KR20180132093A - 개조된 상처 드레싱 - Google Patents

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KR20180132093A
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wound dressing
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루시 발라미
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컨바텍 테크놀러지스 인크
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Abstract

본원에 기술된 구현예는 상처, 예컨대, 만성 상처 또는 감염된 상처의 검출을 위한 화합물, 이러한 화합물을 함유하는 조성물, 기질, 키트, 드레싱 물질, 및 물품, 및 시스템에 관한 것이다. 추가의 구현예는 진단 검정, 및 조성물 속에 함유된 특이적인 기질의 효소적 전환을 기반으로 하여 만성 또는 감염된 상처의 진단 및/또는 검출시 이들 조성물, 키트 및 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다. 추가의 구현예는 복수의 마커의 발현을 기반으로 하여 상처를 특성 규명하고 이러한 정보를 사용하여 만성 또는 감염된 상처로 고생하는 환자를 치료하고, 관리하며, 후속조치하는 방법에 관한 것이다.

Description

개조된 상처 드레싱
관련 출원에 대한 교차-참고
본 출원은 2016년 3월 30일자로 출원된 미국 가 특허원 제62/315,567호의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 이의 전문이 본원에 참고로 포함되어 이의 일부를 이룬다.
기술 분야
본원에 기술된 구현예는 일반적으로 상처 치유(wound healing), 및 특히 상처의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
포유동물에서, 피부 손상은 세포 및 생화학적 현상의 조직화된 복잡한 캐스캐이드(cascade)를 촉발시켜 상처를 치유한다. 상처 치유는 해부학적 지속성 및 기능의 복원을 야기하는 복잡한 역학적 과정이다: 이상적으로 치유된 상처는 정상의 해부학적 구조, 기능, 및 외형으로 되돌리는 것이다. 전형적인 상처는 4개 단계 - '삼출성' 상, 증식 상, 회복 상 및 상피 성숙(Hatz et al., Wound Healing and Wound Management, Springer-Verlag, Munich, 1994) 또는 지혈, 염증, 증식 및 리모델링 상(Nwomeh et al., Clin. Plast. Surg. 1998, 25, 341)으로 이루어진 모델을 통해 치유된다.
불행히도, 만성 및 "감염된" 상처는 전형적으로 치유하기 어렵다. 만성 손상은 예컨대, 정맥 다리 궤양, 당뇨병성 족부 궤양(diabetic foot ulcer) 및 욕창을 포함한다(Krasner et al., Clinical Source Care: A Clinical Source Book for Healthcare Professionals , HMP Communication , 2001). 만성 상처를 지닌 환자는 많은 주의를 필요로 하며 상처는 흔히 삶의 질에 있어서 감소를 야기하고; 만성 상처는 일부 환자들이 이들의 남은 여생 전체에서 다루어야만 하는 문제가 될 수 있다. 환자 동시-이환(co-morbidity)은 또한 상처 치유 과정에서 유의적인 효과를 가져서, 심지어 상기 공정을 중단시킬 뿐만 아니라 삶의 질의 손실에 대한 기여 인자가 될 수 있다. 치유하기 어려운 상처르 이끌 수 있는 요인은 병리생리학적 쟁점, 미생물에 의한 감염, 비-이용가능한 조직의 존재, 불량한 조직 관류, 만성 염증 상태 및 당뇨병과 같은 다른 직면한 상태를 포함한다(Bowler et al., Annals of Medicine 2002, 34, 419-427).
많은 경우에, 만성 상처는 세균 균총(bacterial flora) 및/또는 진균 및 바이러스와 같은 병원체에 의해 콜로니화되며 이 경우 이들은 감염될 수 있다. 세균은 효소 및 독소를 생산하며 또한 이의 작용이 상처의 치유를 위해 필서적인 대식구 및 섬유아세포와 영양소 및 산소에 대해 경쟁하기 때문에, 세균에 의한 상처의 감염은 치유 과정을 지연시킨다. 따라서, 감염은 침입하는 세균을 위한 교란된 숙주/세균 균형의 만연(manifestation)이다. 이는 전신계적 ?혈성 반응을 유발하며, 또한 상처 치유에 관여하는 다수의 과정을 억제한다. 치유의 과립화 상은 감염이 가라앉은 후에만 개시한다.
염증 상은 상처 치유 과정에 특히 중요하며, 여기서 상처 부위에서의 생화학적 반응은 치유를 촉진시키지만 과량의 프로테아제의 생산으로 인한 조직 파괴를 유발할 수도 있다. 프로테아제는 과량의 죽은 조직을 파괴하는데 있어서 중요하지만, 이들은 또한 살아있는 조직에서 유해한 효과를 가져서 추가의 염증을 유발한다.
매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 엘라스타제, 및 카텝신 G와 같은 이들 단백질분해 효소는 종종 호중구의 과도한 자극과 관련되어 있다.
상승된 프로테아제 활성은 지연된 상처 회복에 관여하는 것으로 여겨지며 상처 감염의 지표일 수 있다. 예를 들어, 주변 세포에 구조적 및 생화학적 지지를 제공하는 세포에 의해 분비된 세포외 매트릭스(ECM)의 수집은 과도한 프로테아제(예컨대, MMP) 활성으로 인하여 및 동시에 약화된 피브리노겐 수준으로 인하여 상처 부위에서 흔히 고갈된다. 증가된 프로테아제 활성은 또한 성장 인자의 퇴화를 가져오므로, 치유 과정을 억제한다. 따라서, 감염 및 다른 문제들은 만성 상처에서 악화되고 상처는 치료하기 어렵게 된다(Yager et al., Wound Repair Regen 1997, 5, 23-32; Widgerow et al., Wound Repair Regen 2011, 19, 287-291).
상처를 평가하는 현재의 방법은 숙련의의 훈련 및 경험에 의존한다. 상처는 가시적으로 평가되는 경향이 있으며, 길이 및 깊이 측정이 이루어질 수 있고, 상처의 가시적 상태 및 크기를 추적하기 위해 이용가능한 경우, 디지탈 사진이 사용될 수 있다(Krasner et al., supra). 임상적 실시에서, 감염의 진단은 국소 통증, 열, 팽윤, 분비물, 및 홍조의 존재와 같은, 간접적인 매개변수를 기반으로 한다. 염증 및 분비물과 같은 많은 이러한 임상적 지표는 상처에서 감염의 낮은 예측 값을 갖는다. 상처의 면봉채취에 이은 병원 실험실에서 미생물학 시험은 정확한 항생제 과정을 처방하기 위한 세균 군집화(colonization)의 확인 및 균주의 식별을 위한 선택사항이지만; 이러한 과정은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 감염의 진단에 있어서 지연은 항생제의 투여를 지연시킬 수 있고 패혈증 진행 위험을 증가시킬 수 있다.
또한, 상처 치유의 관리를 위한 객관적인 기술은 거의 없다. MMP 프로테아제 수준 및 활성이 치유되는 상처 속의 유액과 비교하는 경우 만성 상처의 유액 속에 존재한다는 보고가 있지만(Liu et al., Diabetes Care 2009, 32, 117-119; Bullen et al., J. Investig. Dermatol. 1995, 104, 236-240), 이들 보고는 상처가 만성이 되는 한계를 시사하지 않는다.
따라서, 이러한 시약을 사용함을 포함하는, 사람 및 동물 대상체에서 만성 및 감염된 상처를 확인하기 위한 민감하고 특이적인 시약, 키트 및 검정 및/또는 과학적 연구 및 또한 임상 적용, 예를 들면 효과적이고 정확한 진단 및 이러한 상처, 예컨대, 정맥 궤양, 욕창 및 당뇨병성 궤양에 의해 특징화되는 질환의 효율적이고 정확한 진단 및 치료를 위한 키트에 대한 절박하지만 충족되지 않은 요구가 존재한다.
발명의 요약
본원에 개시된 기술은 감염되고/되거나 만성인 상처를 검출하는 조성물 및 방법을 제공한다. 개시된 기술은: 감염된 상처의 검출의 민감성, 정확성 및 특수성의 증가; 정성적 및 정량적 측정 능력의 제공; 및 발생 부위(in situ)에서 및 실시간으로 감염된 상처의 검출 속도의 증가에 의해 기존의 검정을 개선시킨다. 본원에 기술된 검정 및 방법은 부분적으로 감염되거나 만성인 상처에서 존재하는 생물마커(biomarker) 및/또 프로브(probe)를 검출하는 특이한 시약의 사용을 기반으로 한다. 검출 과정은 감염된 상처 속에 존재하는 마커에 대해서는 특이적이지만 감염되지 않거나 비-만성인 상처에 대해서는 특이적이지 않은 시약의 사용을 포함할 수 있으며 검출 단계는 프로브가 마커에 의해 작동하는 경우 생성되는 시그널(들)의 정성적 또는 정량적 측정을 포함할 수 있다. 검출 방법이 상처 속에 존재하는 효소의 검출을 포함하는 구현예에서, 프로브는 효소에 대해 특이적인 개조된 효소 기질을 포함하며, 이는 임의로 증폭될 수 있는 시그널을 생성한다. 이는 검출 효능 및 특이성을 크게 개선시킨다. 더욱이, 각각 하나 이상의 표적(target)에 대해 특이적인, 다수의 검출 프로브, 예컨대, 상처에 대해 특이적인 효소를 사용할 수 있다. 이는 거짓 양성(예컨대, 비-특이적인 상호작용 및/또는 표적 중복성으로 인한)의 발생을 최소화하면서 진단 검정의 효능 및 정밀성 둘 다를 극대화하는데 크게 도움을 준다. 더욱이, 본원에 개시된 실험 결과는 이를 기반으로 한 신규 프로브 및 검정 기술이 다양한 유형의 상처를 검출하고 특징화할 수 있음을 확인한다. 최종적으로, 개시된 기술의 시약은 항생제, 항진균제 등과 같은 치료학적 분자와 함께 사용되어 만성 상처의 치료 및 관리를 모니터링하고 평가할 수 있다.
일 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이며; L은 존재하거나 부재하는 링커이고, L은, 존재하는 경우 M 및 R을 연결한다)를 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처-드레싱 물질(wound-dressing material)이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고 R은 리포터 분자이다)를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고 R은 리포터 분자이며 여기서 M은 R과 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 접합된다)를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이며; L은 서로 독립적으로 M 및 R과 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 접합된 링커이다)를 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 링커이며, 여기서 리포터 R은 효소 기질을 포함한다)의 화학식 I을 포함하는 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 링커이며, 여기서 리포터 R은 당, 다당류, 핵산, 아미드, 펩타이드, 단백질, 지질, 또는 이의 유도체 또는 이의 조합물인 효소 기질을 포함한다)의 화학식 I을 포함하는 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 상기 기질은 당, 다당류, 아미드, 펩타이드 또는 단백질, 또는 이의 유도체이다. 특히 이러한 구현예 하에서, 기질은 아미노산 또는 다수의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함하는 펩타이드 기질(PEP)이다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이고, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 M은 셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 펙틴, 알기네이트, 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이의 유도체 또는 이의 어떠한 혼합물 또는 조합으로부터 선택된다)을 포함하는 화학식 I을 포함하는 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 중합체는 카복시메틸셀룰로즈(CMC) 또는 이의 염이다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은, 존재하는 경우, M 및 R을 연결하고, 여기서 M은 약 200 내지 약 4000개의 단량체 단위를 포함한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, M은 약 500 내지 약 2000개의 단량체 단위를 포함한다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 L은 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 또는 이의 에테르, 아미드, 또는 에스테르인 단량체 또는 중성 중합체를 포함한다)의 화학식 I을 포함하는 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, L은 1 내지 10개의 단량체 단위의 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 또는 이의 에테르, 아미드, 또는 에스테르를 포함한다. 보다 구체적으로 이러한 구현예 하에서, L은 적어도 하나의 폴리프로필렌 글리콜 소단위를 포함한다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 R은 검출가능한 표지를 포함한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 검출가능한 표지는 발광성 분자, 화학발광성 분자, 형광색소, 형광성 퀀칭제(quenching agent), 지질, 착색된 분자, 방사성동위원소, 섬광제, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속, 및 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 R은 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, 텍사스 레드(Texas Red), 파르-레드(Phar-Red), 알로피코시아닌(APC), 플루오레세인 아민, 에오신, 단실, 움벨리페론, 5-카복시플루오레세인 (FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인 (JOE), 6 카복시로다민 (R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 6-카복시-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2, 2'디설폰산, 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, r-아미노-N-(3-비닐설포닐)페닐나프탈이미드-3,5, 디설포네이트(Lucifer Yellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow), 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 7-아미노-4-트리플루오로메틸코울루아린(쿠마린 151), 시아노신, 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-설포네프탈레인(Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC), 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티디움, 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), QFITC (XRITC), 플루오레스카민, IR144, IR1446, 말라카이트 그린(Malachite Green) 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레솔프탈레인, 니트로타이로신, 파라로사닐린, 페놀 레드(페놀 Red), B-피코에리트린, o-프탈디알데하이드, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, 반응성 레드(Reactive Red) 4, 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체, 테트라메틸 로다민, 리보플라빈, 로솔산, 및 테르비움 킬레이트 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광성 분자를 포함한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 R은 검출가능한 표지 및 퀀처 분자를 포함한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 퀀처(quencher) 분자를 포함하는 리포터는 효소 또는 이의 생성물에 의해 활성화된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 리포터 분자 또는 이의 일부는 효소와 상호작용시 방출된다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 리포터 분자는 효소와 상호작용시 방출되는 검출가능한 표지를 포함한다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결하며, 여기서 리포터 분자는 상처-특이적인 효소에 대해 특이적인 기질을 포함하며, 이는 효소에 의해 활성화되는 생성물을 형성한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 상처-특이적인 효소는 프로테아제이다. 보다 특히 이러한 구현예 하에서, 리포터는 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처-특이적인 효소에 대해 특이적인 기질을 포함한다. 특히 이러한 구현예 하에서, 리포터는 MMP-2 및 MMP-9 또는 이의 조합에 대해 특이적인 기질을 포함한다.
다른 구현예에서, 담체 및 구조 M-L-R(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자이고; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은 존재하는 경우, M 및 R을 연결한다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 보다 특히 이러한 구현예 하에서, 약제학적 조성물은 항생제 화합물 또는 상처-치유 펩타이드를 포함한다. 특히 이러한 구현예 하에서, 항생제는 β-락탐, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 글리실사이클린 및 폴리믹신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고/되거나 상처-치유 펩타이드는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)이다.
다른 구현예에서, 앞서 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질을 포함하는 물품(article)을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 상처를 앞서 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질과 접촉시켜 리포터 분자의 검출가능한 시그널(signal)로의 전환을 허용하고 상기 시그널을 검출하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 상처의 상태를 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 리포터 분자의 검출가능한 시그널로의 전환은 상처-특이적인 프로테아제, 예컨대, MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처 특이적인 프로테아제에 의해 수행된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 상기 방법은 만성 상처 또는 감염된 상처를 진단하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상처를 앞서 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질과 접촉시켜 리포터 분자의 검출가능한 시그널로의 전환을 허용하고 시그널을 검출하는 단계; 상처에서 상처-특이적인 효소의 활성 또는 수준인 매개변수를 평가하는 단계; 매개변수를 한계 수준(threshold level)과 비교하는 단계; 및 상처에서 매개변수의 수준이 한계 수준보다 더 높은 경우 상처가 만성 또는 감염되어 있는지를 측정하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 상처의 상태를 진단하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 구현예 하에서, 매개변수는 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처-특이적인 프로테아제의 양 또는 활성이다. 특히 이러한 구현예 하에서, 진단 방법은 제 자리(in situ)에서 수행된다.
다른 구현예에서, 상처를 앞서 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질과 접촉시킴을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 상처를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 드레싱 물질은 상처 부위에 국소적으로 또는 피부에 적용된다.
다른 구현예에서, 겔-형성 중합체 M을 리포터 영역 R과 접합시킴을 포함하여, 앞서에 따른 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 L은 부재하고, 여기서 M 및 R은 각각 개별적으로, 앞서 기술된 바와 같다. 특히 이러한 구현예 하에서, 겔-형성 중합체 M은 펩타이드 연결, 글리코시드 연결, 에스테르 연결, 옥시에스테르 연결, 아미드 연결, 아미도 연결, 옥시아미도 연결, 에테르 연결, 설포닐 연결, 설피닐 연결, 설폰아미드 연결, 알콕시 연결, 알킬티오 연결, 알킬아미노 연결, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공유결합성 연결을 통해 리포터 영역 R에 접합된다. 특히 이러한 구현예 하에서, 겔-형성 중합체 M은 글리코시드 연결 또는 펩타이드 연결을 통해 리포터 영역 R에 접합된다.
다른 구현예에서, 겔-형성 중합체 M을 링커 L과 접합시켜 전구체 분자 M-L을 생성시키는 단계; 전구체 분자 M-L을 리포터 영역 R에 접합시키는 단계(여기서, M, L 및 R은 서로 개별적으로 전술한 바와 같다)를 포함하는, 상기에 따른 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 본원에 제공되며, 여기서 L은 존재한다. 특히 이러한 구현예 하에서, 겔-형성 중합체 M은 링커 L에 접합되고/되거나 링커 L은 에스테르 연결, 옥시에스테르 연결, 아미드 연결, 아미도 연결, 옥시아미도 연결, 에테르 연결, 설포닐 연결, 설피닐 연결, 설폰아미드 연결, 알콕시 연결, 알킬티오 연결, 알킬아미노 연결, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공유결합 연결을 통해 리포터 영역 R에 접합된다.
다른 구현예에서, 링커 L을 리포터 R과 접합시켜 전구체 분자 L-R을 생성시키는 단계; 전구체 분자 L-R을 겔-형성 중합체 M에 접합시키는 단계(여기서, M, L 및 R은 각각 개별적으로 전술한 바와 같다)를 포함하여, 앞서에 따른 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 L은 존재한다. 특히 이러한 구현예 하에서, 겔-형성 중합체 M은 링커 L에 접합되고/되거나 링커 L은 에스테르 연결, 옥시에스테르 연결, 아미드 연결, 아미도 연결, 옥시아미도 연결, 에테르 연결, 설포닐 연결, 설피닐 연결, 설폰아미드 연결, 알콕시 연결, 알킬티오 연결, 알킬아미노 연결, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공유결합 연결을 통해 리포터 영역 R에 접합된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-PEP(화학식 II)(여기서, M은 겔-형성 중합체이고; PEP는 펩타이드 및 적어도 하나의 아미노산이며; L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은, 존재하는 경우, M 및 PEP를 연결한다)를 포함하는 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서,
Figure pct00001
;
Figure pct00002
;
Figure pct00003
;
Figure pct00004
;
Figure pct00005
;
Figure pct00006
;
Figure pct00007
;
Figure pct00008
;
Figure pct00009
;
Figure pct00010
;
Figure pct00011
; 및
Figure pct00012
;
(여기서 n은 200 내지 4000이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처 드레싱 물질이 본원에 제공된다.
본 기술의 다른 구현예 및 구성은 다음의 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것임이 이해되어야 하며, 여기서 본 기술의 다양한 구성은 실시예 또는 예시의 방식으로 나타내고 기술된다. 실현될 바와 같이, 본 기술은 다른 및 상이한 구성일 수 있고 이의 몇가지 세부사항은 모두 본 기술의 영역을벗어나지 않고, 다양한 다른 국면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 상세한 설명은 특성상 나열하는 것이고 제한하는 것이 아닌 것으로 고려되어야 한다.
본 개시내용을 이해하기 위하여, 본 개시내용의 구현예 및 실시예가 나열되어 있으며, 하기 기술과 함께 본 개시내용의 원리를 설명하기 위해 제공되는 첨부된 도면을 참고로 실시예의 방식으로 이제 기술될 것이다.
도 1은 형과성-계 연구를 사용한 중합체 12의 효소 효능의 정량화를 나타낸다.
도 2는 도 1의 형광성-계 연구에서 사용된 중합체 12 샘플의 영상을 나타낸다.
도 2a는 주위 광 하에서 관찰된 샘플을 나타낸다.
도 2b는 UV 광 하에서 관찰된 샘플을 나타낸다.
도 2c는 개개 샘플의 표지화(labeling)를 나타낸다.
도 3은 PBS-침지 기간 후에 형광성-계 연구: 용출제를 사용한 중합체 17(PBS로 예비처리됨)의 효소 효능의 정량화를 나타낸다.
도 4는 초기 PBS-침지 기간 후에 형광성-계 연구: PBS 속에 재-현탁된 고체를 사용한 중합체 17(PBS로 예비처리됨)의 효소 효능의 정량화를 나타낸다.
도 5는 환자 A, F 및 G로부터의 세포주에 대한 스크래치 모델(scratch model) 시험 동안 폐쇄에 대한 평균 시간을 나타낸다. 적색 바아(bar)는 섬유 형태의 샘플을 강조하며; 청색 바아는 분말 형태의 샘플을 나타낸다.
도 6은 12명의, CMC-PEG-NH2 분말, 환자 A, 0.066 mg/mL 스크래치 검정에 대한 공초점 현미경 사진을 나타낸다. 적색 점선은 스크래치 구역을 나타내고, 섬유아세포 증식은 T=1h(채널 속에 세포가 존재하지 않음)와 T=68h(세포가 채널에 충전됨) 사이에서 관찰될 수 있다.
도 6a는 1시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 6b는 30시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 6c는 50시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 6d는 68시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 7은 12명의, CMC-PEG-NH2 분말, 환자 A, 0.66 mg/mL 스크래치 검정에 대한 공초점 사진을 나타낸다. 적색 점선은 스크래치 구역을 나타내고, 섬유아세포 증식은 T=1h(채널 속에 세포가 존재하지 않음)과 T=68h(세포가 채널에 충전됨) 사이에 관찰될 수 있다.
도 7a는 1시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 7b는 30시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 7c는 50시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 7d는 68시간 째에 관찰된 섬유아세포 증식을 나타낸다.
도 8은 7일에 걸쳐 격자 직경을 나타내는 플롯인, 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타낸다 - 환자 A.
도 9는 7일에 걸쳐 격자 직경을 나타내는 플롯인, 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타낸다 - 환자 F.
도 10은 7일에 걸쳐 격자 직경을 나타내는 플롯인, 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타낸다 - 환자 G.
도 11은 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타내며, 여기서 사진은 3일 및 7일 째에 격자 직경에 있어서의 차이을 나타낸다 - 환자 A.
도 12는 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타내며, 여기서 사진은 3일 및 7일 째에 격자 직경에 있어서의 차이을 나타낸다 - 환자 F.
도 13은 콜라겐 매트릭스 모델을 사용한 연구의 결과를 나타내며, 여기서 사진은 3일 및 7일 째에 격자 직경에 있어서의 차이을 나타낸다 - 환자 G.
도 14는 프로테아제의 검출을 위한 잠재적인 펩타이드 개조된 CMC 및 LC 시스템의에 대한 개략도를 나타내며, 여기서 (a)는 동일속성 LC 정렬을 나타낼 수 있는 초기 시스템 셋업을 나타내고(교차 편광 렌즈로 보는 경우 암색), (b)는 진행시 액체를 방출하는 펩타이드의 절단을 나타내며, (c)는 LC와 접촉시 절단된 지질을 나타내고, 이는 초기 평면 LC 재정렬일 수 있다(교차 편광 렌즈 하에서 보는 경우 착색됨).
도 15는 CMC 겔의 적용시 액정 4'-n-펜틸-4-시아노-비페닐 (5CB) 충전된 TEM(투과 전자 현미경) 격자를 나타내는 사진을 나타낸다.
도 15a는 CMC 하이드로겔-동일속성 LC 정렬의 적용 전 5CB 충전된 TEM 격자를 나타낸다.
도 15b는 T=0에서 CMC 하이드로겔의 적용 후 5CB 충전된 TEM 격자를 나타낸다; 평면 LC 정렬에 대한 변화.
도 15c는 T=2 분에서 CMC 하이드로겔의 적용 후(좌측 패널) 및 T=5 분에서 CMC 하이드로겔의 적용 후(우측 패널) 5CB 충전된 TEM 격자를 나타낸다.
도 15d는 T=10 분에서 CMC 하이드로겔의 적용 후(좌측 패널) 및 T=90 분에서 CMC 하이드로겔의 적용 후(보유된 평면 LC 정렬)(우측 패널) 5CB 충전된 TEM 격자를 나타낸다.
상세한 설명
다양한 국면이 이후 보다 충분히 설명될 것이다. 그러나, 이러한 국면은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본원에 설정된 구현예에 한정되는 것으로 고려되어서는 안되고; 오히려 이들 구현예는 이러한 개시내용이 철저하고 완전할 것이며 당해 분야의 숙련가에게 이의 영역을 전달하도록 제공된다.
본 개시내용 전체에서, 다양한 특허, 특허원 및 공보가 참고된다. 이들의 전문에서 이들 특허, 특허원 및 공보의 개시내용은 본 개시내용의 날짜 이후 당해 분야의 숙련가에게 알려진 바와 같은 당해 분야의 상태를 보다 충분히 기술하기 위해 참고로 본 개시내용에 포함된다. 인용된 특허, 특허원 및 공보와 본 개시내용 사이에 어떠한 불일치가 있는 경우에 본 개시내용이 우선할 것이다.
I. 정의
광범위한 값이 제공되는 경우, 이러한 범위의 상한치와 하한치 사이의 각각의 사잇 값 및 어떠한 다른 기술되거나 기술된 범위의 사잇 값이 본 개시내용에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 1 μm 내지 8 μm이 기술된 경우, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 및 7 μm, 및 1 μm 이상의 값의 범위 및 8 μm 이하의 값의 범위도 또한 명쾌하게 기술되어 있는 것으로 의도된다.
단수 형("a," "an," 및 "the")은 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 참고를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체"에 대한 참고는 단수 중합체 및 2개 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하며; "부형제"에 대한 참고는 단일 부형제 및 2개 이상의 동일하거나 상이한 부형제 등을 포함한다.
단어 "약"은 수치 바로 앞에 있는 경우, 당해 값의 ± 10%의 범위를 의미하며, 예컨대, 본 개시내용이 달리 나타내지 않거나, 이러한 해석과 일치하지 않는 한, "약 50"은 45 내지 55를 의미하고, "약 25,000"은 22,500 내지 27,500 등을 의미한다. 예를 들면, "약 49, 약 50, 약 55의 수치의 목록에서, "약 50"은 앞의 값과 뒤의 값 사이의 간격(들)의 1/2 미만, 예컨대, 49.5 초과 내지 52.5 미만을 의미한다. 또한, 어구 "약 미만"의 값 또는 "약 초과"의 값은 용어 "약"의 정의의 측면에서 이해되어야 한다.
"실질적으로" 또는 "필수적으로"는 거의 전체적으로 또는 완벽하게, 예를 들면, 일부 제공된 양의 중량 또는 용적 또는 측정되는 어떠한 다른 매개변수당 80% 내지 95%, 예컨대, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9% 이상을 의미한다. "실질적으로 유리된"은 일부 제공된 양의 약 1% 내지 약 20% 미만의 수준에서 존재하는 것과 같이 일부 제공된 양의 거의 전체적이거나 완전한 부재, 예컨대, 중량 또는 용적 또는 측정되는 어떠한 다른 매개변수당 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만을 의미한다. 일부 구현예에서, "실질적으로 유리된"은 약제학적 조성물의 중량당 1 내지 5% 이하의 수준에서의 존재를 의미한다.
II. 상처 드레싱에서 사용하기 위한 조성물 및 시스템
상처의 치료요법 및 진단 및 상처 관리에서 사용될 개질된 상처 드레싱 물질이 본원에 제공되며, 여기서 상처 드레싱 물질은 사용하는 경우 상처 제 자리에서 상승된 효소 수준의 존재를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "상처"는 조직 구조의 연속성 또는 통합성의 물리적 파열을 지칭한다. "상처 치유"는 조직 통합성의 회복을 지칭한다. 이는 조직 통합성의 부분적이거나 완전한 회복을 지칭할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 상처의 치료는 상처 치유 과정과 관련된 하나 이상의 단계 또는 과정의 촉진, 개선, 진행, 가속화, 또는 기타의 경우에는 진전을 지칭한다.
상처는 급성 또는 만성일 수 있다. 욕창, 정맥 다리 궤양 및 당뇨병성 족부 궤양을 포함하는 만성 상처는 치유할 수 없는 상처로 단순히 기술될 수 있다. 만성 상처의 정확한 분자적 병리학은 충분히 이해되어 있지 않지만, 이는 다수-요인인 것으로 알려져 있다. 급성 손상 동안 정주성 세포(resident cell) 및 이주성 세포의 정상 반응이 손상되므로, 이들 상처는 연장된 염증 반응, 결함이 있는 상처 세포외 매트릭스(ECM) 리모델링 및 재-상피화의 실패에 의해 특징화된다.
상처는 내부 상처일 수 있는데, 예컨대, 피멍 또는 내부 궤양과 같이 피부의 외부 구조적 통합성이 유지되는 어떠한 내부 상처, 또는 외부 상처, 특히 피하 상처일 수 있으며, 후속적으로 조직은 어떠한 내부 또는 외부 체 조직일 수 있다. 일 구현예에서, 조직은 피부(예를 들면, 사람 피부)일 수 있는데, 즉, 상처는 피 또는 상치 상처와 같은 피하 상처이다.
사람 피부는 2개의 명확한 층, 상피 및 진피로 구성되며, 이 아래에 피하 조직이 놓여있다. 피부의 주요 기능은 내부 기관 및 조직에게 외부 외상 및 병원체 감염으로부터의 보호, 감각 및 열조절을 제공한다.
피부의 최외부 층인, 상피는 두께가 대략 0.04 mm 두께이며, 무혈관이고, 4개의 세포 유형(각질형성세포, 멜라닌세포, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 및 촉각 세포(Merkel cell)을 포함하며, 수개의 상피 세포 층내로 계층화되어 있다. 상피의 최내부 상피 층은 기저 막이며, 이는 진피와 직접 접촉하고 있으며, 상피를 진피에 앵커(anchor)시킨다. 피부에서 일어나는 모든 상피 세포 분열은 기저 막에서 일어난다. 세포 분열 후, 상피 세포는 상피의 외부 표면을 향해 이주한다. 이러한 이주 동안, 세포는 각질화로 알려진 과정을 겪으며, 이로 인해 핵이 손실되고 세포는 거질고, 평편하며, 내성인 죽은 세포로 변환된다. 이주는 세포가 상처 구조의 최외부인, 각질층, 건조하고 방수성의 평편 세포 층에 도달하면 완료되며, 이러한 세포 층은 하부 조직의 건조를 방지하는데 도움을 준다. 죽은 상피 세포의 층은 지속적으로 벗겨져서 기저 막으로부터 표면으로 이동하는 각질화된 세포에 의해 교체된다. 표피의 상피가 무혈관이므로, 기저 막은 이의 영양 공급을 위해 진피에 의존한다.
진피는 진피에 영양분을 공급하는 고도로 혈관화된 조직 층이다. 또한, 진피는 신경 종말, 림프관, 콜라겐 단백질, 및 연결 조직을 함유한다. 진피는 두께가 대략 0.5 mm이며 주로 섬유아세포 및 대식구로 구성된다. 이들 세포 유형은 피부를 포함한, 모든 동물 연결 조직에서 발견되는 단백질인, 콜라겐의 생산 및 유지에 크게 관여한다. 콜라겐은 주로 피부의 탄력성, 탄성 특성에 관여한다. 콜라겐이 풍부한 진피 아래에서 발견되는 피하 조직은 피부 이동성, 단열, 칼로리 저장, 및 혈액을 그 위에 있는 조직에 제공한다.
상처는 2개의 일반적인 범주인, 부분 두께 상처 또는 완전한 두께 상처중 하나로 분류될 수 있다. 부분 두께 상처는 진피 혈관에 대한 손상이 없이 상피 및 표면 진피로 한정된다. 완전한 두께 상처는 진피의 붕괴를 포함하며 진피 혈관의 붕괴를 포함하는, 보다 깊은 피부 층으로 확장된다. 부분 두께 상처의 치유는 상피 조직의 단순한 재생으로 일어난다. 완전한 두께 상처에서 상처 치유는 보다 복잡하다. 본원에서 고려된 피하 상처는 부분 두께 또는 전체 두께 상처일 수 있다.
본원에 고려된 상처는 자상 및 궤양, 외과적 절개 또는 상처, 구멍, 찰과상, 긁힘, 압축 상처, 마모, 마찰 상처(예컨대, 기저기 발진, 마찰 물집), 욕창성 궤양 (압력, 또는 욕창), 열상 상처(냉 및 열원에서 직접 또는 전도, 대류 또는 조사 및 전원을 통한 화상), 화학적 상처 (산, 알칼리 화상) 또는 개방 또는 완전한 종기, 피부 발진, 반점 및 여드름, 궤양을 포함하는 병원성 감염(예컨대, 바이러스, 세균 또는 진균), 만성 상처(하지 및 족 궤양, 정맥 다리 궤양 및 욕창과 같은 당뇨병 관련 상처 포함), 피부 이식편/이식 기증자 및 수혜자 부위, 면역 반응 상태, 예컨대, 건선 및 습진, 위 또는 장 궤양, 입의 궤양을 포함하는 경구 상처, 손상된 연골 또는 뼈, 절단 상처 및 각막 병변을 포함한다.
상처 드레싱 물질 및 이의 제형:
본원에 기술된 구현예는 개질된 상처 드레싱을 제공하며, 이를 사용하여 만성 상처를 진단하고/하거나 치료할 수 있다. 드레싱은 겔-형성 중합체, 비-겔-형성 섬유, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 상처 드레싱 물질은 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 구현에에서, 본원에 기술된, 상처 드레싱 물질은 포유동물에서 만성 상처를 진단하기 위한 방법에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 상처 드레싱 물질은 포유동물에서 감염된 상처를 진단하는 방법에서 사용된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 상처 드레싱 물질은 포유동물에서 상처를 치료하는 방법에서 사용된다. 추가의 구현예에서, 본원에 기술된 상처 드레싱 물질은 포유동물에서 만성인 상처를 치료하기 위한 방법에서 사용된다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 I을 갖는다:
{화학식 I]
Figure pct00013

