BRPI0619128A2

BRPI0619128A2 - método para avaliação quanto a conjutivite bacteriana

Info

Publication number: BRPI0619128A2
Application number: BRPI0619128-2A
Authority: BR
Inventors: John Gavin Macdonald; Stephanie M Martin; Jason Lye
Original assignee: Kimberly Clark Co
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2011-09-13
Also published as: KR20080082638A; US20070140971A1; AU2006325302A1; AU2006325302B2; EP1960533A1; KR101343675B1; WO2007070181A1; US7727513B2; JP2009519709A

Abstract

MéTODO PARA AVALIAçãO QUANTO A CONJUTIVITE BACTERIANA. Um método para detectar conjuntivite infecciosa rapidamente em um hospedeiro anfitrião é fornecido. O método inclui contatar uma amostra teste ocular com um cromogênio (por exemplo, tintura de Reichardt) que exibe uma mudança de cor na presença de micróbios. Os presentes inventores descobriram que a extensão da mudança de cor pode variar, dependendo em se o micróbio é uma bactéria ou vírus. Sem pretender ser limitados através de teoria, os presentes inventores acreditam que o cromogênio interage com a estrutura de parede celular com base em peptidoglicano de bactérias para induzir uma mudança de cor que é ainda mais evidente em níveis infecciosos. Acredita-se que esta interação ocorre em uma extensão muito maior em bactérias do que em vírus. Conseqúentemente, embora o cromogênio ainda possa submeter-se a uma mudança de cor na presença dos vírus, é tipicamente em uma extensão muito menor. Desta maneira, o grau de mudança de cor do cromogênio pode ser utilizado na presente invenção como um mecanismo para diferenciar-se entre conjuntivite virótica e bacteriana.

Description

"MÉTODO PARA AVALIAÇÃO QUANTO A CONJUTIVITE BACTE-

RIANA"

Antecedente da Invenção

Conjuntivite é o distúrbio ocular mais comum e po- de variar na gravidade de uma inflamação moderada com dila- ceramento a uma inflamação severa que causa lesão de tecido. Conjuntivite infecciosa geralmente é causada pela presença de bactérias ou virus. Uma variedade de bactérias pode cau- sar conjuntivite bacteriana, tal como S. pneumoniae, H. in- fluenzae, P. aeruginosa, ou S. pyogenes. Igualmente, uma variedade de virus pode ser responsável pela conjuntivite viral, tais como adenovirus, virus do herpes simples (HSV), virus de varicela-zoster (VZV) , picornavirus (enterovirus 70, Coxsackie A24), poxvirus (molusco contagioso, vacinia), e virus da imunodeficiência humana (HIV). Conjuntivite ade- noviral é a causa mais comum de conjuntivite viral. Subti- pos particulares de conjuntivite adenoviral incluem cerato- conjuntivite epidêmica (olho rosa) e febre faringoconjunti- va. Infecção por herpes simples ocular primária é da mesma forma comum, particularmente em crianças, e está normalmente associada com uma conjuntivite folicular.

O protocolo de tratamento para conjuntivite infec- ciosa depende em grande parte se a infecção é viral ou bac- teriana. Conjuntivite viral é auto-limitante e pode não re- querer nenhum tratamento especifico, exceto gotas para ali- viar quaisquer sintomas associados com a infecção. Por ou- tro lado, pacientes tendo conjuntivite bacteriana são tipi- camente tratados com antibióticos tópicos (por exemplo, go- tas de sulfacetamida sódica 10% ou trimetoprima/polimixina B qid) . Técnicas convencionais para diagnosticar o tipo de infecção ocular contam principalmente com exame clinico. Por exemplo, porque a descarga na conjuntivite bacteriana é normalmente mais purulenta do que a descarga aquosa de con- juntivite viral, exame fisico pode ser empregado no diagnós- tico. Infelizmente, tais técnicas diagnosticas são freqüen- temente incertas e levam à prescrição de gotas antibióticas em casos em que elas não são necessárias.

Como tal, uma necessidade atualmente existe para uma técnica de avaliação rápida para conjuntivite bacteriana em um paciente.

Sumário da Invenção

De acordo com uma modalidade da presente invenção, um método para avaliação quanto a conjuntivite bacteriana é descrito. 0 método compreende contatar uma amostra teste ocular com um cromogênio. 0 cromogênio submete-se a uma mu- dança de cor em menos do que cerca de 30 minutos na presença de bactérias em uma concentração patogênica.

Outras características e aspectos da presente in- venção são discutidos em maiores detalhes abaixo.

Breve Descrição dos Desenhos

Uma descrição total e de operação da presente in- venção, incluindo o melhor modo desta, direcionada por al- guém de experiência ordinária na arte, é mencionada mais particularmente no restante da especificação, que faz refe- rência às figuras anexas em que:

Fig. 1 é a estrutura de uma tintura de merocianina que pode ser empregada na presente invenção;

Figs. 2-3 ilustram um método para sintetizar uma tintura de merocianina;

Fig. 4 é uma vista perspectiva de um dispositivo de ensaio de fluxo lateral que pode ser empregado em uma mo- dalidade da presente invenção; e

Fig. 5 é uma vista perspectiva de um substrato an- tes (Fig. 5A) e depois de (Fig. 5B) submeter-se a uma mudan- ça de cor; e

Fig. 6 é uma ilustração gráfica dos resultados ob- tidos no.Exemplo 4 em que Delta E é plotado versus concen- trações conhecidas de P. aeuruginosa.

Uso repetido de caracteres de referência na pre- sente especificação e desenhos é pretendido representar as mesmas ou características análogas ou elementos da invenção.

Descrição Detalhada de Modalidades Representativas

Definições

Quando aqui empregado, o termo "amostra teste ocu- lar" geralmente se refere a um material biológico obtido di- retamente ou indiretamente do olho de um hospedeiro, tal co- mo de líquido de lente ocular (por exemplo, lágrimas), des- carga, tecido, etc. A amostra teste pode ser obtida em qualquer método desejado, tal como empregando um cotonete. A amostra teste pode da mesma forma ser empregada como obti- 25 da ou pré-tratada de alguma maneira. Por exemplo, tal pré- tratamento pode incluir filtração, precipitação, diluição, destilação, misturação, concentração, inativação de compo- nentes interferentes, a adição de reagentes, lise, etc. Quando aqui empregado, o termo "hospedeiro" se re- fere a qualquer animal, preferivelmente um humano.

Descrição Detalhada

Referência agora será feita em detalhes em várias modalidades da invenção, um ou mais exemplos dos quais são mencionados abaixo. Cada exemplo é fornecido por meio de explicação da invenção, não limitação da invenção. De fato, ficará evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas na presente inven- ção sem afastar-se do escopo ou espirito da invenção. Por exemplo, características ilustradas ou descritas como parte de uma modalidade, podem ser empregadas em outra modalidade para produzir ainda uma outra modalidade. Desse modo, pre- tende-se que a presente invenção abranja tais modificações e variações visto que entram no escopo das reivindicações ane- xas e seus equivalentes.

Em geral, a presente invenção é direcionada a um método para avaliação rápida quanto a conjuntivite bacteria- na em um hospedeiro. 0 método inclui contatar uma amostra teste ocular com um cromogênio (por exemplo, tintura de Rei- chardt) que exibe uma mudança de cor na presença de um mi- cróbio. Os presentes inventores descobriram que a extensão da mudança de cor pode variar dependendo de se o micróbio é uma bactéria ou vírus. Sem pretender ser limitado por teo- ria, os presentes inventores acreditam que o cromogênio in- terage com a estrutura de parede celular com base em pepti- doglicano de bactérias para induzir uma mudança de cor que está ainda mais evidente em níveis infecciosos. Acredita-se que esta interação ocorre em uma extensão muito maior em bactérias do que em virus. Desta maneira, embora o cromogê- nio ainda possa submeter-se a uma mudança de cor na presença dos virus, é tipicamente em uma extensão muito menor. Desta maneira, o grau de mudança de cor do cromogênio pode ser em- pregado na presente invenção como um mecanismo para diferen- ciação entre conjuntivite viral e bacteriana.

