ES2968013T3

ES2968013T3 - Apósitos para heridas modificados

Info

Publication number: ES2968013T3
Application number: ES17776619T
Authority: ES
Inventors: Lucy Ballamy
Original assignee: Convatec Technologies Inc
Current assignee: Convatec Technologies Inc
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2024-05-06
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: CO2018011720A2; WO2017173026A1; AR108054A1; CA3019548A1; JP2019509853A; CL2018002782A1; EP3436012A4; AU2017244116B2; JP7394526B2; US20190307904A1; PL3436012T3; JP7395630B6; AU2017244116C1; EP3436012C0; UY37176A; JP2022065128A; EP3436012A1; US20210275693A1; SG11201808528VA; TW201806625A

Abstract

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a compuestos para la detección de heridas, por ejemplo, heridas crónicas o heridas infectadas, que incluyen composiciones, sustratos, kits, materiales y artículos para apósitos, y sistemas que contienen dichos compuestos. Realizaciones adicionales se refieren a métodos para usar estas composiciones, kits y sistemas en ensayos de diagnóstico y en el diagnóstico y/o detección de heridas crónicas o infectadas basándose en la conversión enzimática de sustratos específicos que están contenidos en las composiciones. Realizaciones adicionales se refieren a métodos para caracterizar heridas basándose en la expresión de una pluralidad de marcadores y al uso de dicha información para tratar, gestionar y realizar un seguimiento de pacientes que padecen heridas crónicas o infectadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Apósitos para heridas modificados

Remisión a otras solicitudes relacionadas

La presente invención se beneficia del derecho de prioridad sobre la solicitud de patente en trámite provisional en los Estados Unidos de América número 62/315,567, presentada el día 30 de marzo de 2016.

Campo de la invención

Las realizaciones descritas en la presente se refieren en general a la cicatrización, y en particular a composiciones y métodos para la detección y el tratamiento de heridas.

Antecedentes de la invención

En los mamíferos, la lesión dérmica desencadena una compleja cascada organizada de eventos celulares y bioquímicos que resultan en una herida curada. La cicatrización es un proceso dinámico complejo que da como resultado la restauración de la continuidad y la función anatómica: una herida cicatrizada de manera ideal es la que ha regresado a su estructura, función y aspecto anatómicos normales. Una herida típica se cicatriza mediante un modelo que consta de cuatro etapas: fase "exudativa", fase proliferativa, fase reparadora y maduración epitelial(Hatz et al., Wound Healing and Wound Management, Springer-Verlag, Múnich, 1994)o fases hemostática, inflamatoria, proliferativa y de remodelación(Nwomeh et al., Clin. Plast. Surg. 1998, 25, 341).

Desafortunadamente, las heridas crónicas e "infectadas" suelen ser difíciles de cicatrizar. Las heridas crónicas incluyen, por ejemplo, úlceras venosas en la pierna, úlceras del pie diabético y úlceras por presión (Krasner et al.,Chronic Wound Care: A Clinical Source Book for Healthcare Professionals, HMP Communications,2001). Los pacientes con heridas crónicas requieren un mayor cuidado y la herida a veces conduce a una reducción en la calidad de vida; una herida crónica puede convertirse en un problema que algunos pacientes deben lidiar durante el resto de su vida. Las comorbilidades del paciente también pueden tener un efecto significativo en el proceso de cicatrización de la herida, que limita e incluso detiene el proceso, además de ser factores que contribuyen a la pérdida de calidad de vida. Los factores que pueden llevar a que una herida sea difícil de cicatrizar incluyen problemas patofisiológicos, infección por microorganismos, presencia de tejido no viable, mala perfusión tisular, afecciones inflamatorias crónicas y otras afecciones subyacentes tales como diabetes (Bowler et al.,Annals of Medicine2002, 34, 419-427).

En muchos casos, las heridas crónicas están colonizadas por flora bacteriana y/o patógenos como hongos y virus, en cuyo caso pueden infectarse. La infección de las heridas por bacterias retrasa el proceso de cicatrización, ya que las bacterias producen enzimas y toxinas y también compiten por los nutrientes y el oxígeno con macrófagos y fibroblastos cuyas actividades son esenciales para la cicatrización de la herida. La infección es, por lo tanto, una manifestación de un equilibrio alterado entre huésped/bacteria a favor de las bacterias invasoras. Esto provoca una respuesta séptica sistémica y también inhibe los múltiples procesos implicados en la cicatrización de heridas. La fase de granulación de la cicatrización solo comenzará después de que la infección haya disminuido.

La fase inflamatoria es particularmente importante para el proceso de cicatrización, en donde las reacciones bioquímicas en el lugar de la herida facilitan la cicatrización pero también provocan la degradación del tejido debido a la producción de proteasas en exceso. Aunque las proteasas juegan un papel importante en la descomposición del tejido muerto, en exceso, también tienen un efecto perjudicial sobre el tejido viable, ya que causan inflamación adicional.

La liberación de estas enzimas proteolíticas, tales como metaloproteasas de matriz (MMP), elastasa y catepsina G, por lo general, se asocia con una estimulación excesiva de neutrófilos.