상기 화학식 I에서,
M은 겔-형성 중합체이고; R은 리포터 분자를 포함하는 영역이며; L은 M 및 R을 연결하는 링커(linker)이다. 일 구현예에서, 링커 (L)이 존재한다. 다른 구현예에서, 링커 (L)은 부재하며, 이 경우에, 상처 드레싱 물질은 식 M-R(여기서 M-R은 각각 개별적으로 위에서 기술한 바와 같다)이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 II의 구조를 갖는다:
[화학식 II]
Figure pct00014

상기 화학식 II에서,
M은 겔-형성 중합체이고; PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이며; L은 M 및 R을 연결하는 링커이다. 일 구현예에서, 링커 (L)는 존재한다. 다른 구현예에서, 링커 (L)은 부재하며, 이 경우에, 상처 드레싱 물질은 식 M-R(여기서, M-R은 각각 개별적으로 위에서 기술한 바와 같다)이다.
구체적인 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질은 링커를 함유하지 않으며, 여기서 리포터 (R) 또는 펩타이드 (PEP)는 겔-형성 중합체에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 회합된다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 공유결합은 결합된 원자 사이의 전자의 공유를 포함한다. 대조적으로, 비-공유 결합은 예를 들면, 이온 상호작용, 전전기 상호작용, 수소 결합 상호작용, 물리화학적 상호작용, 반 데르 바알스 힘(van der Waal forces), 루이스(Lewis-acid)/루이스 염기(Lewis-base) 상호작용, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특히 링커가 부재하는 이러한 예에서, 펩타이드는 공유결합성 상호작용을 통해 겔-형성 중합체에 부가되거나 접합된다.
용어 "펩타이드"는 펩타이드 및 이러한 펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 전형적으로, 펩타이드는 공유 결합, 예컨대 펩타이드 결합을 통해 서로 결합된 다수의 아미노산 잔기, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. "아미노산 잔기"는 본 개시내용의 펩타이드내로 혼입된 개개 아미노산 단위를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아미노산"은 천연적으로 존재하거나 합성인 아미노산, 및 아미노산 유사체, 입체이성체, 및 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 모사체(amino acid mimetic)를 의미한다. 당해 정의에 의해 1. 히스티딘 (His) 2. 이소루이신 (Ile) 3. 루이신 (Leu) 4. 라이신 (Lys) 5. 메티오닌 (Met) 6. 페닐알라닌 (Phe) 7. 트레오닌 (Thr) 8. 트립토판 (Trp) 9. 발린 (Val) 10. 아르기닌 (Arg) 11. 시스테인 (Cys) 12. 글루타민 (Gln) 13. 글리신 (Gly) 14. 프롤린 (Pro) 15. 세린 (Ser) 16. 타이로신 (Tyr) 17. 알라닌 (Ala) 18. 아스파라긴 (Asn) 19. 아스파르트산 (Asp) 20. 글루탐산 (Glu) 21. 셀레노시스테인 (Sec)과 같은 천연 아미노산; 시트룰린; 시스틴; 감마-아미노 부티르산 (GABA); 오르니틴; 테아닌 및 베타인; 카르니틴; 카르노신 크레아티닌; 하이드록시트립토판; 하이드록시프롤린; N-아세틸 시스테인; S-아데노실 메티오닌(SAM-e); 타우린; 타이라민과 같은 아미노산 유도체와 같은 비천연 아미노산이 포함된다. 반응성 측쇄를 함유하는 아미노산, 예컨대, 시스테인, 세린, 트레오닌, 라이신, 아스파르테이트/아스파라긴, 글루타메이트/글루타민, 글리신, 알라닌 등이 특히 사용된다.
특정 구현예에서, 펩타이드는 예컨대, 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환을 통해, 하나 이상의 아미노산의 유도체화를 통해, 또는 폐환 등을 통해 개질될 수 있다. 특히, 펩타이드는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 카복시-말단(C-말단) 또는 아미노-말단(N-말단)에서 개질된다. 특히, 펩타이드는 적어도 하나의 아미노산, 특히, 반응성 측쇄를 함유하는 아미노산, 예컨대, 시스테인, 세린, 트레오닌, 라이신, 아스파르테이트/아스파라긴, 글루타메이트/글루타민, 글리신, 알라닌 등을 첨가함에 의해 C-말단에서 개질되며, 여기서 반응성 측쇄는 염료와 같은 표지와 함께 사용될 수 있다. 특히 이러한 구현예 하에서, 펩타이드는 C-말단에 추가의 시스테인 또는 세린 잔기, 형광성 염료와 커플링하기 위해 사용되는 시스테인의 황 그룹 또는 세린의 하이드록실 그룹을 함유하도록 개질된다.
구체적인 구현예에서, 반응성 측쇄, 예컨대, 시스테인의 SH 그룹을 포함하는 추가의 아미노산을 함유하는 펩타이드를 클릭 화학(click chemistry)을 통해 염료에 커플링시킬 수 있다. 여기서, 1,2-아미노티올과 2-시아노벤조티아졸(CBT) 사이의 반응을 사용하여 형광성인 루시페린을 제조할 수 있다. 루시페린 형광성을 이후에 분광분석법으로 정량화한 후 세척하여, 1,2-아미노티올을 지니는 분자의 상대적인 존재를 측정하는데 사용될 수 있다. 비-1,2-아미노티올-함유 단백질의 정량화가 요구되는 경우, 목적한 단백질을 절단하여 2-CBT에 대해 취약한 N' Cys를 지닌 단편을 수득할 수 있다. Liang et al., J. Angew.Chem., Int. Ed., 48, 965, 2009를 참고한다.
겔-형성 중합체 (M):
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 셀룰로즈, 화학적으로 개질된 셀룰로즈, 펙틴, 알기네이트, 키토산, 개질된 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이의 유도체 또는 이의 어떠한 혼합물 또는 이의 조합으로부터 선택된 화합물이다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈(CMC), 산화된 셀룰로즈(또는 이의 유도체), 셀룰로즈 에틸 설포네이트 (CES), 펙틴, 알기네이트, 키토산, 개질된 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이의 어떠한 조합 또는 혼합물로부터 선택된다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 셀룰로즈 또는 화학적으로 개질된 셀룰로즈, 예컨대, 카복시메틸셀룰로즈, 산화된 셀룰로즈 또는 이의 유도체, 셀룰로즈 에틸 설포네이트이다.
일 구현예에서, 겔 형성 중합체는 중합 화합물의 유도체, 예컨대, 셀룰로즈 유도체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 겔 형성 중합체의 염, 아미드, 에스테르, 에놀 에테르, 에놀 에스테르, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 산, 염기, 용매화물, 수화물 또는 전구화물을 포함한다. 예를 들면, 여기서 중합체는 셀룰로즈이고, 셀룰로즈의 하이드록실 그룹(-OH)은 다양한 시약과 부분적으로 또는 완전히 반응하여 유용한 특성을 지닌 유도체, 예컨대, 셀룰로즈 에스테르 및 셀룰로즈 에테르(-OR)를 형성한다. 일 구현예에서, 셀룰로즈의 유도체는 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 에틸셀룰로즈, 메틸에틸셀룰로즈, 하이드록시에틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 및 하이드록시프로필셀룰로즈로부터 선택된다. 이러한 유도체는 이러한 유도체화를 위한 공지된 방법을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 유도체는 실질적인 독성 효과없이 동물 또는 사람에게 투여될 수 있으며 약제학적으로 활성이거나 전구약물이다. 셀룰로즈 유도체의 대표적인 유형은 미국 특허 제7,544,640호 및 제9,561,188호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 유도체는 중합체 화합물의 염, 예컨대, Li+, Na+, K+, Rb+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, 또는 Ba2+, 바람직하게는 Na+, K+, Mg2+, Ca2+의 염이다. 나트륨 또는 칼슘 염과 같은 셀룰로즈, 셀룰로즈 에스테르 및 셀룰로즈 에테르의 염은 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 겔-형성 중합체 화합물은 하나 이상의 전술한 화합물의 조합 또는 혼합물을 함유할 수 있다. 용어 "조합"은 하나 이상의 성분을 함유하는 화합물을 포함하며, 이는 서로 접합되거나 접합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 겔-형성 중합체 화합물은 예컨대, 공유결합 또는 비-공유결합 상호작용을 통해 서로 접합되는 하나 이상의 상술한 화합물의 조합을 포함한다. 특수한 예로서, 겔-형성 중합체는 펙틴 및 카복시메틸셀룰로즈의 조합을 포함할 수 있다. Ninan et al., Carbohydr Polym. 2013 Oct 15; 98(1):877-85; PMID: 23987424를 참고한다.
일부 구현예에서, 화합물은 상술한 중합체 화합물의 혼합물을 포함한다. 용어 "혼합물"은 이들이 이들 개개의 특성을 상실할 수 있는 반응의 발생없이 2개 이상의 물질과 함께 섞임을 지칭한다. 예를 들면, 화합물 A 및 화합물 B의 혼합물은 어떠한 중량비의 화합물 A 및 화합물 B를 함유하여, 혼합물의 전체 중량이 100%에 이르는 양, 예컨대, 99:1 중량비의 화합물 A/화합물 B 또는 1:99 중량비의 화합물 A/화합물 B일 수 있다. 대표적인 화합물은 약 2, 3, 4, 5개 이상의 상술한 중합체 화합물을 함유할 수 있다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 분말 또는 섬유, 또는 이의 조합의 형태이다. 화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 섬유의 형태이다. 겔-형성 섬유는 상처 유출물의 흡수시 습윤성, 미끄러움, 또는 젤라틴성이 되고 따라서 주변 섬유가 상처에 부착하도록 하는 경향을 감소시키는 흡습성 섬유이다. 겔-형성 섬유는 유출물의 흡수시 이들의 구조적 통합성을 보유하는 유형일 수 있거나 이들의 섬유 형태를 상실하여 구조가 없는 겔이 되는 유형일 수 있다. 겔-형성 섬유는 바람직하게는 흡수성이 섬유의 그램당 적어도 2 그램의 0.9% 염수 용액의 흡수성을 갖는다(자유 팽윤법(free swell method)으로 측정).
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 비-겔-형성 섬유를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-겔-형성 섬유는 셀룰로즈 섬유(예컨대, 면 또는 라이오셀(lyocell)/TENCEL), 폴리에스테르, 나일론, 비스코스, 아라미드, 아크릴, 엘라스탄(LYCRA), 폴리올레핀, 폴리락타이드, 실크, 및 천연 또는 합성 울(wool)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 겔-형성 중합체 및 비-겔-형성 섬유를 포함한다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 분말의 형태이다. 화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 분말 겔-형성 중합체가 분말 겔-형성 중합체의 보다 높은 치환도(DoS)로 인하여 섬유성 겔-형성 섬유보다 바람직하다. 화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 섬유상 겔-형성 섬유가 분말 겔-형성 중합체보다 바람직하다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 겔-형성 중합체는 DoS가 적어도 0.2, 적어도 0.3, 적어도 0.4, 적어도 0.5, 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1.0, 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 2.0 이상이다. 용어 DoS는 당해 분야에서 이해된다. 예를 들면, 셀룰로즈 화학과 관련하여 각각의 무수글르코즈(β-글루코피라노즈) 단위가 3개의 반응성(하이드록실) 그룹을 갖는 경우; DoS는 따라서 0(셀룰로즈) 내지 3(완전히 치환된 셀룰로즈)의 범위일 수 있다.
링커 (L):
일부 구현예에서, 여기서 상처 드레싱 물질은 링커를 포함하고, 링커는 겔-형성 중합체에 공유결합 또는 비-공유결합으로 부착될 수 있다. 당해 분야에 이해되는 바와 같이, 공유 결합은 전자의 공유를 포함한다. 대조적으로, 비-공류 결합은 예를 들면, 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합 상호작용, 물리화학적 상호작용, 반 데르 반 데르 바알스 힘(van der Waal forces), 루이스(Lewis-acid)/루이스 염기(Lewis-base) 상호작용, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 링커는 겔-형성 중합체에 공유결합성 상호작용을 통해 부착되거나 접합된다.
일 구현예에서, 화학적 링커는 탄소수가 2 내지 10, 특히 탄소수가 4 내지 8 또는 특히 탄소수가 4 내지 6인 카복실산이다.
다른 구현예에서, 링커는 이의 에테르, 아미드, 및 에스테르를 포함하는, 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단량체 또는 중성 중합체이다.
일 구현예에서, 중성 중합체는 프로필렌을 포함하는 이의 단량체가 또한 사용될 수 있지만, 폴리프로필렌이다. 폴리프로필렌 (PP)은 이의 저 밀도, 낮은 생산 비용, 설계 유용성 및 재활용성으로 인하여 매트릭스 물질로서 가장 중요하고 광범위하게 사용된 폴리올레핀이다. 폴리프로필렌이 소수성이므로, 이는 셀룰로즈와 같은 극성 표면과는 비혼화성일 수 있다. 이러한 쟁점은 폴리(프로필렌-그래프트-말레산 무수물)(PP-g-MA)과 같은 기능화된 폴리프로필렌을 복합체에 혼입함으로써 해결할 수 있으며, 여기서 카복실산 무수물 그룹은 셀룰로즈에 공유 결합을 제공할 수 있다. Spoljaric et al., Composites: Part A 40, 791-799, 2009를 참고한다.
일 구현예에서, 중성 중합체 링커는 알킬렌 글리콜을 포함하는 이의 단량체가 또한 사용될 수 있지만, 폴리알킬렌 글리콜이다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 폴리부틸렌 글리콜과 같은 직쇄 또는 측쇄 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 지칭한다. 폴리알킬렌 글리콜 소단위는 단일 폴리알킬렌 글리콜 단위이다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 소단위는 쇄 말단 지점에서 수소로 캡핑된(capped) 에틸렌 글리콜, -O-CH2-CH2-O-, 또는 프로필렌 글리콜, -O-CH2-CH2-CH2-O-일 수 있다. 폴리(알킬렌 글리콜)의 다른 예는 PEG, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) (mPEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), PPG, 폴리(테트라메틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드), 또는 이의 공중합체 및 조합과 같은 PEG 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 천연 중합체는 폴리아민이나, 아민을 포함하는 이의 단량체가 또한 사용될 수 있다. 용어 "폴리아민"은 폴리알킬렌 이민에서와 같이 골격내로 혼입된 단량체 단위, 또는 폴리비닐 아민에서와 같이 펜던트 그룹(pendant group)내 아민 기능성을 가진 중합체를 말한다.
특히, 링커는 PEG 또는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) (mPEG), 폴리(에틸렌 옥사이드), PPG, 폴리(테트라메틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드), 또는 이의 공중합체 및 조합과 같은 PEG 유도체이다.
다른 구현예에서, 다른 친수성 또는 소수성 링커는 또한 이들이 굴곡성인 한, 링커, 예컨대, 이중 결합 또는 사이클릭 구조를 함유하지 않거나 단지 적은 수의 이중 결합을 함유하는 사이클릭 구조 또는 사이클릭 구조를 함유하는 링커로서 사용될 수 있다. 대표적인 예는 예컨대, 쇄 길이가 약 2 내지 약 20개의 쇄 원자인 폴리알킬렌, 폴리하이드록시알킬렌, 폴리알킬렌 석시네이트, 폴리락타이드 등을 포함한다. 폴리알킬렌글리콜의 쇄 길이는 엣지(edgy) 3 단위 (MW 약 150 Da) 내지 예컨대, 약 100 (MW 약 5000) 이하에서 변할 수 있다. 다당류와 관련하여 폴리알킬렌글리콜의 상대적인 양은 생성물의 요구되는 두께 및 요구되는 굴곡성에 따라, 약 1/200 내지 약 1/1, 특히 약 1/50 내지 약 1/1.5에서 변할 수 있다. 미국 특허 제9,089,614호 및 미국 공보 제2005-0079155호를 참고한다.
화학식 I 또는 화학식 II의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, 링커 L은 예컨대, 천연 중합체의 1 내지 약 20개의 단량체 단위, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 단량체 단위를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 링커는 1 내지 약 5개의 에틸렌 글리콜 단위 또는 이의 유도체, 2 내지 약 5개의 에틸렌 글리콜 단위 또는 이의 유도체, 2 내지 약 8개의 에틸렌 글리콜 단위 또는 이의 유도체, 2 내지 약 10개의 에틸렌 글리콜 단위 또는 이의 유도체 또는 5 내지 약 10 에틸렌 글리콜 단위 또는 이의 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커 L은 친핵성 반응의 생성물인 화학 모이어티를 포함한다. 일반적으로, 용어 "친핵체"는 지방족 화학에서 단일분자("SN1"으로 알려짐) 또는 2분자("SN2")로서 지방족 화학에서 일반적으로 발생하는, 이탈 그룹(일반적으로 다른 친핵체)을 교체함으로써 화합물과 반응하는 각각의 전자 쌍을 갖는 화학 그룹을 의미하는 것으로 당해 분야에 인식되어 있다. 친핵체의 예는 아민, 머캅탄, 및 알코올과 같은 하전되지 않은 화합물, 및 티올, 티올레이트, 카바니온과 같은 하전된 그룹, 및 다양한 유기 및 무기 음이온과 같은 하전된 그룹을 포함한다. 예시적인 음이온성 친핵체는 특히 아지드, 시아니드, 티오시아네이트, 아세테이트, 포르메이트, 또는 클로로포르메이트, 및 비설파이트와 같은 단순한 음이온을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커 L은 말레이미드-티올 부가물을 포함한다. 말레이미드는 티올-함유 물질, 예컨대, 시스테인과 같은 티올-함유 아미노산에 접합하는데 특히 유용하다. 티올 그룹은 이중 결합을 가로질러 첨가함으로써 말레이미드와 반응하여 티오에테르를 형성한다. 말레이미드는 메티오닌, 히스티딘, 또는 타이로신보다 시스테인의 티올에 대해 선택적이다. 말레이미드와 아민의 반응은 일반적으로 말레이미드와 티올의 반응보다 더 높은 pH를 필요로 한다. 말레이미드의 가수분해는 특히 pH 8 초과에서 티올 개질와 유의적으로 경쟁한다. 미국 공보 제2007-0087446호를 참고한다.
일부 구현예에서, L은 할로아세트아미드-티올 접합 생성물을 포함한다. 할로아세트아미드, 예컨대, 요오도아세트아미드 또는 브로모아세트아미드를 또한 사용하여, 아미노산, 예컨대, 시스테인의 티올 그룹과 공유결합으로 결합시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 L은 티올 또는 디설파이드를 함유하는 화합물을 포함하며, 이는 유리하게는 말레이미드에 대해 사용될 수 있다. Zalipsky et al., Bioconjug. Chem. 6, 150-165, 1995; Greenwald et al. Crit. Rev. Ther. Drug 담체 Syst. 17, 101-161, 2000; 및 Herman et al., Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209, 1994를 참고한다. 또한 미국 특허 제7,432,330호를 참고한다.
리포터 및 마커
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 리포터 분자를 포함하는 영역을 포함한다. 특히, 리포터는 하나 이상의 상처-특이적인 마커, 예컨대, 상처 환경에서 발견된 효소에 대한 기질이다. 본원에 사용된 바와 같은, "상처 특이적인 효소"는 상처내에서 차등적으로 발현된 효소이다. "차등적 발현"은 효소의 수준 또는 활성이 다른 부위, 예컨대, 정상 조직 또는 주변 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 더 높거나 낮음을 의미한다. 특히, 차등적 발현은 정상 또는 상처입지 않은 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 더 높은 수준의 효소의 발현 또는 활성을 내포한다. 효소의 차등적 발현은 통상의 수단으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 샘플 속에서 효소의 수준은 ELISA 검정 또는 다른 면역검정으로 분석할 수 있다. 효소의 활성은 예컨대, 질량 분광기 또는 HPLC를 사용하여 기질의 손실율 및/또는 생성물의 형성율을 측정하여 분석할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예 단락에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 마커는 하이드롤라제, 프로테아제, 에스테르라제, 및 퍼옥시다제 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소이다.
일 구현예에서, 마커는 하이드롤라제이다. 본원에 사용된 바와 같은, "하이드롤라제" 또는 "가수분해 효소"는 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 효소, 예컨대, 에스테라제 및 뉴클레아제(에스테르 결합을 파괴함); 글리콜라제(글리코시드 링커를 파괴함); 펩티다제(펩타이드 결합을 파괴함) 등이다.
일 구현예에서, 마커는 프로테아제 효소이다. 프로테아제는 서열-특이적이거나 포괄적인 프로테아제이다. 특히, 용어 "서열-특이적인 프로테아제"는 이의 소화를 위한 펩타이드의 특이적인 서열을 인식하는 프로테아제(예를 들면, 카스파제)를 의미하며, 이의 하나의 말단으로부터 펩타이드를 순차적으로 분해하고 서열-비특이적인 방식으로 펩타이드를 소화하는 총괄적인 프로테아제(예를 들면, 트립신)와는 구별된다. 서열 특이성의 경우, 펩타이드 기질의 아미노산 서열은 4개 이상의 아미노산 (a.a.) 잔기를 포함할 수 있다. 인식 부위 및 소화 부위는 서로 근접할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로테아제에 대한 기질 펩타이드"는 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 의미하며, 이는 이의 프로테아제 활성에 대한 기질, 예컨대, 하나 이상의 생성물로 절단될 수 있는 기질로서 프로테아제에 의해 인식되는, 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 다수의 아미노산을 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 영역을 포함한다. 용어 "다수"는 개개 단위가 구조적으로 및/또는 기능적으로 상이할 필요는 없지만, 2개 이상의 단위, 예컨대, 아미노산을 의미한다.
일 구현예에서, 펩타이드는 천연 아미노산을 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함하는 합성 펩타이드를 또한 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 이의 각각이 특수한 효소에 대해 특이적인 다수의 기질을 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 이들 각각이 다수의 효소에 대해 특이적인, 다수의 기질을 또한 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제 효소는 엑소펩티다제 또는 엔도펩티다제이다. 엑소펩티다제는 펩타이드 쇄의 말단 근처에서만 구조를 분해하고; 엔도펩티다제는 펩타이드내에서 내부 결합을 절단할 수 있다. 이들 부류는 또한 소그룹으로 분할할 수 있다: 시스테인-프로테아제, 세린-프로테아제, 트레오닌-프로테아제, 아스파르틱-프로테아제, 글루탐산-프로테아제, 메탈로-프로테아제 등. 각각은 펩타이드 결합의 가수분해에 의해 특이적인 단백질 연결을 분해할 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제는 상처에 대해 특이적이다. 본원에 사용된 바와 같은, "상처 특이적인 프로테아제"는 상처내에서 차등적으로 발현된 프로테아제이다. "차등적인 발현"은, 프로테아제의 수준 또는 활성이 다른 부위, 예컨대, 정상 조직 또는 주변 조직과 비교하여 상처 환경에서 더 높거나 낮음을 의미한다. 특히, 차등적 발현은 상처나지 않은 조직과 비교하여 상처 미세환경에서 프로테아제의 발현 또는 활성의 보다 높은 수준을 내포한다. 프로테아제의 차등적 발현은 통상의 수단으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 샘플 속에서 프로테아제의 수준은 ELISA 검정 또는 다른 면역검정으로 분석할 수 있다. 프로테아제의 활성은 펩타이드 기질의 손실율 및/또는 생성물의 형성율을 예컨대, 질량 분광기 또는 HPLC를 사용하여 측정함으로써 분석할 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있고 실시예 단락에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 상처 특이적인 프로테아제는 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 기질은 콜라게나제에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 MMP-2에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 MMP-3에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 호중구 콜라게나제에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 겔라티나제에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 사람 호중구 엘라스타제에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 카텝신 G에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 라이소자임에 대해 특이적인 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 기질은 라이소자임에 의해 절단될 수 있는 당이다.
하나의 구체적인 구현예에서, 상처-특이적인 프로테아제는 MMP-1, MMP-2, MMP-8 및 MMP-9 (콜라게나제), 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)이다. MMP-1(UNIPROT 수탁 번호 제P03956호[사람] 및 제Q9EPL5호[마우스])은 또한 세포간 콜라게나제 및 섬유아세포 콜라게나제로 공지되어 있다. MMP-2(UNIPROT 수탁 번호 제P08253호[사람] 및 제P33434호[마우스])는 또한 겔라티나제로 공지되어 있다. MMP-8(UNIPROT 수탁 번호 제P22894호[사람] 및 제 O70138호[마우스])는 또한 PMNL 콜라게나제(MNL-CL)로 공지되어 있다. MMP-9 (UNIPROT 수탁 번호 제P14780호[사람] 및 제P41245호[마우스])는 또한 겔라티나제 B (GELB)로 공지되어 있다.
하나의 구체적인 구현예에서, MMP는 MMP-2 또는 MMP-9, 또는 이의 조합이다.
일부 구현예에서, 예컨대, 약 6 U/mL, 약 7 U/mL, 약 8 U/mL, 약 9 U/mL, 약 10 U/mL, 약 11 U/mL, 약 12 U/mL, 약 13 U/mL, 약 14 U/mL, 약 15 U/mL, 약 16 U/mL, 약 17 U/mL, 약 18 U/mL, 약 19 U/mL, 약 20 U/mL, 약 21 U/mL, 약 22 U/mL, 약 23 U/mL, 약 24 U/mL, 약 25 U/mL, 또는 이상 사이의 모든 값을 포함하는 약 5 U/mL 내지 약 30 U/mL의 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 활성 단위(U)는 전형적으로 효소 촉매 활성을 기술하는데 사용되며, 여기서 단위(U)는 분당 1 마이크로몰(μmole)의 기질의 전환을 촉매하는 효소의 양을 지칭한다. 따라서, 1 효소 단위(U) = 1 μmol/min이고, 여기서 μmol은 전환된 기질이 양을 지칭한다.
하나의 구체적인 구현예에서, MMP는 MMP-2 또는 MMP-9이고, 여기서 적어도 10.5 U/mL의 MMP-2 및 MMP-9 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
MMP에 의해 절단가능한 어떠한 펩타이드도 본원에 기술된 구현예에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 이의 주제가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,148,194호의 표 1을 참고한다.
표 1은 다양한 기질 및 사람 MMP의 상이한 동형에 대한 이들의 특이성을 나타낸다. 데이타는 Nagase et al. ("Substrate specificity of MMPs," in Matrix Metalloproteinase Inhibitors in Cancer Therapy, Clendeninn & Appelt Eds., Springer Science Media New York, 2001)에 나타나 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
[표 1]
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Figure pct00016