Qualquer dentre uma variedade de bactérias e/ou virus pode ser detectada de acordo com a presente invenção. Por exemplo, cocos gram-positivos (por exemplo, Staphylococ- cus epidermidis, Streptococcus pyogenes, e Streptococcus pneumoniae); cocos gram-negativos (por exemplo, P. aerugino- sa, Neisseria meningitides, e Moraxella laeunata) ; e basto- netes gram-negativos (por exemplo, Haemophilus influenzae) estão freqüentemente associados com conjuntivite bacteriana e podem ser detectados na presente invenção. Bactérias gram-negativas têm uma parede celular revestida com lipopo- lissacarideo (LPS). Bactérias gram-positivas são revestidas com camadas semelhantes a lâmina de peptidoglicano espesso (ou mureina). As causas mais prevalecentes de conjuntivite bacteriana são Streptoeoeeus pneumoniae, Haemophilus influ- enzae, ou Streptoeoeeus pyogenes. Streptoeoeeus pyogenes é um cocus não formadores de esporo, não móveis, Gram- positivos que ocorrem em cadeias ou em pares de células. Streptoeoeeus pyogenes é um anaeróbio aerotolerante negativo de catalase (anaeróbio facultativo) e requer meio enriqueci- do contendo sangue para crescer. Haemophilus influenzae é uma bactéria Gram-negativa não móvel na família Pasteurella- ceae. Cepas não encapsuladas de Haemophilus influenzae são acreditadas causar principalmente conjuntivite.

Vírus contêm um ácido nucléico incluído dentro de uma proteína organizada em subunidades de capsômero ("capsí- deo"). Alguns vírus da mesma forma contêm um envelope de glicoproteína que circunda o capsídeo que é composto de duas camadas de lipídio espalhadas com moléculas de proteína (bi- camada de lipoproteína) e pode conter material da membrana de uma célula de hospedeiro ou de origem viral. Vírus podem da mesma forma desenvolver pontas feitas de glicoproteína em seus envelopes que os ajudam a ligar-se a superfícies de cé- lula específicas. A forma mais comum de conjuntivite viral que pode ser detectada de acordo com a presente invenção é causada por adenovírus da família Adenoviridae. Ceratocon- juntivite epidêmica, por exemplo, está associada com soroti- pos de adenovírus 8, 19, e 37. Adenovírus são vírus de DNA de filamento duplo que contêm capsídeos icosaédricos com do- ze vértices e sete proteínas de superfície. 0 vírus é não revestido e esférico. Vírus do herpes estão da mesma forma comumente associados com conjuntivite viral. Vírus do her- pes contêm capsídeos icosaédricos circundados por uma camada grossa de proteínas adicionais (Tegumento) e um envelope ex- terior com glicoproteínas semelhantes à pontas. 0 capsídeo contém 162 capsômeros incluindo uma estrutura de núcleo con- tendo DNA viral linear de filamento duplo. Vírus do herpes são classificados em três grupos com base no tropismo de te- cido, patogenicidade, e comportamento sob condições de cul- tura no laboratório, isto é, vírus do herpes α, β e γ. Vi- rus do herpes simples tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) estão na subfamilia α de virus do herpes. HSV-I está mais geralmente associado com conjuntivite viral.

O cromogênio é selecionado de acordo com a presen- te invenção para interagir de alguma maneira com a membrana celular do micróbio e/ou do ambiente em que o micróbio está presente. Como resultado desta interação, o, cromogênio submete-se a uma mudança na cor que é facilmente detectável (por exemplo, com um olho nu) . O termo "cor" refere-se à presença ou ausência de certos comprimentos de onda de luz refletida ou emitida de objetos em um campo visual. Luz que entra no olho, por exemplo, é submetida a uma análise espec- tral por três tipos de cones retinais que são sensíveis a regiões específicas do espectro visível. Estímulos destas células são sucessivamente processados por neurônios reti- nais, neurônios do nervo ótico e o córtex visual de forma que uma sensação de cor seja experimentada. O cromogênio empregado na presente invenção tipicamente deve sua cor à absorção de certos comprimentos de onda de luz. Como tal, a cor percebida é normalmente o complemento da cor associada com o comprimento de onda de luz a ser absorvido pelo obje- to. Um objeto que parece ser vermelho na cor quando visto na luz branca, por exemplo, está de fato seletivamente ab- sorvendo luz azulada na faixa de comprimento de onda de 4 90 a 500 nanômetros. Similarmente, um objeto que parece amare- lo na luz branca está de fato absorvendo luz azul na faixa de comprimento de onda de 435 a 480 nanômetros.

A absorção de luz visível está associada com tran- sições eletrônicas dentro de uma molécula e resulta na gera- ção de um estado excitado. A diferença de energia entre o estado base da molécula e o estado excitado relevante deter- mina o comprimento de onda de luz absorvida de acordo com a relação de Planck:

E=hv

em que,

E é energia,

h é a constante de Planck, e

ν é a freqüência do fóton de luz absorvida, e está relacionado ao comprimento de onda λ e a velocidade de luz c em v=c/λ.

Um diagrama do estado, tal como mostrado abaixo, pode ser empregado para graficamente descrever as transições eletrônicas:

<figure>figure see original document page 9</figure>

A energia de um fóton absorvido é desse modo in- versamente proporcional ao comprimento de onda do fóton. Desse modo, fótons de luz azul (435 - 480 nanômeteros) têm uma energia mais alta do que a luz amarela (580 - 595 nanô- meteros). Como tal, a cor do cromogênio é determinada pela energia de transição entre o estado base do cromogênio e o primeiro estado excitado permitido. A porção de absorção de luz do cromogênio emprega- da na presente invenção é um cromóforo que é geralmente res- ponsável pela cor do cromogênio e é conectado a um sistema conjugado. Por exemplo, grupos azo (por exemplo, tinturas de azo), grupos polieno (por exemplo, tintura de caroteno), grupos carbonila (por exemplo, tinturas de antraquinona) são cromóforos comuns. Auxocromos pode induzir uma troca da má- xima absorção do cromóforo para a extremidade vermelha do espectro ("troca batocrômica") ou a extremidade azul do es- pectro ("troca hipsocrômica"). Auxocromos podem ou não po- dem ser conjugados com o cromogênio. Por exemplo, um grupo amino conjugado em um grupo azo (cromóforo) por meio de, por exemplo, um anel de benzeno, formará um cromogênio de amino- azo. O tipo de troca de absorção depende da natureza do cromóforo e, por exemplo, em se o auxocromo funciona como um aceptor de elétron, em que uma troca hipsocômica resulta, ou se o grupo amino funciona como um doador de elétron, em que uma troca batocrômica resulta. Por exemplo, um auxocromo de amino conjugado trocará a faixa de absorção do grupo azo pa- ra comprimentos de onda mais longos e aumentará a intensida- de da faixa de absorção. A troca de absorção fornece uma diferença de cor que é detectável, visualmente ou através de instrumento.

Uma classe particularmente adequada de cromogênios que podem sofrer uma mudança de cor detectável na presença de bactérias é tinturas solvatocrômicas. Tinturas solvato- crômicas são tinturas tendo características espectroscópicas (por exemplo, absorção) no espectro ultraviole- ta/visivel/quase infra-vermelho e são algumas vezes influen- ciadas pelo meio circundante. As tinturas solvatocrômicas podem ser positivas ou negativas, que correspondem às trocas batocrômicas e hipsocrômicas, respectivamente, da faixa de emissão com polaridade de solvente crescente. Em uma moda- lidade, por exemplo, a tintura solvatocrômica submete-se a uma mudança de cor em um certo ambiente molecular com base na polaridade de solvente e/ou propensão de ligação de hi- drogênio. Por exemplo, uma tintura solvatocrômica pode ser azul em um ambiente polar (por exemplo, água), porém amarela ou vermelha em um ambiente não polar (por exemplo, solução rica em lipidio). A cor produzida pela tintura solvatocrô- mica depende da diferença de polaridade molecular entre o estado base e excitado da tintura.