La actividad elevada de la proteasa parece ser responsable de retrasar la cicatrización de la herida y puede ser predictivo de infección de la herida. Por ejemplo, la matriz extracelular (ECM), una colección de moléculas extracelulares segregadas por células que proporciona soporte estructural y bioquímico a las células circundantes, con frecuencia disminuye en el sitio de la herida debido al exceso de actividad de proteasa (por ejemplo, MMP) y de manera concomitante debido a niveles atenuados de fibrinógeno. El aumento de la actividad de la proteasa también conduce a la degradación de los factores de crecimiento, lo que inhibe el proceso de cicatrización. En consecuencia, la infección y otros problemas se exacerban en las heridas crónicas y la herida sigue siendo difícil de tratar(Yager et al., Wound Repair Regen 1997, 5, 23-32; Widgerow et al., Wound Repair Regen 2011, 19, 287-291).

Los métodos actuales para evaluar una herida dependen del entrenamiento y la experiencia del profesional. Es probable que se evalúe una herida visualmente, se pueden tomar medidas de longitud y profundidad, y se puede usar fotografía digital cuando esté disponible para dar seguimiento a la condición visual y el tamaño de una herida (Krasner et al., supra). En la práctica clínica, el diagnóstico de infección se basa en parámetros indirectos, tal como presencia de dolor local, calor, hinchazón, secreción y enrojecimiento. Muchos de estos indicadores clínicos, como la inflamación y la secreción, tienen un bajo valor predictivo de infección en las heridas. El hisopado de una herida seguida de pruebas de microbiología en el laboratorio del hospital es una opción para confirmar la colonización bacteriana y la identificación de la cepa para prescribir el curso correcto de antibióticos; sin embargo, este proceso lleva mucho tiempo y requiere trabajo intensivo. El retraso en el diagnóstico de infección puede retrasar la administración de antibióticos y puede aumentar el riesgo de desarrollar sepsis.

Además, existen pocas técnicas objetivas para medir la cicatrización de heridas. Aunque existen informes de que los niveles y actividad de la proteasa de MMP están presentes en el fluido de heridas crónicas cuando se comparan con el fluido en heridas cicatrizadas (Liu et al.,Diabetes Care2009, 32, 117-119; Bullen et al.,J. Investig. Dermatol1995, 104, 236-240), estos informes no sugieren el límite por el cual la herida se vuelve crónica.

Existen documentos de la técnica anterior que describen apósitos para heridas que detectan infecciones que comprenden polímeros (PNIPAM) y tintes fluorescentes que emiten fluorescencia al cambiar el pH (Mike Orcutt, 2015,"Smart Bandage Signals Infection by Turning Fluorescent-MIT Technology Review",MIT Technology Review, disponible de URL: https://www.technologyreview.com/s/544166/smart-bandage-signals-infection -by-turningfluorescent/; Anónimo, 2011,"Glowing bandages 'could show infections' - NHS"NHS, disponible desde URL: https://www.nhs.uk/new/medication/glowing-bandages-could-show-infections/#; Anónimo, 2011,"Gel shines bright to spot bacteria - Futurity",Futurity, disponible en URL: https://www.futurity.org/gel-shines-bright-to-spot-bacterial). Saswati Ghosh Roy y. al., Polym Chem., 2014, 5, 3624 describe geles poliméricos que comprenden triptófano que proporcionan características de fluorescencia cuando se produce un cambio en el pH.

La patente EP0243151A2 describe un gel polimérico que comprende una celulosa producida microbianamente, en el que una proteína adhesiva de células animales está unida a dicha celulosa o dicha celulosa está modificada químicamente; sin embargo, no describe cómo esto puede beneficiar a los médicos y pacientes con respecto a la detección de infecciones en heridas.

Gayathri Srinivasan, 2014,"PEG-based Fluorescent Hydrogel for Glucose Biosensing",Tesis de maestría, páginas 1-62, disponible en URL: https://pdfs.semanticscholar.org/52e5/f261a0594cdb8faa8639d17d2701280ba491.pdf describe un hidrogel enzimático para detectar glucosa en personas con diabetes.

La solicitud de patente WO 93/04192 describe un método para analizar la actividad enzimática en una célula preparando una solución biocompatible con un sustrato que comprende una parte que interactúa de manera removible con la enzima y una molécula con propiedades espectrales, por ejemplo fluoróforos. La patente EP1577316A1 describe un oligosacárido unido a asparagina adecuado para detectar un cambio en los oligosacáridos que puede asociarse, por ejemplo, con cánceres, enfermedades crónicas, enfermedades infecciosas y envejecimiento.

Por lo tanto, existe una necesidad inminente pero no satisfecha de reactivos, kits y técnicas de ensayo sensibles y específicos para identificar heridas crónicas e infectadas en humanos y sujetos veterinarios, que incluye, el uso de tales reactivos y/o kits para estudios científicos y también en aplicaciones clínicas, por ejemplo, en el diagnóstico y tratamiento eficaz y preciso de enfermedades que se caracterizan por tales heridas, por ejemplo, úlceras venosas, úlceras por decúbito y úlceras diabéticas.