다른 구현예에서, 본 발명의 상처-특이적인 프로테아제는 사람 호중구 엘라스타제 (HNE) (UNIPROT 수탁 번호 제P08246호[사람]이고 제Q3UP87호[마우스])는 키모트립신과 동일한 계열에서 세린 프로테이나제이고 광범위한 기질 특이성을 갖는다. 염증 동안 호중구 및 대식구에 의해 분비되어, 이는 세균 및 숙주 조직을 파괴한다. 일 구현예에서, HNE를 검출하기 위한 기질은 코어 서열 알라닌-알라닌-프롤린-발린(AAPV)을 갖는다. 다른 구현예에서, HNE에 대한 기질은 Ala-Pro-Glu-Glu-Ile/Met-Arg-Arg-Gln (APEEI/MRRQ) (Kasperkiewicz et al., PNAS USA, 111(7): 2518-2523, 2014; Korkmaz et al., Methods Mol Biol., 844:125-138, 2012)이다.
일부 구현예에서, 예컨대, 약 6 U/mL, 약 7 U/mL, 약 8 U/mL, 약 9 U/mL, 약 10 U/mL, 약 11 U/mL, 약 12 U/mL, 약 13 U/mL, 약 14 U/mL, 약 15 U/mL, 약 16 U/mL, 약 17 U/mL, 약 18 U/mL, 약 19 U/mL, 약 20 U/mL, 약 21 U/mL, 약 22 U/mL, 약 23 U/mL, 약 24 U/mL, 약 25 U/mL 이상 사이의 모든 값을 포함하는, 약 5 U/mL 내지 약 30 U/mL의 사람 호중구 엘라스타제 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 9.6의 사람 호중구 엘라스타제 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 22.9 U/mL의 사람 호중구 엘라스타제 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
MMP 및 HNE 소그룹은 상처내에서 단백질과 상호작용하는 경우 상이한 메카니즘을 가지므로 각각은 상처 치유의 상이한 억제 방법을 가진 것으로 예측할 수 있다.
다른 구현예에서, 상처-특이적인 효소는 라이소자임이다. 라이소자임 (UNIPROT 수탁 번호 P61626호[사람] 및 제P08905호[마우스])은 글리코시드 하이드롤라제이며 이의 주요 기능은 세균의 세포벽을 파괴하는 것이다. 이는 펩티도글리칸내 N-아세틸무람산과 N-아세틸-D-글루코스아민 잔기 사이 및 또한 키토덱스트란내 N-아세틸-D 글루코스아민 잔기 사이의 (1→4)-β-연결을 가수분해한다. 라이소자임에 대한 천연 기질은 세균 세포벽의 펩티도글리칸 층이다. 그러나, 뮤레인 분해 생성물 및 또한 합성 화합물을 포함하는 다양한 저 분자량 기질을 다양한 광도계, 동형, 및 면역학적 라이소자임 검정에 사용하여 왔다(Holtje et al., EX , 75:105-10, 1996). 다음의 저 분자량 라이소자임 기질이 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 Sigma Aldrich로부터 이용가능하다: 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N',N"-트리아세틸-키토트리오시드(Sigma 제품 번호 M5639) 및 4-니트로페닐 β-D-N,N',N"-트리아세틸-키토트리오시드(Sigma 제품 번호 N8638).
일부 구현예에서, 예컨대, 약 1100 U/mL, 약 1200 U/mL, 약 1300 U/mL, 약 1400 U/mL, 약 1500 U/mL, 약 1600 U/mL, 약 1700 U/mL, 약 1800 U/mL, 약 1900 U/mL, 약 2000 U/mL, 약 2100 U/mL, 약 2200 U/mL, 약 2300 U/mL, 약 2400 U/mL, 약 2500 U/mL, 약 2600 U/mL, 약 2700 U/mL, 약 2800 U/mL, 약 2900 U/mL, 약 3000 U/mL, 약 3250 U/mL, 약 3500 U/mL, 약 3750 U/mL, 약 4000 U/mL, 약 4250 U/mL, 약 4500 U/mL, 약 4750 U/mL, 약 5000 U/mL, 약 5250 U/mL, 약 5500 U/mL, 약 5750 U/mL, 약 6000 U/mL 이상의 모든 값을 포함하는, 약 1000 U/mL 내지 약 10000 U/mL의 라이소자임 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 4800 U/mL의 라이소자임 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
여전히 추가의 구현예에서, 상처-특이적인 효소는 퍼옥시다제, 보다 구체적으로, 마이엘로퍼옥시다제(MPO)이다. MPO (UNIPROT 수탁 번호 P05164호[사람] 및 제P11247호[마우스])는 호중구 과립구에서 발견된 퍼옥시다제이다. 과산화수소(H2O2) 및 할라이드(가장 일반적인 클로라이드)의 존재하에서, 이는 항미생물 물질 차아염소산염, 단일선 산소(1O2), 염소(Cl2) 및 하이드록실 라디칼(OH·)을 포함한다. MPO는 테트라메틸벤지딘 또는 4-벤조일아미노-2,5-디메톡시아닐린을 사용하여 검출할 수 있다. Andrews et al., Anal Biochem, 127(2):346-50, 1982; Klebanoff et al., J. Leukocyte Biol., 77, 598-625, 2005를 참고한다.
여전히 추가의 구현예에서, 상처-특이적인 효소는 카텝신 G (UNIPROT 수탁 번호 P08311호[사람] 및 제P28293호[마우스])이며, 아주로필과립(azurophil granule)에 저장된 키모트립신 계열의 3개의 세린 프로테아제 중 하나이다. 카텝신 G-특이적인 기질은 서열 Ala-Ala-Pro-Phe 또는 Ala-Ala-Pro-Met (Sigma Aldrich 제품 번호 제S7388호 및 제M7771호)을 갖는다.
일부 구현예에서, 예컨대, 약 15 U/mL, 약 20 U/mL, 약 25 U/mL, 약 30 U/mL, 약 35 U/mL, 약 40 U/mL, 약 45 U/mL, 약 50 U/mL, 약 55 U/mL, 약 60 U/mL, 약 65 U/mL, 약 70 U/mL, 약 75 U/mL, 약 80 U/mL, 약 85 U/mL, 약 90 U/mL, 약 95 U/mL, 약 100 U/mL, 약 110 U/mL, 약 120 U/mL, 또는 이상 사이의 모든 값을 포함하는, 약 10 U/mL 내지 약 100 U/mL의 카텝신 G 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 50 U/mL, 적어도 40 U/mL, 적어도 30 U/mL, 적어도 20 U/mL, 적어도 15 U/mL 또는 적어도 10 U/mL 사이의 모든 값을 포함하는, 약 10 U/mL 내지 약 100 U/mL의 카텝신 G 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상처-특이적인 효소는 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (UNIPROT 수탁 번호 P00749호[사람] 및 제P06869호[마우스])이며, 이는 세포외 매트릭스의 붕괴 및 가능하게는 종양 세포 이주 및 증식에 관여하는 세린 프로테아제이다. 우로키나제에 대해 특이적인 기질은 염기성 모티프 Arg-Val 또는 Lys-Val를 갖는다. Rijken et al., Biochem Biophys Res Commun., 174(2):432-8, 1991를 참고한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 효소는 에스테라제이다. 에스테라제는 에스테르를 물과의 화학 반응에서 산 및 알코올로 분할하는 하이드롤라제이다. 하나의 구체적인 구현예에서, 에스테라제에 대한 기질은 플루오레세인 디아세테이트-5-말레이미드이다.
일부 구현예에서, 조성물은 다수의 효소, 예컨대, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4개 이상의 전술한 효소를 검출할 수 있는 기질을 포함한다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 동일한 겔 중합체 또는 상이한 겔 중합체에 접합된 다수의 기질을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 기질은 표지된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "표지"는 에피토프 결합제, 또는 다른 기질 물질에 부착된 어떠한 물질도 지칭하며, 여기서 물질은 검출 방법으로 검출가능하다. 적합한 표지의 비-제한적 예는 발광성 분자, 화학발광성 분자, 형광색소, 형광성 퀀칭제, 착색된 분자, 방사성동위원소, 섬광제, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속, 및 효소(알칼린 포스파타제, 퍼옥시다제, 및 루시퍼라제 포함)를 포함한다. 이러한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
특정 구현예에서, 기질은 검출가능한 표지인 표지로 표지된다. 검출가능한 표지는 모이어티(moiety)이며, 이의 존재는 직접 또는 간접적으로 확인될 수 있다. 일반적으로 표지의 검출은 예를 들면, 에너지의 방출과 같은 검출가능한 시그널의 생성을 포함한다. 표지는 화학적, 펩타이드 또는 핵산 특성을 가지지만 이에 한정되지 않는다. 사용된 표지의 특성은 수행되는 분석의 특성, 사용된 에너지원 및 검출인자의 유형 및 중합체의 유형, 분석물, 프로브 및 1차 및 2차 분석물-특이적인 결합 파트너를 포함하는, 다양한 인자에 의존할 것이다. 표지는 이들이 결합하는 성분과 입체적으로 및 화학적으로 혼화성이어야 한다.
표지는 예를 들면 특수한 파장의 전자기 조사를 방출하고/하거나 흡수하는 이의 능력에 의해 직접 검출될 수 있다. 표지는 예를 들면, 결합하고, 보충하며, 일부 경우에 자체적으로 특수한 파장의 광을 방출하거나 흡수할 수 있는 다른 모이어티(예컨대, FLAG 에피토프와 같은 에피토프 태그, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 등)를 분해하는 이의 능력에 의해 직접 검출할 수 있다. 일반적으로 검출가능한 표지는 형광성 분자(예컨대, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, 텍사스 레드(Texas Red), 파르-레드(Phar-Red), 알로피코시아닌(APC), 플루오레세인 아민, 에오신, 단실, 움벨리페론, 5-카복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 6 카복시로다민 (R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 6-카복시-X-로다민 (ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조) 벤조산(DABCYL), 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2, 2'디설폰산, 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, r-아미노-N-(3-비닐설포닐)페닐나프탈이미드-3,5, 디설포네이트(루시페르 옐로우(Lucifer Yellow) VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow), 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 7-아미노-4-트리플루오로메틸코울루아린(쿠마린 151), 시아노신, 4', 6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5"-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-설포네프탈레인(브로모피로갈롤 레드(Bromopyrogallol Red)), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트 (DABITC), 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티디움, 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), QFITC (XRITC), 플루오레스카민, IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레솔프탈레인, 니트로타이로신, 파라로사닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린, o-프탈디알데하이드, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, 반응성 레드 4 (Cibacron® 르릴리언트 레드(Brilliant Red) 3B-A), 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체, 테트라메틸 로다민, 리보플라빈, 로솔산, 및 테르비움 킬레이트 유도체), 화학발광성 분자, 생물발광성 분자, 색원체 분자, 방사성동위원소 (예컨대, P32 또는 H3, 14C, 125I 및 131I), 전자 스핀 공명 분자 (예를 들면 니트록실 라디칼과 같은), 광학 또는 전자 밀도 분자, 분자를 전도하거나 전달하는 전기 전하, 자기 또는 상자성 비드 또는 입자와 같은 전자기 분자, 반도체 나노결정 또는 나노입자(예를 들면 미국 특허 제6,207,392호에 기술되고 Quantum Dot Corporation 및 Evident Technologies로부터 시판되는 양자 점), 콜로이드성 금속, 콜로이드 금 나노결정, 핵 자기 공명 분자 등과 같은 검출가능한 표지로 이루어진 그룹으로부터 직접 선택될 수 있다.
검출가능한 표지는 또한 효소(예컨대, 알칼린 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, p-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제와 같은 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호); 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 사카라이드 옥시다제; 과산화수소를 사용하여 HRP와 같은 염료 전구체로 산화시키는 효소에 커플링된 우리카제 및 크산틴 옥시다제와 같은 헤테로사이클릭 옥시다제, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제), 효소 기질, 친화성 분자, 리간드, 수용체, 바이오틴 분자, 아비딘 분자, 스트렙타비딘 분자, 항원(예컨대, FLAG 또는 HA 에피토프와 같은 에피토프 태그), 합텐(예컨대, 바이오틴, 피리독살, 디곡시게닌 플루오레세인 및 디니틀페놀), 항체, 항체 단편, 마이크로비드 등과 같은 검출가능한 표지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 항체 단편은 Fab, F(ab)2, Fd 및 CDR3 영역을 포함하는 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은 FRET 쌍을 형성하는, 공여체 및 수용체 형광단 각각과 접합한다. FRET는 예를 들면, 특수한 제2 항체가 이것이 결합하는 분석물의 실체와 상관없이 결합되는지를 측정하기 위한 배열 양식으로 사용된다. 대안적으로, 제2의 결합 파트너는 제1 항체 파트너의 표지없이 직접 표지될 수 있다. 제2 결합 파트너의 표지는 또한 이에 부착된 핵산의 배향을 확립하는데 유용하다. FRET 만이 일반적으로 하나의 여기 공급원(및 따라서 파장) 및 일반적으로 하나의 검출인자만을 필요로 한다 검출인자는 공여체 또는 수용체 형광단의 방출 스펙트럼으로 설정될 수 있다. 이는 FRET가 공여체 형광성의 퀀칭에 의해 검출되는 경우 공여체 형광단 방출 스펙트럼으로 설정된다. 대안적으로, 이는 FRET가 수용체 혈광단에 의해 검출되는 경우 수용체 형광단 방출 스펙트럼으로 설정된다. 일부 구현예에서, 공여체 및 수용체 둘 다의 FRET 방출은 검출될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 공여체는 편광으로 여기되고 방출 스펙트럼 둘 다의 편광화가 검출된다.
일 구현예에서, 검출가능한 표지는 FRET-계 검정과 혼용성이다. FRET는 FRET 형광단 쌍의 사용을 필요로 한다. FRET 형광단 상은 FRET가 서로 근접하여 위치하는 경우 검출가능한 시그널을 생산하거나 제거할 수 있는 2개의 형광단이다. 공여체의 예는 Alexa 488, Alexa 546, BODIPY 493, Oyster 556, Fluor (FAM), Cy3 및 TMR (Tamra)를 포함한다. 수용체의 예는 Cy5, Alexa 594, Alexa 647 및 Oyster 656을 포함한다. Cy5는 예로서, 공여체로서의 Cy3, TMR 또는 Alexa 546과 함께 작업한다. FRET는 서로로부터 50-100 nm에서 이격된 형광성 막시마를 갖는 어떠한 형광단 쌍과 함께 존재할 수 있다.
기질은 본원에 논의된 바코드 표지외에 서열 비-특이적인 방식으로 표지될 수 있다. 예를 들면, 중합체가 DNA와 같은 핵산인 경우, 이의 골격은 골격 표지로 염색될 수 있다. 서열 비-특이적인 방식으로 핵산을 표지하는 골격 염색의 예는 페난트리딘 및 아크리딘(예컨대, 아티디움 브로마이드, 프로피디움 요오다이드, 헥시디움 요오다이드, 디하이드로에티디움, 에티디움 단독이량체-1 및 -2, 에티디움 모노아지드, 및 ACMA); 인돌 및 이미다졸(예컨대, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 및 DAPI)과 같은 마이너 그로브 결합제(minor grove binder); 및 아크리딘 오렌지(또한 인터컬레이팅할 수 있음), 7-AAD, 악티노마이신 D, LDS751, 및 하이드록시스틸바미딘과 같은 기타 핵산 염료와 같은 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)를 포함한다. 전술한 핵산 염료 모두는 Molecular Probes와 같은 공급업자로부터 상업적으로 이용가능하다.
핵산 염료의 여전히 다른 예는 Molecular Probes로부터의 다음 염료를 포함한다: SYTOX BLUE, SYTOX GREEN, SYTOX ORANGE, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, PICOGREEN, OLIGREEN, RIBOGREEN, SYBR GOLD, SYBR GREEN I, SYBR GREEN II, SYBR DX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45 (청색), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25 (녹색), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85 (오렌지색), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60, -63 (적색)과 같은 시아닌 염료.
일부 구현예에서, 리포터 분자는 발색단 또는 형광단을 포함한다. 추가의 구현예에서, 발색단은 아조 모이어티, 니트로 모이어티, 트리아릴메탄 모이어티, 메틴, 안트라퀴논, 폴리엔 모이어티, 또는 프탈로시아닌이다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 염료이다. 염료는 로다민, 쿠마린, 시아닌, 크산텐, 폴리메틴, 피렌, 디피로메텐 보로디플루오라이드, 나트탈이미드, 피코빌리단백질, 페리디늄 클로로필 단백질, 이의 접합체, 및 이의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지 않는 것으로 고려된다. 염료의 비-제한적 예는 플루오레세인, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드, 캘리포니아 레드(California Red), iFluor594, 테트라메틸로다민, 카복시로다민, 카복시로다민 6F, 카복시로돌, 카복시로다민 110, 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), 캐스캐이드 옐로우(Cascade Yellow), 쿠마린, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, Cy-크롬(Chrome), DyLight 350, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800, 피코에리트린, PerCP (레리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE (6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인), NED, ROX (5-(및-6-)-카복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Alexa Fluor® 350, Alex Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, 이의 접합체, 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 디메틸아미노아조벤젠설폰산(답실) 또는 답실 유도체이다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 플루오레세인, 플루오레세인 유도체, 또는 플루오레세인-함유 화합물이다.
일부 구현예에서, 리포터 분자는 지질이다. 일부 구현예에서, 액체는 합성 인지질 유도체이다. 일부 구현예에서, 합성 인지질 유도체는 DDPC, DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, POPC, 또는 DEPC이다. 일부 구현예에서, 합성 인지질 유도체는 DLPC, DMPC, 또는 DPPC이다. 일부 구현예에서, 합성 인지질 유도체는 DLPC이다. 일부 구현예에서, 합성 인지질 유도체는 DMPC이다. 일부 구현예에서, 합성 인지질 유도체는 DPPC이다.
일부 구현예에서, 리포터 분자는 효소와 접촉시 상처 드레싱 물질로부터 절단되는 검출가능한 단편 속에 포함된다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 효소와 접촉시 상처 드레싱 물질로부터 절단되는 검출가능한 단편 속에 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 나안으로 가시화된다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 UV 광 하에서 가시화된다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 형광성 램프를 사용하여 가시화된다.
화학식 I의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, R은 임의로 퀀처 단편을 임의로 포함한다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 형광으로부터 리포터 분자를 방지한다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 보호 그룹이다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 아세테이트 그룹이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 효소에 대한 표적 서열을 함유하는 개질된 상처 드레싱 물질이 본원에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 효소-촉매된 절단은 검출가능한 단편을 방출한다. 검출가능한 단편은 리포터 분자를 포함할 수 있다. 검출가능한 단편의 수준의 정량적 또는 정성적 측정은 상처내 감염의 존재 또는 부재의 측정을 가능하도록 한다.
일부 구현예에서, 효소-촉매된 절단은 검출가능하지 않은 단편을 방출한다. 일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질과의 효소 상호작용은 퀀쳐 단편을 절단하며 리포터 분자가 상처 드레싱 물질에 결합하여 형광을 띄도록 한다. 형광의 정성적 또는 정량적 측정은 상처에서 감염의 존재 또는 부재의 측정을 가능하도록 한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 프로테아제에 대한 표적 서열을 함유하는 펩타이드-개질된 상처 드레싱 물질이 본원에 개시되어 있다. 프로테아제-촉매된 절단은 검출가능한 펩타이드 단편을 방출한다. 검출가능한 펩타이드 단편은 리포터 분자를 포함한다. 검출가능한 펩타이드 단편의 수준의 정성적 또는 정량적 측정은 상처내에서 상승된 프로테아제의 존재 또는 부재의 측정을 가능하도록 한다.
일부 구현예에서, 효소-촉매된 절단은 검출가능하지 않은 단편을 방출한다. 일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질과의 효소 상호작용은 퀀처 단편을 절단하여 리포터 분자 상처 드레싱 물질에 결합하여 형광성이 되도록 한다. 형광성의 정성적 또는 정량적 측정은 상처에서 감염의 존재 또는 부재의 측정을 가능하도록 한다.
화학식 I의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, R은 퀀처(quencher) 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 형광으로부터 리포터 분자를 방지한다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 보호 그룹이다. 일부 구현예에서, 퀀쳐 단편은 아세테이트 그룹이다. 화학식 I의 상처 드레싱 물질의 일부 구현예에서, R은 친핵성 반응 생성물인 화학적 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, R은 말레이미드-티올 첨가물을 포함한다. 일부 구현예에서, R은 할로아세트아미드-티올 접합 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, R은 할로아세트아미드 접합 생성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 Ia의 구조를 갖는다:
[화학식 Ia]
Figure pct00017

화학식 Ia에서, R은 리포터 분자를 포함하는 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30이상이며; n은 이들 사이의 모든 일원화된 값, 예를 들면, 201, 202, 203 등을 포함하는, 200 내지 4000으로부터 선택된 정수, 예컨대, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다. 일부 구현예에서, R은 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 Ib의 구조를 갖는다:
[화학식 Ib]
Figure pct00018

화학식 Ib에서, R은 리포터 분자를 포함하는 영역이고; n은 이들 사이의 모든 일원화된 값, 예를 들면, 201, 202, 203 등을 포함하는, 200 내지 4000으로부터 선택된 정수, 예컨대, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다. 일부 구현예에서, R은 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 IIa의 구조를 갖는다:
[화학식 IIa]
Figure pct00019

화학식 IIa에서, M은 셀룰로즈, 화학적으로 개질된 셀룰로즈, 펙틴, 알기네이트, 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이의 어떠한 조합으로부터 선택된 겔-형성 중합체이고; PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이며; L은 M 및 PEP를 연결하는 링커이고, 여기서 L은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 소단위 또는 폴리프로필렌 소단위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 IIb의 구조를 갖는다:
[화학식 IIb]
Figure pct00020

상기 화학식 IIb에서, PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 이상이며; n은 200 내지 4000으로부터 선택된 정수이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 IIc의 구조를 갖는다:
[화학식 IIc]
Figure pct00021

화학식 IIc에서, PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 이상이며; n은 이들 사이의 모든 일원화된 값, 예를 들면, 201, 202, 203 등을 포함하는, 200 내지 4000으로부터 선택된 정수, 예컨대, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다.
조성물:
본원에 기술된 구현예는 또한 화학식 I 또는 화학식 II를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 통상의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
일단 제형화되면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물의 수득되는 스톡(stock) 조성물은 통상의 방법, 예컨대, 담체, 젤화제, 연화제, 표면활성제, 습윤제, 유화제 등을 사용하여 바람직한 형태, 예컨대, 겔, 향유, 로션, 크림, 페이스트 등으로 제조할 수 있다. 예컨대, 제WO 2011/126384호 및 제WO 2013/004953호를 참고하며, 이는 참고로 포함된다.
조성물에 사용하기 위한 담체는 물, 글리세린, 디글리세린, 글리세린 유도체, 글리콜, 글리콜 유도체, 당, 에톡실화된 및/또는 프로폭실화된 에스테르 및 에테르, 우레아, 나트륨 PCA, 아로올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 담체는 프로필렌 글리콜이다. 전형적으로 조성물은 담체를 조성물의 약 1 중량% 내지 조성물의 약 99.9중량%, 보다 전형적으로 조성물의 약 2중량% 내지 조성물의 약 95중량%, 및 보다 전형적으로 조성물의 약 5중량% 내지 조성물의 약 90중량%를 함유한다.
열-가역성 겔화제는 50℃와 같은 승온에서 친수성 담체 속에서 가용성, 부분적으로 가용성, 또는 혼화성인 성분으로서 정의되며, 여기서 제제는 25℃로 냉각하는 경우 담체를 점성이 되도록 하는 능력을 지니나, 기질에 대한 적용이 필요한 경우 50℃에서 점성이 아닐 수 있는 능력을 갖는다. 적합한 친수성 담체는 물, 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜을 포함한다. 조성물에서 사용하기 위한 열-가역성 겔화제는 나트륨 스테아레이트, 나트륨 팔미테이트, 칼륨 스테아레이트와 같은 지방 산의 염을 포함할 수 있다. 이들 염은 조성물에 가해질 수 있거나 지방산을 첨가하고 적절한 염기로 중화함으로써 반응계내에서 생성될 수 있다. 조성물의 반응계내 생성이 예는 스테아르산 및 수산화나트륨을 제공하여 나트륨 스테아아레이트를 생산하는 것이다. 다른 일반적인 헤르모스-가역성 겔화제(hermos-reversible gelling agent)는, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 및 PEG-20, PEG-150 디스테아레이트, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라스테아레이트, 디스테아레쓰-75 IPDI, 디스테아레쓰-100 IPDI, 지방 알코올, 예컨대, 세틸 알코올과 같은 유도체, 스테아르산, 하이드록시스테아르산과 같은 지방산 및 이의 유도체, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
담체 및 헤르모스-가역성 겔화제 외에도, 조성물은 다양한 다른 성분 및 요소를 함유할 수 있다. 조성물내에 포함될 수 있는 다른 성분의 예는 연화제, 스테롤 또는 스테롤 유도체, 천연 및 합성 지방 또는 오일, 점도 향상제, 유동학 개질제, 폴리올, 표면활성제, 알코올, 에스테르, 실리콘, 점토, 전분, 셀룰로즈, 입자화물, 습윤제, 필름 형성제, 슬립 개질제(slip modifier), 표면 개질제, 피부 보호제, 습윤제, 자외선차단제 등이다.
약제학적 조성물 및/또는 제제:
본원에 기술된 구현예는 또한 하나 이상의 전술한 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및/또는 제제에 관한 것이다. 어구 "약제학적으로 허용되는"은 본원에서 화합물, 염, 조성물, 투여량 형 등을 지칭하기 위해 본원에 사용되며 - 이는 적절한 의학적 판단 영역내에서 - 충분한 이점/위험비에 비례하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증없이 사람 및/또는 다른 포유동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하다. 일부 국면에서, "약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 포유동물(예컨대, 동물), 및 보다 특히 사람에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되어 있음을 의미한다.
약제학적 조성물은 당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 수단에 의해서도 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 예는 (a) 국소 적용, 예컨대, 물품(예컨대, 거즈, 패드, 면봉, 드레싱), 크림, 연고, 겔, 로션 등; (b) 비경구 투여, 예컨대, 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사; (c) 경구 투여, 외부 적용(예컨대, 수성 및 비-수성 용액 또는 현탁액을 포함하는 드렌치(drench), 정제, 환제, 산제, 과립제, 사료와 혼합하기 위한 펠렛, 혀 적용을 위한 페이스트 등을 위해 채택된 것들을 포함한다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항생제" 또는 "항미생물제"는 미생물의 성장을 억제하거나 이를 파괴하는 물질을 지칭한다. 바람직하게는, 항생제는 감염제의 발병력을 억제하고/하거나 감염성 질환을 치료하는데 유용하다. 항생제는 또한 반-합성 물질을 지칭하며, 여기서 미생물, 예컨대, 효모 또는 진균에 의해 생산된 천연 형태가 구조적으로 개질되어 있다.
바람직하게는, 항생제는 β-락탐(β-락타마제 억제제 및 세팔로스포린 포함), 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 테트라사이클린 및/또는 글리실사이클린 및/또는 폴리믹신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 항생제의 어떠한 조합도 임의로 아미노글리코시드 등과 함께 사용될 수 있는데, 예컨대, 임의로 아미노글리코사이드 등과 함께, 적어도 하나의 β-락탐 및 적어도 하나의 플루오로퀴놀론; 적어도 하나의 아미노글리코시드 및 하나의 세팔로스포린; 적어도 하나의 β-락탐 및 하나의 β-락탐 억제제를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "β-락탐" 억제제는 천염 및 반-합성 페니릴린 및 페니실린 유도체, 예컨대, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린(페니실린 G), 페녹시메틸페니실린(페니실린 V), 프로카인 페니실린 및 옥사실린; 메티실린, 디클록산실린 및 플루클록사실린; 테목실린; 아목실클린 및 암피실린; 아즐로실린, 카르베니실린, 티카르실린, 메즐로실린 및 피페라실린; 베아페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 이미페넴, 메로페넴, 파니페넴 및 PZ-601; 세팔렉신, 세팔로틴, 세파졸린, 세파클로르, 세푸록심, 세파만돌, 세포테탄, 세폭시틴, 세포탁심, 및 세프포독심; 세페핌 및 세프피롬; 세파드록실, 세픽심, 세프프로질, 세팔렉신, 세팔로틴, 세푸록심, 세파만돌, 세페핌 및 세프리롬; 세폭시틴, 세포테탄, 세프메타졸 및 프로목세프; 티게모남, 노카르디신 A 및 타브톡신; 클라불란산, 목살락탐 및 플로목세프를 포함한다. 플루오로퀴놀론은 시프로플록사신, 가레녹사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 레보플록사신, 및 목시플록사신을 포함한다. 아미노글리코시드는 예컨대, 가나마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 겐타마이신, 시소마이신, 네틸마이신, 네오마이신 B, 네오마이신 C, 네오마이신 E (파로모마이신) 및, 합성 유도체 클라리트로마이신 및 아지트로마이신을 포함하는, 스트렙토마이신을 포함한다. 테트라사이클린은 천연적으로 존재하는 화합물(예컨대, 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린) 또는 반-합성제(예컨대, 라이메사이클린, 메클로사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 롤리테트라사이클린)을 포함한다. 글리사이클린(예컨대, 미노사이클린/티게사이클린)은 테트라사이클린으로부터 유도된다. 폴리믹신은 예컨대, 폴리믹신 B 및 폴리믹신 E(콜리스틴)을 포함한다.
특정의 구현예에서, 조성물은 항생제를 0.1 mg/mL, 0.5 mg/L, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL 44 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/m, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL 이상의 농도로 포함한다. 예를 들면, 이미페넴 및 에르타페넴은 50, 30, 20, 15, 10, 5 및 1 mg/mL의 농도로 사용될 수 있다.
상처 드레싱:
특정의 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질, 예컨대 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 상처 드레싱이 본원에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 상처 드레싱은 본원에 기술된 바와 같은 상처 드레싱 물질, 예컨대, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 상처 드레싱은 생적합성, 생분해성, 비-면역원성일 수 있으며 용이하게 상업적으로 이용가능하다.
일 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물은 임의로 의약을 함유하는, 섬유 입자 또는 분말 입자와 같은 입자의 형태로 제공된다. 특히, 물질은 바람직하게는 CMC 섬유를 함유한다.
조성물은 바람직하게는 드레싱 물질 및 다른 화합물의 친밀한 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 일 구현예에서, 친밀한 혼합물은 드레싱 물질과 용매와 같은 적합한 비히클(vehicle)의 분산액, 또는 이러한 용액 또는 분산액을 제거함으로써 생산된 고체 조성물을 포함한다. 이러한 구현예하에서, 드레싱 물질은 물질의 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 90% 또는 이상의 중량%의 물질을 포함한다. 특정의 바람직한 구현예에서, 물질은 드레싱 물질로 필수적으로 이루어진다.
물질의 다른 성분은 0 내지 25중량%, 예를 들면 약 1 내지 약 20중량%의 하나 이상의 다른 생적합성 다당류, 예를 들면, 알긴산나트륨 또는 알긴산칼슘과 같은 알기네이트, 나트륨 전분 글리콜레이트와 같은 전분 유도체, 메틸 셀룰로즈 또는 카복시메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 유도체, 또는 하이알루론산 또는 이의 염과 같은 글리코스아미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트 또는 헤파란 설페이트를 포함할 수 있다. 물질은 또한 약 25중량%, 예를 들면, 약 1 내지 약 20중량%의, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는 단백질은 콜라겐을 포함하며, 보다 바람직하게는 이는 필수적으로 콜라겐으로 이루어진다. 물질은 또한 약 20중량% 이하, 바람직하게는 약 2% 내지 약 10중량%의 물을 포함할 수 있다. 물질은 또한 0 내지 40중량%, 예를 들면, 약 5 내지 약 25중량%의 가소제, 바람직하게는 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 다가 알코올을 포함할 수 있다.
특정의 구현예에서, 물질은 또한 약 10중량% 이하, 예를 들면 약 0.01 내지 약 5중량%, 전형적으로 약 0.1 내지 약 2중량%의 비-스테로이드성 소염 약물(예컨대, 아세트아미노펜), 스테로이드, 국소 마취제, 항미생물제, 또는 성장 인자(예컨대, 섬유아세포 성장 인자 또는 혈소판 유래한 성장 인자)와 같은 하나 이상의 치료학적 상처 치유제를 포함할 수 있다. 항미생물제는 예를 들면, 소독제, 항생제, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 항생제는 테트라사이클린, 페니실린, 테라마이신, 에리트로마이신, 박시트라신, 네오마이신, 폴리마이신 B, 무피로신, 클린다마이신 및 이의 혼합물을 포함한다. 바람직한 소독약은 콜로이드성 은을 포함하는 은, 물질을 구성하는 하나 이상의 음이온성 중합체의 염을 포함하는 은 염, 은 설파디아진, 클로르헥시딘, 포비돈 요오드, 트리클로산, 수크랄페이트, 4급 암모늄 염 및 이의 혼합물을 포함한다. 본 발명에 따른 이들 의약처리된 상처 드레싱은 사용시 상처 드레싱 물질이 파되되면서 치료제의 지속적인 방출을 제공한다.
상술한 퍼센트 모두는 무수 중량 기준이다. 바람직하게는, 상처 드레싱 물질 대 다른 보조제 및 물질의 중량비는 약 1:99 내지 약 99:1이다. 보다 바람직하게는, 상기 중량비는 약 1:9 내지 약 9:1의 범위이고, 보다 바람직하게는 이는 약 4:1 내지 약 1:4의 범위, 여전히 보다 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:2의 범위이다.
물질은 분말, 미세구, 플레이크(flake), 매트(mat) 또는 필름과 같은 어떠한 편리한 형태일 수 있다.
특정의 구현예에서, 물질은 국소 적용을 위한 반고체 또는 연고의 형태이다.
특정의 구현에에서, 물질은 만성 상처에 적용하기 위한 동결-건조되거나 용매-건조된 생흡수성 스폰지이 형태이다. 바람직하게는, 스폰지의 평균 공극 크기는 10 내지 500 μm, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300μm의 범위이다. 적합한 스폰지는 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을, 적합한 치료제와 함께 포함하는 수성 분산액을 동결-건조시키거나 용매 건조시켜 제조하였다.
여전히 다른 구현예에서, 물질은 굴곡성 필름의 형태이며, 이는 연속적이거나 차단(예컨대, 천공)될 수 있다. 굴곡성 필름은 바람직하게는 가소제를 포함함으로써, 글리세롤과 같이 이것이 굴곡성이도록 한다.
조절가능한 특성의 범위를 갖는 겔 형성 중합체, 예컨대, 셀룰로즈 유도체 둘 다의 용이한 이용가능성은 본 기술에 개시된 조성물의 특성이 예외적인 정도까지 조절될 수 있음을 의미한다. 특히, 물질의 생물학적 흡수 속도, 다공성 및 밀도는 조절될 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 조성물의 활성 층을 포함하는, 시이트(sheet) 형태의 상처 드레싱 물질이다. 활성 층은 일반적으로 사용시 상처 접촉 층일 수 있지만, 일부 구현예에서 이는 액체-투과성 상단 시이트에 의해 상처로부터 분리될 수 있다. 일 구현예에서, 활성 층의 부위는 약 1 cm2 내지 약 400 cm2, 특히 약 4 cm2 내지 약 100 cm2의 범위이다.
다른 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 또한 활성 층의 측면에 접하는 상처에 대해 반대쪽의 활성 층 위에 확장된 배면 시이트를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 배면 시이트는 활성 층보다 더 커서, 너비가 1 mm 내지 50 mm, 바람직하게는 5 mm 내지 20 mm인 가장자리 영역이 활성 층 주변으로 확장되어 소위 섬 드레싱(island dressing)을 형성하도록 한다. 이러한 경우에, 배면 시이트는 바람직하게는 적어도 이의 가장자리 영역에서 감압성 의약 등급의 접착제로 피복된다.
드레싱 물질이 배면 시이트를 포함하는 구현예에서, 배면 시이트는 실질적으로 액체-투과성이다. 다른 구현예에서, 배면 시이트는 투과성이며, 예컨대, 배면 시이트는 바람직하게는 물, 증기에 대해 투과성이지만, 액체 물 또는 상처 삼출물에 대해서는 투과성이 아니다. 바람직하게는, 배면 시이트는 또한 미생물-불투과성이다. 적합한 연속 형성가능한 배면 시이트는 바람직하게는 37.5℃에서 100% 내지 10%의 상대 습도 차이에서 300 내지 5000 g/m2/24 hrs, 바람직하게는 500 내지 2000 g/m2/24 hrs의 배면 시이트 만의 습윤 증기 투과율(MVTR)을 갖는다. 배면 시이트 두께는 바람직하게는 10 내지 1000 마이크로미터, 보다 바람직하게는 100 내지 500 마이크로미터이다.
전체로서 드레싱의 MVTR은 천공된 시이트가 부분적으로 드레싱을 통한 습윤 전달을 파괴하므로 백킹 시이트 단독보다 더 낮다.
배면 시이트를 형성하기에 적합한 중합체는 폴리우레탄 및 폴리알콕시알킬 아크릴레이트 및 메타크릴레이트이다. 바람직하게는, 배면 시이트는 주로 밀폐된-셀(closed-cell)인 고 밀도 차단된 폴리우레탄 발포체의 연속 층을 포함한다. 적합한 배면 시이트 물질은 폴리우레탄 필름이다.
접착제를 포함하는 백킹 층(backing layer)을 포함하는 상처 드레싱에서, 접착 층은 습윤 증기 투과성이고/이거나 패턴이어서 수증기의 통과를 허용하여야 한다. 접착 층은 바람직하게는 섬-형 상처 드레싱(island-type wound dressing)에 편리하게 사용된 유형의 연속적인 습윤 증기 투과성, 감압성 접착 층, 예를 들면, 아크릴레이트 에스테르 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르 및 폴리우레탄을 기반으로 한 감압성 접착제이다. 폴리우레탄-계 감압성 접착제가 선택적으로 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 드레싱은 또한 활성 층과 보호 시이트 사이에 구축될 수 있는 다층 흡수성 물품의 추가 층을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들 층은 구멍이 있는 플라스틱 필름을 포함함으로써 사용시 활성 층에 대한 지지체를 제공하며, 여기서 필름 속의 구멍은 바람직하게는 하이드로겔 층 속의 틈이 맞춰지도록 정렬된다.
여전히 추가로, 다른 구현예에서, 드레싱은 특히 드레싱이 삼출되는 상처에 사용하기 위한 경우, 활성 층과 보호 시이트 사이에 흡수성 층을 포함할 수 있다. 임의의 흡수성 층은 거즈, 부직포, 초흡수제, 하이드로겔 및 이의 혼합물을 포함하는, 상처 치유 분야에서 상처 유액, 혈청 또는 혈액을 흡수하기 위해 편리하게 사용된 층 중의 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 흡수성 층은 개방 셀의 친수성 폴리우레탄 발포체와 같은 흡수성 발포체의 층을 포함한다. 다른 구현예에서, 흡수성 층은 부직 섬유상 웹(web), 예를 들면, 점성 스테이플 섬유(stable fiber)의 카딩된 웹(carded web)일 수 있다.
특정 구현예에서, 상처 드레싱은 제거가능한 커버 시이트에 의해 보호될 수 있다. 커버 시이트는 일반적으로 굴곡성 열가소성 물질로부터 형성된다. 적합한 물질은 폴리에스테르 및 폴리올레핀을 포함한다. 바람직하게는, 커버 시이트의 접착제와 접하는 표면은 이형 표면(release surface)이다. 다시 말해서, 이 표면은 배면 시이트 상의 활성 층과 접착제에 대해서만 약하게 접착하여 커버 시이트로부터 하이드로겔 층의 박리를 보조한다. 예를 들면, 커버 시이트는 플루오로중합체와 같은 비-접착성 플라스틱으로부터 형성될 수 있거나 이는 실리콘 또는 플루오로중합체 이형 코팅과 같은 방출 코팅과 함께 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 상처 드레싱은 미생물-불투과성 용기 속에서 멸균되고 포장된다.
키트(kit):
특정의 구현예에서, 개시된 기술은 하나의 또는 별도의 구획 속에 임의로 부형제, 담체 또는 오일과 함께, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 또한 추가의 성분, 예컨대, 겔화제, 연화제, 표면활성제, 습윤제, 점도 향상제, 유화제 등을 하나 이상의 구획 속에 포함한다. 키트는 임의로 상처, 예컨대, 만성 또는 감염된 상처를 진단, 검출 또는 치료하기 위한 물품을 제형화하는 지시사항을 포함할 수 있다. 키트는 또한 상처의 치료시 개별적으로 또는 함께, 성분을 사용하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다.
관련된 구현예에서, 개시된 기술은 상술한 조성물을 포함하는 적어도 하나의 흡수성 물품(상술한 바와 같음)을 포함하는 키트를 포함한다. 또한, 키트는 임의로 포장 속에 또는 포장과 함께 사용가능한 제2 정보와 함께, 개개 성분을 별도로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 다른 구현예는 상처의 치료를 위한 드레싱의 제조용 조성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상처는 만성 상처, 예를 들면, 정맥 궤양, 와위 궤양(decubitis ulcer) 및 당뇨병성 궤양으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처이다.
표면:
개시된 기술의 구현예는 또한 상술한 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 표면을 제공하며, 여기서 리포터(reporter) 또는 펩타이드가 배향되어 파트너, 예컨대, 효소에 대한 결합을 허용한다. 바람직하게는, 표면은 지지체의 표면이다. 다수 및 다양한 고체 지지체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 유용한 고체 지지체는 한천, 아가로즈, 가교-결합된 알긴산, 특히 질산 및 카복실산과 치환된 및 가교결합된 구아 검, 셀룰로즈 에스테르, 혼합된 셀룰로즈 에스테르, 및 셀룰로즈 에테르와 같은 천연 중합체 탄수화물 및 이들의 합성적으로 개질되거나, 가교-결합되거나 치환된 유도체; 가교결합되거나 개질된 젤라틴을 포함하는, 단백질 및 유도체와 같은, 질소를 함유하는 천연 중합체; 라텍스 및 고무와 같은 천연 탄수화물 중합체; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐아세테이트 및 이의 부분적으로 가수분해된 유도체, 폴리아크릴 아미드, 폴리메타크릴레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드와 같은 다른 중축합물, 및 폴리우레탄 또는 폴리에폭사이드와 같은 다른 중합체의 공중합체 및 테르중합체를 포함하는, 비닐 중합체와 같은 적합한 다공성 구조로 제조될 수 있는 합성 중합체; 황화바륨, 황화칼슘을 포함하는 알칼리 토금속 및 마그네슘의 설페이트 또는 카보네이트, 알칼리 및 알칼리 토금속, 알루미늄 및 마그네슘의 실리케이트; 및 점토, 알루미나, 활석, 카올린, 제올라이트, 실리카 겔, 또는 유리와 같은 알루미늄 또는 규소 산화물 또는 수화물(이들 물질은 상기 중합체 물질과 함께 필터로서 사용될 수 있다); 및 기존의 천연 중합체 위에 합성 중합체의 중합을 개시함으로써 수득된 그래프트 공중합체와 같은, 상기 부류의 혼합물 또는 공중합체를 포함한다.
일 구현예에서, 지지체는 배열 플레이트의 웰(well), 예컨대, 미세배열이다. 이러한 배열을 구축하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, Cao et al., Appl Environ Microbiol., 77(23): 8219-8225, 2011). 각각의 화학식 I의 화합물(또는 펩타이드 지표 단독)은 3회 스폿팅되어 배열내 물리적 결함으로 인한 불규칙적인 데이타를 제거할 수 있다.
시스템:
개시된 기술의 구현예는 상술한 조성물 및/또는 키트를 포함하는 진단 시스템을 추가로 제공한다.
진단 시스템의 다양한 성분은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 화학식 I의 화합물 (예컨대, 펩타이드 리포터를 함유하는 화합물)은 동결건조된 시약으로서 제공될 수 있다. 이들 동결건조된 시약은 동결건조 전에 예비-혼합됨으로써 재구성되는 경우 이들은 검정시 사용하도록 준비된 성분 각각의 적절한 비를 지닌 완전한 혼합물을 형성한다. 또한, 개시된 기술의 진단 시스템은 키트의 시약을 재구성하기 위한 재구성 시약을 함유할 수 있다.
본원에 기술된 구현예는 또한 LC 검출 시스템에 관한 것이다. LC 검출 시스템은 검출 방법으로서 5CB 액정(LC의 정렬에 있어서의 변화의 모니터링을 이용한다. 이러한 LC 검출 시스템이 CMC 구조에 맞도록 하기 위하여, 지질을 절단할 수 있는 펩타이드 서열의 부분에 가한다. 지질은 방출되면 5CB내 정렬 변하를 유발할 수 있다. 5CB의 정렬은 교차 편광 렌즈를 통해 검출될 수 있으며 암색에서 연한 색으로 색상 변화를 나타내고; 시스템은 사용 시점까지 정확한 정렬에서 LC의 오염을 포함하며 또한 검출 및/또는 가시화를 위한 교차된 편광 렌즈 및 현미경의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱은 하기 화학식 Ia의 구조를 갖는 상처 드레싱 물질을 포함한다:
[화학식 Ia]
Figure pct00022

