DE1598092A1 - Verfahren und diagnostische Mittel zum Bakterien-Nachweis - Google Patents

Verfahren und diagnostische Mittel zum Bakterien-Nachweis

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Description

  • Verfahren und diagnostische Mittel zum Bakterien-Nachweis Für die rasche und wirkungsvolle Bekämpfung von Infektionskrankheiten ist es wünschenswert, die krankheitserregenden Mikroorganismen schnell nachzuweisen und sicher zu differenzieren. Neben den altbekannten serologischen Methoden sind eine Reihe von Untersuchungsverfahren bekannt geworden, bei denen die von den Mikroorganismen gebildeten Enzyme mit Hilfe eines Farbstoffindikators nachgewiesen oder bei denen die Stoffwechselprodukte spezifischer Bakteriophagen zum Nachweis der Bakterien herangezogen werden.
  • So ist z.B. der Nachweis von einigen Bakterienarten durch die Grieß' sche Nitritprobe möglich, bei der Nitrat durch die von den Bakterien gebildete Nitritreduktase zu Nitrit reduziert wird, welches mit Sulfanilsäure und α-Naph thyl amin nachgewiesen wird; vgl. H.J. Walther, Ärztl.Lab. 6, S. 287 (1960). Da es sich hierbei nur um einen unspezifischen und unzuverlässigen Nachweis von Nitrit und nicht um einen spezifischen Nachweis von Bakterien handelt, kommt ihm nur eine beschränkte und bedingte Bedeutung zu; vgl. Linzenmeier et al, Klin Wachr. 41, S. 919 (1963).
  • Eine andere bekannte Methode zum Nachweis von Bakterien beruht auf der Reduktion des farblosen 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchlorids zum rot-braun gefärbten Triphenylformazan durch bakterieneigene Reduktasen.
  • Diese Reaktion ist völlig unspezifisch und gestattet deshalb keine Differenzierung der vorhandenen Bakterien vgl. Siminons et al.,rncet 1, S. 1377 (1962).
  • Aus der US-Patentchrift Nr. 3.122.480 ist ein Nachweis für Pseudomonasarten bekannt, der auf der Reaktion bakterieneigener Enzyme mit p-Phenylendiamin und substituierten Maphtholderivaten zu farbigen Vorbindungen (Indophenolblau) beruht. Zur Durchführung dieser Nachweisreaktion müssen die zu identifizierenden Mikroorganismen zunächst durch Verwendung selektiver Nährmedien zum Wachsen gebracht werden, wozu Inkubationszeiten von ca. 18 Stunden bei 370C erforderlich sind. Für die Isolierung von einem wichtigen Erreger von Harnweginfekten, nämlich Pseudomonas aeruginosa, benötigt man Spezialnährböden, woduroh sich die Anwendung des genannten Verfahrens zusätzlich erschwert.
  • Der entscheidende Mangel dieses Verfahrens ist jedoch die Tatsache, daß Escherichia coli und Enterokokken, wie Steptococcus faecalis, nicht erfaßt werden, obwohl diese beiden in mehr als zwei Drittel aller unspezifischen Harnweginfekte als Erreger anzutreffen sind.
  • Für den Nachweis einer speiellen Bakterienart, nämlich Gonokokken, ist in der US-Patentschrift Nr. 2.970.945 die Verwendung von Tetramethylp-phenylendiamin beschrieben worden, wobei die Indikatorsubstanz durch bakterieneigene Oxydasen zum Farbstoff oxydiert wird. Wegen der Luftempfindlichkeit der Indikatorsubstanz und der Beshhränkung auf eine Bakterienart kann dieser Reaktion keine allgemeine Bedeutung zugemessen werden.
  • Schließlich sind eine Reihe von Publikationen erschienen, welche den Bakterien-Nachweis mit Hilfe von Bakteriophagen beschreiben; vgl.
  • H.J. Reattig, "Bak teriophagie", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart (1958), S. 53. Diese Methode hat sich aber aus mehreren Gründen nicht zur Routinemethode entwickeln können, da " es für eine Bakterienart monovalente Bakteriophagen kaum gibt, und ...diese wenigen monovalenten Phagen leicht polyvalent werden und damit auf andere Bakterienarten übergreifen".