Tinturas de merocianina (por exemplo, mono, di, e tri-merocianinas) são um exemplo de um tipo de tintura sol- vatocrômica que pode ser empregada na presente invenção. Tinturas de merocianina, tal como merocianina 540, inclui-se na classificação de cromogênio de aceptor simples - doador de Griffiths como discutido em "Colour e Constitution of Or- ganic Molecules "Academic Press, London (1976). Mais espe- cificamente, tinturas de merocianina têm um núcleo básico e núcleo ácido separado através de uma cadeia conjugada tendo ainda um número de carbonos de metina. Tais tinturas possu- em um grupo carbonila que age como uma porção de aceptor de elétron. O aceptor de elétron é conjugado a um grupo de do- ação de elétron, tal como um grupo hidroxila ou amino. As tinturas de merocianina podem ser cíclicas ou acíclicas (por exemplo, amidas vinylalogous de tinturas de merocianina cí- clicas) . Por exemplo, tinturas de merocianina cíclicas ge- ralmente têm a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 12</formula>

em que, η é qualquer número inteiro, incluindo 0. Como indicado acima pelas estruturas gerais 1 e 1', tinturas de merocianina tipicamente têm uma forma de ressonância de carga separada (isto é, "híbridas"). Tinturas híbridas são aquelas que contêm cargas positivas e negativas e são neu- tras líquidas, porém altamente carregadas. Sem pretender estar limitada através de teoria, acredita-se que a forma híbrida contribua significativamente para o estado base tin- tura. A cor produzida por tais tinturas, desse modo, depen- de da diferença de polaridade molecular entre o estado base e excitado da tintura. Um exemplo particular de uma tintura de merocianina tendo um estado base mais polar do que o es- tado excitado e mencionado abaixo como estrutura 2.

<formula>formula see original document page 12</formula>

A forma canônica do lado esquerdo separada por carga 2 é um contribuidor principal para o estado base visto que a forma canônica do lado direito 21 é um contribuidor principal para primeiro estado excitado. Ainda outros exem- plos de tinturas de merocianina adequadas são mencionados abaixo nas seguintes estrutes 3-13

<formula>formula see original document page 13</formula> <formula>formula see original document page 14</formula>

em que, "R" é um grupo, tal como metila, alquila, arila, fenila, etc.

índigo é outro exemplo de uma tintura solvatocrô- mica adequada para uso na presente invenção. índigo tem um estado base que é significativamente menos polar do que o estado excitado. Por exemplo, índigo geralmente tem a se- guinte estrutura 14: <formula>formula see original document page 15</formula>

A forma canônica do lado esquerdo 14 é um contri- buidor principal para o estado base da tintura, visto que a forma canônica do lado direito 14' é um contribuidor princi- pal para o estado excitado.

Outras tinturas solvatocrômicas adequadas que po- dem ser empregadas na presente invenção incluem aquelas que possuem uma forma híbrida permanente. Isto é, estas tintu- ras têm cargas positivas e negativas formais contidas dentro um sistema de π-elétron contíguo. Ao contrário das tinturas de merocianina referidas acima, uma estrutura de ressonância neutra não pode ser extraída para tais cromogênios híbridos permanentes. Tinturas exemplares desta classe incluem tin- turas de N-fenolato betaína, tais como aquelas tendo a se- guinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que R1-R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, um grupo nitro (por exemplo, nitrogênio), um halogênio, ou um grupo C1 a C20 linear, ramificado ou cíclico (por exemplo, alquila, fenila, arila, piridinila, etc.), que pode ser saturado ou insatura- do e não substituído ou opcionalmente substituído ao mesmo ou em átomos de carbono diferentes com um, dois ou mais gru- pos halogênio, nitro, ciano, hidróxi, alcóxi, amino, fenila, arila, piridinila, ou alquilamino. Por exemplo, a tintura de N-fenolato betaína pode ser 4-(2,4,β-trifenilpiridínio-1- il)-2, 6-difenilfenolato (tintura de Reichardt) tendo a se- guinte estrutura geral 15:

<formula>formula see original document page 16</formula>

A tintura de Reichardt mostra solvatocromismo ne- gativo forte. Isto é, tintura de Reichardt exibe uma troca na absorvência em um comprimento de onda mais curto e desse modo tem mudanças de cor visíveis quando a resistência ao eluente de solvente (polaridade) aumentos. Ainda outros e- xemplos de tinturas de N-fenolato betaína de piridínio sol- vatocrômicas negativamente adequadas são mencionados abaixo nas estruturas 16-23: em que, R é hidrogênio, -C(CH3)3, -CF3, ou CeF13. <formula>formula see original document page 17</formula> <formula>formula see original document page 18</formula> <formula>formula see original document page 19</formula>

Ainda exemplos adicionais de tinturas tendo uma forma híbrida permanente incluem tinturas tendo a seguinte estrutura geral 24 : <formula>formula see original document page 20</formula>

em que, η é O ou maior, e X é oxigênio, carbono, nitrogênio, enxofre, etc. Exemplos particulares das tintu- ras híbridas permanentes mostrados na estrutura 24 incluem as seguintes estruturas 25 - 33.

<formula>formula see original document page 20</formula> <formula>formula see original document page 21</formula>

Ainda outras tinturas solvatocrômicas adequadas podem incluir, porém não são limitadas a 4-dicianmetileno-2- metil-6-(p-dimetilaminostiril)-4H-pirano (DCM); 6-propionil- 2-(dimetilamino)naftaleno (PRODAN); 9-(dietilamino)-5H- benzo[a]fenox-azin-5-ona (Nilo Red); 4- (dicianovinil)julolidina (DCVJ); azul de fenol; tinturas de estilbazólio; tinturas de cumarina; tinturas de cetocianina; N,N-dimetil-4-nitroanilina (NDMNA) e N-metil-2-nitroanilina (NM2NA); azul de Nilo; ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfônico (1,8-ANS), e dapoxilbutilsulfonamida (DBS) e outros análogos de dapoxila. Além disso, as tinturas mencionadas acima, a- inda outras tinturas adequadas que podem ser empregadas na presente invenção, porém não são limitadas a, 4-[2-N- substituido-1,4-hidropiridin-4-ilidina)etilideno]cicloexa- 2,5-dien-l-ona, tinturas de pirazolona vermelhas, tinturas de azometina, tinturas de indoanilina, e misturas destes.

Embora as tinturas referidas acima sejam classifi- cadas como solvatocrômicas, deve ser entendido que a presen- te invenção necessariamente não está limitada a qualquer me- canismo particular para a mudança de cor do cromogênio. Mesmo quando uma tintura solvatocrômica é empregada, outros mecanismos podem ser de fato completamente ou parcialmente responsáveis pela mudança de cor da tintura. Por exemplo, reações de doação de ácido-base ou próton entre a tintura e micróbio podem resultar na mudança de cor. Como um exemplo, porções de ácido altamente organizadas nas paredes celulares das bactérias podem protonar certas tinturas, resultando em uma perda de cor. Reações de oxirredução entre a tintura e micróbio podem igualmente contribuir para a mudança de cor.

O cromogênio pode ser utilizado sozinho ou como parte de uma composição de detecção. Se desejado, a compo- sição de detecção pode conter um portador para o cromogênio que funciona como uma fase móvel. O portador pode ser um liquido, gás, gel, etc., e pode ser selecionado para forne- cer o desempenho desejado (tempo para mudança de cor, con- traste entre áreas diferentes, e sensibilidade) do cromogê- nio. Em algumas modalidades, por exemplo, o portador pode ser um solvente aquoso, tal como água, bem como um solvente não aquoso, tal como glicóis (por exemplo, propileno glicol, butileno glicol, trietileno glicol, hexileno glicol, polie- tileno glicóis, etoxidiglicol, e dipropilenoglicol); álcoois (por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, e isopropanol); triglicerideos; acetato de etila; acetona; triacetina; ace- tonitrilo, tetraidrafurano; xilenos; formaldeidos (por exem- plo, dimetilformamida); etc. A quantidade do portador e cromogênio na composição de detecção pode geralmente variar com base no nivel de sensibilidade de micróbio e padrão de cor ou projeto utilizado. Por exemplo, em algumas modalida- des, o cromogênio pode estar presente na composição de de- tecção em uma concentração de cerca de 0,1, a cerca de 100 miligramas por mililitro de portador, em algumas modalidades a partir de cerca de 0,5 a cerca de 60 miligramas por mili- litro de portador, e em algumas modalidades, a partir de cerca de 1 a cerca de 40 miligramas por mililitro de porta- dor .