상기 화학식 Ia에서, R은 리포터 분자를 포함하는 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; n은 200 내지 4000으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다. 일부 구현예에서, R은 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 Ib의 구조를 갖는 상처 드레싱 물질을 포함한다:
[화학식 Ib]
Figure pct00023

상기 화학식 Ib에서, R은 리포터 분자를 포함하는 영역이고; n은 200 내지 4000으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다. 일부 구현예에서, R은 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이다. 일부 구현예에서, R은 리포터 분자 및 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이다.
또 다른 구현예에서, 화학식 II의 구조를 갖는 상처 드레싱 물질을 포함하는 상처 드레싱이 본원에 제공된다:
[화학식 II]
Figure pct00024

상기 화학식 II에서, M은 겔-형성 중합체이고; PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이며; L은 M 및 PEP를 연결하는 링커이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱은 화학식 IIa의 구조를 갖는 상처 드레싱 물질을 포함한다;
[화학식 IIa]
Figure pct00025

상기 화학식 IIa에서, M은 셀룰로즈, 화학적으로 개질된 셀룰로즈, 펙틴, 알기네이트, 키토산, 개질된 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, CES, 산화된 셀룰로즈(또는 이의 유도체) 또는 이의 어떠한 조합으로부터 선택된 겔-형성 중합체이고; PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이며; L은 M 및 PEP를 연결하는 링커이고, 여기서 L은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 소단위 또는 폴리프로필렌 소단위를 포함한다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 IIb의 구조를 갖는다:
[화학식 IIb]
Figure pct00026

상기 화학식 IIb에서, PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이며; n은 200 내지 4000로부터 선택된 정수이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500으로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다.
일부 구현예에서, 상처 드레싱 물질은 화학식 IIc의 구조를 갖는다:
[화학식 IIc]
Figure pct00027

화학식 IIc에서, PEP는 리포터 분자 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 펩타이드 영역이고; m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이며; n은 200 내지 4000으로부터 선택된 정수이다. 추가의 구현예에서, n은 300 내지 3500로부터 선택된 정수이다. 여전히 추가의 구현예에서, n은 400 내지 3200으로부터 선택된 정수이다.
화학식 I 또는 화학식 II의 화합물의 제조 방법:
본원에 제공된 구현예는 또한 이의 전구체를 포함하는 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 용어 "전구체"는 중간 또는 최종 생성물을 생성하기 위한 반응제로서 사용되는 어떠한 화합물도 포함한다.
일 구현예에서, 겔-형성 중합체와 리포터 분자를, 예컨대, 공유 결합을 통해 접합시킴을 포함하는, 구조 M-R(여기서, M은 셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈 (CMC), 산화된 셀룰로즈(또는 이의 유도체), 셀룰로즈 에틸 설포네이트 (CES), 펙틴, 알기네이트, 키토산, 개질된 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이의 어떠한 조합 또는 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 잔량체를 포함하는 겔-형성 중합체이고 R은 리포터 영역이다)를 포함하는 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 리포터 R은 앞서 기술한 바와 같은 하이드롤라제, 및 보다 구체적으로 프로테아제와 같은 상처-특이적인 마커, 예컨대, 상처-특이적인 효소이다. 이러한 구현예 하에서, 상처-특이적인 마커에 대한 기질은 예를 들면, 가수분해가능한 기질, 예컨대, 아미노산, 당, 펩타이드, 다당류, 핵산, 지질, 또는 이의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 겔-형성 중합체는 펩타이드, 글리코시드, 아미드, 에스테르, 에테르, 무수물 또는 유사한 연결을 통해 리포터 분자에 접합된다. 본원에 사용된 바와 같은, "펩타이드 결합"은 2개의 아미노산 사이의 축합 반응에 의해 형성되며, 여기서 하나의 산 모이어티는 다른 것의 아미노 모이어티와 반응하여 2개의 아미노산 사이에 펩타이드 결합(-CO-NH-)을 생산한다. 본원에 사용된 바와 같은, "글리코시드 결합"은 사카라이드(또는 사카라이드로부터 유도된 분자)의 헤미아세탈 또는 헤미케탈 그룹과 알코올과 같은 일부 화합물의 하이드록실 그룹 사이에 형성된다. 글리코시드 결합을 함유하는 물질은 글리코시드이다. 용어 '글리코시드'는 이제 연장되어 당의 헤미아세탈(또는 헤미케탈) 그룹과 -SR (티오글리코시드), -SeR (셀레노글리코시드), -NR1R2 (N-글리코시드), 또는 심지어 -CR1R2R3 (C-글리코시드)와 같은 하이드록실 이외의 몇가지 화학 그룹 사이에 형성된 결합을 지닌 화합물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미드"는 --N(R1)--C(=O)-- 또는 --C(=O)--N(R1)--(여기서, R1은 수소 및 다른 그룹을 포함하는 것으로 본원에 정의된다)를 지칭한다. 용어 "치환된 아미드"는 R1이 수소가 아닌 상황을 지칭하는 반면, 용어 "치환되지 않은 아미드"는 R1이 수소인 상황을 지칭한다. 용어 "에스테르"는 산(유기 또는 무기)으로부터 유도된 화학적 화합물을 지칭하며, 여기서 적어도 하나의 하이드록실 그룹은 알콕시 그룹으로 대체된다. 에스테르는 일반 화학식 -C(=O)-OR1 또는 R1-C(=O)-O-(여기서 R1은 본원에서 수소 및 다른 그룹을 함유하는 것으로 정의된다)를 갖는다. "에스테르"의 대표적인 유형은 카복실산, 인산, 포스핀산, 설폰산, 설핀산 및 붕산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 산성 그룹의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 헤테로아르알킬, 사이클로알킬 및 헤테로사이클릴 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "설포닐"은 화학식 ―SO2-알킬 또는 ―SO2-아릴(여기서 "알킬"은 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 모이어티를 갖는 포화된 1가 탄화수소 라디칼을 포함하고, 탄소수가 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 5이다)의 그룹을 나타내고 "아릴"은 그룹 할로겐, 하이드록시, 티올, 아미노, 니트로, 시아노, 아실, 아실옥시, 설포닐, 설피닐, 알킬아미노, 카복시, 에스테르, 에테르, 아미도, 설폰산, 설폰아미드, 알킬티오, 옥시에스테르로부터 독립적으로 선택된 1 내지 5개의 치환체로 임의 치환된, 페닐 또는 나프틸과 같이, 하나의 수소의 제거로 방향족 탄화수소로부터 유도된 유기 라디칼을 포함한다. 용어 "설피닐"은 화학식 ―SO-알킬 또는 ―SO-아릴(여기서 "알킬" 및 "아릴"은 위에서 정의한 바와 같다)의 그룹을 나타낸다. 용어 "설폰아미드"는 화학식 ―SO2NH2의 그룹을 나타낸다. 용어 "옥시에스테르"는 화학식 ―O―COO-알킬, 또는 ―O―COO-아릴(여기서 "알킬" 및 "아릴"은 위에서 정의한 바와 같다)의 그룹을 의미한다. 용어 "에테르"는 화학식 알킬-O-알킬 또는 알킬-O-아릴 또는 아릴-O-아릴(여기서 "알킬" 및 "아릴"은 위에서 정의한 바와 같다)의 그룹을 의미한다. 용어 "아미도"는 화학식 ―CONRR'(여기서 R 및 R'는 수소, "알킬" 또는 "아릴"로부터 독립적으로 선택된다)이 그룹을 의미한다. 용어 "옥시아미도"는 ―O―CONRR'(여기서 R 및 R'는 수소, "알킬" 또는 "아릴"로부터 독립적으로 선택된다)이 그룹을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알콕시"는 ―O-알킬 그룹(여기서 "알킬"은 위에서 정의한 바와 같다)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬티오"는 알킬 그룹(여기서 "알킬"은 위에서 정의한 바와 같다)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "알킬아미노"는 ―NH알킬 또는 ―N(알킬)2 그룹(여기서 "알킬"은 위에서 정의한 바와 같다)을 포함한다.
반응성 모이어티를 접합시켜 글리코시드, 펩타이드, 에스테르, 옥시에스테르, 아미드, 아미도, 옥시아미도, 에테르, 설포닐, 설피닐, 설폰아미드, 또는 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 등과 같은 다른 연결을 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 실시예에서 추가로 기술된다.
다른 구현예에서, 구조 M-L-R(여기서, M 및 R은 각각 앞서 기술한 바와 같고, L은 단량체 또는 중성 중합체의 중합체, 예컨대, 이의 에테르, 아미드, 및 에스테르를 포함하는, 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체인 링커이다)을 포함하는 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, M은 첫번째 에스테르, 옥시에스테르, 아미드, 아미도, 옥시아미도, 에테르, 설포닐, 설피닐, 설폰아미드, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 또는 유사한 연결을 통해 L에 접합된다. 유사하게, 이러한 구현예 하에서 링커 L은 제2의 에스테르, 옥시에스테르, 아미드, 아미도, 옥시아미도, 에테르, 설포닐, 설피닐, 설폰아미드, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 또는 유사한 연결을 통해 리포터 영역 R에 접합된다. 2개의 연결은 동일하거나 상이할 수 있고, 예컨대, M은 에스테르 연결을 통해 L에 접합될 수 있으나 L은 펩타이드 연결을 통해 R에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 구조 M-L-R을 갖는 화학식 I의 화합물은 겔-형성 중합체 M을 링커 L에 우선 접합시켜 전구체 M-L을 생성한 다음 전구체 M-L을 리포터 영역 R과 접합시켜 화학식 I의 화합물을 생성함으로써 합성된다.
대안적으로, 구조 M-L-R를 갖는 화학식 I의 화합물은 링커 L을 리포터 영역 R과 우선 접합시켜 전구체 L-R을 생성하고, 이를 이후에 겔-형성 중합체 M에 접합시켜 화학식 I의 화합물을 생성함으로써 합성된다.
여전히 또한, 구조 M-L-R을 갖는 화학식 I의 화합물은 단일 반응 챔버 또는 다중 반응 챔버 속에서 합성될 수 있다.
화학식 I의 화합물의 합성에 사용된 잠재적인 반응식의 대표적인 레트로신쎄틱(retrosynthetic) 개요는 하기 나타낸다:
레트로신테틱 개요 I
Figure pct00028