  • Da Bakterien ausserdem sehr häufig phagenresistent werden, ist der an sich schon sehr aufwendig und zeitraubende Nachweis obendrein unsuverlässig und für die Praxis ungeeignet.
  • Es wurde nun gefunden, daß Substanzen der Formel I in der X ßauerstoff, Schwefel oder ein alkyliertes Stiokstoffatom bedeutet und R die folgenden Reste darstellt in denen R1 eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Acyl, Hydroxy- oder Aoyloxyalkylgruppe, R2 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, R3 und R4 Wasserstoff oder zusammen eine Isopropylidengruppe bedeuten und n die Zahl 2 oder 3 ist, zum Nachweis von Bakterien vorzugsweise in Urin, durch eine Farbreaktion geeignet sind. Der neuartige Nachweis der Bakterien beruht darauf, daß diese Substanzen von Bakterien zu - teilweise sogar für die Bakterienart spezifischen-Farbstoffen metabolisiert werden.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man das zu untersuchende Medium mit einem flüssigen oder festen Nährboden und einer nicht-wachstumshemmenden Menge einer Verbindung der Formel I zusammenbringt und nach 1 bis 18 Stunden Bebrütungezeit bei 20-37°C die Farbänderung auswertet.
  • Die erfindungsgemässendiagnostischen Mittel bestehen aus einem flüssigen oder festen Nährboden und einer nicht-wachstumshemmenden Menge einer Verbindung der Formel 1.
  • Mit dem neuartigen Test kann ein allgemeiner Nachweis von Bakterien geführt werden (= qualitative Gesamtkeimbestimmung); d.h. es ist möglich, mehrere Keime, die beispielsweise bei einer Harnweginfektion nebeneinander vorkommen können, mittels einer gemeinsamen Farbreaktion zu erfassen. Es lässt sich aber auch eine Keimdifferenzierung (= qualitativer Nachweis einzelner Keimarten) erreichen; d.h. einzelne Keimarten,z.B nur Escherichin coli, können auf Grund einer für die betreffenden Keime spezifischen Farbreaktion nachgewiesen und genau bestimmt werden. Hierbei kann die zu untersuchende Probe auch mit mehreren verschiedenen erfindungsgemässen diagnostischen Mitteln nebeneinander geprüft werden, wobei man zweckmässigerweise solche Substanzen I wählt, die gut unterscheidbare spezifische Farbreaktionen liefern. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Kombination enthalten weiterhin selektiv wirksame bakterizide bzw. bakteriostatiscLwirksame Substanzen und/oder Differenzierungsnährboden, welche für die nachzuweisende Keimart besonders günstige Wachstumsbedingungen bieten, jedoch unerwünschte Begleitkeime hemmen.
  • Da bei einigen der Substanzen I der Zeitpunkt der Verfärbung von der Anzahl der ursprünglichen vorhandenen Keime abhängt, sind nach dem erfindungsgemässen Verfahren und mit Hilfe der erfindungegemässen diagnostischen Mittel auch halbquantitative Jestimmungen der Keimzahlen möglich.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird die zu untersuchende Lösung (Urin, Milch, Trinkwasser etc.) z.B. in einem Reagenzglas zu einer Nährbouillon gegeben, die mit einer ausreichenden aber nicht-wachstumshemmenden Menge einer der SubstanzzIversetzt ist. Die mengenmässige Begrenzung der zuzusetzenden Verbindungen I nach oben ist notwendig, da die Substanzen I gewisse bakterizide bzw. bakteriostatische Eigenschaften besitzen. Aufgrund dieser Tatsache war eigentlich zu erwarten, daß in Gegenwart dieser Substanzen kein ausreichendes Bakterienwachstum mehr möglich sei, so daß die Substanzen auch nicht von Bakterien zu Farbstoffen metabolisiert werden könnten. Überrasohenderweise sind aber für die erfindungsgemässe Nachweisreaktion wesentlich geringere Mengen als die minimalen Hemmkonzentrationen erforderlich und es treten keine Störungen bei Durchführung des Tests auf.