Além do cromogênio e portador, a composição de de- tecção pode da mesma forma conter uma variedade de outros componentes. Em uma modalidade, por exemplo, aditivos são incorporados na composição de detecção que realça o desempe- nho do cromogênio. Por exemplo, ciclodextrinas podem realçar a sensibilidade do cromogênio e o contraste entre regiões de cor diferente. Enquanto não desejando estar ligado através de teoria, os presentes inventores acreditam que tais aditi- vos podem inibir a cristalização da tintura e desse modo fornecer uma cor mais vivida e da mesma forma realçar a sen- sibilidade de detecção. Isto é, moléculas de tintura simples têm maior sensibilidade para micróbios porque cada molécula de tintura está livre para interagir com a membrana microbi- ana. Ao contrário, cristais pequenos de tintura têm que dis- solver primeiro e em seguida penetrar a membrana. Exemplos de ciclodextrinas adequadas podem incluir, porém não estão limitados a, hidroxipropil-p-ciclodextrina, hidroxietil-β- ciclodextrina, γ-ciclodextrina, hidroxipropil-γ- ciclodextrina, e hidroxietil-γ- ciclodextrina, que estão co- mercialmente disponíveis a partir de Cerestar International of Hammond Indiana.

Surfactantes podem da mesma forma ajudar a realçar a sensibilidade do cromogênio e o contraste entre regiões diferentes. Surfactantes particularmente desejados são sur- factantes não iônicos, tais como alquilfenóis etoxilados, álcoois graxos etoxilados e propoxilados, copolímeros de bloco de óxido de etileno-óxido de propilene, ésteres etoxi- lados de ácidos graxos (C8-C18) , produtos de condensação de óxido de etileno com amidas e aminas de cadeia longa, produ- tos de condensação de óxido de etileno com álcoois, dióis acetilênicos e misturas destes. Vários exemplos específicos de surfactantes não iônicos adequados incluem, porém não es- tão limitados a, metil glucete-10, diestearato de metil gli- cose de PEG-20, sesquiestearato de metil glicose de PEG-20, parete-20 Cn-I5, cetete-8, cetete-12, dodoxinol-12, laurete- 15, óleo de rícino de PEG-20, polissorbato 20, estearete-20, éter cetílico de polioxietileno-10, éter estearílico de po- lioxietileno-10, éter cetílico de polioxietileno-20, éter oleílico de polioxietileno-10, éter oleílico de polioxieti- leno-20, um nonilfenol etoxilado, octilfenol etoxilado, do- decilfenol etoxilado ou álcool graxo (C6-C22) etoxilado, in- cluindo 3 a 20 porções de óxido de etileno, éter isoexadecí- lico de polioxietileno-20, laurato de glicerol de polioxie- tileno-23, estearato de glicerila de polióxi-etileno-20, é- ter de metil glicose de PPG-10, éter de metil glicose de PPG-20, monoésteres de sorbitano de polioxietileno-20, óleo de rícino de polioxietileno-80, éter tridecílico de polioxi- etileno-15, éter tridecílico de polióxi-etileno-6, laurete- 2, laurete-3, laurete-4, óleo de rícino de PEG-3, dioleato de PEG 600, dioleato de PEG 400, e misturas destes. Surfac- tantes não iônicos comercialmente disponíveis podem incluir a faixa de SÜRFYNOL® de surfactantes de diol acetilênicos disponíveis de Air Products and Chemical of Allentown, Pennsylvania e a faixa de TWEEN® de surfactantes de polioxi- etileno disponíveis de. Fischer Scientific of Pittsburgh, Pennsylvania.

A composição de detecção pode da mesma forma con- ter um aglutinante para facilitar a imobilização do cromogê- nio sobre um substrato. Por exemplo, polímeros orgânicos so- lúveis em água podem ser empregados como aglutinantes. Uma classe adequada de polímeros orgânicos solúveis em água in- cluem polissacarídeos e derivados destes. Polissacarídeos são polímeros que contêm unidades de carboidrato repetidas, as quais podem ser catiônicas aniônicas, não iônicas e/ou anfotéricas. Em uma modalidade particular, o polissacarídeo é um éter celulósico não iônico, catiônico, aniônico e/ou anfotérico. Éteres celulósicos não iônicos adequados podem incluir, porém não estão limitados a, éteres de alquil celu- losos, tais como metil celulose e etil celulose; éteres de hidroxialquil celulose, tais como hidroxietil celulose, hi- droxipropil celulose, hidroxipropil hidroxibutil celulose, hidroxietil hidroxipropil celulose, hidroxietil hidroxibutil celulose e hidroxietil hidroxipropil hidroxibutil celulose; éteres de alquil hidroxialquil celulose, tais como metil hi- droxietil celulose, metil hidroxipropil celulose, etil hi- droxietil celulose, etil hidroxipropil celulose, metil etil hidroxietil celulose e metil etil hidroxipropil celulose; e assim sucessivamente.

Se desejado, a composição de detecção pode ser a- plicada a um substrato que é contatado subseqüentemente com a amostra teste infectada. Técnicas de aplicação adequadas incluem impressão, imersão, pulverização, extrusão por fu- são, revestimento (por exemplo, revestimento de solvente, revestimento de pó, revestimento com escova, etc.), e assim sucessivamente. Na aplicação, a composição de detecção é se- ca para remover o portador e deixar um resíduo do cromogênio interagir com um micróbio. Por exemplo, a composição de de- tecção pode ser impressa sobre uma superfície do substrato para sinalizar a presença de micróbios em uma mudança na cor. A composição de detecção pode cobrir tudo ou apenas uma porção da superfície do substrato. Em uma modalidade, por exemplo, a composição de detecção é impressa na forma de in- dícios que carregam uma certa mensagem ao usuário. O subs- trato pode ser formado de quaisquer de uma variedade de ma- teriais capazes de ser aplicados com a composição de detec- ção. Por exemplo, o substrato pode ser formado de película, papel, um tecido não trançado, um tecido tricotado, um teci- do trançado, espuma, etc. O substrato pode ser incorporado em uma ampla variedade de artigos, tais como tiras, disposi- tivos de fluxo laterais, adesivos, kits de teste, mechas ab- sorventes & cartões conhecidos, tecidos faciais, fraldas, esfregaços faríngeos, curativos para ferimento, e assim su- cessivamente. Em uma modalidade particular, o substrato é um material de facestock geralmente empregado na fabricação de rótulos, tais como papel, poliéster, polietileno, polipropi- leno, polibutileno, poliamidas, etc. Um adesivo, tal como um adesivo sensível à pressão, adesivo ativado por calor, adesivo termorreversivel, etc., pode ser empregado em uma ou mais superfícies do material de facestock para ajudar a ade- ri-lo a uma superfície. Exemplos adequados de adesivos sen- síveis à pressão incluem, por exemplo, adesivos com base em acrílico e adesivos elastoméricos. Em uma modalidade, o ade- sivo sensível á pressão é com base em copolímeros de ésteres de ácido acrílico (por exemplo, acrilato de 2-etil hexila) com co-monômeros polares (por exemplo, ácido acrílico). O adesivo pode ter uma espessura na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 2 mils (2,5 a 50 mícrons). Um revestimento de libe- ração pode da mesma forma ser empregado o qual contata o a- desivo antes do uso. O revestimento de liberação pode conter qualquer de uma variedade de materiais conhecidos por aque- les de experiência na arte, tal como um papel revestido por silício ou substrato de película. Embora a discussão acima refira-se à aplicação da composição de detecção ao substra- to, deve ser entendido que aditivo(s) pode(m) da mesma forma ser aplicado(s) separadamente da composição de detecção con- tendo cromogênio.