진단 및 치료 방법
일 구현예에서, 본원에 기술된 조성물, 드레싱 물질, 물품, 키트 및 시스템은 상처, 특히 만성 또는 감염된 상처를 진단하거나 치료하는데 유용하다. 어떠한 유형의 상처도 진단하고/치료할 수 있지만, 구현예는 특히 삼출되는 상처 유액을 진단하고 치료하는데 적합하다. 예를 들면, 상처는 만성 또는 급성 상처일 수 있다. 만성 상처의 대표적인 예는 예컨대, 정맥 궤양, 욕창, 와위 궤양(decubitis ulcer), 당뇨병성 궤양 및 알려지지 않은 병인학의 만성 궤챵을 포함한다. 급성 상처의 대표적인 예는 의도된 수술적 절개로부터 생성되는 급성 외상성 열상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상처 유액"은 상처의 표면에 존재하거나, 흡입, 흡수 또는 세척에 의해서 상처 표면으로부터 제거된 다른 유액(적합하게는 실질적으로 혈액을 포함하지 않는) 어떠한 상처 삼출액 또는 다른 유액(적합하게는 실질적으로 혈액을 포함하지 않는)을 지칭할 수 있다. 결정, 측정 또는 정량화는 환자의 신체로부터 제거된 상처 유액에서 적합하게 수행되지만, 또한 상체 유액 자체내에서 수행될 수 있다. 용어 "상처 유액"은 보통 상처 부위에서 떨어진 혈액 또는 조직 혈장을 언급하는 것은 아니다. 용어 "상처 유액"은 포유동물 상처 유액, 적합하게는 사람 상처 유액이다.
일 구현예에서, 진단 방법은 상처를 본원에 기술된 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물을 포함하는 적어도 하나의 조성물, 이러한 화합물을 포함하는 드레싱 물질, 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 물품, 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 키트, 또는 이러한 물질 또는 화합물을 포함하는 시스템과 접촉시키는 단계; 및 상처와 관련된 매개변수를 측정하는 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 측정되는 매개변수는 상처-특이적인 하이드롤라제의 수준 또는 활성이다. 특히, 측정되는 매개변수는 하이드롤라제의 활성이다.
전술된 구현예에서, 측정은 반응계내 또는 반응계외에서 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "반응계내"는 주변 환경, 예를 들면, 조성물, 물품, 시스템 또는 장치가 접촉하는 생물학적 물질을 포함하는, 시스템 또는 장치와 관련하여 존재하거나 일어난 공정, 현상, 대상, 또는 성분을 지칭한다. 예로서, 반응계내 반응은 사람 피부 조직(예컨대, 효소를 함유하는 상처 삼출물)에 의해 제공된 성분을 포함하는, 장치(예컨대, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물) 속에 존재하는 다양한 성분의 반응을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 환경의 외부를 지칭하는 반응계외와는 대조적이다.
제2 구현예에서, 측정은 생체외, 예컨대, 분석을 위한 상처로부터 유액을 본 발명의 기구 또는 장치 속에서 제거하여 수행한다.
적합하게는, 측정은 반응계내에서 수행된다.
하나의 진단 구현예에서, 상기 방법은 리포터, 예컨대, 상처-특이적인 효소에 의해 작동하는 기질의 생성물의 수준을 측정함을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 하이드롤라제 효소 생성물의 수준을 측정함을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "측정하는"은 상기 하이드롤라제의 활성 또는 수준의 수치를 측정하는 단계; 활성 또는 수준이 예정된 범위를 초과하거나 미만인지를 확립하고/하거나; 활성 또는 수준의 수치를 대조군 표준과 비교함을 포함한다. 대조군 표준은 상처가 없는 부위로부터 또는 건강한 대상체로부터 수득된 생검 물질 속의 하이드롤라제의 수준 또는 활성을 측정함을 포함할 수 있다.
하나의 구체적인 구현예에서, 용어 "측정하는"은 MMP-1(콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (젤라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자(uPA), 및 라이소자임, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 상처 특이적인 프로테아제의 매개변수(예컨대, 활성 또는 수준)을 측정하고; 상기 매개변수가 제1의 예정된 역치(threshold)를 초과하는지를 확립하고/하거나 매개변수의 수치를 대조군 표준과 비교함을 포함한다. 대조군 표준은 상처가 없는 부위로부터 또는 건강한 대상체로부터 수득된 생검 물질 속에서 프로테아제의 매개변수를 측정함을 포함할 수 있다. 관련된 구현예에서, 용어 "결정하는"은 다수의 상술한 프로테아제와 관련된 매개변수의 칭량 평균(칭량된 합)이 상기 칭량된 평균의 예정된 역치 값을 초과하는지의 여부를 확립함을 포함한다.
하나의 특수한 구현예에서, 매개변수는 상처 유액속에서 분석물(예컨대, 프로테아제)의 활성 수준이다. 전형적으로, 개개 분석물의 활성은 용어 단위/mL로 나타낸다.
다른 구현예에서, 매개변수는 상처 유액 속에서 분석물(예컨대, 프로테아제)의 수준이다. 전형적으로, 용어 양은 또한 특수한 분석물의 활성의 지표이다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "조합된 양" 도는 "조합된 활성"은 다수의 값, 예를 들면, 개개 분석물의 수에 대해 수득된 양에 대한 수학적 함수의 적용으로부터 수득한 단일 수치를 지칭한다. 예를 들면, 용어 "조합된 양" 또는 "조합된 활성"은 개개 값의 그룹의 합 또는 생성물을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "조합된 양" 또는 "조합된 활성"은 개개 값의 그룹의 합에 관한 것이다. 예를 들면, 적합한 구현예에서, 엘라스타제의 양은 엘라스타제-유사 활성(예컨대, U/mL)을 지칭하며 메탈로프로테이나제(MMP)이 양은 각각의 분석물의 총 농도(예컨대, ng/mL)를 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "정량화하는"은 실험 오차의 한계내에서, 샘플 속의 특수한 분석물(들) 또는 기질(들)의 절대 수량을 측정함을 지칭한다.
용어 "마커" 또는 "분석물"은 본원에 정의된 기구, 장치, 키트 또는 방법을 사용하여 확인하거나 측정하는 어떠한 화학적 실체를 지칭한다. 개시된 기술의 기구, 장치, 키트 또는 방법에 의해 측정되거나 확인된 마커 또는 분석물은 전술된 효소의 절단된 생성물이다.
본원에 사용된 경우, 용어 "예정된 범위"는 숙련가가 이해한 데이타 범위 또는 프로파일이 환자의 특수한 소 부류의 지표임을 지칭한다. 예를 들면, 예정된 범위는 항생체 치료요법과 같은 특수한 상처 치료에 대해 잘 반응할 수 있는 상처의 대표적인 데이타 범위 또는 프로파일일 수 있다. 또한, 예정된 범위는 항생제 치료요법과 같은 특수한 상처 치료에 대해 잘 반응하지 않는 상처의 대표적인 데이타 범위를 적합하게 지칭한다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "예정된 역치"는 숙련가가 이해하는 최소 수준이 예를 들면 상기 추가로 설명된 바와 같이, 공지된 치유되는 및 치유되지 않은 상처에 대해 측정된 값의 통게적 분석을 기반으로 한 치유되지 않은 상처의 지표이다. 시험이 임상적으로 유용하게 되기 위해서는, 역치를 적절한 수준으로 설정함으로써 고 프로테아제 활성으로 치유되지 않는 상처를 정확하게 확인하여야 한다. 역치의 증가는 역치를 넘는 치유되지 않은 상처만의 기회를 증가시킬 것이다. 그러나, 역치가 너무 높은 경우, 높은 수준의 프로테아제로 인하여 치유되지 않은 상처가 확인되지 않을 수 있고 임상적으로 이는 이들이 필요한 프로테아제 조절 치료를 수용하지 않을 수 있음을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우, 용어 "대조군 표준" 또는 "대조군"은 다른 데이타 점 또는 데이타 세트를 정의하거나 표준화하기 위하여 참고 또는 비교로서 사용될 수 있는 데이타 세트 또는 프로파일을 지칭한다. 예를 들면, 용어 "대조군" 또는 "대조군 표준"은 특히 환자의 소-부류의 지표인 데이타 세트 또는 프로파일일 수 있다. 적합하게는, 대조군 표준은 치유 또는 비-치유 상태의 데이타 세트 또는 프로파일 지표일 수 있다.
적합하게는, 개시된 기술의 다른 국면 또는 구현예에서, "대조군" 또는 "대조군 표준"은 상처가 항생제 치료요법과 같은 상처 치료에 대해 반응성이거나 비-반응성인 경향이 있는지의 여부를 숙련가가 측정하도록 하는 비교 도구로서 사용될 수 있는 데이타 세트 또는 프로파일일 수 있다. 일 구현예에서, 대조군 표준은 상처 치료에 대해 잘 반응하지 않는 환자의 데이타 세트 또는 프로파일 지표이다. 전형적으로, 대조군 표준은 상처 치료에 대해 잘 반응하는 환자의 데이타 세트 또는 프로파일 지표이다. 본원에 개시된 바와 같이 상처 치료에 잘 반응하는 경향이 있는 환자는 치료에 대해 잘 반응하지 않는 경향이 있는 환자보다 하이드롤라제의 보다 낮은 조합된 양 또는 활성을 나타낸다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이 상처 치료에 대해 잘 반응하는 경향이 있는 환자는 적어도 하나의 상처-특이적인 하이드롤라제의 보다 적은 조합된 양을 나타낸다.
일 구현예에서, 역치 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 활성은 예컨대, 약 6 U/mL, 약 7 U/mL, 약 8 U/mL, 약 9 U/mL, 약 10 U/mL, 약 11 U/mL, 약 12 U/mL, 약 13 U/mL, 약 14 U/mL, 약 15 U/mL, 약 16 U/mL, 약 17 U/mL, 약 18 U/mL, 약 19 U/mL, 약 20 U/mL, 약 21 U/mL, 약 22 U/mL, 약 23 U/mL, 약 24 U/mL, 약 25 U/mL 이상 사이의 모든 값들을 포함하는, 약 5 U/mL 내지 약 30 U/mL이며, 만성 상처 감염을 나타낸다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 활성 단위(U)는 전형적으로 효소 촉매 활성을 기술하기 위해 사용되며, 여기서 단위(U)는 분당 1 마이크로몰(μmole)의 기질의 전환을 촉매하는 효소의 양을 지칭한다. 따라서, 1 효소 단위(U) = 1μmol/min이고, 여기서 μmol은 전환된 기질의 양을 지칭한다.
일 구현예에서, 역치 사람 호중구 엘라스타제 활성은 예컨대, 약 6 U/mL, 약 7 U/mL, 약 8 U/mL, 약 9 U/mL, 약 10 U/mL, 약 11 U/mL, 약 12 U/mL, 약 13 U/mL, 약 14 U/mL, 약 15 U/mL, 약 16 U/mL, 약 17 U/mL, 약 18 U/mL, 약 19 U/mL, 약 20 U/mL, 약 21 U/mL, 약 22 U/mL, 약 23 U/mL, 약 24 U/mL, 약 25 U/mL 이상 사이의 모든 값들을 포함하는, 약 5 U/mL 내지 약 30 U/mL이며, 만성 상처 감염을 나타낸다.
하나의 구체적인 구현에에서, 적어도 9.6의 역치 사람 호중구 엘라스타제 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 22.9 U/mL의 사람 호중구 엘라스타제 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
일 구현예에서, 예컨대, 약 1100 U/mL, 약 1200 U/mL, 약 1300 U/mL, 약 1400 U/mL, 약 1500 U/mL, 약 1600 U/mL, 약 1700 U/mL, 약 1800 U/mL, 약 1900 U/mL, 약 2000 U/mL, 약 2100 U/mL, 약 2200 U/mL, 약 2300 U/mL, 약 2400 U/mL, 약 2500 U/mL, 약 2600 U/mL, 약 2700 U/mL, 약 2800 U/mL, 약 2900 U/mL, 약 3000 U/mL, 약 3250 U/mL, 약 3500 U/mL, 약 3750 U/mL, 약 4000 U/mL, 약 4250 U/mL, 약 4500 U/mL, 약 4750 U/mL, 약 5000 U/mL, 약 5250 U/mL, 약 5500 U/mL, 약 5750 U/mL, 약 6000 U/mL 이상 사이의 모든 값들을 포함하는, 약 1000 U/mL 내지 약 10000 U/mL의 역치 라이소자임 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 하나의 구체적인 구현예에서, 적어도 4800 U/mL의 라이소자임 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
일 구현예에서, 예컨대, 약 15 U/mL, 약 20 U/mL, 약 25 U/mL, 약 30 U/mL, 약 35 U/mL, 약 40 U/mL, 약 45 U/mL, 약 50 U/mL, 약 55 U/mL, 약 60 U/mL, 약 65 U/mL, 약 70 U/mL, 약 75 U/mL, 약 80 U/mL, 약 85 U/mL, 약 90 U/mL, 약 95 U/mL, 약 100 U/mL, 약 110 U/mL, 약 120 U/mL 이상 상이의 모든 값들을 포함하는, 약 10 U/mL 내지 약 100 U/mL의 역치 카텝신 G 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적어도 50 U/mL, 적어도 40 U/mL, 적어도 30 U/mL, 적어도 20 U/mL, 적어도 15 U/mL 또는 적어도 10 U/mL의 카텝신 G 활성 수준은 만성 상처 감염을 나타낸다.
본원에 개시된 구현예는 본원에 기술된 조성물, 물질, 물품, 드레싱, 키트 및/또는 시스템을 사용한 만성 또는 감염된 상처의 치료에 관한 것이다. 치료학적 구현예는 개시된 기술의 조성물, 물질, 물품, 드레싱, 키트, 시스템 또는 장치를 이를 필요로 하는 대상체와 접촉시킴을 포함한다. 임의로, 상기 방법은 대상체가 치료에 대해 반응하는지의 여부를 결정함을 포함할 수 있다.
숙련가는 상처가 치료에 대해 반응성인지 아닌지를 용이하게 확인할 수 있다다. 특히, 숙련가는 상처 치료, 특히 산화된 셀룰로즈를 포함하는 상처 드레싱을 사용한 치료에 대해 우수한 반응 또는 불량한 반응의 예측 또는 지표인 본 청구범위에서 확인된 프로테아제의 수준을 용이하게 결정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "반응성" 및 "반응자(들)"은 상처 치료, 특히 약리학적 제제, 예컨대, 항생제를 사용한 치료에 대해 잘 반응하는 것으로 고려된 상처를 지칭한다. 유사하게, "비-반응성" 및 "비-반응자(들)"은 상처 치료, 특히 약리학적 제제, 예컨대, 항생제를 사용한 치료에 대해 잘 반응하는 것으로 고려되지 않은 상처를 지칭한다. 예를 들면, 상처 치료 4주 후 50% 초과의 상처 봉합을 나타내는 환자는 상기 치료에 대해 반응성인 것으로 고려된다.
특정의 구현예에서, 환자는 본원에 기술된 조성물, 물품, 시스템, 또는 장치로 동시 진단되고 치료될 수 있다. 본원에 사용된 경우, 용어 "동시에"는 기술된 목적, 예컨대, 진단 및 치료를 함께 수행함을 의미한다.
특정의 구현예에서, 환자는 본원에 기술된 조성물, 물품, 시스템, 또는 장치로 순차적으로 진단되어 치료될 수 있다. 본원에 사용된 경우, 용어 "실질적으로"는 기술된 목적, 예컨대, 딘단 및 치료가 일시적으로 또는 공간적으로 분리됨을, 예컨대, 치료 전 진단 또는 치료 후 진단 또는 이의 조합, 예컨대, 1번째 진단 ==> 치료 ==>2번째 진단을 의미한다.
본원에 기술된 구현예는 또한 보호자 또는 환자가 상처가 치유되지 않는 경향이 있는지를 신속하고 신뢰가능하게 결정하고, 이러한 결정을 바탕으로 적절한 치료요법을 선택할 수 있도록 한다. 예를 들면, 치유되지 않는 상처는 특수한 치료제를 포함하는 상처 드레싱과 같은 특수한 상처 트레싱을 적용하여 치유를 촉진함을 필요로 할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 구현예는 추가로 상처가 치유되는지 또는 치유되지 않는지를 결정한 후, 치유되지 않는 경우 상처에 치료제를 포함하는 상처 드레싱을 적용시킴을 포함하는, 상처, 예컨대, 만성 또는 감염된 상처의 치료 방법을 포함한다.
본원에 기술된 구현예는 감염된 상처의 진단 또는 검출을 위한 방법 및 검정을 제공한다. 상기 방법은 세균 감염성 제제의 검출에 적합하다. 일 구현예에서, 상처는 그람-음성 세균으로 감염된다. 대표적인 그람-음성 세균은 이. 콜라이, 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 헬리코박터(Helicobacter)와 같은 프로테오박테리아, 및 시아노박테리아(cyanobacteria)를 포함한다. 의약과 관련하여 분류하는 경우, 이들은 호흡계의 교란을 유발하는 슈도모나스 아에루기노사 및 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 뇨 시스템의 교란을 유발하는 에스케리키아 콜라이 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 소화계의 교란을 유발하는 바실러스 가에르트너(Bacillus Gaertner) 및 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 및 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)와 같은 미구균(micrococci)을 포함한다.
다른 구현예에서, 상처는 그람-양성 세균으로 감염된다. "그람-양성 세균"은 이의 세포 벽내에서 테이코산(예컨대, 리포테이코산 및/또는 담 테이코산), 또는 기능적으로 등가물인 당중합체(예컨대, 람모다당류, 테이코산, 아라비노갈락탄, 리포만난, 및 리포아라비노만난)을 함유하는 세균 또는 세균들을 의미한다. 기능적으로 등가물인 당중합체의 비-제한적 예는 Weidenmaier et al., Nature, 6:276-287, 2008에 기술되어 있다.
세균은 포유동물 숙주(예컨대, 소, 쥐, 말, 영장류, 고양이, 개, 및 사람 숙주)를 감염시키는 병원성 세균을 포함한다. 이러한 병원성 세균의 예는 예컨대, 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 해모필루스(Haemophilus), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 에스케리키아(Escherichia), 살로넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 비브리오(Vibrio), 또는 리스테리아(Listeria)와 같은 세균 종의 구성원을 포함한다. 사람에서 질환을 유발하는 일부 임상적으로 관련있는 병원성 세균의 예는 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보루스(Brucella aborus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 프시타키(Chlamydia psittaci), 클라미디아 트라콘마티스(Chlamydia trachomatis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 파에칼리스(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 에스케리키아 콜라이, 엔테로톡시게닉 에스케리키아 콜라이(enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC), 엔테로파토게닉 에스케리키아 콜라이(enteropathogenic Escherichia coli), 이. 콜라이 O157:H7, 프란키셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케챠 리키치(Rickettsia rickettsii), 살로넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파이피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미스(Staphylococcus epidermis), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA), 반코마이신-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: VSA), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 비브릭 콜레라에(Vibrio cholerae), 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 감염성 세균은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 카르페넴-내성 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)(CR-크렙시엘라 아종(Klebsiella spp); CR-이. 콜라이), 및 나이세리아 고노세리아(Neisseria gonorrhoeae)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 감염성 세균은 다중약물 내성 악시네토박터(Acinetobacter), 약물-내성 캄필로박터(Campylobacter), 확장된 스펙트럼의 β-락타마제(ESBL)-생산 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae), 반코마이신-내성 엔테로코쿠스(enterococcus), 다중 약물-내성 슈도모나스 아에루기노사(pseudomonas aeruginosa), 약물-내성 비-장티푸스 살모넬라(Salmonella), 약물-내성 살모넬라 엔테리카 세로바르 티피(Salmonella enterica serovar Typhi), 약물-내성 시겔라, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA), 약물-내성 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 및 약물-내성 투베르쿨로시스(Tuberculosis)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 감염성 세균은 반코마이신-내성 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로마이신-내성 그룹 A 스트렙토코쿠스, 클린다마이신-내성 그룹 B 스트렙토코쿠스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정의 구현예에서, 만성 또는 감염된 상처는 숙주 대상체에서 발견된다. 바람직하게는, 숙주는 포유동물, 예컨대, 설치류, 사람, 가축 동물, 반려 동물, 또는 비-사육 또는 야생 동물이다. 일 구현예에서, 대상체는 설치류, 예컨대, 마우스, 랫트, 기니아 피그 등일 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체는 가축 동물일 수 있다. 적합한 가축 동물의 비-제한적 예는 돼지, 소, 말, 염소, 양, 라마 및 알파카(alpaca)를 포함할 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 대상체는 반려 동물일 수 있다. 반려 동물의 비-제한적 예는 개, 고양이, 토끼, 및 새와 같은 애완 동물을 포함할 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 대상체는 동물원 동물일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "동물원 동물"은 동물원에서 발견될 수 있는 동물을 지칭한다. 이러한 동물은 비-사람 영장류, 큰 고양이, 늑대, 및 곰일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 대상체는 사람이다.
일 국면에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처에 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정성적인 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처에 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정성적인 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 국면에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정성적인 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적인 결정을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계를 포함한다.
일부 국면에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 효소의 수준을 검출하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정성적인 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적인 결정을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계를 필수적으로 포함한다.
일 국면에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 프로테아제의 수준을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 프로테아제의 수준을 검출하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 포유동물 상처에서 하나 이상의 프로테아제의 수준을 검출하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적 결정과 하나 이상의 참고 샘플을 비교하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물에서 하나 이상의 프로테아제의 수준을 검출하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적 결정과 하나 이상의 참고 샘플을 비교하는 단계를 포함한다.
다른 국면에서, 포유동물 상처에서 만성 상처를 진단하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 국면에서, 포유동물 상처에서 만성 상처를 진단하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; 및 (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 국면에서, 포유동물 상처에서 만성 상처를 진단하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적 결정을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계를 포함한다.
일부 국면에서, 포유동물 상처에서 만성 상처를 진단하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; 및 (c) 정량적 결정을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계를 포함한다.
다른 국면에서, 포유동물 상처에서 상처를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 적량적 결정을 수득하는 단계; 및 (d) 의학적 치료를 포유동물에게 실시하는 단계를 포함하며; 여기서 의학적 치료는 리포터 분자의 농도가 포유동물 상처가 만성임을 나타내는 경우에만 항생체 치료요법을 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 상처에서 상처를 치료하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 가시적으로 비교하는 단계; (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 적량적 결정을 수득하는 단계; 및 (d) 의학적 치료를 포유동물에게 실시하는 단계를 필수적으로 포함하며; 여기서 의학적 치료는 리포터 분자의 농도가 포유동물 상처가 만성임을 나타내는 경우에만 항생체 치료요법을 포함한다.
다른 국면에서, 포유동물 상처에서 상처를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계; 및 (d) 의학적 치료를 포유동물에게 실시하는 단계를 포함하며; 여기서 의학적 치료는 리포터 분자의 농도가 포유동물 상처가 만성임을 나타내는 경우에만 항생체 치료요법을 포함한다.
일부 구현예에서, 포유동물 상처에서 상처를 치료하는 방법은: (a) 본원에 기술된 상처 드레싱 물질을 포유동물 상처와 접촉하여 두는 단계; (b) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질 속의 리포터 분자의 농도의 정량적 결정을 수득하는 단계; (c) 포유동물 상처와 접촉된 상처 드레싱 물질을 하나 이상의 참고 샘플과 비교하는 단계; 및 (d) 의학적 치료를 포유동물에게 실시하는 단계를 필수적으로 포함하며; 여기서 의학적 치료는 리포터 분자의 농도가 포유동물 상처가 만성임을 나타내는 경우에만 항생체 치료요법을 포함한다.
바람직하게는, 진단 및 치료는 자체적으로 수행된다. 따라서, 본원에 기술된 구현예는 용이하고, 비-침입적인 방식으로 상처의 진단 및 치료를 허용한다. 예를 들면, 진단은 실시간으로 이루어질 수 있으며 치료는 감염된 상처 또는 환자(전신적으로) 적용될 수 있으며 상처 치료의 진행은 실시간에 걸쳐, 예컨대, 상처 치유로 인한 리포터 분자에 의해 생성된 시그널의 소멸로 모니터된다.
실시예
본원에 기술된 구조, 물질, 조성물, 및 방법은 대표적인 실시예인 것으로 의도되며, 본 발명의 영역은 실시예의 영역으로 한정되지 않음이 이해될 것이다. 숙련가는 상기 구현예 및 개시된 기술이 개시된 구조, 물질, 조성물 및 방법에 있어서의 변화로 실시될 수 있으며, 이러한 변화는 개시내용의 영역내인 것으로 고려된다.
약어의 목록:
위에서 사용된 바와 같은, 및 본 발명의 설명 전체에서, 다음의 약어는, 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 수 있다:
ACN 또는 MeCN 아세토니트릴
Bn 벤질
BOC 또는 Boc 3급-부틸 카르바메이트
t-Bu 3급-부틸
CMC 카복시메틸셀룰로즈
DCE 디클로로에탄 (ClCH2CH2Cl)
DCM 디클로로메탄 (CH2Cl2)
DIPEA 또는 DIEA 디이소프로필에틸아민
DMAP 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘
DMF 디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
equiv 당량(들)
Et 에틸
EtOH 에탄올
EtOAc 에틸 아세테이트
Fmoc 플루오레닐메틸 카바메이트
HBTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트
HPLC 고 성능 액체 크로마토그래피
Me 메틸
MeOH 메탄올
MS 질량 분광법
NMR 핵 자기 공명
PBS 인산염 완충된 염수
RP-HPLC 역상-고압 액체 크로마토그래피
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
하기 실시예에 나타낸 중합체의 경우, n은 400 내지 3200 중에서 선택된 정수이다.
실시예 1: 중합체 1의 제조(CMC 섬유 사용)
Figure pct00029
나트륨 카복시메틸셀룰로즈 (NaCMC) 섬유 (443 mg, 1.08 mmol)를 탈이온수 (44 ml)에 용해하여 1% 용액을 수득하였다. Dowex 650C 모노스피어(monosphere) 이온 교환 수지를 가하여 산성화된 CMC (CMC-H)를 제공하였다. 모노스피어를 여과로 제거한 후 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 (TBAH) 40% (aq)를 pH가 8 내지 9가 될 때까지 가하였다. 수득되는 용액을 밤새 동결건조시키기 전에 30분 동안 교반하였다. 동결건조된 물질(0.38 g)을 40 ml 무수 DMF 속에 질소하에서 교반하면서 대략 1시간의 기간에 걸쳐 약하게 가열하면서 용해시켰다. 수득되는 용액은 불투명하고 회백색이었다. 용액을 대략 4℃로 냉각시켰다. 이러한 교반 용액에, 2-클로로-N-메틸피리디늄 요오다이드 (CMP-I) (0.33 g, 1.3 mmol)를 가하였다. 이러한 직후, 화합물 1-b (0.5 g, 2 mmol)를 또한 3 방울의 무수 DCM 및 약간의 소적의 무수 트리에틸아민과 함께 가하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 유지시키고 3시간 교반한 후, 이는 보다 어두운 거의 갈색이 되었다. 95% 아세톤 (aq) (80ml)을 서서히 가하고 4℃에서 20분 동안 교반한 후 4℃에서 밤새 유지시켰다. 수득되는 백색 침전물을 여과하여 갈색 용액을 제거하였다. 물질을 이후에 아세톤을 사용하여 다음 방법으로 5회 세척하였다: 40 ml의 99.5% 아세톤을 가하고, 혼합하고 대략 1분 동안 초음파 처리하고, 아세톤을 여과 제거하고 고체 생성물을 수집하였다. 이는 고체, 회백색의 스폰지 물질을 생산하였다. 나머지 아세톤을 감압하에 제거하였다. 고체를 에탄올(20 ml x 1)에 이어서 아세톤 (20 ml x 3)으로 세척하였다. 각각의 세척 동안, 세척 용액을 1분 동안 초음파 처리한 후 여과하여 고체를 수득하였다. 고체 (화합물 1-c)를 고압 회전 증발기에 45분 동안 두었다. 중량 = 0.288 g. FTIR: 3360, 3320 (N-H/ O-H), 2875 (C-H), 쇼울더(shoulder)가 있는 1650(BOC의 아미드성 C=O), 1590 (CMC의 C=O).
화합물 1-c의 용해도를 평가하기 위하여, 다음 방법을 수행하였다:
화합물 1-c를 질량 분광법 바이알(vial)내로 칭량하였다(바이알 당 ~0.0013 g). 대략 1 ml의 필요한 용매를 바이알에 가하였다. 샘플을 다음의 시점에서 용해도에 대해 가시적으로 평가하였다: 초기에, 40℃에서 1분 동안 약하게 가열한 후, 10초 동안 초음파 처리한 후, 실온에서 밤새 두었다. 데이타는 하기에 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00030
화합물 1-c (0.05g, 0.11089 mmol)를 칭량하고 최대한 가능한 최소의 조각으로 잘랐다. DCM 중 10% TFA를 가하였고(10ml) 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 휘발성 용매 시약을 고압 회전 증발기를 사용하여 제거하였다. 남아있는 고체를 공비 혼합물에 3회 적용시켜 이의 비등점을 강하시킴으로써 어떠한 남아있는 TFA도 제거하였다: 톨루엔(10 ml x 3)을 고체 생성물에 가하고 고 진공 회전 증발기를 사용하여 제거하기 전까지 교반함으로써 회백색 고체로서의 중합체 1을 제공하였다. 중량 = 0.0524 g. FTIR: 3326 (N-H/ O-H), 2891 (C-H), 1668 (C=O 우레탄 스트레치). 원소 분석 (TFA 염): 탄소: 예측치 ~43%; 실측치 = 38.90%. 수소: 예측치 ~5.8%; 실측치 = 5.43%. 질소: 예측치 ~4.4%; 실측치 = 0.28%. 치환도는 0.28/ 4.38 = 0.06이다.
중합체 1의 용해도를 화합물 1-c에 대해서와 유사한 방식으로 측정하였다. 데이타는 하기 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00031
중합체 1의 아민화의 정량적 측정을 닌하이드린-계 카이저 시험(닌하이드린-based Kaiser test)을 사용하여 평가하였다. 3개의 시약을 제조하였다: (1) 10 ml의 EtOH 중 500 mg (0.5 g)의 닌하이드린; (2) 20 ml의 EtOH 중 80 g의 페놀; 및 (3) 피리딘으로 100 mL로 희석된 2 ml의 0.001 M KCN. 중합체 1 (10-20 mg)의 샘플을 환저 플라스크에 두었다. 3 내지 5 소적(drop)의 각각의 시약을 플라스크에 가하였다. 플라스크를 오일 욕 및 환류 응축기를 사용하여 100℃로 가열하고 5분 동안 교반하였다. 어떠한 색상 변화도 육안으로 관찰하였다. 아민의 존재를 나타내는 암청색/자주색 색상이 검출되었다.
실시예 2: 중합체 2의 제조
Figure pct00032
Fmoc-Phe-OH (0.0267 g, 0.069 mmol), HBTU (0.0262 g, 0.069 mmol), DIPEA (0.015 ml, 0.090 mmol) 및 무수 DMF (0.82 ml)의 용액을 제조하였다. 15-ml의 플라스틱 분리 컬럼을 10 μm의 폴리에틸렌 프릿(frit)으로 설정하고 루어 팁(luer tip)을 부착하였다. 중합체 1 (0.034 g, 0.097 mmol)에 이어 아미노산 용액을 컬럼에 가하였다. 뚜껑을 컬럼 위에 두고 파라필름으로 추가로 밀봉하였다. 컬럼을 혈액 회전기 위에 실온에서 밤새 두었다. 용액을 감압을 사용하여 배수하고 고체 생성물을 EtOH로 세척하여 중합체 2를 백색 고체로서 수득하였다. 중량 = 0.0266 g. 카이저 시험(Kaiser test)을 사용하여 말말 아민의 부재를 확인하였다. FTIR: 3324 (N-H/ O-H), 3281 (O-H), 2898 (C-H), 1720 (방향족 C=O), 1666 (C=O 우레탄 스트레치), 1660, (Fmoc의 C=O 아미드 스트레치)
중합체 2의 용해도를 화합물 1-c에 대해서와 유사한 방식으로 측정하였다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00033
Figure pct00034
실시예 3: 중합체 3의 제조
Figure pct00035
중합체 2를 피페리딘: DMF (1:4 v/v, 6 ml)의 용액 속에 대략 2시간 동안 두었다. 수득되는 탈-보호된 생성물을 EtOH로 세척한 후 카이저 시험(Kaiser test)을 수행하여 유리 아민의 존재를 확인하였다. 이러한 탈-보호된 생성물 (0.080 g, 0.15 mmol)을 10 μm 폴리에틸렌 프릿 및 루어 팁으로 설정된 15-ml의 플라스틱 분리 컬럼에 가하였다. Fmoc-Phe-OH (0.063 g, 0.16 mmol), HBTU (0.062 g, 0.16 mmol), DIPEA (0.23 ml, 1.8 mmol) 및 무수 DMF (6 ml)의 용액을 제조하고 컬럼에 가하였다. 뚜껑을 컬럼 위에 두고 파라필름으로 추가로 밀봉하였다. 컬럼을 혈액 회전기 위에 실온에서 밤새 두었다. 용액을 감압을 이용하여 배수시키고 고체 생성물을 EtOH (10 ml x3)로 세척하여 커플링 생성물을 적색 고체로 제공하였다. 중량 = 0.0691 g. 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다. 커플링 생성물을 DCM으로 세척하였다. FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2866 (C-H),1730 (방향족 C=O), 1651+쇼울더 (C=O, F의 아미드) 및/또는 (F-Fmoc의 C=O 아미드 스트레치), 1587 (C=O 우레탄 스트레치).
Fmoc 그룹을 제거하기 위하여, 커플링 생성물을 피페리딘:DMF (1:4 v/v, 6 ml) 용액에 대략 2시간 동안 두었다. 수득되는 탈보호된 생성물을 이후에 EtOH (10 ml x3) 및 DCM (10 ml)로 세척하여 취성의 적색 고체로서 중합체 3을 제공하였다. 중량 = 0.0638 g, 수율 = 62%. 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다. FTIR: 3315(N-H/ O-H), 2866 (C-H), 1730 매우 작은 피크(방향족 C=O), 쇼울더가 없는 1651 (C=O, F의 아미드), 1587 (C=O 우레탄 스트레치). [주목: FTIR는 최종 생성물에 소량의 Fmoc가 남아있음을 시사한다].
실시예 4: 중합체 4의 제조
중간체 4-c의 합성
Figure pct00036
Fmoc-Lys-OH·HCl (0.0405g, 0.100 mmol)을 환저 플라스크에 두고, 여기에 1,4-디옥산 : 10% K2CO3 의 5:2의 혼합물(aq)(3 ml)을 적가하였다. 혼합물을 교반하고 답실(Dabsyl) 클로라이드(0.033 g, 0.10 mmol)를 혼합물에 가한 후 실온에서 대기에 개방하여 밤새 교반하였다. 용액을 150 ml의 물로 희석시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 디에틸 에테르 (10 ml x3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 농축시켰다. 조 물질을 섬광 컬럼 크로마토그래피(10:90 MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 화합물 4-c를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 1 소적의 CD3OD가 들어있는 CDCl3) 8.55, 7.79, 7.65, 7.52, 7.26, 7.17, 6.69, 6.59, 5.19, 5.06, 4.78, 4.28, 4.17, 4.08, 3.97, 3.57, 3.55, 3.35, 3.05, 2.87, 2.14, 1.99, 1.63, 1.41, 1.21, 0.83, 0.03.
중합체 4의 합성
Figure pct00037
화합물 4-c (0.0160 g, 0.024 mmol), HBTU (0.00925 g, 0.0244 mmol), DIPEA (0.23 ml, 1.8 mmol) 및 무수 DMF (6 ml)의 용액을 제조하였다. 15-ml 들이의 플라스틱 분리 컬럼에 10μm 폴리에틸렌 프릿 및 루어 팁을 장착하였다. 중합체 3 (0.0230 g, 0.084 mmol)에 이어 아미노산 용액을 컬럼에 가하였다. 뚜껑을 컬럼 위에 두고 파라 필름으로 추가로 밀봉하였다. 컬럼을 혈액 회전기에 실온에서 밤새 두었다. 용액을 감압을 사용하여 배수시키고 고체 생성물을 EtOH (10 ml x3)로 세척하여 적색 고체로서 커플링 생성물을 제공하고, 이를 DCM으로 세척하였다. 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다. FTIR: 3346 (N-H/ O-H), 2912 (C-H), 1730 (답실의 C=C 방향족), 1652 (C=O, 아미노산의 아미드), 1591 (C=O 우레탄).
커플링 생성물을 피페리딘 : DMF (1:4 v/v) 용액(6 ml) 속에 대략 2시간 동안 두었다. 수득되는 탈-보호된 생성물을 EtOH (10 ml x3)에 이어 DCM (10 ml)으로 세척하여 적색/갈색 취성 고체로서 중합체 4를 제공하였다. 중량 = 0.0368 g, 수율 = 56%. 카이저 시험을 수행하여 말단 아민의 존재를 확인하였다. FTIR: 3335 (N-H/ O-H), 2918 (C-H), 1651 (C=O, 아미노산의 아미드, 또는 Fmoc), 1589 (C=O 우레탄).
실시예 5: 중합체 5의 제조(분말 CMC 사용)
Figure pct00038
DoS 0.7의 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 (NaCMC) (2.0 g, 8.33 mmol)를 탈이온수 (180 mL) 속에 용해하여 1% 용액을 수득하였다. Dowex 650C 모노스피어 이온 교환 수지를 10분 동안 교반하면서 가하였다. 모노스피어를 여과로 제거한 후 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 (TBAH) 40% (aq)를 0.1mL의 분취량 속에 pH가 8 내지 9(3.5 mL, 36.14 mmol)가 될 때까지 가하였다. 수득되는 용액을 30분 동안 교반한 후 7일에 걸쳐 동결건조시켰다.
동결건조된 물질을 무수 DMF (240 mL) 속에 질소 대기하에서 용해하였으며, 교반 및 약한 가열이 대략 2시간 동안 요구되었다. 용액을 대략 4℃로 냉각시킨 후 2-클로로-N-메틸피리디늄 요오다이드 (CMP-I) (1.5 g, 5.8 mmol)을 격렬히 교반하면서 가하였다. 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (1.3567 g, 9.17 mmol)을 반응에 무수 트리에틸아민 (5mL)과 함께 가하였다. 반응을 4℃에서 유지시키고 최소 3시간 동안 교반한 후, 95% 에탄올(aq) (80 mL)을 가하고 10분 동안 4℃에서 교반하였다. 99% 아세톤 (200 mL)을 교반하면서 서서히 가하여 생성물을 침전시키고 이를 여과하고 아세톤 (3 x 200 mL)으로 세척하였다. 생성물을 진공하에 농축시켜 회백색 고체를 수득하였다. 중량 = 1.908 g, 수율 = 68 %. FTIR: (vmax/ cm-1) 3267 (N-H/ O-H), 2916/ 2873 (C-H), 1739 (아세톤), 1650 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1588 (CMC의 C=O), 1401/ 1314/ 1257/ 1037. 13C CP MAS NMR: CMC 0.7 DoS (출발 물질): δ C (13,000Hz, CP MAS) 61.7 (C6), 74.5 (C7, C2, C5), 82.5 (쇼울더, C3), 97.0 (C4), 103.3 (C1), 177 (C=O); CMC- PEG 디-아민: δ C (13,000Hz, CP MAS) 13.4 (C14), 20.1 (지정되지 않음지정되지 않음), 23.4 (지정되지 않음), 30.6 (C9), 61.7 (C6), 70 (쇼울더, C7), 74.5 (C2, C5), 82.5 (C3), 95 (C4), 103.3 (C1), 113 (지정되지 않음), 142 (지정되지 않음), 152 (지정되지 않음), 169.7 (링커의 C=O), 177.1 (CMC의 C=O). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7인 경우 생성물의 생성물의 예측치: Mass 306 g/mol: C 45%, H 7%, N 6%; (d) 실측치: C 43%, H 7%, N 4%. 이후에, 모든 단량체 중, 대략 47%가 치환되어 이제 링커 그룹을 함유하지 않았다. 정성적 카이저 시험: 유리 아민의 존재를 나타내는 양성. 570 nm에서 수득된 UV 데이타는 표준 참고로서 발린을 기반으로 한 교정 곡선에 따라, 4.6 μmol 아민과 동일하다.
중합체 5의 용해도를 화합물 1-c에 대해서와 동일한 방식으로 측정하였다. 데이타는 하기에 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00039
실시예 6: 중합체 6의 제조
Figure pct00040
중합체 5를 무수 DMF (6 mL) 속에 여과 튜브 속에서 20분 동안 침지시켰다. 화합물 4-c (0.0416g, 0.063 mmol) 및 HBTU (0.2893g, 0.8571 mmol)를 DIPEA (0.2 mL, 0.8571 mmol)와 함께 가하였다. 튜브를 고정시키고 실험실 혼합기 위에서 밤새 실온으로 회전시켰다. 상층액을 여과하고 나머지 고체를 DMF (3 x 3 mL) 및 메탄올(3 x 5 mL)로 세척한 후 진공 하에 건조시켰다. 중량 = 0.1285 g (45% 수율). 카이저 시험을 사용하여 유리 아민의 존재를 확인하였다. FTIR: 3313 (N-H, O-H), 2862 (O-H), 1747 (아미드의 C=O), 1587 (CMC의 C=O), 1404/ 1315 / 1023. 원소 분석: XKSTH: 예측치 51%; 실측치 = 40%. 수소: 예측치 5%; 실측치 = 6%. 질소: 예측치 5%; 실측치 = 4%.
중합체 6의 용해도를 다음 방식으로 시험하였다. 소량의 중합체 6을 2개의 별도의 유리-바닥 페트리 디쉬에 두었다. 물질을 pH 4의 일반적인 실험실 완충액 또는 pH 9의 K2HPO4/MgCl2 완충액 (각각 20 μL)내에 두었다. 각각을 Zeiss Axioimager 광학 현미경 x10 배율의 광학 렌즈 플러스 x 10 배율의 접안 렌즈 하에서 관찰하였다.