  • Ein Teil der Substanzen I ist schwer löslich; in diesen Fällen ist es vorteilhaft, einen Lösungsvermittler zuzusetzen, um für den Farbtest ausreichende Konzentrationen zu erzielen. Den Test-Ansatz läßt man einige Stunden bei Raumtemperature oder bei Brutschrank temperatur von 37°C stehen und wertet von Zeit zu Zeit die Farbänderungen aus. Anstelle einer flüssigen Nährbouillon kann man auch die Substanzen I mit einem erwärmten flüssigen Nähr-Agar vermischen und nach dem Erkalten die zu untersuchende Flüssigkeit auf den erstarrten Nährboden aufbringen.
  • Bevorzugte Ausführungsformen für die erfindungegemässen diagnostisohen Mittel sind nährstoffhaltige Tabletten oder nährstoffhaltige Filterpapierstreifen, die bereits die jeweilige Substanz I enthalten. Bei Verwendung von Tabletten brauchen diese zur Durchführung der Nachweisreaktion nur nooh in einer Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit gelöst zu werden. Nach der Jebrütungsseit von durchschnittlich 1 bis 18 Stunden kann die Parbänderung unmittelbar ausgewertet werden. Bei Verwendung von Filterpapierstreifen wird der Streifen kurze Zeit in die zu untersuchende Lösung eingetaucht, dann in ein steriles Glasröhrchen gesteckt und eineige Zeit bei Raumtemperatur oder bei 37° aufbewahrt; das Ergebnis kann ebenfalls unmittelbar abgelesen werden. Um die Tabletten oder Filterpapierstreifen lagerfähig zu halten, werden sie zweckmässigerweise mit Äthylenoxyd sterilisiert und in sterile, vor dem Gebrauch leicht abreißbare Folien eingesiegelt.
  • Die Vorteile des erfindungagemässen Verfahrens und der erfindungsgemässen diagnostischen Mittel gegenüber den bislang bekannten Nachweis methoden sind zunächst die einfache und sichere Handhabung sowie die zuverlässige Anzeige vorhandener Keime. Insbesondere die bei unspezifischen Harnweginfekten auftretenden Erreger wie Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia und Pseudononas aeruginosa werden zuverlässig erfaßt. Weiterhin ist es erfindungsgemäss möglich, sow*S die generelle Anwesenheit von Bakterien nachzuweisen, als auch qualitative und halbquantitative Einzelbestimmungen spezieller Keimarten durchzuführen, ohne daß dazu vorher umständliche, kostspielige und zeitraubende Isolierungen der Erreger in Reinkulturen vorgenommen werden müssen Auch ist es möglich die Nachweisreaktionen ohne Benutzung eines Brutschrankes bei Zimmertemperatur vorzunehmen, wobei an allerdinge etwas längere Bebrütungezeiten in Kauf nehmen muss; während im Brutschrank nur Zeiten von 1 bis 12 Stunden nötig sind, muss man bei Raumtemperatur gewöhnlich 4 bis 18 Stunden bis zur deutlichen Färbung warten. Bei Verwendung von vorgefertigten Nährböden, Testpapieren und Tabletten entfallen die üblichen Vorbereitungezeiten und es genügen Reagenzgläser oder Pipetten als Hilfsmittel.