Independente da maneira na qual é aplicado, a quantidade do cromogênio empregada é eficaz para resultar em uma mudança de cor detectável em contato com bactérias. A quantidade exata pode variar com base em uma variedade de fatores, incluindo a sensibilidade do cromogênio, a presença de outros aditivos na composição de detecção, o grau deseja- do de detectabilidade (por exemplo, com um olho nu), a con- centração suspeita do micróbio, etc. Em alguns casos, é de- sejável detectar apenas a presença de bactérias em concen- trações que são consideradas patogênicas. Por exemplo, uma concentração de bactérias de cerca de 1 χ IO5, em algumas modalidades cerca de 1 χ IO6, e em algumas modalidades, cer- ca de 1 χ IO8 unidades formadoras de colônia ("CFU") por mi- lilitro de uma amostra teste pode ser uma concentração pato- gênica limiar para conjuntivite bacteriana. Desse modo, o cromogênio pode estar presente em uma quantidade suficiente para submeter-se a uma mudança de cor detectável na presença de bactérias em uma concentração de pelo menos cerca de 1 χ 10^8 CFU por mililitro da amostra teste. Por exemplo, quando presente em um substrato, o cromogênio pode constituir de cerca de 0,001 % em peso a cerca de 20 % em peso, em algumas modalidades a partir de cerca de 0,01 % em peso a cerca de 10 % em peso, e em algumas modalidades a partir de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 5 % em peso do peso seco do subs- trato. A quantidade de outros aditivos (por exemplo, ciclo- dextrinas, surfactantes, aglutinantes, etc.) pode da mesma forma variar quando desejado, tal como a partir de cerca de 0,001 % em peso a cerca de 10 % em peso, em algumas modali- dades a partir de cerca de 0,01 % em peso a cerca de 5 % em peso, e em algumas modalidades a partir de cerca de 0,025 % em peso a cerca de 1 % em peso com base no peso seco do substrato.

Como declarado acima, o grau ao qual o cromogênio muda a cor fornece informação com respeito à presença de bactérias ou vírus aos quais está exposto. Por exemplo, a tintura de Reichardt mostra solvatocromismo negativo forte e pode desse modo submeter-se a uma mudança de cor significan- te de azul para incolor na presença de bactérias. Na presen- ça de certos vírus, a mudança de cor ocorre alguma vez em uma extensão menor. Desse modo, quando uma amostra teste in- fectada é colocada em contato com a tintura, a mudança de cor pode simplesmente ser observada para determinar se a in- fecção é causada através de bactérias. Isto é, se a mudança de cor ocorre a um certo grau (por exemplo, de azul para in- color) , pode ser determinado que a amostra teste infectada contém bactérias. Igualmente, se uma mudança de cor ocorre em uma extensão menor (por exemplo, de azul para azul fra- co) , pode ser determinado que a amostra teste contém um ní- vel infeccioso de um vírus ou que a conjuntivite é simples- mente devido à causas não infecciosas, tal como conjuntivite alergênica. Em cada caso, entretanto, ficará facilmente evi- dente se um antibiótico é ou não necessário.

A cor de um cromogênio teste reagido pode ser com- parada (por exemplo, visualmente ou com a ajuda de um ins- trumento) à cor de um cromogênio de controle, que é formado de um composto que é o mesmo ou similar ao cromogênio teste com respeito à sua atuação aos micróbios. Cromogênios de controle múltiplos podem ser empregados igualmente os quais correspondem a tipos diferentes de bactérias à concentração patogênica limiar. Em comparação, um ou mais dos cromogê- nios de controle pode(m) ser selecionado(s) o(s) qual(ais) tem(têm) uma cor que é a mesmo ou substancialmente similar a um cromogênio teste reagido com uma amostra teste. 0 tipo de micróbio dentro da amostra teste é, em seguida, determinado a partir do(s) cromogênio(s) de controle selecionado(s) e o(s) micróbio(s) conhecido(s) correspondente(s).

O grau ao qual o cromogênio muda a cor pode ser determinado visualmente ou utilizando instrumentação. Em uma modalidade, a intensidade de cor é medida com um leitor óp- tico. A configuração atual e estrutura do leitor óptico po- dem geralmente variar visto que é facilmente entendido por aqueles versados na técnica. Tipicamente, o leitor óptico contém uma fonte de iluminação que é capaz de emitir radia- ção eletromagnética e um detector que é capaz de registrar um sinal (por exemplo, luz transmitida ou refletida). A fon- te de iluminação pode ser qualquer dispositivo conhecido na técnica que é capaz de fornecer radiação eletromagnética, tal como luz na faixa visível ou quase visível (por exemplo, luz infravermelho ou ultravioleta). Por exemplo, fontes de iluminação adequadas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, porém não são limitadas a, díodos emisso- res de luz (LED), lâmpadas do flash, lâmpadas fluorescentes de cátodo frio, lâmpadas eletroluminescentes, e assim suces- sivamente. A iluminação pode ser multiplexada e/ou colimada. Em alguns casos, a iluminação pode ser pulsada para reduzir qualquer interferência de fundo. Além disso, a iluminação pode ser contínua ou pode combinar onda contínua (CW) e ilu- minação pulsada onde os feixes de iluminação múltiplos são multiplexados (por exemplo, um feixe pulsado é multiplexado com um feixe de CW) , permitindo a discriminação de sinal en- tre um sinal induzido pela fonte de CW e um sinal induzido pela fonte pulsada. Por exemplo, em algumas modalidades, LEDs (por exemplo, diodos vermelhos de arsenieto de gálio de alumínio, diodos verdes de fosfeto de gálio, diodos verdes de fosfeto de arsenieto de gálio ou diodos viole- ta/azul/ultravioleta (UV) de nitrito de gálio) são emprega- dos como a fonte de iluminação pulsada. Um exemplo comerci- almente disponível de um diodo de excitação de LED UV ade- quado apropriado para uso na presente invenção é Modelo NSHU550E (Nichia Corporation) que emite 750 a 1000 micro- watts de poder óptico em uma corrente avançada de 10 milli- amps (3,5-3,9 volts) em um feixe com uma largura total de quase o máximo de 10 graus, um comprimento de onda de pico de 370-375 nanômetros, e uma meia largura espectral de 12 nanômetros.

Em alguns casos, a fonte de iluminação pode forne- cer iluminação difusa ao cromogênio. Por exemplo, uma dispo- sição de fontes luminosas de pontos múltiplos (por exemplo, LEDs) pode simplesmente ser empregada para fornecer ilumina- ção relativamente difusa. Outra fonte de luz particularmente desejada que é capaz de fornecer iluminação difusa de uma maneira relativamente barata é um dispositivo eletrolumines- cente (EL). Um dispositivo EL é geralmente uma estrutura de capacitor que utiliza um material luminescente (por exemplo, partículas de fósforo) em sanduíche entre os eletrodos, pelo menos um dos quais é transparente para permitir a luz esca- par. Aplicação de uma voltagem pelos eletrodos gera um campo elétrico variável dentro do material luminescente que faz emitir luz.

O detector pode geralmente ser qualquer dispositi- vo conhecido na arte que é capaz de sentir um sinal. Por e- xemplo, o detector pode ser um detector de imageamento ele- trônico que é configurado para discriminação espacial. Al- guns exemplos de tais sensores de imageamento eletrônicos incluem dispositivos acoplados por carga lineares, de velo- cidade alta (CCD), dispositivos injeção de carga (CID), dis- positivos de semicondutor de óxido de metal complementar (CMOS), e assim sucessivamente. Tais detectores de imagem, por exemplo, são geralmente disposições bidimensionais de sensores de luz eletrônicos, embora detectores de imageamen- to lineares (por exemplo, detectores de CCD lineares) que incluem uma única linha de pixels detectores ou sensores de luz, tais como, por exemplo, aqueles utilizados para varre- dura de imagens, possam da mesma forma ser utilizados. Cada disposição inclui um conjunto de posições conhecidas, sem igual que podem ser referidas como "endereços." Cada endere- ço em um detector de imagem é ocupado por um sensor que co- bre uma área (por exemplo, uma área tipicamente moldada como uma caixa ou um retângulo). Esta área geralmente referida como um "pixel" ou área de pixel. Um pixel detector, por exemplo, pode ser um sensor de CCD, CID, ou um de CMOS, ou qualquer outro dispositivo ou sensor que detecta ou mede luz. O tamanho de pixels detectores pode variar amplamente, e pode em alguns casos ter um diâmetro ou comprimento tão baixo quanto 0,2 micrômetro.