샘플 둘 다가 완충액과 접촉한 하이드로겔을 형성하였다. 현미경 하에서, 분말 응집물은 겔화된 것으로 여겨지며 적색의 답실을 함유한다. 일부 구역은 다른 것보다 색상에 있어 보다 농축되었으나 색상 분포는 샘플에 걸쳐 관찰되었다. 본 실험을 출발 화합물 4-c 및 중합체 5에 대해 반복하였다. 중합체 5 샘플에서 색상은 가시적이 아니었다; 하이드로겔 분말 구조가 관찰되었다. 화합물 4-c의 샘플은 전체적으로 적색이었으며 하이드로겔을 형성하지 않았다.
실시예 7: 중합체 7의 제조
Figure pct00041
나트륨 카복시메틸셀룰로즈 (NaCMC) 분말(2.0 mg, 8.3 mmol, DoS = 0.7)을 교반하면서 탈이온수 (200 mL) 속에 용해하고, 60초 동안 초음파처리하고, 30분의 과정에 걸쳐 약하게 가열하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) (1.92 g, 10.01 mmol)를 용액에 교반하면서 가하였다. pH는 8인 것으로 밝혀졌으며 1.0 M HCl (3 방울)을 첨가하여 pH = 6으로 조절하였다. L-시스테인 (0.50 g, 4.1 mmol)을 교반하면서 반응물에 가하였다. pH는 이후에 8인 것으로 밝혀졌으며 다시 HCl을 사용하여 pH 6 (~ 1 mL)에 도달시켰다. 반응물 밤새 교반한 후 1 M HCl (700 mL)에 이어, 1 M HCl 및 1% NaCl (700 mL)에 이어, 0.5 M HCl (700 mL)에 대해 투석을 수행하였으며(12-14 KDa 메디셀 투석 막), 이들 각각은 10℃에서 60분 동안 암실에서 수행하였다. 수득되는 용액을 동결건조시켜 중합체 7을 제공하였다. FTIR: 3296 (N-H, O-H), 2972/ 2930 (C-H), 2733 (small), 2522 (C의 S-H), 2089 (v small), 1730 (Cys의 C=O 산), 1681 (아미드), 1633 (CMC의 C=O), 1469 (쇼울더), 1382/ 1346/ 1221/ 1107, 1051. 13C CP MAS NMR: 14 (C11), 18 (지정되지 않음), 24 (지정되지 않음), 43 (C9), 58 (지정되지 않음), 62 (C6), 74 (C2, 3, 5, 7), 82 (C4), 103 (C1), 173 (C8 아미드의 카보닐). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 299 g/mol: C 40%, H 6%, N 3%, S 6%; 실측치: C 34%, H 8%, N 8%, S 1.4%. 따라서, 모든 단량체 중 대략 16%는 링커 그룹을 함유한다.
중합체 7의 용해도는 화합물 1-c에 대해서와 유사한 방식으로 측정하였다. 중합체 7은 물,, DMF, 아세톤, MeOH, EtOH, 및 DCM 속에서 불용성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 8: 중합체 8의 제조
Figure pct00042
중합체 5 (1.00 g, 2.86 mmol)를 미세 분말로 분쇄하고 DMF (25 ml)로 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Cys(StBu)-OH (3.7 g, 8.6 mmol), HBTU (2.87 g, 8.57 mmol) 및 DIPEA (1.10 ml, 8.57 mmol)을 실온에서 교반하면서 공기에 개방하면서 가하였다(원심분리 튜브 및 실험실 회전기를 사용하여 혼합물 밤새 촉진시켰다). 혼합물을 30초 동안 초음파처리한 후 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고 DCM (20 mL x5) 및 MeOH (20 mL x5)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 진공하에 건조시켜 화합물 8-b를 회백색 고체로서 수득하였다. 13C CP MAS NMR: 20 (지정되지 않음), 30 (C9), 32 (C19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 55 (C16), 61 (C6), 70-74 (광범위, C2,3,5,7), 82 (쇼울더, C4), 92 (C17), 96 (지정되지 않음), 103 (C1), 120 (C24), 127 (C25,26,27), 141 (C28), 145 (쇼울더, C23), 157 (C20, C=O 카바메이트), 171 (아미드의 C8 카보닐), 177 (C8 XKSTHyl of CMC), 191 (지정되지 않음), 221/227 (오염 가능성).
화합물 8-b (0.5 g)를 랩 실험실에 피페리딘 : DMF (20:80 v/v) 용액(10 ml) 속에 대략 2시간 동안 두었다. 수득되는 탈보호된 생성물을 EtOH (50 mL x3) 및 DCM (50 mL x3)으로 세척하여 화합물 8-c를 회백색 고체로서 수득하였다. 당해 과정을 반복하여 Fmoc 그룹을 완전히 반복하였다.
화합물 8-c (0.30 g, 0.54 mmol)를 환저 플라스크에 가하고 질소 가스로 퍼지(purging)하였다. 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) (0.307 g, 1.07 mmol)을 탈이온수 (1.3 ml) 속에 용해하고 반응물에 MeOH (2.6 ml)와 함께 교반하면서 가하였다. 시스템을 질소하에 실온에서 1시간 동안 교반하면서 유지시킨 후 여과하고 다음 용액으로 세척하였다: 2:1 MeOH/물(90 ml), 1:2 MeOH/물 (90 ml), 100% 물 (90 ml), 100% MeOH (90 ml). 수득되는 고체를 진공 건조시켜 중합체 8을 회백색 고체로서 수득하였다. 본 과정을 반복하여 이황화물을 완전히 감소시켰다. 13C CP MAS NMR: 30 (C9, 19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 54 (C16), 60 (C6), 70-74 (광범위, C2,3,5,7), 82 (쇼울더, C4), 92 (C17), 97 (지정되지 않음), 102 (C1), 120 (C24), 127 (C25,26,27), 141 (C28), 156 (C20, C=O 카바메이트), 171 (아미드의 C8 카보닐), 177 (C8 CMC의 카보닐), 191 (지정되지 않음), 221(지정되지 않음). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 390 g/mol: C 43%, H 6%, N 6%, S 5%; 실측치: C 46%, H 7%, N 4%, S 3.5%. 따라서 모든 단량체 중에서, 대략 50%는 링커 그룹을 함유한다.
실시예 9: 중합체 9의 제조
Figure pct00043
중합체 5 (1.0 g, 2.714 mmol)를 PBS (25 mL) 속에서 약하게 가열하고, 교반하고 초음파처리하면서 분산시켰다. 반응 용기를 질소 가스로 퍼지하였다. PBS (50 mL)중 트라우트 시약(Traut's reagent)(0.600 g, 4.304 mmol)의 용액에 EDTA (0.044g, 0.15 mmol)를 가하였다. 일단 완전히 용해되면, 이러한 용액을 반응 혼합물에 가하고, 이를 실온에서 질소 대기하에 1시간 동안 교반하였다. 수득되는 생성물을 여과로 분리하고 PBS (3 x 10 mL) 및 메탄올(3 x 10 mL)로 세척하였다. 백색/회백색 분말 고체 생성물을 이후에 진공 건조시키고 질소 하에 저장하였다. 중량 = 1.2413 g (91%). 엘만 시험(Ellman test)으로부터의 황색은 일부 유리된 티올이 가능하게는 반응하지 않은 출발 물질 속에 여전히 존재함을 나타낸다. 정량적 시험에서, 대략 0.06 mmol/g의 S-H 그룹이 존재한다. FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2957/ 2934/ 2870 (C-H), 1644 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1593 (CMC의 C=O), 1412/ 1322/ 1022. 2059 cm-1에서 S-H에 대해 매우 약한 피크가 존재하였다. δ C (13,000Hz, CP MAS): 176.7 (C8, CMC의 C=O), 172.2 (C8, 아미드의 C=O), 156.0 (C15, 작은 피크) 121.0, 103.0 (C1), 81.3 (C7, 쇼울더), 74.4 (C2,C3,C4,C5), 61.7 (C6), 38.9 및 쇼울더 (C9,C10,C11,C12,C13,C14). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 414 g mol-1: C 43%, H 7%, N 6%, S 4%. 실측치: C 40%, H 7 %, N 4%. 따라서, 모든 단량체 중, 대략 47%가 링커 그룹을 함유한다.
실시예 10: 중합체 10의 제조
Figure pct00044
중합체 9 (0.150g, 0.316 mmol)를 환저 플라스크내로 칭량하고 질소로 퍼지하였다. 엘만 시약(0.375g, 0.947 mmol)을 PBS (20 mL) 속에 용해하고 중합체 9에 가하였다. 반응을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 중간체 이황화물 생성물 10-a을 여과하고 PBS (3 x 20 mL), 메탄올 (1 x 20 mL)로 세척한 후 진공하에 건조시켜 중간체 10-a를 담백색/황색 분말 고체로 수득하였다. 중량 = 0.133 g (60% 수율). 엘만 시험으로부터의 황색 색산은 일부 유리된 티올이 가능하게는 반응하지 않고 남아있는 출발 물질 속에 여전히 존재함을 나타낸다. 정량적 시험에서, 대략 0.33 mmol/g의 S-H 그룹이 존재하였다. FTIR: 3310 (N-H/ O-H), 2911/ 2875 (C-H), 1727 (C=O 카복실산), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1592 (CMC의 C=O). 대략 2059 cm-1에서 S-H에 대해 매우 약한 피크가 존재하였다. δC (10,000Hz, CP MAS): 222.37 (스피닝 측면 밴드), 다음의 쇼율더: 172.5 (C8, CMC의 C=O), 172.5 (C8, 아미드의 C=O, 엘만 시약 위에서 산 그룹 중 가능하게는 또한 일부), 156.0 (C15, 작은 피크) 123.7 (스피닝 측면 밴드), 144.5 (엘만 시약의 방향족 영역), 103.0 (C1), 96.79, 82.25 (C7, 쇼울더), 74.5 (C2, C3, C4, C5), 61.4 (C6), 39.3 플러스 쇼울더 (C9, C10, C11, C12, C13, C14), 32.2 날카로운 피크(오염 가능성). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 553 g mol-1: C 43%, H 6%, N 6%, S 6%. 실측치: C 39%, H 6 %, N 4%, S 1.45%. 따라서, 모든 단량체 중, 대략 17%는 링커 그룹을 함유한다.
중간체 이황화물 생성물 10-a (0.1g, 0.1422 mmol), 머캅토벤조산(0.11g, 0.7112 mmol) 및 메탄올 : 물 (4:1 비, 5 mL)를 합하고 실온에서 질소 대기 하에 2시간 동안 합하였다. 수득되는 생성물을 여과하고 메탄올 (3x 10 mL), DCM (3 x 10 mL)으로 세척하고 메탄올 (3 x 10mL)로 추가로 세척한 후 진공하에 건조시켜 중합체 10을 황색 고체 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.0821 g (87% 수율). 엘만 시험으로부터의 강력한 황색 색상은 일부 유리된 티올이 가능하게는 반응하지 않은 나머지 출발 물질 속에 여전히 존재하였음을 나타낸다. 정량적 시험에서, 거의 2.97 mmol/g의 S-H 그룹이 존재한다. FTIR: 3293 (N-H/ O-H), 2910/ 2881/ 2849 (C-H), 1718 (C=O 카복실산), 1638 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1586 (CMC의 C=O), 1553. δ C (10,000Hz, CP MAS): 177.4 (C8, CMC의 C=O), 171.9 (C8, 아미드의 C=O, 가능하게는 또한 벤조산의 산 그룹 중 일부), 130/143 작은 광범위한 피크, 102.7 (C1), 96.79, 81.6 (C7, 쇼울더), 74.1 (C2, C3, C4, C5), 62.5 (C6), 39.0 및 쇼울더 (C9, C10, C11, C12, C13, C14), 32.1 날카로운 피크 (오염 가능성). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 520 g mol-1: C 44%, H 6%, N 6%, S 6%. 실측치: C 37%, H 6 %, N 3%.
추가의 세척 순서를 물 속에서 수행하여 어떠한 부-생성물도 팽윤(하이드로겔-유사) 상태에서 구조로부터 세척되도록 보증하였다. pH 9 인산염 완충액 (100 mL), 탈이온수 (20 mL), pH 9 인산염 완충액 (5 mL) 및 최종적으로 메탄올 (20 mL)을 사용하여 고체를 세척하고 이후 진공하에 건조시켜 중합체 10을 백색/크림색 고체 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.0482 g (51% 수율). 엘만 시험으로부터의 담황색 색상은 일부 유리된 티올이 가능하게는 반응하지 않고 남아있는 출발 물질 속에 여전히 존재하였음을 나타낸다. 정량적 시험에서, 거의 0.31 mmol/g의 S-H 그룹이 존재하였다. FTIR: 3267 (N-H/ O-H), 2904/ 2866 (C-H), 2119 작은 피크 ( S-H), 1638 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1587 (CMC의 C=O), 1547. 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 520 g mol-1: C 44%, H 6%, N 6%, S 6%. 실측치: C 38%, H 6%, N 3%, S 0.65%.
중합체 9 및 10의 용해도를 화합물 1-c에서와 유사한 방식으로 측정하였다. 데이타는 하기에 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다
Figure pct00045
실시예 11: 중합체 11의 제조
Figure pct00046
아미노페닐 플루오레세인 (0.005g, 0.0180 mmol), HBTU (0.0136g, 0.036 mmol) 및 중합체 5 (0.013g, 0.036 mmol)를 교반 바아(bar)를 사용하여 25mL RBF에 가하고 N2(g)로 퍼지하였다. 무수 DMF (5 mL)를 가하고 반응물을 실온에서 밤새 교반하면서 호일을 덮어 광으로부터 보호하였다. 반응 용액을 여과 튜브를 통해 여과하고 수회 DMF로 세척하였다. 상층액은 주황색을 유지하였다; 이를 세척과 함께 유지하고 진공하에 건조시켰다. 고체 생성물을 회수하고 진공하에 건조시켰다. 커플링을 최대화하기 위해서, 및 상층액 및 세척물이 일부 주황색을 갖는다고 가정하고, 반응을 상층액으로부터 회수된 고체를 사용하여 반복하고 반응물로서 세척하였다. 중량 = 0.012 g (43% 수율). FTIR: 3367 (N-H/ O-H), 2932 (C-H), 1702, 1655 (C=O, 아미드), 1555 쇼울더 (CMC의 C=O), 1494 (방향족 C-C of APF), 1437/ 1413/ 1387/ 1308, 1194 (C-C), 1106 (C-O of APF), 838 (평면 C-H 벤딩의 방향족 제거).
실시예 12: 중합체 12의 제조
Figure pct00047
초기 중합체 8을 TCEP로 처리하여 형성된 어떠한 이황화물 결합도 탈-커플링시켰다. TCEP (0.0243 g, 0.0848 mmol, 4 equiv)를 1 mL의 물 속에 용해하고 중합체 8 (0.01 g, 0.0212 mmol)에 가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 물 (3 x 10 mL)로 세척하고 동결-건조시켜 고체 회백색/크림색 분말을 수득한 후 이를 DMF (3 x 10 mL)로 세척하였다.
화합물 12-a (0.0108 g, 0.0212 mmol, 1 equiv)를 3 mL의 무수 DMF 속에 용해하고 중합체 8에 가하고 이를 N2 (g)로 퍼지하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하면서 호일로 덮어 광으로부터 보호하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 적색이 되었으며 여과시, 단지 매우 소량의 백색 고체 물질이 회수되었다(0.0022 g). 용액 상을 진공 하에 농축시켜 조 중합체 12를 적색 왁스성 고체로 수득하였다.
생성물 및 출발 물질이 조 중합체 12 속에 존재하는 것이 가능하였으므로 조 물질을 추가로 정제하기 위하여 추가의 세척이 필요하였다. 혼합물은 헥산, 에탄올 및 클로로포름 속에서 불용성이었다. 그러나, 탈이온수 속에 침지시키고 약하게 가열 및 초음파 처리 후, 상층액은 주황색이 되었고, 이는 아마도 출발 물질 화합물 12-a이었다. 용액을 다음의 단계에 5회 적용하였다: (1) 탈이온수 (5 mL)의 첨가, (2) 교반하면서 약한 가열 (3) 1분 초음파 처리를 3회 반복, 및 (4) 여과 컬럼 및 프릿 필터를 통해 여과. 추가의 50 ml의 탈이온수를 고체 샘플을 통해 완전히 세척하였다. 이후에, 이를 여과하고 밤새 동결 건조시켜 물을 제거하였다. 생성물의 중량: 0.01701 g (85% 수율). FTIR: 3347 (N-H/ O-H), 2915/ 2851 (C-H), 1756 (에스테르의 C=O/플루오레세인의 C=O), 1716 (에스테르의 C=O/플루오레세인의 C=O), 1643 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1608 (CMC의 C=O/ 방향족 C=C 스트레칭), 1492 (방향족 C=C 스트레칭), 1369 (에스테르의 C-O 스트레치), 1246 (C-O 스트레칭), 1152 (t -OH), 1110 (에스테르의 C-O/ -OH), 842 (평면 C-H 벤딩의 방향족 제거).
중합체 12 의 효소 효능
효소 효능을 PBS (0.99 mL) 중 에스테라제 (0.01 mL)를 혼합하여 달성된 ~50 단위/mL)를 사용하여 시험하였다.
형광 현미경은 중합체 12의 샘플과 대조군 샘플(효소가 없는 PBS 중 중합체 12) 사이의 형광성에 있어서 명백한 관찰가능한 차이를 나타내었으며, 부착된 플루오레세인으로부터의 에스테르 그룹을 방출하는 중합체 상에서 효소에 의한 활성이 존재함을 입증한다.
공초점 현미경의 사용은 중합체 12와 대조군 샘플 사이의 형광성에 있어서의 차이를 가시화하였다. 현미경 셋팅: 깔끔한 획득(smart gain) = 716 v, 깔끔한 상쇄(smart offset) = -2.1 %, 확대 = x20, 핀홀(Pinhole) 크기 = 105.05 μm.
효소 효능을 정량화하고 정밀하게 측정하기 위하여, 추가의 실험을 96 웰 플레이트 및 플레이트 판독기(485 nm로 설정된 여기(excitation), 590 nm로 설정된 방출(emission) 및 1500으로 설정된 획득을 사용한 Fluostar Optima BMG Labtech)를 사용하여 설정하였다. 중합체 12를 320μL의 PBS 속에 분산시키고 와동 혼합하였다. 40 μL의 현탁액을 8개의 웰에 분산시키고 기본선 판독으로서 측정하였다. 다음의 용액을 제조하였다: PBS(약한 효소 용액) 중 에스테라제 58 단위/mL, PBS 중 에스테라제 116 단위/mL(강력한 효소 용액), 1 M NaOH (aq).
N=2개 웰은 시험 분산액에만 첨가된 40 μL의 PBS(대조군)를 가졌다.
N=2개 웰은 시험 분산액에만 피펫팅된 40 μL의 약한 효소 용액을 가졌다.
N=2개 웰은 시험 분산액에만 피펫팅된 40 μL의 강한 효소 용액을 가졌다.
N=2개 웰은 시험 분산액에 피펫팅된 40 μL의 1 M NaOH 용액을 가졌다.
다른 형광 판독을 최종 웰에 첨가한 직후에 기록한 후, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 및 60분 후에 기록을 취하였다. 플레이트를 이후에 회수하고 밤새두어 24시간 후 판독을 수득하였다. 그러나, 형광 검출기가 이의 한계에 도달하였으므로 의미있는 결과는 이 시점의 경우 달성되지 않았다. 도 2 및 도 1은 각각의 시점에서의 형광 판독에서 기본선 판독(입자 현탁액만)을 뺀 것을 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00048
1시간에 걸쳐 음성 대조군에 의해 방출된 형광에 있어서 약간의 증가가 존재한다.
예측한 바와 같이, 약한 및 강력한 에스테라제 용액에 대한 형광은 시간에 걸쳐 증가한다. 강한 에스테라제 용액은 30분 주변에서 장치에 의해 측정될 수 있는 최대 형광 강도에 이른 것으로 여겨진다(기계 포화점은 65000이다).
도 1은 30분 까지 강력한 에스테라제에 대한 플롯을 나타내며 전체 60분에 걸쳐 이러한 및 약한 에스테라제에 대한 추세선을 플롯팅한다.
본 실험에 이어서, 각각의 용액(n=1 만)을 나안으로 실험하기 위해 이의 웰 밖으로 및 유리 바닥 현미경내로 피펫팅하였다. 이는 또한 긴 파장 셋팅으로 설정된 UV 챔버에 두고 영상을 포획하였다(도 2a-c).
이와 함께, 이러한 증거는 합성 방법이 성공적이었으며 효소 절단 단계가 형광 분광기에 의해 정량될 수 있는 양성 반응을 제공하였음을 시사하였다. 중합체 12의 샘플은 아마도 커플링이 약간 과할 수 있음을 시사하는 에스테라제의 첨가없이도 형광을 낸다.
실시예 13: 중합체 13의 제조 (CMC 섬유 사용)
Figure pct00049
DoS가 대략 0.2 내지 0.3 (1.97 g, 8.33 mmol)인 NaCMC 섬유 (2 x AQUACEL 드레싱 10x10 cm)을 손으로 작고, 개방된 섬유(open fiber)로 떨어뜨려 찢고 에탄올/탈이온수 (80:20 v/v)의 용액(180 mL)을 분산시켰다. Dowex 650C 모노스피어 이온 교환 수지를 가하여 산화된 CMC(CMC-H)를 제공하고 대략 30분 동안 혼합하였다. 모노스피어를 여과로 조심스럽게 제거하고 테트라부틸암모늄 하이드록사이드(TBAH) 40% (aq)를 pH가 8 내지 9에 이를 때까지 가하였다. 수득되는 용액을 30분 동안 교반한 후 진공하에 농축시켰다. 건조된 물질을 무수 DMF (150 mL) 속에 질소 하에 용해하였다. 밤새 교반이 요구되며 수득되는 용액은 선명한/황색 색상을 지닌 매우 점성이었다. 무수 DMF (100mL)를 추가로 첨가하여 점도를 감소시키고 혼합물을 약 4℃로 냉각시키고 교반한 후 2-클로로-N-메틸피리디늄 요오다이드 (CMP-I) (1.4875 g, 5.8 mmol)를 가하였다. 잠시 후, 화합물 5-b (1.3567 g, 9.17 mmol)를 무수 트리에틸아민 (5 mL)과 함께 가하였다. 반응을 4℃에서 유지시키고 밤새 교반하였다. 고체를 여과한 후 아세톤 (3 x 100 mL)에 이어서 DMF (3 x 100 mL)로 세척하고, 초음파처리를 세척 단계 동안 수행하여 섬유가 세척 용액 속에 분산되도록 하였다. 고체를 추가로 진공하에 건조시켜 중합체 13을 회백색의 솜털/분말 섬유로서 수득하였다. 중량 = 1.8365 g (60% 수율). 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다(3.08 μmol 아민과 동일한 570 nm에서의 판독). SS NMR: δ (10,000Hz, CP MAS) 176.9 (C=O) 153.4, 142.4, 104.1 (C1), 96.8 (C4), 83.6 (C3), 74.2 (C7, C2, C5),69.4 (C6), 61.9 (C6, 쇼울더). FTIR: 3325 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1589 (CMC의 C=O), 1543, 1408/ 1367/ 1265/ 1022. 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: Mass 318 g mol-1:C 45%, H 7%, N 6%. 실측치: C 42.5%, H 7%, N 3%. 따라서 모든 단량체 중, 대략 35%는 링커 그룹을 함유한다.
중합체 13의 용해도를 화합물 1-c에 대해서와 유사한 방식으로 측정하였다. 데이타는 하기에 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00050
실시예 14: 중합체 14의 제조
Figure pct00051
중합체 13 (0.250 g, 1.396 mmol)을 RB 플라스크에 질소 대기하에 두었다. 화합물 14-a (90 mg, 0.679 mmol)를 무수 DMF (5 mL) 속에 질소 대기 하에 용해시키고 중합체 13에 교반하면서 가하였다. 반응 혼합물을 90분 동안 실온에서 질소 대기 하에 교반한 후 여과하고 DMF (5 x 5 mL) 및 메탄올 (5 x 5 mL)로 세척하였다. 생성물을 진공하에 농축시켜 중합체 14를 회백색 분말 고체로서 수득하였다. 중량 = 0.1852 g (52% 수율). 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다(1.86 μmol 아민과 동일한 570 nm에서의 판독). FTIR: 3251 (N-H/ O-H), 2915/ 2874 (C-H), 1649 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1583 (CMC의 C=O), 1405/ 1316/ 1262/ 1020. 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: Mass 519 g mol-1: C 48%, H 5.8%, N 5.6%. 실측치: C 42.8%, H 6.95%, N 4.25%. 따라서, 모든 단량체 중 대략 53%는 링커 그룹을 함유한다.
중합체 14의 용해도를 화합물 1-c에 대해서와 유사한 방식으로 측정하였다. 데이타는 하기에 나타낸다: x는 불용성 물질을 나타낸다.
Figure pct00052
실시예 15: 중합체 15의 제조
Figure pct00053
중합체 5-a (실시예 5에서와 같이 2.0 g의 NaCMC를 사용하여 제조함)를 무수 DMF (150 mL) 속에 질소하에서 용해하였다. 1분 동안 수회 주기의 초음파처리 외에 ~2시간의 기간 동안 교반 및 ~50℃까지의 가열이 필요하였다. 용액을 ~4℃로 냉각시키고 교반한 후 2-클로로-N-메틸피리디늄 요오다이드 (CMP-I) (1.4875 g, 5.8 mmol)를 가하였다. 용액은 점성의 "젤리"가 되었으며 격렬히 혼합하고 추가로 20 mL의 무수 DMF를 가하여 겔을 파괴하고 희석시켰다. 이러한 직후 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 (12.02 g, 2.02 mL, 9.17 mmol)을 무수 트리에틸아민 (5 mL)과 함께 가하였다. 반응물을 4℃에서 유지시키고 밤새 교반하였다. 아세톤 (100 mL)을 4℃로 냉각시키고 반응 혼합물을 교반하면서 서서히 침지시켰다. 혼합물을 20 mL의 분취량으로 여과하여 선명한, 백색의 겔화된 고체를 수득하였다. 고체를 아세톤 (3 x 100 mL), 에탄올(3 x 100 mL), 물 (1 x 100 mL), 헥산(1 x 100 mL), 및 이어서 다시 물(1 x 100 mL) 속에서 세척한 후 대략 15분 동안 농축시켰다. 수득되는 생성물을 3일의 기간 동안 동결건조시켜 중합체 5-a를 밝은 솜털 고체로서 수득하였다. 중량 = 1.794 g (49% 수율). 카이저 시험을 사용하여 말단 아민의 존재를 확인하였다(1.86 μmol의 아민에 상응하는 570 nm에서의 판독). 13C NMR (101 MHz, 없음) δ 176.51 (C8, CMC의 C=O), 171.09 (C8, 아미드의 C=O), 163.79 (새로운 피크), 153.15, 143.12, 103.40 (C1), 82.39 (C7), 75.81/ 73.99/ 70.07 (C2, C3, C4, C5), 60.81 (C6), 42.54/ 36.84 (C11, C12, C13, C14, C15, C16), 31.45(C9, C14), 28.25. FTIR: 3239 (N-H/ O-H), 2865 (C-H), 1650 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1586 (CMC의 C=O), 1404/ 1388/ 1315/ 1256/ 1053에서 피크. 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량Mass 369 g mol-1:C 47.5%, H 7%, N 4%. 실측치: C 45.5%, H 7.4%, N 5.1%. 따라서 모든 단량체 중, 대략 87.5%가 링커 그룹을 함유한다.
실시예 16: 중합체 16의 제조
Figure pct00054
중합체 15 (1.000 g, 2.273 mmol)를 미세한 분말로 분쇄하고 DMF (15 mL)와 20분 동안 혼합하였다. 화합물 8-a (1.14 g, 2.639 mmol), HBTU (2.59 g, 6.82 mmol) 및 DIPEA (1.19 mL, 6.82 mmol)를 실온에서 교반하면서, 공기에 개방하여(원심분리 튜브 및 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다) 가하였다. 혼합물을 30초 동안 초음파처리한 후 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 커플링된 중간체를 진공하에 건조시켰다. 이러한 중간체 (850 mg)를 피페리딘 : DMF (20:80 v/v)의 용액(20mL)에 가하고 질소 가스로 버블링하여 혼합물을 1시간 동안 교반시킨 후 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 이러한 공정을 이후에 반복하고 아민 중간체를 진공 건조시켰다. 이러한 아민 중간체를 RB 플라스크에 가하고 질소 가스로 퍼징하였다. TCEP (428 mg)를 탈이온수 (2.6 mL)에 용해하고 교반하면서 아민 중간체에 가한 후, 메탄올 (5.2 mL)을 첨가하였다. 시스템을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하면서 유지시킨 후 여과하고 다음의 용액으로 세척하였다: 2:1 메탄올: 물 (90 mL), 1:2 메탄올 : 물 (90 mL), 100% 물 (90 mL) , 100% 메탄올 (90 mL). 수득되는 고체를 진공 건조시켜 중합체 16을 회백색 분말 고체로서 수득하였다. 중량 = 0.3537 g (30% 수율). 엘만 시험으로부터의 황색은 유리 티올이 존재하였음을 나타낸다. 엘만 시험으로부터의 황색은 유리 티올이 존재하였음을 나타낸다. FTIR: 3349 (N-H/ O-H), 2917/ 2872 (C-H), 1716 (아세톤), 1650 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1593 (CMC의 C=O), 1539, 1438/ 1313/ 1255/ 1028. δ C (10,000Hz, CP MAS): 171.8 (C8,C19) 156.5 (Fmoc의 잔류하는 C=O), 142.3 (Fmoc의 잔류하는 CHAr), 127.9 (Fmoc의 잔류하는 CHAr), 120.08, 103.3 (C1), 82.6 (C7), 74.5(C2, C3, C4, C5), 69.9 (x), 61.5(C6), 49.5(C20), 36.37 (C9, C18, C21), 29.52 (C10-18). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 440.7 g mol-1: C 45%, H 7%, N 5.4%, S 4.1%. 실측치: C 47.1%, H 6.74%, N 4.11%, S 0.80%. 따라서, 모든 단량체 중, 대략 20%는 링커 그룹을 함유한다.
용해도 평가는 중합체 16이 pH 9 완충액 (K2HPO4/MgCl2) 속에서 하이드로겔을 형성함을 나타낸다.
실시예 17: 중합체 17의 제조
Figure pct00055
초기에, 중합체 16을 TCEP로 처리하여 형성된 어떠한 이황화물 결합도 탈-커플링시켰다. TCEP (0.1685 g, 0.196 mmol, 4 equiv)를 1 mL의 물에 용해하고 중합체 16 (0.0754 g, 0.147 mmol)에 가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 물 (3 x 10 mL)로 세척하며 동결 건조시켜 고체 회백색/크림색 분말을 수득하고 이를 이후에 DMF (3 x 10 mL)로 세척하였다.
화합물 12-a (0.0250 g, 0.049 mmol, 1 equiv)를 2 mL의 무수 DMF 속에 용해하고 중합체 16에 가하고 이를 N2 (g)로 퍼지하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 호일로 덮어 광으로부터 보호하였다. 밤새 교반한 후, 반응물은 색상이 변하지 않았다. 회백색 고체 분말을 여과하고 다음과 같이 세척하면서, 각각의 단계를 5회 반복하였다: (1) 탈이온수 (5 mL)의 첨가, (2) 교반하면서 약한 가열, (3) 1분 초음파 처리를 3회 반복, (4) 여과 컬럼 및 프릿 필터를 통해 여과, 및 (5) 탈이온수(20mL)로 추가로 플러싱. 수득되는 고체를 여과하고 3시간 동안 동결 건조시켜 중합체 17 회백색 생성물로서 제공하였다. 중량 = 0.063 g (44% 수율). FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2911/ 2869 (C-H),1922, 1756 (에스테르의 C=O/플루오레세인의 C=O), 1720 (에스테르의 C=O/플루오레세인의 C=O), 1647 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1591 (CMC의 C=O/ 방향족 C=C 스트레칭), 1420 (방향족 C=C 스트레칭), 1366 (에스테르의 C-O 스트레치), 1248 (C-O 스트레칭), 1050 (C-O of 에스테르/ -OH), 894 (평면 C-H 벤딩의 방향족 제거. δ C (10,000Hz, CP MAS): 171.0 (C8,C19, C40) 153.1 (C22, C37), 141.7 (C-CAr), 127.0 (C-CAr), 102.4 (C1), 81.9 (C7, C33), 74.5(C2, C3, C4, C5), 68.6 (C23, C34), 61.5(C6), 46.7(C20), 36.5 (C9, C18), 32.1 (C21), 29.5 (C10-17). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 0.7이었던 경우 생성물의 예측치: 질량 797.7 g mol-1: C 52%, H 5%, N 3.5%, S 2.1%. 실측치: C 42.8%, H 6.95%, N 4.02%, S 0.52%. 따라서, 모든 단량체 중, 대략 25%가 링커 그룹을 함유한다.
중합체 17 의 효소 효능
효소 효능을 에스테라제(미가공 에스테라제 (0.01 mL)를 PBS (0.99 mL) 속에서 혼합하여 달성한 ~58 단위/mL)를 사용하여 실험하였다.
효소 효능을 정량화하고 정밀하게 측정하기 위하여, 실험을 96 웰 플레이트 및 플레이트 판독기(485 nm로 설정된 여기, 590 nm로 설정된 방출 및 1500로 설정된 획득을 지닌 Fluostar Optima BMG Labtech)를 사용하여 설정하였다. 샘플의 제조: 0.4 mg의 중합체 17를 640 μL의 PBS 속에 24시간 동안 침지시켰다. 침지 후, PBS 용액은 변경되지 않았고 선명하게 남았다. 혼합물을 원심분리하여 대부분의 고체를 제거하고, 이 시점에서 중합체 17의 샘플은 하이드로겔이 되는 것으로 여겨진다. 이후에, 용출물을 여과하고 분석하였다: 고체 하이드로겔을 추가의 실험을 위해 유지시켰다. 40 μL의 용출액을 각각 분취하기 전에 웰내로 완전히 교반하면서 분산시켰다. 측정은 기본선 판독으로 취하였다. 다음의 용액을 제조하였다: PBS 중 에스테라제 58 단위/mL(약한 효소 용액), PBS 중 에스테라제 116 단위/mL(강한 효소 용액).
N=4개의 웰은 시험 분산액에만 첨가된 40 μL의 PBS를 가졌다(대조군).
N=4개의 웰은 시험 분산액에 피펫팅된 40 μL의 약한 효소 용액을 가졌다.
N=4개의 웰은 시험 분산액에 피펫팅된 40 μL의 강력한 효소 용액을 가졌다.
다른 형광 판독을 다른 형광 판독을 최종 웰에 첨가하기 직전에 기록한 후, 160분 동안 60초마다 기록을 취하였다. 도 3은 각각의 시점에서의 형광 판독에서 기본선 판독(입자 현탁액만)을 뺀 것을 나타낸다. 장치는 앞서 수행된 바와 같이 본 실험 동안에 포화도에 이르지 않았다. 예측한 바와 같이, 약한 및 강한 에스테라제 용액에 대한 형광은 시간에 따라 증가하였다.
음성 대조군 샘플의 형광(효소가 없고, PBS만 있는 샘플)은 시간에 따라 약간 증가하였다.
상기 실험에 더하여, 추가의 대조군 실험을 고체 여액을 사용하여 수행하였다. 고체를 640 μL의 PBS에 가하고, 와동 혼합하고 양호한 분산이 관찰될때까지 초음파 처리하였다. 용액을 위에서 기술한 바와 동일한 역학적 방법으로 분석하였다(결과에 대해 도 4 참고). 이와 함께, 본 증거는 합성 방법이 성공적이었으며 효소 절단 단계가 형광 분광기에 의해 적량화할 수 있는 양성 반응을 제공하을 시사한다. 중합체 17은 에스테라제의 부재하에서 중합체 12와 같은 형광성이 아니며, 이는 형광성 표지가 중합체에 거의 부착되어 있지 않음을 나타낸다.
실시예 18: 중합체 18의 제조
Figure pct00056
초기에 중합체 8을 TCEP로 처리하여 형성된 어떠한 이황화물 결합도 탈-커플링시켰다. TCEP (0.0243 g, 0.0848 mmol, 4 equiv)를 1 mL의 물 속에 용해하고 중합체 8 (0.01 g, 0.0212 mmol)에 가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 물 (3 x 10 mL)로 세척하며 동결-건조시켜 고체 회백색/크림색 분말을 수득하고 이를 이후 DMF (3 x 10 mL)로 세척하였다
메톡시폴리에틸렌글리콜 말레이미드 (화합물 18-a) (0.01 g, 0.0543mmol, 2.5 equiv)를 2 mL의 무수 DMF 속에 용해하고 중합체 8에 가하고 이를 N2(g)로 퍼지하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 호일로 덮어 광으로부터 보호하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 적색이 되도록 하고 여과하는 경우, 고체 상이 없었다. 여과기를 DMF (5 mL)로 세정하고 용액을 합하고 진공하에 환원시켜 선명한/황색 오일(중량 =0.0106 g)을 수득하였다. 급냉시킨 탈이온수 (2 mL)를 4℃에서 오일에 서서히 적가한 후 동결 건조시켜 중합체 18을 회백색/분홍색 왁스성 고체로서 수득하였다. 중량 = 6.42 mg. 비-정량적 카이저 시험(Kaiser test)은 유리 아민이 존재하지 않음을 나타낸다. FTIR: ~3350 (작은, N-H/ O-H), 2881 (C-H), 2740 (C-H), 1964, 1710 (5-원 사이클릭 케톤), 1665 (C=O, 아미드), 1359 (에스테르의 C-O 스트레치), 1240 (C-O 스트레칭), 1145/ 1100 (에스테르/-OH의 C-O), 842 (평면 C-H 벤딩으로부터 빠져나온 방향족).
용해도 평가는 클로로포름, PBS, 및 DMF에서 용이한 용해도를 나타내었다.
실시예 19: 중합체 19의 제조
Figure pct00057
중합체 5 (300 mg, 0.81 mmol)를 미세 분말로 분쇄하고 DMF (20 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Ala-OH(1.00 g, 2.31 mmol), HBTU (1.84 g, 4.86 mmol), EDC(100mg, 0.52mmol) 및 DIPEA (6.2 mL, 4.86 mmol)를 큰 원심분리 튜브에 가하고 질소로 퍼지하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 19-a를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.2932 g. 양성 카이저 시험은 불완전한 커플링을 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1589 (CMC의 C=O), 1403/ 1022, 896.
중합체 19-a (207 mg)를 피페리딘 : DMF (20:80 v/v) 용액 (20 mL)에 두고 질소 가스로 퍼지하고 1시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 본 과정을 이후 반복하고, 생성물을 건조시켜 중합체 19를 회백색 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.345 g (60% 수율). 양성 카이저 시험 결과는 유리 아민의 존재를 입증하였다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1589 (CMC의 C=O), 1403/1022, 896.
실시예 20: 중합체 20의 제조
Figure pct00058
중합체 19 (200 mg, 0.470 mmol)를 미세 분말로 분쇄하고 DMF (20 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Ala-OH(0.439 g, 1.41 mmol), HBTU (0.539 g, 1.41 mmol), EDC(270mg, 1.41mmol) 및 DIPEA (0.018 mL, 1.41 mmol)를 큰 원심분리 튜브에 가하고 질소로 퍼지하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 20-a를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.1576 g. 양성 카이저 시험 결과는 불완전한 커플링을 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2900/ 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1584 (CMC의 C=O), 1542 (), 1445/1403/ 1022, 899에서 피크.
중합체 20-a (158 mg)를 피페리딘 : DMF (20:80 v/v) 용액 (20 mL)에 두고 질소 가스로 퍼지하고 1시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 본 과정을 이후 반복하고, 생성물을 건조시켜 중합체 20을 회백색 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.1391 g (58% 수율). 양성 카이저 시험 결과는 유리 아민의 존재를 입증하였다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2900/ 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1584 (CMC의 C=O), 1403/ 1025, 900에서 피크.
실시예 21: 중합체 21의 제조
Figure pct00059
중합체 20 (150 mg, 0.2785 mmol)을 미세 분말로 분쇄하고 DMF (20 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Ala-OH(0.282 g, 0.836 mmol), HBTU (0.317 g, 0.8356 mmol), EDC (160 mg, 0.836 mmol) 및 DIPEA (0.20 mL, 0.836 mmol)를 여과 컬럼 튜브에 가하고 밀봉하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 21-a를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.10967 g. 양성 카이저 시험 결과는 미반응한 아민을 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1584 (CMC의 C=O), 1403/1025에서 피크.
중합체 21-a (100 mg)를 피페리딘 : DMF (20:80 v/v) 용액 (20 mL)에 두고 1시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 본 과정을 이후 반복하고, 생성물을 건조시켜 중합체 21을 회백색 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.08020 g (47% 수율). 양성 카이저 시험 결과는 유리 아민의 존재를 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1584 (CMC의 C=O), 1453/1403/1024, 962/906/841에서 피크.
실시예 22: 중합체 22의 제조
Figure pct00060
중합체 21 (100 mg, 0.165 mmol)을 미세 분말로 분쇄하고 DMF (10 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Val-OH(0.167 g, 0.494 mmol), HBTU (0.187 g, 0.494 mmol), EDC (95 mg, 0.494 mmol) 및 DIPEA (0.064 mL, 0.494 mmol)를 여과 컬럼 튜브에 가하고 밀봉하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 21-a를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.0603 g. 양성 카이저 시험은 미반응한 아민의 존재를 나타내었다.
중합체 22-a (60 mg)를 피페리딘 : DMF (20:80 v/v) 용액 (20 mL)에 두고 1시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 본 과정을 이후 반복하고, 생성물을 건조시켜 중합체 22를 회백색 분말로서 수득하였다. 중량 = 0.0553 g (48% 수율). 양성 카이저 시험 결과는 유리 아민의 존재를 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1585 (CMC의 C=O), 1453/1403/ 1024/1095/ 1058, 961, 841에서 피크.
실시예 23: 중합체 23의 제조
Figure pct00061
중합체 22 (50 mg, 0.707 mmol)를 미세 분말로 분쇄하고 DMF (10 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-Cys(StBu)-OH(716 g, 2.122 mmol), HBTU (805 g, 2.122 mmol), EDC (407 mg, 2.122 mmol) 및 DIPEA (0.274 mL, 2.122 mmol)를 여과 컬럼 튜브에 가하고 밀봉하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 23-a를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.0253 g. 양성 카이저 시험은 미반응한 아민의 존재를 나타내었다. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (아미드), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1585 (CMC의 C=O), 1453/1403/ 1024/1095/ 1058, 961, 841.
중합체 23-a (25 mg)를 물(5mL) 중 TCEP의 용액에 두고 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 고체를 여과하고 에탄올(3 x 50 mL) 및 DCM (3 x 50 mL)으로 세척하였다. 본 과정을 이후 반복하고, 생성물을 건조시켜 중합체 23을 회백색 분말로서 수득하였다. 양성 카이저 시험 결과는 유리 아민의 존재를 나타내었다. 이러한 물질을 추가의 특성화없이 실시예 24에서 사용하였다.
실시예 24: 중합체 24의 제조
Figure pct00062