  • Die Substanzen der Formel I sind neue Verbindungen; ihre Heratellung erfolgt nach den im folgenden beschriebenen an sich bekannten Methoden: I. Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von N-8ubetituierten 2.4-Di-(5-nitro-2-furfury liden)-granatan-3-on- bzw. 2,4-Di-(5-nitro-2-furfuryliden)-troDin-on-Derivaten (Formel Ia) 0,1 Mol des betreffenden N-substitutierten Norgranatan-3-ons bzw. Tropinor werden nit 28,2 g (0,2 Mol) 5-Xitrofurturol in 50 ml aoetanhydrid 3 Stunden unter Rühren as Rüokfluss erhitzt. Darauf wird nit Eiswasser verrührt, die ausfallende kristalline Substanz abgesaugt und umkristallisiert. Auf diese Weise werden die folgenden Verbindungen hergestellt:
    Verbindung R1 n Ausbeute Fp (°C) umkris talli siert
    int.Nr. aus
    Do 26 -CH2CH2OCOCH3 3 83 % 144-145° Alkohol/Eisessig
    Do 29 -CH3 3 63 % 226-228° Isopropanol
    Do 50 -CH3 2 18 % 203-204° Isopropanol
    Do 51 -C2H5 3 56 % 226-227° Dimethyl-
    formamid
    Do 52 -C6H5 3 5 % 218-220° Bu tanol
    Do 53 -CH2C6H5 3 74 % 215-217° Dioxan
    Do 54 -CH2CH=CH2 3 37 % 186-187° Isopropanol
    Do 55 -OH 3 9 % 254° (Z) Toluol
    Do 56 -CH2CH2C6H5 3 94 % 158-159° Isopropanol
    Do 63 -COCH3, 3 14 % 255° (Z) Essigsäure
    Das für die Herstellung von Do 55 benötigte Ausgangsprodukt N-Hydroxy-norpseudopelletierin ist ebenfalls neu und wird auf -folgendem Wege hergestellt: Man lost 146 g (1 Mol) Ace tondicarbonsäure, 56 g Natriumacetat (Trihydrat), 69,6 g Hydroxylamin-hydrochlorid und 400 ml 25 %ige Glutardialdehyd-Lösung in 1000 ml Wasser. Es setzt sofort Kohlendioxyd-En twicklung ein. Die Lösung bleibt 3 Tage bei zimmertemperatur stehen. Darauf wird mit Natronlauge alkalisch gemacht und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und eingeengt, Man erhält als Rückstand 108,6 g N-Hydroxy-norpseudopelletierin. Die Verbindung wird aus Essigester umkristallisiert, F. 137-1390. Die Ausbeute beträgt 51 %.
  • II. Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von 5-Nitrofurfurylidenderivaten des Homoph thalimids (Formel 1 b) 0,05 Mol Homophthalimid bzw. N-Methyl-homophthalimid werden in 100 ml Acetanhydrid gelöst. Man setzt 7 g (0,05 Mol) 5-Nitrofurfurol zu und erhitzt auf 700. Nach einiger Zeit wird die ausgefallene Substanz abgesaugt, mit Äther gewaschen und umkristallisiert Auf diese Weise werden folgende Verbindungen hergestellt:
    Verbindung R2 Reaktionsdauer Ausbeute Fp. umkris talli-
    int.Nr. siert aus
    Do 32 H 5 Std. 80 % 278° Essigsäure
    Di 38 CH3 1,5 Std. 41 % 226-227 Dioxan
    III. l-Phenyl-3-methyl-4-(5-nitro-2-furfuryli [int.ir. Do 491 (Formel Ie) 17,4 g (0,1 Mol) 1-Phenyl-3-methyl-pyrazolon-(5) und 14,1 g (0,1 Mol) 5-Nitrofurfurol werden in 150 ml Acetanhydrid 3 Std. bei 1000 gerührt.
  • Nach dem Abkühlen saugt man ab und erhält 28,7 g Rohprodukt. Man kristallisiert aus Dioxan um und erhält so das 1-Phenyl-3-methyl-4-(5-nitro-2-furfuryliden)-pyrazolon-(5) in einer Ausbeute von 55,1 % d.Th. (Fp. 2340 unter Zersetzung) IV. 3-(5-Ni tro-2-thienyl)-2-nitro-1,3-propandiol [int.Nr. HB 1431 und 2,2-Dimethyl-4-(5-nitro-2-thienyl)-5-nitro-1 3-dioxan {int.Nr. HB 1441 (Formel I c) 6,28 g 5-Nitro-thiophen-2-aldehyd löst man in 40 ml Chloroform, gibt 4,4 g Nitroäthanol in 20 ml Chloroform gelöst zu, versetzt mit 0,4 bis 0,6 ml Triäthylamin und lässt bei Raumtemperatur stehen. Bereits nach kurzer Zeit fällt ein Öl aus, welches nach Abkühlen und Reibenhristallisiert. Nach mehrstündigem Stehen im Kühlschrank saugt mg ab, wäscht mit Chloroform nach und erhält so 9,1 g (91,8 % d.Th.) eines Rohprodukts vom Schmelzpunkt 111 bis 1140C. Nach dem Umkris tallisieren aus Isopropanol-Wasser (1:1) unter Zusatz eine Spur p-toluolsul fonsäure steigt der Schmelzpunkt des analysenreinen 3-(5-Ni tro-2-thienyl)-2-nitro-1,3-propandiols auf 136 bis 140°C.
