
  49. 제 46 항에 있어서, 앵커가 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아 지드, 에폭시드 , 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 다-환 또는 다중-방향족 고리시스템, 친유성 그룹 및 이의 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  50. 하기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열:
    (a) XyN4N3N2N1Xy-Z (서열 번호 5), 또는
    (b) XyN4N3N2N1Xy-L-Z (서열 번호 6),
    여기에서,
    X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고;
    y는 각각 독립적으로 0 내지 6으로 선택된 수이고;
    N4 는 알라닌, 글리신, 발린 및 글루타민으로부터 선택되고;
    N3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 리신 및 세린으로부터 선택되고;
    N2 는 프롤린, 알라닌 및 글리신으로부터 선택되고;
    N1은 세린, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 류신 및 메티오닌으로부터 선택되고;
    L은 연결 잔기이고;
    Z는 검출 가능한 표지를 포함한다.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 y는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수인, 폴리펩타이드.
  52. 제 50 항에 있어서, (a) XyN4N3N2N1Xy-Z(서열 번호 5) 또는 (b) XyN4N3N2N1Xy-L-Z(서열 번호 6)를 포함하는 각각의 펩타이드는 독립적으로 각각 카텝신 G에 대해 불안정한, 폴리펩타이드.
  53. 제 50 항에 있어서, 아민 보호기를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  54. 제 50 항에 있어서, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)인 아민 보호기를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  55. 제 50 항에 있어서, Z는 미엘로페록시다제(MPO)에 의해 활성화되는, 폴리펩타이드.
  56. 제 50 항에 있어서, Z가 인독실 화합물을 포함하는, 폴리펩타이드.
  57. 제 55 항의 폴리펩타이드를 포함하는 앵커 영역(A) 및 지표 영역(I)을 포함하는 화학적 실체.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 앵커 영역은 다당류, 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  59. 제 57 항에 있어서, 앵커 영역이 펩티도글리칸 또는 이의 단량체, 또는 단량체(들)의 올리고머를 포함하는, 화학적 실체.
  60. 제 59 항에 있어서, 앵커가 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아 지드, 에폭시드 , 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 다-환 또는 다중-방향족 고리시스템, 친유성 그룹 및 이의 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  61. 폴리펩타이드 서열로서, 아미노산 서열 (a) XyUUUUy-Z를 포함하고, X는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고; y는 각각 독립적으로 1 내지 50으로 선택된 수이고; U는 LEVLFQ로부터 선택된 아미노산이고, Z는 표지인, 폴리펩타이드 서열.
  62. 제 61 항에 있어서, (a)의 각각의 펩타이드가 3C 프로테아제에 대해 불안정한, 폴리펩타이드.
  63. 제 61 항에 있어서, 아민 보호기를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  64. 제 61 항에 있어서, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)인 아민 보호기를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  65. 제 61 항에 있어서, Z는 미엘로페록시다제 (MPO)에 의해 활성화되는, 폴리펩타이드.
  66. 제 61 항에 있어서, Z가 인독실 화합물을 포함하는, 폴리펩타이드.
  67. 제 61 항의 폴리펩타이드를 포함하는 앵커 영역(A) 및 지표 영역(I)을 포함하는 화학적 실체.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 앵커 영역은 다당류, 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, 펩티도글리칸 또는 키토산 또는 이의 단량체, 이의 올리고머, 이의 유도체, 이의 혼합물 또는 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  69. 제 67 항에 있어서, 앵커 영역이 펩티도글리칸 또는 이의 단량체, 또는 단량체(들)의 올리고머를 포함하는, 화학적 실체.
  70. 제 69 항에 있어서, 앵커가 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아 지드, 에폭시드 , 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 다-환 또는 다중-방향족 고리시스템, 친유성 그룹 및 이의 조합을 포함하는, 화학적 실체.
  71. 반사광 또는 전류 패턴을 사용하여 고상 시스템에 배치된 제 46 항의 화학적 실체의 전환 정도를 검출하기 위한 장치.
  72. 제 46 항의 화학적 실체가 관찰자에게 가시적이거나 검출 가능하도록 배치된 스틱, 튜브, 챔버 또는 리세스를 포함하는 장치.
  73. 체액, 체액 에어로졸 또는 유기체로부터의 유사한 샘플이 챔버를 통과 할 때 바이오 마커 효소 존재의 정도를 나타내도록 반응할 수 있도록 제 46 항의 화학적 실체가 배치된 스틱, 튜브, 챔버 또는 리세스를 포함하는 장치.
  74. 제 46 항에 있어서, 기도의 유체 및 에어로졸과 함께 사용되는 장치.
  75. 제 46 항에 있어서, 진공 치료를받는 상처로부터의 유체 및 에어로졸과 함께 사용하기 위한 장치.
  76. 제 46 항에 있어서, 방광으로부터의 유체 및 에어로졸과 함께 사용하기 위한 장치.
  77. 제 46 항에 있어서, 혈액으로부터의 유체 및 에어로졸과 함께 사용하기 위한 장치.
  78. 하기 화학식 D의 화합물:
    [화학식 D]
    Figure pct00128