Em outras modalidades, o detector pode ser um sen- sor de luz que necessita de capacidades de discriminação es- paciais. Por exemplo, exemplos de tais sensores de luz podem incluir dispositivos fotomultiplicadores, fotodiodos, tais como fotodiodos em avalanche ou fotodiodos de silício, e as- sim sucessivamente. Fotodiodos de silício são às vezes van- tajosos visto que eles são baratos, sensíveis, capazes de operação em alta velocidade (risetime curto / largura da faixa alta), e facilmente integrados na maior parte das ou- tras tecnologias de semicondutor e circuição monolítica. A- lém disso, fotodiodos de silício são fisicamente pequenos, que os permite ser facilmente incorporados em vários tipos de sistemas de detecção. Se os fotodiodos de silício são em- pregados, em seguida a faixa do comprimento de onda do sinal emitido pode estar dentro de sua faixa de sensibilidade, que é 400 a 1100 nanômetros.

Os leitores ópticos geralmente podem empregar qualquer técnica de detecção conhecida, incluindo, por exem- plo, luminescência (por exemplo, fluorescência, fosforescên- cia, etc.), absorvência (por exemplo, fluorescente ou não fluorescente), difração, etc. Em uma modalidade particular do presente, o leitor óptico mede a intensidade de cor como uma função de absorvência. Em uma modalidade, leituras de absorvência são medidas utilizando um leitor de microplaca de Dynex Tecnologies of Chantilly, Virgínia (Model #MRX). Em outra modalidade, leituras de absorvência são medidas utili- zando um teste convencional conhecido como "CIELAB" que é discutido em Pocket Guide to Digital Printing por F. Cost, Delmar Publishers, Albany, NY. ISBN 0-8273-7592-1 nas pági- nas 144 e 145. Este método define três variáveis, L*, a*, e b*, que correspondem a três características de uma cor per- cebida com base na teoria oposta de percepção de cor. As três variáveis têm o seguinte significado:

L * = Leveza (ou luminosidade), variando a partir de 0 a 100, onde 0 = escuro e 100 = luz;

a* = Eixo vermelho/verde, variando aproximadamente de -100 a 100; valores positivos são avermelhados e valores negativos são esverdeados; e b* = Eixo amarelo/azul, variando aproximadamente de -100 a 100; valores positivos são amarelados e valores negativos são azulados.

Porque o espaço de cor CIELAB é um pouco visual- mente uniforme, um único número pode ser calculado o qu.al representa a diferença entre duas cores quando percebida por um humano. Esta diferença é denominada ΔΕ e calculada tiran- do-se a raiz quadrada da soma dos quadrados das três dife- renças (AL*, Aa*, e Ab*) entre as duas cores. No espaço de cor de CIELAB, cada unidade de ΔΕ é aproximadamente igual a uma diferença "realmente notável" entre duas cores. CIELAB é, portanto, uma boa medida para um sistema de especificação de cor independente de dispositivo objetivo que pode ser u- tilizado como um espaço de cor de referência com a finalida- de de administração de cor e expressão de mudanças na cor. Utilizando-se este teste, intensidades de cor (L*, a*, e b*) podem desse modo ser medidas utilizando-se, por exemplo, um espectrofotômetro de mão de Minolta Co. de Osaka, Japan (Mo- delo #CM2600d). Este instrumento utiliza a geometria de D/8 que adapta-se a CIE No.15, ISO 7724/1, ASTME1164 e JIS Z8722-1982 (iluminação difundida/sistema de visão de 8 grau. A luz D65 refletida pela superfície de espécime em um ângulo de 8 graus ao normal da superfície é recebida pelo sistema óptico de medição de espécime. Ainda outro leitor óptico a- dequado é o espectrofotômetro de refletância descrito na Pub. de Ped. de Patente U.S. No. 2003/0119202 por Kailor, e outros, que está incorporado aqui em sua totalidade através de referência para todos os propósitos. Igualmente, sistemas de detecção de modo de transmissão podem da mesma forma ser utilizados na presente invenção.

As técnicas acima descritas podem ser implementa- das em uma variedade de modos de acordo com a presente in- venção. Por exemplo, um substrato pode ser utilizado o qual contém uma zona de detecção que fornece qualquer número de regiões de detecção distintas (por exemplo, linhas, pontos, etc.) de forma que um usuário possa determinar melhor a pre- sença de um ou mais micróbios dentro de uma amostra teste. Cada região pode conter o mesmo cromogênio teste, ou pode conter cromogênios diferentes para reagir com tipos diferen- tes de micróbios. Alguns cromogênios, por exemplo, são mais sensíveis a bactérias gram-positivas e alguns são mais sen- síveis a bactérias gram-negativas. A concentração de cromo- gênio teste pode da mesma forma ser seletivamente controlado para fornecer o nível desejado de sensibilidade de detecção. Por exemplo, concentrações mais altas podem fornecer um ní- vel mais alto de sensibilidade de detecção quando baixos ní- veis de micróbio são suspeitos. Referindo-se a Fig. 5A, uma modalidade da presente invenção é mostrada em que um subs- trato 80 está na forma de uma tira de teste que é revestida uniformemente com um cromoqênio (não mostrado). Quando uma amostra de teste ocular infectada (por exemplo, obtida de uma mecha absorvente) contata uma região 82 do substrato 80, ela muda a cor para indicar a presença da infecção (Fig. 5B) .

Se desejado, o substrato da mesma forma pode con- ter uma zona de controle que é aplicada com um cromogênio de controle que é o mesmo ou similar ao cromogênio teste. A zo- na de controle geralmente não muda a cor durante o teste de forma que esta possa ser empregada para comparação. Similar à zona de detecção, a zona de controle pode da mesma forma fornecer qualquer número de regiões distintas. Por exemplo, a zona de controle pode conter regiões que correspondem à concentrações de micróbio pré-determinadas diferentes, tal como descrito acima. Além disso, as regiões podem conter tinturas que têm um nivel de sensibilidade diferente para tipos diferentes de micróbios.

Referindo-se a Fig. 4, outra modalidade da presen- te invenção é ilustrada em que o substrato é um dispositivo de fluxo lateral 20. Mais especificamente, o dispositivo 20 contém uma membrana porosa 23 que age como um médio fluídi- co e é opcionalmente suportado por um material rígido (não mostrado) . Em geral, a membrana porosa 23 pode ser feita a partir de qualquer dentre uma variedade de materiais através dos quais a amostra teste é capaz de passar. Por exemplo, os materiais empregados para formar a membrana porosa 23 pode incluir, porém não estão limitados a, materiais de ocorrên- cia natural, sintéticos, naturais que são modificados sinte- ticamente, tais como polissacarideos (por exemplo, materiais de celulose tais como derivados de celulose e papel tais co- mo acetato de celulose e nitrocelulose); poliéter sulfona; polietileno; náilon; fluoreto de polivinilideno (PVDF); po- liéster; polipropileno; sílica; materiais inorgânicos, tais como alumina desativada, terra diatomácea, MgSO4, ou outro material finamente dividido inorgânico uniformemente disper- so em uma matriz de polímero poroso, com polímeros tais como cloreto de vinila, copolímero de cloreto de vinila- propileno, e copolímero de cloreto de vinila-acetato de vi- nila; tecido, ambos de ocorrência natural (por exemplo, al- godão) e sintético (por exemplo, náilon ou raiom); géis po- rosos, tais como silica gel, agarose, dextrana, e gelatina; películas poliméricas, tais como poliacrilamida; e assim sucessivamente. Em uma modalidade particular, a membrana po- rosa 23 é formada a partir de materiais de nitrocelulose e/ou de poliéter sulfona. Deve ser entendido que o termo "nitrocelulose" refere-se aos ésteres de ácido nítrico de celulose, que podem ser apenas nitrocelulose ou um éster misturado de ácido nítrico e outros ácidos, tais como ácidos carboxílicos alifáticos que têm a partir de 1 a 7 átomos de carbono. O dispositivo 20 pode da mesma forma conter uma al- mofada absorvente 28. A almofada absorvente 28 geralmente recebe líquido que migrou-se através da membrana porosa in- teira 23. Como é bem conhecido na técnica, a almofada ab- sorvente 28 pode ajudar na promoção da ação capilar e fluxo de liquido através da membrana 23.