  • 1,24 g des erhaltenen rohen diols vom Fp. 111 bis 114° list man in 6 ml wasserfreiem Aceton, gibt 12 ml wasserfreies Benzol sowie eine innige Mischung von 0,6 g Phosphorpentoxid und 0,6 g Kieselgur zu, erwärmt auf 40 bis 450C, gibt nach 15 Minuten nochmals 12 ml Benzol zu und rührt anschliessend noch ca. 6 Stunden bei 40 bis 45°C. Nun saugt man das Ungelöste ab, wäscht mit Äthylenchlorid ins Filtrat nach, neutralisiert das Filtrat mit einer Auf' schlämmung von Calciumcarbonat in Wasser und saugt das Ungelöste ab. Die wässrige Schicht des Filtrats wird mit Äthylenchlorid extrahiert. Man vereinigt die organischen Phasen, trooknet diese mit Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein, wobei 1,4 g eines Öls verbleiben. Dieses reibt man zunächst mit Ligroin und dann mit Isopropyläther an, saugt das dadurch erhaltene Kristallisat ab, und wäscht mit Isopropyläther nach. Man erhält so 0,8 g Kristalle (55, 5 d.Th.) vom Fp. 105 bis 1080. Nach Umkristallisation aus 8 ml Isopropanol steigt der Fp. des 2,2-dimethyl-4-(5-ni tro-thienyl)-5-nitro-1,3-dioxans auf 107 bis 1090 (Zers.). Die Ausbeute beträgt 0,55 g. y. 1-(5-Nitro-1-methyl-2-nyrryl)-2-(4-chinolyl)-äthylen [int.Nr. HB 2051 (Formel I d) 1,68 g 4-Methylchin olin erhitzt man mit 1,85 g 5-Nitrõ-1-methylpyrrol-2-aldehyd in 12 ml Acetanhydrid 4 Stunden unter Rüokfluss (1600, Badtemperatur), saugt nach dem Erkalten das ausgefallene, gelbe Kristallisat ab, wäscht mit wenig Acetanhydrid und dann mit Isopropyläther. Man erhält so 0,6 g (18 % d.Th.) papierchromatographisch reines Material, welches nach Umkristallisation aus 17 ml Dioxan (unter Zusatz von Aktivkohle) bei 240 bis 242 0C schmilzt (Zers) Die Ausbeute beträgt 0,45 g.
  • In den nachfolgenden Beispielen ist das erfindungsgemässe Verfahren sowie einige typische Ausführungaformen der diagnostischen Mittel näher erläutert.
  • Beispiele 1.) Allgemeine Vorschrift zur Durchführung des Bakteriennachweises 25,6 mg der jeweiligen Substanz I werden in 5 ul Dinethylformamid und 5 #1 Polyoxyäthylensorbi tanlaureat ("Tween 20") gelöst. Mit aqua dest. steril. wird eine geometrische Verdünnungsreihe (Faktor 0,5) bereitet, die mit einer üblichen Nährbouillon (z.13. von der Firma Difco) im Verhältnis 1:10 verdünnt wird. Die einzelnen Lösungen enthalten demnach 256, 128, 64, 32, 16 etc. µg/ml der Substanz. Sterilisierte Reagenzgläser werden mit je 2 ml dieser Lösungen gefüllt und mit der zu untersuchenden, Bakterien-haltigen Probe versetzt. Man verschließt die Reagenzgläser mit einem storilen Wattebausch und bebrütet bei 21 bis 37°C, wobei anstelle eines Brutschrankes auch ein thermostatisiertes Wasserbad verwendet werden kann. In er Abhängigkeit von der Keimart, der Bebrütungszeit und der Anzahl der eingesäten Keime beginnt die Probe sich zu verfärben. Die Farbe und der Zeitpunkt der Verfärbung werden mit Standardwerten verglichen und zeigen auf diese Weise die Art und Menge der Bakterien an. Wegen der bakteriostatischen Wirkung einiger der Substanzen I gegen gewisse Keimarten treten in den roten mit hohen Konzentrationen an Substanz I nur schwächere oder keine Verfärbungen auf. Im allgemeinen werden daher nur die Proben mit den niedrigeren Konzentrationen ausgewertet.