    상기 식에서,
    R1 은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH2CH3이고;
    X는 -C(=O)-, -S(=O)2-이고;
    R2는 -C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만 이에 한정되지 않으며, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 선택적으로 1 내지 5개의 치환체에 의해 치환되되, 치환체는 페로센, 할로겐 (예를 들어, F, Cl, Br, I), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-로부터 독립적으로 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 -(C1-C12)알킬 -(C1-C12)알케닐 -(C1-C12)알키닐 -(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알킬 -(C1-C8)[(C1-C4)알콕시]알케닐 -(C6-C10)아릴-(C1-C5)알킬 -(C2-C9)헤테로아릴-(C1-C5)알킬일 수 있지만, 이에 제한되지는 않으며, 여기에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 및 헤테로아릴은 선택적으로 1 내지 5개의 치환체에 의해 치환되되, 치환체는 할로겐 (예를 들어, F, Cl, Br, I), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시으로부터 독립적으로 선택되거나, N(R4R5)은 아지리딘, 아제티딘, 피롤리딘, 피레리딘, 아제판 또는 아조칸, 1-치환된 피페라진, 또는 몰포린 잔기이고; Y는 -NH-CH2-CH(OH)- ,-NH-, -NH-C(=O)-NH-, -NH-C(=S)-NH-이고;
    R3은 -C6-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴일 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 여기에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 및 알킬헤테로아릴기는 선택적으로 1 내지 5개의 치환체로 치환되되, 치환체는 페로센, 할로겐 (예를 들어, F, Cl, Br, I), (C1-C4)알킬, (C1-C4)알케닐, (C1-C4)알키닐, (C3-C7)사이클로알킬, (C1-C6)헤테로사이클로알킬, (C6-C10)아릴, (C1-C9)헤테로아릴, (C1-C4)알콕시, 시아논 (-CN), 아지도 (-N3), -NR4R5, R4C(=O)-, R4C(=O)O-, R4OC(=O)O-, R4NHC(=O)-, R4C(=O)NH-, R4R5NC(=O)-, R4OC(=O)-로부터 독립적으로 선택된다.
  79. 화학식 A의 화합물:
    [화학식 A]
    Figure pct00129

    상기 식에서, Y는 O, 또는 N이고;
    Ar은,
    Figure pct00130
    이거나,
    페로센이고;
    R은 -C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴 또는 알킬헤테로아릴이고;
    α는 A, V, F, G, M, R 또는 L이고;
    β는 결합이거나, 독립적으로는 P, F, A, R, L 또는 G이고;
    γ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
    δ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G 또는 V이고;
    ε는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V 또는 E이고;
    Φ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고;
    이때 β, γ, δ, ε 및 Φ 각각이 결합이면, α의 N-말단은 X에 결합되고;
    X는 0 내지14개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 사슬이고;
    PG는 -C(=O)-O-R1(여기서, R1 은 C1-C30 알킬, t-부틸, 또는 메틸플루오레닐임) 또는 -C(=O)-R2(여기서, R2 는 -C1-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴임)이다.
  80. 화학식 B의 화합물:
    [화학식 B]
    Figure pct00131

    상기 식에서,
    L은 A, AA, V 또는 트리아졸일이고,
    Z는 페로센, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린, 톨루이딘 블루, 반응성 블랙 5, 레마 졸 브릴리언트 블루, 반응성 바이올렛 5 및 반응성 오렌지 16, 반응성 블루 4, 반응성 레드 120, 반응성 블루 2, 반응성 그린 19 또는 반응성 브라운 10이고,
    α는 A, V, F G, M, R 또는 L로부터 선택되고,
    β는 결합이거나, 독립적으로는 P, F, A, R, L, 또는 G로부터 선택되고,
    γ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G로부터 선택되고,
    δ는 결합이고: 아미노산이 아니거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G 또는 V이고,
    ε는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L, G, V 또는 E이고,
    Φ는 결합이거나, 독립적으로는 P, A, R, L 또는 G이고,
    이때 β, γ, δ, ε, 및 Φ 각각이 결합이면, α의 N-말단은 X에 결합되고;
    X는 0 내지14개의 AA를 포함하는 펩타이드 사슬이며, 이때 AA는 아미노산, 폴리아민 또는 폴리옥시알킬렌이고;
    PG는 폴리스티렌 비드, 실리카 겔 비드, 다당류 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 셀룰로오스 비드, 다당류, 유도화 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드, UV-활성화 기, 페놀성 아지드, 에폭시드, 펩티도글리칸, 지방족 사슬, 지방족 알코올 사슬, 지방족 아민, 메르캅토에틸, 다-환 또는 다중-방향족 고리시스템, 친유성 그룹, -C(=O)-O-R1(여기서, R1 은 C1-C30 알킬, t-부틸, 메틸플루오레닐임)이고,
    -C(=O)-R2(여기서, R2는 -C1-C30 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 또는 알킬헤테로아릴임)이다.
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