TCEP (0.0357g, 0.125 mmol, 4 equiv)를 1 mL의 물에 용해하고 중합체 23 (25.3 mg, 0.0312 mmol)에 가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 물 (10 mL x 3)로 세척하고 동결 건조시켜 고체 회백색/크림색 분말을 수득한 후 이를 DMF (10 mL x 3)로 세척하였다.
플루오레세인디아세테이트-5-말레이미드(화합물 12-a) (0.016 g, 0.0312 mmol, 1 equivalent)를 3 mL 무수 DMF 속에 용해하고 예비-처리된 중합체 23에 가하고 이를 N2 (g)로 퍼지하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 호일로 덮어 광으로부터 보호하였다. 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다. 고체를 여과하고 DCM (5 x 20 mL) 및 메탄올 (5 x 20 mL) 및 메탄올(5 x 20 mL)로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 24를 회백색 분말로서 제공하였다. 중량 = 0.0156 g (32% 수율). FTIR: (vmax/ cm-1) 3286 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1722 (아세톤), 1647 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1589 (CMC의 C=O), 1545 (C-C Ar. 플루오레세인), 1409/ 1317/ 1250/ 1024/ 894. 13C CP MAS NMR: CMC 0.7 DoS (출발 물질): δ C (13,000Hz, CP MAS) 61.7 (C6), 74.5 (C7, C2, C5), 82.5 (쇼울더, C3), 97.0 (C4), 103.3 (C1), 177 (C=O); CMC- PEG di-아민: δ C (13,000Hz, CP MAS) 13.4 (C14), 20.1 (지정되지 않음), 23.4 (지정되지 않음), 30.6 (C9), 61.7 (C6), 70 (쇼울더, C7), 74.5 (C2, C5), 82.5 (C3), 95 (C4), 103.3 (C1), 113 (지정되지 않음), 142 (지정되지 않음), 152 (지정되지 않음), 169.7 (링커의 C=O), 177.1 (CMC의 C=O).
실시예 25: 중합체 25 (섬유)의 제조
Figure pct00063
중합체 13을 DMF (30 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-C(StBu)-OH (1.5 g, 3.5 mmol), HBTU (3.09 g, 8.14 mmol) 및 DIPEA (1.05 mL, 8.14 mmol)를 실온에서 교반하면서 가하고, 공기에 개방시켰다(원심분리 튜브 및 실험실 회전자를 사용하여 혼합을 밤새 촉진하였다). 밤새 회전시킨 후, 고체를 여과하고 DCM (5 x 50 mL), 메탄올 (5 x 50 mL) 및 다시 DCM (5 x 50 mL)으로 세척하였다. 수득되는 생성물을 건조시켜 중합체 25를 제공하고 이를 실시예 (실시예 26)에 직접 사용하였다.
실시예 26: 중합체 26의 제조
Figure pct00064
중합체 26을 실시예 12에서와 유사한 공정을 사용하여 제조하였다. 외관: 회백색, 분말/고체. 중량 = 1.258 g (59% 수율). FTIR: 3339 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1736 (아세톤), 1648 (C=O, 커플링된 생성물의 아미드), 1549 (CMC의 C=O), 1419, 1363, 1313, 1201. δ C (10,000Hz, CP MAS): 30 (C9, 19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 54 (C16), 60 (C6), 70-74 (broad, C2,3,5,7), 83 (쇼울더, C4), 92 (C17), 97, 104 (C1), 120 (C24), 128 (C25,26,27), 142 (C28), 156 (작음, C20, C=O 카바메이트), 171 (C8 아미드의 카보닐). 원소 분석: 원료 물질의 DoS가 1이었고 링커 그룹으로 완전 전환된 경우의 생성물의 예측치: 질량 781 g mol-1 : C 55%, H 7%, N 5 %, S 8%. 실측치: C 46%, H 7%, N 2%, S (수행되지 않음). S 국면을 고려하고 % N를 계산하면 % N 가능성 (2/3.5) = 링커 그룹의 57% 커플링을 나타낸다. S 국면을 고려하고 % N를 계산하면 % N 가능성(2/3.5) = 링커 그룹의 57% 커플링을 나타낸다. 따라서 모든 단량체 중, ~40 %이 링커 그룹을 함유한다.
실시예 27: 중합체 27의 제조
Figure pct00065
무수 DMF (2.0 mL) 중 아미노페닐 플루오레세인 (5 mg, 0.018 mmol) 및 HBTU (14 mg, 0.036 mmol)의 용액을 제조하였다. CMC-PEG-NH2 (5-a) (0.13 mg, 0.036 mmol)를 반응 혼합물에 가하고 실온에서 대략 24시간 동안 호일 커버를 사용하여 광으로부터 보호하면서 교반하였다. 생성물을 여과하고 에탄올(10 mLХ3) 및 DMF (5Х10 mL)로 세척한 후 진공하에 농축시켜 고체 적색/주황색 생성물 (27) (12.0 mg, 43%)을 수득하였다. FTIR (vmax/ cm-1) 3367 (N-H/ O-H), 2932 (C-H), 1702 (APF의 아미드), 1655 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1555 (HNCO, CMC), 1494, 1437, 1413, 1387 (Ar. C=C 벤딩), 1106 (OCHR, 알콕시 APF), 838, 759, 722, 557 (ar. CH 벤딩).
실시예 28: 중합체 28의 제조
Figure pct00066
CMC-Cys (7) (10 mg, 0.029 mmol 1eq.)를 탈이온수(1mL)중 TCEP (16.8 mg, 0.058 mmol, 4eq.)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 교반하여 어떠한 원하지 않는 이황화물 결합도 탈-커플링시켰다. 고체를 여과하고 물(10mLХ3)로 세척하고, 동결-건조시킨 후 DMF (10mLХ3)로 다시 세척하였다. 플루오레세인 디아세테이트 -5- 말레이미드 (12-a) (11 mg, 0.029mmol, 1 eq.)를 무수 DMF (3mL) 속에 용해하고 질소 대기하에 CMC-CYS에 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 광으로부터 보호하였다. 생성물을 물 (3Х100mL) 및 DMF (1Х100mL)로 세척하여 불투명한 왁스성 고체(28) (0.017 g, 85%)를 수득하였다. FTIR (vmax/ cm-1) 3365 (O-H), 2971/2910, (N-H, CH) 2883 (SH), 1728 (COOH, 산), 1677 (CONH, 아미드), 1640 (HNCO, 펩타이드), 1598 (HNCOO, CMC), 1409, 1371 (COO), 1307 (ar. C=C bending), 1216, 1019 (CN, 3급 아민); 물, pH9 인산염 완충액 및 일반적인 실험실 용매(아세톤, 메탄올, 에탄올, THF, DCM 및 DMF) 속에서 불용성인 용해도.
실시예 29: 중합체 29의 제조
Figure pct00067
CMC-PEG-NH2 (15) (1.000 g, 2.27 mmol)를 미세 분말로 분쇄하고 DMF (15 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-C(StBu)-OH (1.14 g, 2.639 mmol, 1.2 eq.), HBTU (2.59 g, 6.8181 mmol) 및 DIPEA (1.19 mL, 6.8181 mmol)를 실온에서 밤새 교반하면서 가하였다. 생성물을 여과하고 DCM (5Х20 mL) 및 메탄올 (5Х20 mL)로 세척한 후 진공하에 환원시켰다. 보호된 생성물을 이후에 StBu 탈보호하고 각각의 탈-보호 단계를 3회 반복한 후 감압하에 환원시켜 백색 고체 분말(29-a) (0.236 g, 5%)을 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 176.52 (CMC 중 C-8 비율), 171.84 (C-8, C-19) , 156.45, 142.32, 127.85- 120.08 (C-Ar, Fmoc), 113.93, 103.26 (C-1), 82.60 (C-4), 74.50 (C-2, C-3, C-5), 69.92 (C-7), 61.45 (C-6), 54.93 (C-20), 49.52, 47.30, 41.58, 38.72- 23.08 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-15, C-16, C-17, C-18, C-20); FTIR (vmax/ cm-1) 3310 (O-H), 2915 (N-H, C-H), 2868 (S-H), 1731 (COOH, 산), 1650 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1592 (HNCOO, CMC), 1538 (HNCOO, 펩타이드), 1441, 1417, 1361 (COO), 1310 (ar. C=C bending), 1252 (아미드 CO 스트레치), 1031 (CN, 3급 아민), 841; 탈보호된 생성물에 대한 EA 예측치 C:45.3%, H:7.5%, N:4.7%, S:7.1%, 실측치 C:47.1%, H:7.8%, N:6.7%, S:10.1% 따라서 커플링 수율은 11%이고; 물 및 일반적인 실험실 용매 (아세톤, 메탄올, 에탄올, THF, DCM 및 DMF) 속에서 불용성, pH9 인산염 완충액에서 시간에 걸쳐 가용성인 용해도; 엘만 시험 양성.
중간체 (29-a) (75.4 mg, 0.147 mmol 3eq.)를 실온에서 탈이온 수(1mL) 중 TCEP (168.5 mg, 0.196 mmol, 4eq.)와 함께 교반하여 어떠한 원치않은 이황화물 결합도 탈-커플링시켰다. 고체를 여과하고 물 (10mLХ3)로 세척하고, 동결-건조시킨 후 DMF (10mLХ3)로 다시 세척하였다. 플루오레세인 디아세테이트 -5- 말레이미드 (12-a) (25.0 mg, 0.049mmol, 1 eq.)를 무수 DMF (2mL)에 용해하고 CMC-PEG-NH-CYS (29-a)에 질소 대기하에 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 광으로부터 보호하였다. 반응 혼합물을 진공하에 환원시키고, 생성물을 물 (~75mL)로 5회 세척하고 동결-건조시켜 회백색 분말(29) (63.0 mg, 44%)을 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 176.38 (C-8 of CMC 비율), 171.00 (C-8, C-19, C-38) , 153.12 (C-22), 141.67, 135.49-, 119.80 (C-Ar, Fmoc, 플루오레세인), 102.43 (C-1), 81.92 (C-4), 74.47 (C-2, C-3, C-5), 70.30 (C-7), 68.61, 61.45 (C-6), 46.73 (C-42), 36.47- 29.48 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-15, C-16, C-17, C-18, C-20); FTIR (vmax/ cm-1) 3315 (O-H), 2911 (N-H, C-H), 2869 (S-H), 1922 , 1720 (COOR, 접합된 에스테르, 플루오레세인), 1647 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1591 (HNCOO, CMC), 1542 (CONH, 펩타이드), 1420, 1366/ 1309, (Ar. C=C 벤딩), 1248 (C-O 스트레칭), 1213, 1050 (CN, 3급 아민), 842, 581(ar. CH 벤딩); EA 예측치 C:51.1%, H:5.8%, N:3.7%, S:2.1%, 실측치 C:42.8%, H:7.0%, N:4.0%, S:0.5% 따라서 커플링 수율은 24%이다.
실시예 30: 중합체 30 (섬유)의 제조
Figure pct00068
DoS 0.3의 NaCMC 섬유(2.0 g, 8.33 mmol)를 에탄올 : 탈이온수 (80:20 v/v)의 용액 (180 mL)에 분산하여 1% 현탁액을 수득하였다. Dowex 650C 모노스피어 이온 교환 수지를 30분 동안 교반하면서 가하였다. 모노스피어를 여과로 제거한 후 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 (TBAH) 40% (aq)를 0.1mL 분취량으로 pH가 8 내지 9 (3.0 mL, 1.16 mmol)일 때까지 가하였다. 수득되는 용액을 30분 동안 교반한 후 진공 속에서 환원시켰다. 필름-유사 물질을 무수 DMF (100 mL) 속에 질소 대기하에 용해하고, 균일한 질감(texture)의 점성 겔-유사 용액을 생성하기 위해 교반 및 약한 가열이 밤새 요구되었다. 용액을 대략 4℃로 냉각시키고 CMP-I (1.48 g, 5.8 mmol)를 격렬히 교반하면서 가하였다. 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (1.36 g, 9.17 mmol)를 반응 혼합물에 무수 트리에틸아민 (3mL)과 함께 가하였다. 반응물을 4℃에서 유지시키고 최소 3시간 동안 교한한 후, 고체를 여과하고 99% 아세톤 (3 x100 mL) 및 DCM (3Х100mL)으로 세척하고, 초음파 처리를 각각의 세척 주기 동안에 1분간 수행하여 섬유 덩어리가 어떠한 오염물도 해체하여 방출하도록 하였다. 생성물을 감압하에 환원시켜 백색 섬유성 고체(30-a) (1.8g, 60%)를 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 176.93 (CMC 중 C-8 비율), 171.96 (C-8), 153.41, 142.40, 104.11, (C-1), 96.80, 83.55 (C-4), 74.18 (C-2, C-3, C-5),69.39 (C-7), 61.89 (C-6), 40.48 (광폭, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14); FTIR (vmax/ cm-1) 3325 (O-H), 2872 (N-H, C-H), 1648 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1589 (HNCOO, CMC), 1543, 1408, 1367 (CHO), 1314, 1265 (아미드 CO 스트레치), 1022 (CN, 3급 아민), 896; EA 예측치 C:41.7%, H:7.0%, N:2.3 %, 실측치 C:42.6%, H:6.3%, N:2.9% 따라서 커플링 수율은 127%이다; 물 및 일반적인 실험실 용매(아세톤, 메탄올, 에탄올, THF, DCM 및 DMF) 속에서 불용성이고, pH9 인산염 완충액 및 PBS 속에서 시간에 걸쳐 가용성인 용해도; 카이저 시험 양성, 3.08 μ.mol 아민.
섬유 형태의 CMC-PEG-NH2 (30-a) (1.0 g, 2.86 mmol)를 DMF (30 mL)와 20분 동안 혼합하였다. Fmoc-C(StBu)-OH (1.5 g, 3.5 mmol), HBTU (3.09 g, 8.14 mmol) 및 DIPEA (1.10 mL, 8.57 mmol)를 실온에서 교반하면서 가하였다. 생성물을 여과하고 DCM (5Х50 mL), 메탄올 (5Х50 mL), DCM (5Х50 mL)으로 다시 세척한 후 진공 하에 환원시켜 백색 고체 분말(30-b) (1.23 g, 59%)을 수득하였다. 주목: 보호된 생성물은 이 단계에서 Fmoc 또는 StBu 탈보호되지 않았다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 176.38 (작은 피크, CMC 중 C-8 비율), 171.93 (C-8, C-15) , 156.28 (C-20), 141.73, 127.61- 120.01 (C-Ar, Fmoc), 104.17 (C-1), 96.81, 87.27, 82.86 (C-4), 74.29 (C-2, C-3, C-5), 69.17 (C-7), 62.17 (C-6), 60.00 (C-21), 54.22 (C-16), 46.87 (C-22), 46.87, 39.36- 29.49 (C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-17, C-19); FTIR (vmax/ cm-1) 3339 (O-H), 2872 (N-H, C-H), 1736 (COOH, acid), 1648(CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1549 (HNCOO, CMC), 1419, 1363 (COO), 1201, 1031 (CN, tertiary 아민), 841; EA 예측치 C:44.6%, H:6.7%, N:1.6%, S:2.5%, 실측치 C:46.0%, H:6.5%, N:2.2%, S: 이용가능하기에 충분하지 않은 물질; 물 및 일반적인 실험실 용매(아세톤, 메탄올, 에탄올, THF, DCM 및 DMF) 속에서 불용성, pH9 인산염 완충액 속에서 시간에 걸쳐 가용성인 용해도; 엘만 시험 양성.
섬유 형태(30-b) (0.5965g, 1.265 mmol)의 CMC-PEG-Cys(Fmoc)StBu를 실온에서 30분 동안 TCEP (1.45g, 5.060 mmol, 4eq.)와 함께 탈이온수(3mL) 속에서 교반하여 어떠한 원치않은 이황화물 결합도 탈-커플링하였다. 고체를 여과하고 물 (10mLХ3)로 세척하며, 동결 건조시킨 후 DMF (10mLХ3)로 다시 세척하였다. 플루오레세인 디아세테이트-5-말레이미드 (12-a) (0.125g, 0.240 mmol, 1eq.)를 무수 DMF (15mL) 속에 용해하고 CMC-PEG-NH-CYS에 질소하에 가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고 광으로부터 보호하였다. 반응 혼합물을 진공하에 환원시키고, 생성물을 DCM (3x50mL), 메탄올 (3x50mL)로 세척하고 진공하에 환원시켰다. 회백색 고체 섬유를 이후에 약하게 가열 및 교반 하면서 물 (5x75mL)로 세척하고, 초음파 처리한 후 여과하고 동결건조시켜 회백색 고체 섬유 (30) (1.10g, 72%)를 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 174.88 (CMC 중 C-8 비율), 172.30 (C-8, C-15, C-34) , 141.36, 129.34- 126.65 (C-Ar, Fmoc, 플루오레세인), 104.58 (C-1), 86.94, 82.52 (C-4), 78.56- 72.96 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69.74, 61.45, 60.35 (C-6), 38.69-21.02 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14); FTIR (vmax/ cm-1) 3315 (O-H), 2868 (N-H, C-H), 1728 (COOR, 접합된 에스테르, 플루오레세인), 1647 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드), 1542 (CONH, 펩타이드의 아미드 커플링, NHCOO CMC), 1419, 1364 (Ar. C=C 벤딩), 1264 (C-O 스트레칭), 1152 (OCHR), 1018 (CN 3급 아민), 879; EA 예측치 C:50.9%, H:6.9%, N:5.5 %, S:1.0%; 실측치 C:30.8 %, H:8.6%, N:1.3%, S: <0.3% 따라서 커플링 수율은 24%이다.
실시예 30: 중합체 31의 제조
Figure pct00069
분말 형태의 CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc)StBu(23-a) (525 mg, 439 mmol)를 실온에서 30분 동안 TCEP (503.4 mg, 0.1756 mmol, 4eq.)와 함께 탈이온 수(23mL) 속에서 교반하여 어떠한 원치않은 이황화물 결합도 탈-커플링하였다. 고체를 여과하고 물 (50mLХ3), 메탄올 (50mLХ3), 에탄올 (50mLХ3) 및 이후 다시 물 (50mLХ3)로 세척한 후, 이를 동결-건조시킨 후 DMF (50mLХ3)로 다시 세척하였다. 플루오레세인-5-말레이미드 (25mg, 59 mmol, 0.1eq.)를 무수 DMF (70mL) 속에 용해하고 CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc)에 질소 대기하에 가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 광으로부터 보호하였다. 반응 혼합물을 진공하에 환원시키고, 생성물을 DCM (3x50mL), 메탄올 (3x50mL), 탈이온 수(3x50mL), 다시 DCM 3x50mL) 및 다시 메탄올 (3x50mL) 및 메탄올 (3x50mL)로 세척하고 진공하에 환원시켜 회백색 고체(31) (436 mg, 68%)를 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 176.70 (CMC 중 C-8 비율, C-39, C-41), 171.39 (C-8, C-15, C-18, C-21, C-26, C-30, C-45) , 153.37 (C-33, C-51), 142.19 (C-36, C-37, C-Ar), 127.57- 120.48 (C-Ar), 103.85, (C-1), 102.63 (C-Ar), 97.55, 82.31 (C-4), 74.34 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69.85 (C-23), 60.80 (C-6, C-27), 52.23-48.37 (C-16, C-19, C-25, C-35), 42.10 (C-9, C-14, C-38), 38.70-25.05 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14), 18.45 (C-17, C-20, C-29), 14.11; FTIR (vmax/ cm-1) 3340/ 3294 (O-H), 2914/ 2862 (N-H, C-H), 1737 (COOH, 산), 1645 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드/ COOR, 접합된 에스테르, 플루오레세인), 1593 (HNCOO, CMC), 1543 (CONH, 펩타이드), 1414, 1375 (COO), 1343 (ar. C=C bending), 1262 (C-O 스트레칭), 1230, 1056 (CN, 3급 아민/ OCHR), 897, 841, 764, 556 (ar. CH 벤딩); EA 예측치 C:53.4%, H:6.0%, N:5.4%, S:1.5 %, 실측치 C:47.1 %, H: 6.7%, N: 4.1%, S: 0.8% 따라서 커플링 전환은 52%이다.
실시예 32: 중합체 32의 제조
Figure pct00070
분말 형태의 CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc)StBu(23-a) (175 mg, 146 mmol)를 실온에서 30분 동안 TCEP (168 mg, 585 mmol, 4eq.)와 함께 탈이온 수(23mL) 속에서 교반하여 어떠한 원치않는 이황하물 결합도 탈-커플링하였다. 고체를 여과하고 물 (50mLХ3), 메탄올 (50mLХ3), 에탄올 (50mLХ3) 및 이어서 다시 물 (50mLХ3)로 세척한 후, 이를 동결-건조시킨 후 DMF (50mLХ3)로 다시 세척하였다. N-Bromo페닐 말레이미드 (37mg, 0146 mmol, 1eq.)를 무수 DMF (20mL) 속에 용해하고 CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc)에 질소 대기하에 가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 광으로부터 보호하였다. 반응 혼합물을 진공하에 환원시키고, 생성물을 DCM (3x50mL), 메탄올 (3x50mL), 탈이온 수 (3x50mL), 다시 DCM 3x50mL) 및 다시 메탄올 (3x50mL) 및 메탄올 (3x50mL)로 세척하고 진공하에 환원시켜 회백색 고체(32) (129 mg, 69%)를 수득하였다. 고체 상태 13C NMR (10,000 MHz, CP MAS) 171.16 (C-8, C-15, C-18, C-21, C-26, C-30, C-38, C-39), 153.33 (C-32), 142.03, 127.45-113.03 (C-Ar, Fmoc, 플루오레세인), 102.74 (C-1), 97.09 , 82.15 (C-4), 74.39 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69.84, 61.21, 57.42 (C-6, C-31), 47.91 (C-16, C-19, C-27), 38.76- 22.56 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14) 18.33-14.16 (C-17, C-20, C-29); FTIR (vmax/ cm-1) 3322 (O-H), 2901/ 2872 (N-H, C-H), 2103, 1788 (COOH, acid), 1644 (CONH, 커플링된 생성물의 아미드/ COOR, 접합된 에스테르, 플루오레세인), 1594 (HNCOO, CMC), 1544/ 1514 (CONH, 펩타이드), 1349/ 1304 (ar. C=C 벤딩), 1251 (C-O 스트레칭), 1230, 1025 (CN, 3급 아민/ OCHR), 898, 843, 738, 556 (ar. CH 벤딩); EA 예측치 C:50.0%, H:6.1%, N:6.1%, S:1.8 %, Br: 4.3% 실측치 C:46.3 %, H: 6.7%, N: 5.2%, S: 0.33%, Br: 검출되지 않음, 따라서 커플링 전환은 17%이다.
실시예 33
펩타이드의 프로테아제/효소 절단
트립신, 키모트립신 및 서몰라이신과 같은 다른 프로테아제를 포함하는 상처 특이적인 프로테아제의 활성을 평가하였다. 트립신은 P1-P1'를 절단하며, 여기서 P1은 Lys 또는 Arg이고, P1'는 비-특이적이다(프롤린에 의해 후속되는 경우 예외). 키모트립신은 P1-P1'(여기서 P1은 어떠한 방향족 아미노 잔기, Trp, Tyr 또는 Phe이고, P1'는 비-특이적이다)를 절단한다. 서모라이신은 P2-P1-P1'-P2'(여기서 P1은 비-특이적이고, P1'는 Leu, Phe, Ile, Val, Met, Ala이며 P2'는 Pro가 아니다)를 절단하는 메탈로엔도펩티다제이다.
에스테라제는 카복실산 에스테르의 에스테르 연결을 가수분해하므로 이는 아미노산 서열을 특이적으로 가수분해하는, 프로테아제에 대해 차등적으로 거동한다. 효소 검정에 사용된 기질은 CMC-PEG-NH-Phe-Phe-Lys(답실)이며 효소 활성은 UV-가시성을 기반으로 하는 방법으로 측정하였다. Phe-Phe-Lys (Dabsyl) 서열은 키모트립신으로 가수분해할 수 있다. 트립신은 이러한 서열을 절단하지 않으므로 음성 대조군으로서 사용되었다.
기질 CMC-PEG-NH-Cys-말레이미드 플루오레세인 디아세테이트에 있어서 효소 활성을 공초점 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 고체 입자가 우선 단독으로 보인 후 에스테라제 용액(~50 단위/mL)을 첨가하였다. 현미경 영상은 효소 용액을 샘플에 가하는 경우 관찰된 형광에 있어서의 증가를 입증한다. 이러한 방법을 사용하는 장점은 입자를 가시화할 수 있고 CMC 중합체에 대한 플루오레세인 디아세테이트의 커플링을 입증한 효소 용액의 첨가에 있어서 형광 강도의 차이를 관찰할 수 있다는 것이다. 대안적으로, 다중-플레이트 판독기를 사용하여 기질의 절단 및 미카엘리스-멘톤 역학(Michaelis-Menton kinetics)을 사용하여 정량한 결과를 평가할 수 있다.
하나의 실험에서, CMC-PEG-NH-Cys-말레이미드-플루오레세인 디아세테이트 분말에 있어서 에스테라제의 효과를 측정하였다. 우선, CMC-PEG-NH-Cys-말레이미드-플루오레세인 디아세테이트 분말 (0.2 mg)을 PBS (320 μL) 속에 분산시켰다. 화합물을 분산시키기 위해 초음파, 와동 혼합 및 약한 가열이 필요하였다. 40 μL의 기질 현탁액을 96-웰 플레이트에 가한 후, 약한 에스테라제 용액(58 U/mL), 강한 에스테라제 용액(116 U/mL) 또는 PBS (음성 대조군)를 가하였다(웰당 40μL). 2시간에 걸쳐 5분의 주기 기간을 형광성 측정을 위해 선택하였다.
2개의 상이한 강도의 에스테라제 용액을 사용하므로 반응율에 있어서의 어떠한 차이도 분석할 수 있었다. 형광 강도에 있어서의 변화는 각각의 후속적인 시점으로부터 0점 판독(기본선)을 유추함으로써 계산하였다.
증가된 형광이 약한 (58 U/mL) 및 강한 (116 U/mL) 에스테라제 용액과 함께 항온처리한 샘플 속에서 관찰되었으며, 이는 시간에 걸쳐 증가하였다. 강한 에스테라제 용액은 약한 에스테라제 용액의 반응율의 3.5배의 증가를 나타내었으며 이후 이는 약 30분째에 포화점에 이르렀다(45000 단위의 강도).
스페이서 길이의 효과
에스테라제 검정에서 보다 긴 PEG 쇄 길이의 효과를 시험하기 위하여, 형광 측정을 77개의 (CMC-'보다 긴' PEG-NH-Cys (Fmoc)-말레이미드 플루오레세인 디아세테이트)에 대해 기록하였다. 이러한 시험에서, 4개의 반복을 샘플마다 수행하고 1분당 주기를 2시간의 기간에 걸쳐 기록하였다. 보다 짧은 기질로서, 에스테라제와 보다 긴 기질(77)의 항온처리는 형광의 검출을 가져왔다. 116 U/mL (강한) 에스테라제 샘플을 40분 후 피크가 되었고; 58 U/mL (약한) 에스테라제 샘플은 80분 후 피크가 되었다. 116 U/mL 에스테라제 반응율은 58 U/mL 샘플의 2배였으므로, 효소 농도의 2배는 반응율의 2배를 유발하였다. 반응율은 보다 짧은 PEG 링커 등가물의 것보다 유의적으로 더 낮았다. 이러한 반응은 CMC로의 펩타이드의 로딩이 보다 낮기 때문에 예측치였다.
섬유 양식 CMC-PEG-NH-Cys(Fmoc)-말레이미드 플루오레세인 디아세테이트 (82)와 에스테라제의 항온처리는 또한 유사한 결과를 생성하였으며, 에스테라제 용액(58 및 116 U/mL) 둘 다는 보다 큰 효소 농도에서 시간과 함께 증가된 형광 및 보다 큰 형광성 생성물의 생성비를 이끌었다.
엘라스타제를 사용한 CMC-PEG-NH-AAPVC-말레이미드 플루오레세인 (분말, 알기네이트 섬유 및 하이드로콜로이드 형태)의 절단: AAPV 펩타이드 서열은 엘라스타제에 대한 기질이며, Ala 및 Val의 P1에서 예측된 절단 부위를 지닌다. 이러한 AAPV 서열을 함유하는 화합물의 경우, 엘라스타제 검정을 에스테라제 검정과 유사한 방식으로 수행하였다. 3개 형태의 기질을 시험하였다: (a) 분말 형태; (b) 습윤 회전된 알기네이트와 섬유 양식의 화합물, 및 (c) 0.8% 또는 8%의 화합물을 함유하는 하이드로콜로이드 겔.
화합물 단독과 엘라스타제의 항온처리는 시간에 걸쳐 형광에 있어서 명확한 증가를 나타내었다. 동일한 실험을 또한 수행하여 분말 양식의 CMC-PEG-NH-AAPVC-말레이미드 플루오레세인의 0.8% 및 8% 로딩을 사용하여 하이드로콜로이드 겔 상에서 엘라스타제 용액 첨가의 효과를 평가하였다. 결과는 대조군(하이드로콜로이드 겔 단독)과 비교하는 경우 개질된 CMC 로딩된 하이드로콜로이드 겔에 대해 시간에 걸쳐 형광에 있어서의 증가를 나타내었다. 보다 높은 로딩 수준 (8%)은 보다 낮은 로딩(0.8%) 샘플보다 현저하게 더 형광성이었다. 2개의 상이한 효소 강도를 시험하였다; 이러한 경우에 강한 엘라스타제 용액(0.5 mg/mL)을 사용하는 경우 약한 엘라스타제 용액(0.1 mg/mL)과 비교하여 샘플의 형광에 있어 단지 약간 증가되었다. 이는 엘라스타제가 0.1 mg/mL로도 심지어 과량이며 개질된 CMC의 사용은 형광 반응에 있어 보다 유의적인 효과를 가짐을 시사한다.
절단된 단편의 LC-MS 분석
실험을 엘라스타제를 분말 양식의 CMC-PEG-NH-AAPVC-말레이미드 플루오레세인에 첨가하는 경우 생산된 단편을 특성화하는 시도에서 설정하였다. 엘라스타제 (PBS 중 0.5mg/ mL)를 78에 가하고 37℃에서 항온처리하고; 분취량을 몇가지 시점(1분 내지 3시간)에 걸쳐 수집하고 액체 질소에 즉시 동결시켜 제조하였다. HPLC를 각각의 해동된 분취량에서 수행하여 단편을 분리한 후 질량 분광법을 수행하여 이들의 질량을 분석하였다. 분석은 엘라스타제와의 항온처리 동안 예측치 단편의 존재를 입증하였다. 예측한 바와 같이, 절단 부위는 Ala 및 Val의 P1에서 존재하였다. 또한, Pro 단편의 일부 증거가 있었으며, 이는 Pro의 P1 부위에서 추가의 절단 부위를 시사할 수 있다. 이러한 결과는 형광계 검정 동안 기록된 형광에 있어서의 증가와 일치하며 또한 시스템이 특이적인 효소를 검출할 수 있고 검출가능한 시그널을 제공한다는 증거를 추가로 확립한다.
실시예 34
세포 연구 - 의학 장치의 생혼화성
의학 장치를 설계하는 경우 고려하는 중요한 국면은 이의 생물학적 안전성 및 세포독성, 감작화, 혈액적합성, 발열원성, 이식, 유전독성, 발암성, 재생 및 발달 독성, 생분해성 등과 같은 다른 인자이다. 새로운 물질과 시험관내(in-vitro)에서 성장한 세포 사이의 상호작용의 연구는 이들 물질이 독성의 양호한 지표를 제공할 수 있으므로, 이들 방법의 배열을 사용한다(Eisenbrand et al., Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 193-236). 적합한 세포형을 선택하여 신체의 부위 및 장치의 최종 사용과 관련된 기능에 적절한 시험을 해야만 한다. 방법은 정량적이거나 순수하게 가시적일 수 있으며, 현대의 기술은 현미경을 통한 세포의 저속-촬영 비디오 영상의 사용과 같은, 세포 상호작용의 수준높은 관점을 허용한다.
상처 치유에 대한 세포 관련성: 섬유아세포 세포는 상처 치유 과정에서 중요하다. 이들은 염증 상의 마지막 단계 동안에 손상 후 대략 24시간 째에 상처 층으로 이주하기 시작한다. 이들은 증식 및 MMP와 같은 프로테아제를 포함하는 매개인자의 생산에 의한 상피화 상 전체에서 상처 환경을 개질시킨다. 최종적으로 섬유아세포 수준은 리모델링 단계에서 정상 수준으로 환원하여 새로운 상체 세포외 매트릭스가 충분한 강도를 달성한다(Bainbridge et al., J. Wound Care 2013, 22, 407-408). 따라서, 섬유아세포는 상처 치유 공정을 모사하는 경우 사용하기에 적합한 세포주이다.
사용된 시험관내 방법론: 2개의 시험관내 세포 방법을 사용하여 이들의 생적합성의 초기 발상에 대해 펩타이드 개질된 CMC 물질을 스크리닝하였다.
사람 피부 섬유아세포의 공급원 및 배양: 사람 피부 섬유아세포를 미리 분리하여 적절한 환경 하에서 저장하였다.
일반적인 섬유아세포의 배양물을 환자로부터 동의서와 함께 수득하였다. 당뇨병, 전신계전 면역억제 또는 국소 감염의 증거를 지닌 환자는 연구에서 배제시켰다. 3명의 환자 세포주가 본 연구에서 이용가능하였다: 환자 A, F 및 G. 6 mm의 생검을 환자의 넙적다리로부터 취하였다. 배양을 단일 세포 현탁 기술에 이은 표본의 효소적 분해에 의해 확립하였다. 요약하면, 조직을 디스파제(2 mg/mL; Boehringer Mannheim, 영국 루이스 소재)와 함께 밤새 항온처리하여 피부 조직으로부터 상피 조직을 분리하였다. 피부 조직 표본을 이후에 세균 클로스트리디움 히스톨리티쿰 A 콜라게나제 (1 mg/mL; Boehringer Mannheim)를 사용하여 밤새 구성 요소로 분해하였다. 섬유아세포 배양물을 L-글루타민 (2 mM), 비-필수 아미노산 (1x), 항생제 (100 U/mL 페니실린 G; 100 mg/mL 스트렙토마이신 설페이트; 0.25 mg/mL 암포테리신 B) 및 1% (v/v) 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 둘베코 개질된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)를 함유하는 섬유아세포-혈청 함유 배지(F-SCM) 속에 유지시켰다. 배양물을 37℃에서 5% CO2 습윤화된 대기 속에 유지시켰다. 합치시 섬유아세포를 트립신처리하여 재-씨딩(seeding)(T75 플라스크당 1.5 x 105개 세포)하였다.
섬유아세포 스크래치 검정 방법론:
스크래치 검정은 섬유아세포의 합치성 단층이 평편한 표면에서 성장한 후 이러한 표면이 '긁힘" 또는 "상처남'으로써 섬유아세포 세포의 2개 구역을 분리하는 채널을 생성하는 기술이다. 샘플 용액을 세포의 상단 위로 가하고 채널을 공촛점 현미경을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링함으로써 세포가 반응하는 방법을 알아보았다(Liang et al., Nat. Protocols 2007, 2, 329-333). 샘플을 함유하는 주변 구역의 세포에 대해 순종하는 경우, 세포는 잘 성장하여 이주함으로써 기간 동안 채널을 충전할 것이며; 샘플이 순종하지 않는 경우 세포는 이주하지 않고 죽을 것이다.
사람 피부 섬유아세포 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트(웰당 2 Х 104개 세포)에 씨딩하고, 80 내지 90 % 합치성으로 배양하고 단층을 조직 배양 플라스틱의 표면을 따라 200 μL의 피펫 팁으로 상처를 내었다. 단층을 PBS로 세척하고 화합물을 DMEM 중 0.66 mg/mL 또는 0.066 mg/mL에서 가하였다. 이후에, 세포에 F-SCM을 재-공급하고 Cell-IQ 시스템이 장착된 공초점 현미경의 동력이 달리고(motorized), 가열되고 가스처리된 단계에서 표준 배양 조건 하에 항온처리하였다.
영상을 20분마다 수집하고 Cell-IQ 소프트웨어를 이용하여 영화를 생성하였다. 검정을 각각의 세포주에 대해 3회 완료하였다; 환자 A, F 및 G.
콜라겐 매트릭스 모델 방법론:
콜라겐 매트릭스 모델은 치유의 재구조화 상 동안 피부를 나타내는 시험관내 도구이다. 여기서, 일련의 섬유아세포 집단화된 콜라겐 격자(FPCL)를 사용하여 콜라겐 매트릭스의 재구조화에 있어서 이들의 효과 측면에서 대조군에 대해 펩타이드 개질된 셀룰로즈를 비교하였다. 정상 조건 하에서 섬유아세포 재-구조화로 인하여 FPCL가 직경을 감소시킴을 예측할 수 있으며, 이는 세포 반응이 정상으로 진행되며 '치유'가 일어날 수 있음을 나타낸다(Carlson et al., Wound Repair Regen. 2004, 12, 134-147).
트립신처리에 의해 배양물로부터 유래한 섬유아세포를 이용ㅎ여 섬유아세포 집단화된 콜라겐 격자(FPCL)를 구축하였다. 제I형 랫트 꼬리 콜라겐은 First Link로부터 구입하였다. 1.5 Х 105개의 섬유아세포(750 μL의 F-SCM중)를 2Х DMEM (40부의 10Х DMEM, 10부의 NaHCO3 (7.5% (w/v)), 4부의 L-글루타민 (200 mM), 4부의 비-필수 아미노산(100 Х), 140부의 H20 및 5부의 NaOH (1 M); 3mL), 0.1M NaOH (750 μL), FCS (750 μL), 2.25 ml의 제I형 콜라겐(1.7 mg/mL) 및 시험 화합물 (0.66 mg/mL)를 함유하는 60mm의 세균학적 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 항온처리하여 콜라겐을 중합시켰다. 이후에 이들을 플레이트의 모서리로부터 탈착시키고 2 ml의 F-SCM를 가하였다. FPCL를 37℃에서 5% CO2 습도처리된 대기 속에서 유지시켰다.
원형을 FPCL 재구조화 공정 동안 유지시켜, FPCL의 직경을 3 및 7일 째에 측정하였다. 각각의 샘플에 대해, 실험을 이들 상이한 환자 샘플(n=3)로부터의 세포에서 수행하였다.
7개의 개질된 CMC 물질을 기본선으로서 CMC 분말 및 CMC 섬유와 함께 시험하였다(표 3).
[표 3]
Figure pct00071
섬유아세포 스크래치 검정의 결과:
일반적으로, 섬유아세포는 생존하여 증식함으로써 시험 기간 동안에 스크래치 채널을 채웠다. 결과(도 5)는 섬유아세포가 스크래치 채널을 완전히 폐쇄하는데 걸리는 시간을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 샘플은 70시간 내에 채널을 폐쇄시켰다. CMC 분말 샘플을 이것이 상처 접촉 적용시 사용하기 위해 안정한 것으로 알려져 있으므로 참고로 사용하였다. CMC-PEG-NH2 섬유는 스크래치가 대조군보다 더 짧은 기간내에 폐쇄되는 유일한 샘플이었다. CMC-PEG-NH2 분말 스크래치 폐쇄 시간은 다른 개질된 CMC 샘플과 대략 동등하였으며(~40 내지 60 시간), 이는 세포가 섬유 형태에서 샘플의 물리적 구조에 대해 일부 바람직할 수 있음을 제안한다.
0.066 mg/ml의 12, CMC-PEG-NH2 분말을 함유하는 환자 A (도 6) 및 0.66 mg/ml의 12, CMC-PEG-NH2 분말을 함유하는 환자 A (도 7)에 대한 스크래치 둘 다는 섬유아세포가 증식하여 채널로 이주하면서 시간에 걸쳐 폐쇄되었다. 이들 영상은 섬유아세포 세포가 샘플 불용성 또는 보다 높은 농도의 샘플에 의해 영향받지 않으며 여전히 개질된 CMC 내부 또는 주변에서 잘 자랄 수 있음을 시사한다. 도 6 및 도 7은 환자 A, F 및 G로부터의 모든 샘플 및 세포주에 걸쳐 수행된 시험 중 거의 모두의 관찰을 대표한다. CMC-보다 긴 PEG-NH2 분말(#83)이 하나의 연구에서 이례적인 결과를 생성하였으며, 시험을 3명의 상이한 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 반복한 경우, 섬유아세포가 증식하여 이주하였다.
실시예 35: 콜라겐 매트릭스 모델
콜라겐 매트릭스 모델 연구 동안에, 섬유아세포 세포는 모든 샘플에 걸쳐 생존하였다. 대조군과 비교하여, 다른 샘플(도 8, 도 9 및 도 10)과 비교하여 시험을 통한 단지 제한된 섬유아세포 재-구조화를 나타낸, 83, CMC-보다 긴 PEG-NH2 분말을 제외하고는, 개질된 CMC 샘플에 대해 재구조화가 거의 전혀 관찰되지 않았다. 유의적인 차이가 화합물 83 (CMC-보다 긴 PEG-NH2 분말; 7일 째에 약 40 mm 내지 60 mm의 격자 직경)과 화합물 12 (CMC-PEG-NH2 분말; 7일 째에 약 15 mm 내지 35 mm의 격자 직경) 상이에서 관찰되었으며, 이 결과는 도 8 내지 10으로부터 명백하다. 도 11 내지 13에서의 사진으로부터 명백한 미가공 데이타는 환자 A (도 11), B (도 12), 및 C (도 13) 각각에서 수득한 세포 샘플에서 3일 및 7일째에 격자 직경에서 화합물 12, 83, 81, 74, 78, 80, CMC 분말 및 CMC 섬유 각각의 효과를 입증한다.
결론
본 연구는 개질된 CMC 물질이 섬유아세포 세포에 대해 독성이 아니었음을 입증한다. 또한, 섬유와 분말 양식, 보다 길거나 보다 짧은 PEG 스페이서 링커, 또는 펩타이드의 첨가 및 검출가능한 단편 사이에 차이가 없었다. 섬유아세포는 콜라겐 매트릭스 모델 동안 모든 경우에서 생존하였으며, 재구조화는, 다른 화합물과 비교하여 약독화된 효과를 나타낸 CMC-보다 긴 PEG-NH2 분말, 83을 제외하고는, 샘플 대부분의 경우 대조군보다 단지 약간 더 느렸다.
실시예 36 액정(LC) 연구
액정 실험 설정
본 연구는 CMC 겔이 5CB 액정 위에 위치하고 편광 현미경으로 시간에 걸쳐 앵커링이 모니터링되는 동안 수행되었다. LC 연구를 설정하기 위하여, 챔버를 생성하여 LC가 설정 구역내에서 유지될 수 있도록 하고 편광 현미경을 사용하여 가시화하도록 할 필요가 있다. 5CB의 TEM 격자 구속을 발표된 연구(Nazarenko et al., Physical Review E 1999, 60, R3495-R3497; Brake et al., Langmuir 2003, 19, 6436-6442)에 따라 시행하였다.
5CB-TEM 격자 실험 시스템을 생성하기 위하여, 우선 기본으로 사용된 유리 격자는 바람직하게는 기름과 같은 불순물이 없다. 세정은 유리로부터 모든 유기 물질을 제거하는 강한 산화제인 피란하 용액(Piranha solution)을 사용하여 수행하였다. 피란하 용액의 강력한 산화 특성으로 인하여, 적절한 안전성 예방책을 취하여 피부와의 접촉을 피하고 또한 파열을 피하였다.
진한 황산(~30 mL, 98% 등급)을 세정될 유리를 함유하는 용기에 가한 후, 과산화수소(~ 10 mL, 30%)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 두었다. 피란하 용액을 붓고 유리를 물 및 알코올로 완전히 세척하였다. 최종적으로 폐기 피란하 용액을 조심스럽게 중화시켰다. 다음에, 유리를 옥타데실트리클로로실란(OTS)으로 코팅하였다. OTS는 유리 슬라이드 표면을 코팅하여 이를 소수성이 되도록 하는 장쇄 자가-조립 양친매성 분자이다. 따라서, 5CB를 챔버의 기저를 따라 동일속성 앵커와 함께 정렬하였다. TEM 격자를 OTS 코팅된 유리에 두어 격자가 LC 용액에 대해 내부에 유지되도록 하였다. 5CB를 TEM 격자에 모세관을 사용하여 조심스럽게 가하여 각각의 격자가 충분히 충전되지만 과도하게 충전되지 않도록 하여 격자의 상단에 용액의 반구형을 생성하였다. TEM 격자에 대한 5CB의 첨가시, 5CB 정렬을 광학 현미경의 교차된 편광 렌즈를 사용하여 점검하였다. 5CB는 당해 단계에서 동일속성이며, 이는 OTS 코팅된 유리 슬라이드과 LC의 정렬에 기인한다.
효소 검출의 원리는 지질, 예를 들면, DLPC의 방출 시, LC 배향의 변화에 의존한다. 이러한 방식으로 펩타이드 개질된 CMC 및 LC를 사용하는 잠재적인 시스템을 도 14에 나타낸다. 이러한 목적으로, 도 15는 CMC 겔의 적용시 5CB 충전된 TEM 격자를 나타내는 사진을 나타낸다.
기타 구현예
앞서의 실시예는 일반적으로 또는 구체적으로 기술된 반응물 및/또는 앞서의 실시예에 사용된 것에 대한 이러한 개시된 기술의 작동 조건을 대체시켜 반복할 수 있다.
앞서의 설명로부터, 숙련가는 이러한 개시된 기술의 필수적인 특성을 용이하게 확인할 수 있고, 이의 취지 및 영역으로부터 벗어나지 않고 이를 다양한 용도 및 조건에 대해 채택하기 위한 개시된 기술의 다양한 변화 및 변형을 이룰 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시된 기술이 속하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 개시된 기술의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 앞서의 절에 기술되어 있다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시하는 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 지배할 것이다.
본원에 인용된 모든 미국 특허 및 발표되거나 발표되지 않은 미국 특허원은 참고로 포함된다. 본원에 인용된 모든 발표된 외국 특허 및 특허원은 참고로 포함된다. 본원에 인용된 모든 발표된 참고문헌, 문서, 원고, 과학 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 NCBI, GENBANK, EBI, PUBMED 데이타베이스에 관한 모든 확인인자 및 수탁 번호는 참고로 본원에 포함된다.
개시된 기술의 바람직한 구현예가 본원에 나타나고 기술되었지만, 당해 분야의 숙련가에게는 이러한 구현예가 단지 예로서 제공됨이 명백할 것이다. 다수의 변화, 변경, 및 치환이 이제 당해 분야의 기술자에게서 일어날 것이다. 본원에 기술된 개시된 기술의 구현예에 대한 다양한 대안이 개시된 기술을 실시하는데 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 개시된 기술의 영역을 정의하며 이들 청구범위의 영역 내의 방법 및 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (42)