Para iniciar a detecção de micróbios dentro de uma amostra teste, um usuário pode aplicar diretamente a amostra teste a uma porção da membrana porosa 23 através da qual po- de em seguida percorrer. Alternativamente, a amostra teste pode ser aplicada primeiro a uma almofada de amostragem (não mostrada) e/ou almofada conjugada (não mostrada) que estão em comunicação com liquido com a membrana porosa 23. Alguns materiais adequados que podem ser utilizados para formar a almofada de amostragem e almofada conjugada incluem, porém não são limitados a, nitrocelulose, celulose, almofadas de polietileno porosas, e papel filtro de fibra de vidro. Inde- pendente de onde é aplicado, a amostra teste migra-se para uma zona de detecção 31 definida pela membrana porosa 23 que é capaz de sinalizar a presença de um micróbio. Em particu- lar, como mostrado na Fig. 4, a zona de detecção 31 inclui uma tintura teste que exibe uma mudança de cor detectável ao contatar um ou mais micróbios. 0 dispositivo de ensaio 20 da mesma forma emprega uma zona de controle 32 que é aplicada com uma tintura de controle e opcionalmente posicionada a jusante a partir da zona de detecção 31. A zona de controle 20 geralmente não muda a cor durante o teste de forma que possa ser utilizada para comparação semi-quantitativa e/ou quantitativa. Os cromogênios de teste e controle são às ve- zes aplicados de forma que eles não difundam-se substancial- mente através da matriz da membrana porosa 23. Isto permite um usuário detectar facilmente a cor das tinturas prontamen- te depois do tempo de reação desejado. Por exemplo, os cro- mogênios podem formar uma ligação iônica e/ou covalente com grupos funcionais presentes sobre a superfície da membrana porosa 23 de forma que eles permaneçam imobilizados nela. Em uma modalidade, uma tintura positivamente carregada pode formar uma ligação iônica com grupos carboxila negativamente carregadas presentes sobre a superfície de algumas membranas porosas (por exemplo, nitrocelulose). Alternativamente, cer- tos componentes podem ser adicionados a uma solução de cro- mogênio que substancialmente inibe a difusão do cromogênio na matriz da membrana porosa 23. Em outros casos, a imobili- zação pode não ser requerida, e o cromogênio pode difundir- se no lugar dentro da matriz da membrana porosa 23 para re- ação com a amostra teste.

Como um resultado da presente invenção, foi desco- berto que infecção bacteriana pode facilmente ser detectada através do uso de um cromogênio que submete-se a uma mudança na cor na presença de bactérias em uma concentração patogê- nica limiar. A mudança de cor é rápida e pode ser detectada dentro de um período relativamente curto de tempo. Por exem- pio, o cromogênio pode submeter-se a uma mudança de cor de- tectável em menor que cerca de cerca de 30 minutos, em algu- mas modalidades menor que cerca de 10 minutos, em algumas modalidades menos que cerca de 5 minutos, em algumas modali- dades menos que cerca de 3 minutos, em algumas modalidades menos que cerca de 1 minuto, e em algumas modalidades, menos que cerca de 30 segundos. Desta maneira, o cromogênio pode fornecer uma indicação de "tempo real" da presença ou ausên- cia de conjuntivite bacteriana. A presente invenção pode ser melhor entendida com referência aos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

Materiais Empregados

Todos os reagentes e solventes utilizados foram obtidos nos Exemplos a partir de Sigma-Aldrich Co., Inc. of St. Louis, Missouri a menos que de outra maneira notado e foram empregados sem outra purificação. Todos os virus foram obtidos a partir de Gibraltar Laboratories, Inc. de Fairfi- eld, New Jersey. A tintura de Reichardt foi da mesma forma obtida a partir de Sigma-Aldrich Chemical Co, Inc.

EXEMPLO 1

A capacidade de formar tinturas de merocianina pa- ra uso na presente invenção foi demonstrada. Por exemplo, a tintura de merocianina mostrada na Fig. 1 foi sintetizada no laboratório utilizando uma reação de duas etapas. Especifi- camente, como mostrado na Fig. 2, iodeto de metila foi adi- cionado lentamente a uma solução agitada de δ-picolina em 50 mililitros de isopropanol em um banho de gelo. Depois que a adição foi concluída, a reação foi aquecida em refluxo e o refluxo prosseguido durante 2 horas. A solução foi, em se- guida, resfriada em um banho de gelo e o precipitado filtra- do, e lavado com álcool esfriado, em um funil de Buchner. O pó foi, em seguida, seco na coifa durante 2 horas. O rendi- mento de produto cru foi de 18,6 gramas. O produto cru não foi também purificado e utilizado diretamente para a próxima etapa. N-metil-ô-Picolona (9,4 gramas, 0,04 mol), e vanilina (6,1 gramas, 0,04 mol) foram todos dissolvidos em 50 milili- tros de etanol com agitação como mostrado na Fig. 3. A esta solução foi adicionado piperidina (3,4 gramas, 0,04 mol) e a mistura refluxada durante 16 horas. A mistura de reação foi, em seguida, resfriada em um banho de gelo e o produto fil- trado utilizando um funil de Buchner e lavado com etanol es- friado. A tintura crua da estrutura 13 foi obtida, onde R é metila. A tintura foi, em seguida, agitada em 250 mililitros de solução de hidróxido de potássio de 0,2 Molar durante 60 minutos para formar o zwitterion e, em seguida, filtrada u- tilizando um funil de Buchner. A tintura foi, em seguida, cristalizada a partir da quantidade mínima de uma mistura de 1 :1 de água/metanol. O rendimento foi de 9,4 gramas (98%) .

Outras tinturas de merocianina foram da mesma for- ma sintetizadas de uma maneira similar através da seleção de um grupo alquila do iodeto de alquila para corresponder com o grupo "R" respectivo desejado. A Tabela seguinte 1 mostra os compostos e os rendimentos obtidos para a estrutura de tintura 13 para três grupos R diferentes.

Tabela 1. Derivados de Alquila Sintetizados e os

Rendimentos Obtidos

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EXEMPLO 2

Adenovirus tipo 2 lagos (ATCC No. VR-846) foi pro- pagado em células renais de macaco Vero e alimentado com Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com soro de bezerro fetal em uma concentração de 5% e incu- bado a 37°C + 1°C em sua presença de CO2 a 5% durante 6 dias. Propagação virótica foi detectada através da observação mi- croscópica de lâminas de célula infetadas para desintegração celular (efeito citopático, CPE) tal como arredondamento, crenação, lise, picnose, etc. como observado em pelo menos 50% da lâmina da célula. A citotoxicidade foi medida como a extensão da desintegração celular quando produzida pelo a- gente sozinho sem o vírus. 0 vírus foi titulado utilizando- se diluições seriais em dez vezes em DMEM, 4 replicações de culturas MA 104 por diluição, cada replicação inoculada com 0,1 mililitro de diluição de vírus. A extensão da replicação virótica foi calculada como a dose infecciosa de cultura de tecido-50% (TCID 50) como determinada pelo método de Reed e Muench. O título de vírus foi calculado ser IO"65.

Haemophilus influenzae (ATCC No. 8149) e Strepto- coccus pneumoniae (ATCC No. 33400) foram desenvolvidos em Agar de Chocolate e alimentado com Caldo de Feijão Soja de Tripticase (TSB). Streptococcus pyogenes (ATCC No. 49399) foi desenvolvido em ágar de eritrócito de ovelha a 5% e da mesma forma alimentado com meio de TSB. A concentração des- tas bactérias (em TSB) foi constatada ser IO8 CFU/ml. As di- luições das bactérias (10"7, 10"6 CFU/ml) foram criadas atra- vés de diluição serial utilizando solução salina.