  • In den nachfolgenden Tabellen I, II und III sind die typischen Verfärnungen in Anhängigkeit von der Substanz I, der Keimart, der Temperatur und der Bebrütungszeit zusammengestellt. Die Keime zahlen liegen hierbei generell über 100 000 Keimen/Ul; das sind Keimzahlen, wie man sie bei ### signifikanten Bakterinrien antrifft (Keimazhlen von unter 100 000 bis 10 000 Keimen/ml findet man bei asymptomatischen Bak teriurien, und Keimzahlen von unter 10 000 Keimen/ml gelten als "normal"). Tabelle I
    Sub Bebrü- Escherichia coli(18) Streptococcus
    stanz tungs- faecalis (155)
    tempe-
    Beginn Farbe Beginn Farbe
    der Ver- der Ver-
    färbung färbung
    nach... nach...
    === Std. == Std.
    Do 26 37° 5 rot 2 grün
    (210) (12) (rot-violett) (12) (grün)
    Do 29 37° 4 violett 1 grün
    (21°) (12) (violett) (12) (grün)
    Do 51 37° 4 violett 1 grün
    Do 52 370 18 braun 18 orange
    Do 53 37° 4 rot-braun 1 braun
    Do 54 370 4 rot 1 1 grün
    Do 55 370 5 dunkel-violett 12 rot
    Do 56 370 5 braun 2 braun
    (21°) (12) (braun) (4) braun
    Do 63 370 1.8 rot
    Do 32 370 7 gelblich 7 grün
    Do 38 370 3 rotbraun 2 grün
    (21°) (10) (grünlich) (5) (grün)
    Do 50 37° 3 violett 1 gelb-grün
    Do 49 37° 18 violett 18 violett
    HB 144 37° 4 orange 4 gelb-grün
    HB 205 370 4 rün 4 grün
    @@@@ (12) grün) (12) (grün)
    Tabelle II
    Sub- Bebrü- Proteus mirabilis Staphylococcus aureus,
    stanz tungs- (298) SG 511 (12)
    tempe-
    ratur Beginn Farbe Beginn
    der Ver- der Ver-
    färbung färbung
    nach... nach...
    Std. Std.
    Do 26 37° 4 braun 12 gelb-grün
    (21°) (12) (braun) (12) (gelb-grün)
    Do 29 37° 4 violett 12 grün
    (21°) (12) (violett) (12) (grün)
    Do 51 37° 4 braun 12 gelb-grün
    Do 52 37° 18 orange # #
    Do 53 37° 5 rot-braun 8 violett
    Do 54 37° 4 braun 12 gelb
    Do 55 37° 5 braun # #
    Do 56 37° 4 braun 12 braun
    (21°) (12) (braun) (12) (gelb-braun)
    Do 63 37° 18 rot # #
    Do 32 37° 6 grün 12 gelb-grün
    Do 38 37° 3 rot 10 olivgrün
    (21°) (10) (rot-braun) (10) (grünlich)
    Do 50 37° 4 rot-braun 12 braun-rot
    Do 49 37° 18 violett 18 violett
    HB 144 37° 12 gelb-orange 12 orange
    HB 205 37° 7 grünlich 8 grün
    (21°) (12) (gelb-grün) (#) (#)
    Tabelle III
    Sub- Bebrü- Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
    stanz tungs- (188) (71)
    tempe-
    ratur Beginn Farbe Beginn Farbe
    der Ver- der Ver-
    färbung färbung
    nach... nach...
    Std. Std.