  1. 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질(wound dressing material):
    [화학식 I]
    Figure pct00072

    상기 화학식 I에서,
    M은 겔-형성 중합체이고;
    R은 리포터 분자이며;
    L은 존재하거나 부재하는 링커이며, L은, 존재하는 경우, M 및 R을 연결한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 L이 부재하는, 상처 드레싱 물질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 M이 R과 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 접합된, 상처 드레싱 물질.
  4. 청구항 1에 있어서, L이 존재하는, 상처 드레싱 물질.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 링커 L이 서로 독립적으로 M 및 R과 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 접합된, 상처 드레싱 물질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 리포터가 효소 기질을 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 효소 기질이 당, 다당류, 핵산, 아미드, 펩타이드, 단백질, 지질, 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합인, 상처 드레싱 물질.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 효소 기질이 당, 다당류, 아미드, 펩타이드, 단백질 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합인, 상처 드레싱 물질.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 겔-형성 중합체가 셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 펙틴, 알기네이트, 키토산, 하이알루론산, 다당류, 또는 검-유도된 중합체, 또는 이들의 유도체 또는 임의의 혼합물 또는 이들의 조합인, 상처 드레싱 물질.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 겔-형성 중합체가 카복시메틸셀룰로즈 또는 이의 염인, 상처 드레싱 물질.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 겔-형성 중합체가 약 200 내지 약 4000개의 단량체 단위를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 겔-형성 중합체가 약 500 내지 약 2000개의 단량체 단위를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  13. 청구항 1에 있어서, L이 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 또는 이들의 에테르, 아미드, 또는 에스테르인 중성 중합체를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  14. 청구항 13에 있어서, L이 에톡실화된 다가 알코올, 폴리비닐 피롤리돈 중합체, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민 또는 이들의 에테르, 아미드, 또는 에스테르의 2 내지 10개의 단량체 단위를 포함하는 중성 중합체인, 상처 드레싱 물질.
  15. 청구항 13에 있어서, L이 적어도 하나의 폴리프로필렌 글리콜 소단위를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 리포터 분자가 검출가능한 표지를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 발광성 분자, 화학발광성 분자, 형광색소, 형광성 퀀칭제, 지질, 착색된 분자, 방사성 동위원소, 섬광제, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 이의 단편, 폴리히스티딘, Ni2+, Flag 태그, myc 태그, 중금속, 및 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 상처 드레싱 물질.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 리포터 분자가 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, R-피코에리트린, Cy-3, Cy-5, Cy-7, 텍사스 레드(Texas Red), 파르-레드(Phar-Red), 알로피코시아닌(APC), 플루오레세인 아민, 에오신, 단실, 움벨리페론, 5-카복시플루오레세인 (FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카복시플루오레세인 (JOE), 6 카복시로다민 (R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 6-카복시-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2, 2'디설폰산, 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, r-아미노-N-(3-비닐설포닐)페닐나프탈이미드-3,5, 디설포네이트(Lucifer Yellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우(Brilliant Yellow), 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 7-아미노-4-트리플루오로메틸코울루아린(쿠마린 151), 시아노신, 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-설포네프탈레인(Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4,4'-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2'-디설폰산, 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC), 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트, 에티디움, 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), QFITC (XRITC), 플루오레스카민, IR144, IR1446, 말라카이트 그린(Malachite Green) 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레솔프탈레인, 니트로타이로신, 파라로사닐린, 페놀 레드(Phenol Red), B-피코에리트린, o-프탈디알데하이드, 피렌, 피렌 부티레이트, 석신이미딜 1-피렌 부티레이트, 반응성 레드(Reactive Red) 4, 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체, 테트라메틸 로다민, 리보플라빈, 로솔산, 및 테르비움 킬레이트 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광성 분자를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 리포터 분자가 검출가능한 표지 및 퀀처 분자를 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 퀀처 분자를 포함하는 상기 리포터가 효소 또는 이의 산물에 의해 활성화되는, 상처 드레싱 물질.
  21. 청구항 16에 있어서, 상기 리포터 분자 또는 이의 일부가 효소와의 상호작용시 방출되는, 상처 드레싱 물질.
  22. 청구항 16에 있어서, 상기 리포터가 상처-특이적인 효소에 대해 특이적인 기질을 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 상처-특이적인 효소가 프로테아제인, 상처 드레싱 물질.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 리포터가 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처-특이적인 효소에 대해 특이적인 기질을 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 리포터가 MMP-2 및 MMP-9 또는 이들의 조합에 대해 특이적인 기질을 포함하는, 상처 드레싱 물질.
  26. 청구항 1에 따른 드레싱 물질을 포함하고, 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  27. 청구항 26의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 담체가 약제학적으로 허용되는 담체인 약제학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 항생제 화합물 또는 상처-치유 펩타이드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 항생제가 β-락탐, 플루오로퀴놀론, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 글리실사이클린 및 폴리믹신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 약제학적 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 상처-치유 펩타이드가 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 또는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)인 약제학적 조성물.
  31. 상처의 상태를 진단하는 방법으로서,
    상처를 청구항 1에 따른 상처 드레싱 물질과 접촉시켜 리포터 분자의 검출가능한 시그널로의 전환을 허용하는 단계; 및
    시그널을 검출하는 단계를 포함하는, 상처의 상태를 진단하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 리포터 분자의 검출가능한 시그널로의 전환이 상처-특이적인 프로테아제에 의해 수행되는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 상처 특이적인 프로테아제가 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 만성 상처 또는 감염된 상처의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 만성 상처 또는 감염된 상처의 존재 또는 부재를 측정하는 단계가 상기 상처 내 매개변수를 측정하는 단계, 측정된 상기 매개변수를 역치(threshold) 수준과 비교하는 단계, 및 상기 상처 내 매개변수의 수준이 상기 역치 수준보다 더 높은 경우 상기 상처가 만성 또는 감염된 것이라고 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 매개변수가 MMP-1 (콜라게나제), MMP-2 (겔라티나제 A), MMP-3 (스토멜라이신 1), MMP-8 (호중구 콜라게나제), MMP-9 (겔라티나제 B), 사람 호중구 엘라스타제 (HNE), 카텝신 G, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성인자 (uPA), 및 라이소자임으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처-특이적인 프로테아제의 양 또는 활성인 방법.
  37. 대상체에서 만성 또는 감염된 상처를 치료하는 방법으로서,
    청구항 1에 따른 드레싱 물질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 드레싱 물질이 상처에 국소적으로 또는 피부에 도포되는, 대상체에서 만성 또는 감염된 상처를 치료하는 방법.
  38. L이 부재하는 청구항 1에 따른 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    겔-형성 중합체 M을 리포터 영역 R과 접합시킴으로써, 식 M-R(식 중, M 및 R은 각각 개별적으로 청구항 1에서 기술한 바와 같다)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
  39. L이 부재하는 청구항 1에 따른 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    겔-형성 중합체 M을 링커 L과 접합시킴으로써, 전구체 화합물 M-L을 형성시키는 단계, 및 상기 전구체 화합물 M-L을 리포터 영역 R과 접합시킴으로써, 식 M-L-R(여기서 M, L 및 R은 각각 개별적으로 청구항 1에서 기술한 바와 같다)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
  40. L이 부재하는 청구항 1에 따른 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서,
    링커 L을 리포터 영역 R과 접합시킴으로써 전구체 화합물 M-L을 형성시키는 단계, 및 상기 전구체 화합물 L-R을 겔-형성 중합체 M과 접합시킴으로써, 식 M-L-R(여기서 M, L 및 R은 각각 개별적으로 청구항 1에서 기술한 바와 같다)의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.
  41. Figure pct00073
    ;
    Figure pct00074
    ;
    Figure pct00075
    ;
    Figure pct00076
    ;
    Figure pct00077
    ; ;
    Figure pct00079
    ;
    Figure pct00080
    ;
    Figure pct00081
    ;
    Figure pct00082
    ;
    Figure pct00083
    ; 및
    Figure pct00084
    (식 중, n은 200 내지 4000이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상처 드레싱 물질.
  42. 하기 화학식 II의 화합물을 포함하는 상처 드레싱 물질:
    [화학식 II]
    Figure pct00085

    상기 화학식 II에서,
    M은 겔-형성 중합체이고;
    PEP는 펩타이드 및 적어도 하나의 아미노산이며;
    L은 존재하거나 부재하는 링커이며,
    L은, 존재하는 경우 M 및 PEP를 연결한다.
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