Os rótulos foram revestidos por imersão com tintu- ra de Reichardt (80 miligramas por 10 mililitros em acetoni- trila) e permitidos secar para produzir um produto acabado de adesivos revestidos por indicador. 50 microlitros de vi- rus não diluído em meios foram gotejados sobre o rótulo e permitido permanecer 3 minutos antes da remoção da gotícula com uma mecha absorvente de algodão. Uma alíquota de meios sozinhos foi utilizada como um controle. A descoloração re- sultante da gotícula de Adenovírus foi fraca e pouco acima da descoloração observada para os meios de controle. Alíquo- tas (50 microlitros) de IO7 e IO6 CFU/mL de bactérias foram da mesma forma gotejadas sobre os adesivos, junto com gotas do controle de solução salina. Gotas de IO8 de bactérias fo- ram da mesma forma gotejadas sobre os adesivos, porém TSB foi utilizado como os meios de controle para estas amostras. Haemophilus influenzae e Streptococcus pyogenes exibiram descoloração sobre os controles dosmeios para todos os ní- veis de CFU/mL testados. A descoloração observada apenas pa- ra Streptococcus pneumoniae registrou acima do controle para a concentração de IO8 de CFU/ml. É notado que a descoloração observada para todas as bactérias na concentração de IO8 de CFU/ml foi significativamente maior que aquela observada pa- ra o Adenovírus, como foi a descoloração vista para as con- centrações menores de bactérias.

EXEMPLO 3

Uma toalha celulósica foi utilizada como um subs- trato sobre o qual P. aeruginosa foi pipetado sobre a toalha (100 μl). A solução de tintura de Reichardt (160 mg em 10 ml de acetonitrila) foi, em seguida, adicionada em 10 μΐ de a- líquotas à mancha e o números de gotas necessárias para es- tabelecer uma cor persistente foi contado. A quantidade de tintura exigida para manter uma cor roxa persistente foi de 80 microlitros.

EXEMPLO 4

Um substrato com base em papel (Neenah Bond™) (disponível de Neenah Paper, Inc. de Alpharetta, Geórgia) e um rótulo (disponível de Avery-Dennison) foram inicialmente revestidos com uma solução de tintura de Reichardt (80 mili- gramas/10 mililitros de acetonitrila) e pendurados para se- car. Uma tira indicadora revestida com tintura de Reichardt foi exposta com quantidades decrescentes de alíquotas de P. aerugínosa. Um espectrofotômetro portátil foi utilizado para aplicação posterior de cada alíquota para determinar o valor "Delta E" (calculado utilizando valores de L*, A*, e B*) para cada concentração de CFU/mL. Os resultados são mencionados abaixo na Tabela 2 (para papel) e Tabela 3 (para rótulo).

Tabela 2: Resultados para Substratos de Papel

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Tabela 3: Resultados para Substratos de Rótulo

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A partir dos anteriores, curvas de detecção pa- drões foram geradas como mostrado na Fig. 6 para P. aerugi- nosa. Em seguida, gotas de concentrações de bactérias des- conhecidas foram colocadas sobre os adesivos e um espectro- fotômetro foi utilizado para medir o "Delta E" da cor resul- tante. Os valores numéricos obtidos para cada amostra desco- nhecida são mencionados abaixo nas Tabelas 4-5.

Tabela 4: Resultados para Substratos de Papel

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Tabela 5: Resultados para Substratos de Rótulo

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Como pode ser visto a partir dos dados numéricos, as concentrações desconhecidas foram preditas determinando- se em qual valor de Delta E conhecido o valor de Delta E do desconhecido foi mais próximo. Embora alguns dos resultados não tenham sido completamente precisos, os presentes inven- tores acreditam que a melhoria da uniformidade do revesti- mento realçaria também a precisão de detecção.

EXEMPLO 5 Virus do Herpes Simples 1 (HSV-I) foi preparado e inoculado em células renais de macaco embrionárias MA-104 propagadas e alimentados com Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com soro de bezerro fetal em uma concentração de 5% e incubado a 37°C + 1°C em sua pre- sença de CO2 a 5% durante 6 dias. A propagação virótica foi detectada através da observação microscópica de lâminas de célula infetadas para desintegração celular (efeito citopá- tico, CPE), tal como arredondaamento, crenação, lise, picno- se, etc., como observado em pelo menos 50% da lâmina de cé- lula. A citotoxicidade foi medida como a extensão da desin- tegração celular como produzida pelo agente sozinho sem o virus. 0 virus foi titulado utilizando diluições seriais de dez em DMEM, 4 replicações de culturas MA 104 por diluição, cada replicação inoculada com 0,1 mililitros de diluição de virus. A extensão da replicação virótica foi calculada como a dose infecciosa de cultura de tecido-50% (TCID 50) como determinado pelo método de Reed e Muench. Os adesivos reves- tidos com tintura de Reichardt (160 miligramas/10 mililitros de acetonitrila, 80 miligramas/10 mililitros de acetonitri- la, 40 miligramas/10 mililitros de acetonitrila, e 20 mili- gramas/10 mililitros de acetonitrila) foram utilizados como uma superfície de teste. 50 microlitros de vírus não diluído (TCID50 10"7 HSV-l/mL) em meios foram gotejados sobre cada adesivo e permitido permanecer 3 minutos antes de remover a gotícula com uma mecha absorvente de algodão. A descoloração subseqüente observada foi comparado àquela observada para meios de controle livres de vírus e da mesma forma a um con- trole positivo de Salmonella (IO8 de CFU/mL) . Embora a des- coloração não seja tão forte quanto aquela observada para bactérias de Salmonella, a exposição ao virus HSV-I não di- luído levou a alguma descoloração do adesivo.

Enquanto a invenção foi descrita em detalhes com respeito às modalidades específicas desta, ficará evidenci- ado que aqueles versados na técnica, ao atingir uma compre- ensão da anteceder, pode entender facilmente das alterações para, variações de, e equivalentes para estas modalidades.

Conseqüentemente, o escopo da presente invenção deve ser a- valiada como aquele das reivindicações anexas e quaisquer equivalentes destas.

Claims

1. Método para avaliar conjuntivite bacteriana, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender contatar uma amostra teste ocular com um cromogênio, em que o cromo- gênio submete-se a uma mudança de cor detectável em menos que cerca de 30 minutos na presença de bactérias em uma con- centração patogênica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do cromogênio ser uma tintura solva- tocrômica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato do cromogênio ser uma tintura hi- brias.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato da tintura híbrida ser uma tintura de N-fenolato betaína.

5. Método para avaliar conjuntivite bacteriana, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender contatar uma amostra teste ocular com uma tintura de N-fenolato beta- ína, em que a tintura submete-se a uma mudança de cor visí- vel em menos que cerca de 30 minutos na presença de bacté- rias em uma concentração patogênica.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato da tintura de N-fenolato betaína ter a estrutura seguinte: <formula>formula see original document page 49</formula> em que R1-R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, grupos nitro, halogênios, e grupos Ci a C20 lineares, ramificados ou cícli- co, saturados ou insaturados, substituídos ou não substituí- dos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato da tintura ser 4-(2,4,6- trifenilpiridínio-l-il)-2,6-difenilfenolato (tintura de Rei- chardt).

8. Método, de acordo com quaisquer das reivindica- ções anteriores, CARACTERIZADO pelo fato do cromogênio estar presente em um substrato.

9. Método, de acordo com quaisquer das reivindica- ções anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da cor do cromogê- nio ser detectada e comparada à cor de um cromogênio de con- trole .

10. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato da mudança de cor ser detectada visualmente.

11. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato da mudança de cor ser quantitativamente medida.

12. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da mudança de cor ocorrer em menos que cerca de 10 minutos.

13. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da mudança de cor ocorrer em menos do que cerca de 5 minutos.

14. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da mudança de cor ocorrer em menos do que cerca de 1 minuto.

15. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da concentração patogênica ser pelo menos cerca de 1 χ IO5 de unidades for- madoras de colônia por mililitro da amostra teste ocular.

16. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato da ausência de cor indicar a presença de bactérias dentro da amostra teste ocular em ou sobre a concentração patogênica.

17. Método, de acordo com quaisquer das reivindi- cações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato das bactérias in- cluírem Streptococcus pneumoniae, Haemophilus Influenzaer P. aeruginosa, Streptococcus pyogenes, ou combinações destes.