    Do 26 37° 6 violett-braun 12 grünlich
    (21°) (14) (braun) (14) (grünlich)
    Do 29 37° 4 violett 12 rot-braun
    (21°) (12) (violett) (12) (grün-braun)
    Do 51 37° 4 violett 12 (grünlich-braun)
    DO 52 37° # # # #
    Do 53 37° 12 rot 12 rot-braun
    Do 54 37° 5 fot-braun 12 braun
    Do 55 37° 12 braun 12 gelb
    Do 56 37° 12 rot-braun 12 braun
    (21°) (12) (gelb-braun) (12) (gelb-orange)
    Do 63 37° 18 braun # #
    Do 32 37° 7 orange-rot 12 gelb-grün
    do 38 37° 3 braun-grün 3 grün
    (21°) (10) (gelb-grün) (10) (grün)
    Do 50 37° 4 violett 12 braun
    Do 49 37° 18 violett 18 violett
    HB 144 37° 6 orange # #
    HB 205 37° 4 grün 12 gelb-grün
    (21°) (12) (grün) (#) (#)
    2. Halbouantitative Bestimmung von Keimzahlen a) Escherichia coli (69) Als Substanz I dient HB 205 in einer Konzentration von 32 µg/ml; Bebrütungstemperatur 370 Bei einer Keimzahl von 1.000 bis 10.000 Keimen/ml tritt nach 10 Stunden noch keine Farbänderung auf. Bei Keime zahlen von 10.000 bis 50.000 färbt sich die gelbliche Lösung nach 10 Stunden deutlich grün. Bei Keimzahlen von 50.000 bis 100.000 tritt diese Verfärbung bereits nach 9 Stunden, bei Keimzahlen von 100.000 bis 500.000 nach 8 Stunden und bei Keimzahlen von über 500.000 Keimen/ml schon nach 7 Stunden auf. b) Klebsiella pneumoniae (286) Als Substanz I dient Do 29 in einer Konzentration von 64 µg/ml; Bebrütungstemperatur 370 Bei Keimzahlen von 1D00 bis 100.000 Keimen/ml färbt sich die gelbliche Lösung nach 9 Stunden rotbraun und nach 10 Stunden violett. Bei Keimzahlen von 100.000 bis mehr als 500.000 Keimen/ml erscheint die rotbraune Farbe bereits nach 7 bis 8 Stunden und die violette Farbe schon nach 9 Stunden. c) Proteus mirabilis (298) Als Substanz I dient Do 38 in einer Konzentration von 32 µm/ml; Bebrütungstemperatur 370 Bei Keimzahlen von 4.000.000 Keimen/ml färbt sich die schwach gelbe Lösung bereits nach 4 Stunden rot. Bei Keimzahlen von 400.000 tritt der Farbumsohlag nach 6, bei Keimzahlen von 40.000 nach 7 bei Keimzahlen von 4.000 nach 8 und bei Keimzahlen von 400 Keimen ml nach 9 Stunden auf.

Claims (3)

  1. Patentanspruch i.) Verfahren zum Nachweis von Bakterien, vorzugsweise @Urin, durch eine Farbreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu untersuchende Medium mit einem flüssigen oder festen Nährboden und einer nicht-wachstumhemmenden Menge einer Verbindung der Formel I in der X Sauerstoff, Schwefel oder ein alkyliertes Stickstoffatnm bedeutet und R die folgenden Reste darstellt in denen R1 eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Aryl-, Araikyl-, Acyl, Hydroxy- oder Acyloxyalkylgruppe, R2 Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, R und R Wasserstoff oder zusammen eine Isopropylidengruppe 3 4 bedeuten und n die Zahl 2 oder 3 ist, zusammenbringt und nach 1 bis 18 Stunden Bebrütungszeit bei 20-37°C die Farbveränderung auswertet.
  2. 2.) Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Bakterien, vorzugsweise in Urin, bestehend aus einem flüssigen oder festen Nährboden und einer nicht-waohstumehemmenden Menge einer Verbindung der Formel I.
  3. 3.) Verwendung der Verbindungen I zum Nachweis von Bakterien, insbesondere in Urin.
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