Sumario de la invención

La tecnología descrita en la presente proporciona composiciones y métodos para detectar heridas infectadas y/o crónicas. La tecnología descrita mejora tras salir de los ensayos al: aumentar la sensibilidad, precisión y especificidad de la detección de heridas infectadas; proporcionar la capacidad de medidas cualitativas y cuantitativas; y, aumentar la velocidad de detección de heridas infectadasin situy en tiempo real. Los ensayos y métodos descritos en la presente se basan, en parte, en el uso de reactivos específicos que detectan biomarcadores y/o sondas que están presentes en heridas infectadas o crónicas. El proceso de detección puede implicar el uso de reactivos que son específicos de los marcadores presentes en heridas infectadas, pero no heridas no infectadas o no crónicas, y la etapa de detección puede implicar mediciones cualitativas o cuantitativas de las señales que se generan cuando la sonda actúa por el marcador. En realizaciones en donde el método de detección implica la detección de enzimas presentes en heridas, las sondas comprenden preferentemente sustratos enzimáticos modificados que son específicos de la enzima, que generan señales que se pueden amplificar de manera opcional. Esto mejora en gran medida la eficiencia y la especificidad de la detección. Además, se puede emplear una pluralidad de sondas de detección, cada una específica para una o más dianas, por ejemplo, enzimas que son específicas de las heridas. Esto ayuda en gran medida a maximizar la eficacia y la precisión de los ensayos de diagnóstico, al tiempo que minimiza la incidencia de falsos positivos (por ejemplo, debido a interacciones no específicas y/o redundancia de diana). Además, los resultados experimentales descritos en la presente confirman que las sondas innovadoras y las técnicas de ensayo basadas en estas son capaces de detectar y caracterizar diversos tipos de heridas. Finalmente, los reactivos de la tecnología descrita se pueden usar junto con moléculas terapéuticas tales como antibióticos, agentes antifúngicos, etc. para controlar y evaluar el tratamiento y el manejo de las heridas crónicas. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia (o para diagnóstico cuando sea apropiado).

La invención está definida por las reivindicaciones. En una realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R.

En otra realización, se proporciona en la presente un compuesto que comprende la estructura M-R, en donde M es un polímero gelificante y R es una molécula indicadora.

En otra realización, se proporciona en la presente un compuesto que comprende la estructura M-R, en donde M es un polímero gelificante y R es una molécula indicadora y en donde M está conjugada covalentemente o no covalentemente con R.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador conjugado covalentemente o no covalentemente, independientemente uno del otro, con M y R.

En una realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador, en donde el indicador R comprende un sustrato de enzima.

En una realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador, en donde el indicador R comprende un sustrato de enzima que es un azúcar, un polisacárido, un ácido nucleico, una amida, un péptido, una proteína, un lípido, un derivado de estos o una combinación de estos. Particularmente en esta realización, el sustrato es un azúcar, un polisacárido, una amida, un péptido o una proteína, o un derivado de estos. Especialmente en esta realización, el sustrato es un sustrato peptídico (PEP) que comprende un aminoácido o un péptido que comprende una pluralidad de aminoácidos.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde M se selecciona de celulosa, carboximetilcelulosa, pectina, alginato, quitosano, ácido hialurónico, polisacárido, o polímero derivado de goma, o un derivado de estos o cualquier mezcla o combinación de estos. Particularmente en esta realización, el polímero es carboximetilcelulosa (CMC) o una sal de esta.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde M comprende de alrededor de 200 a alrededor de 4000 de unidades monoméricas. Particularmente en esta realización, M comprende de alrededor de 500 a alrededor de 2000 unidades monoméricas.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde L comprende un monómero o un polímero neutral que es un alcohol polihídrico etoxilado, un polímero de polivinilpirrolidona, un polipropileno, un polialquilenglicol, una poliamina o un éter, una amida o un éster de estos. Particularmente en esta realización, L comprende 1-10 unidades monoméricas de un alcohol polihídrico etoxilado, un polímero de polivinilpirrolidona, un polipropileno, un polialquilenglicol, una poliamina o un éter, una amida o un éster de estos. Más específicamente en esta realización, L comprende al menos una subunidad de polipropilenglicol. En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde R comprende una etiqueta detectable. Particularmente en esta realización, la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste en una molécula luminiscente, una molécula quimioluminiscente, un fluorocromo, un agente de inactivación fluorescente, un lípido, una molécula coloreada, un radioisótopo, un escintilante, biotina, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, un anticuerpo o un fragmento de este, una polihistidina, Ni2+, una etiqueta Flag, una etiqueta myc, un metal pesado y una enzima.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de la Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante, R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ya sea ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde R comprende una molécula fluorescente seleccionada del grupo que consiste en fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, R-ficoeritrina, Cy-3, Cy-5, Cy-7, Texas Red, Phar-Red, aloficocianina (APC), amina de fluoresceína, eosina, dansilo, umbeliferona, 5-carboxifluoresceína (FAM), 27'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6 carboxirodamina (R6G), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido benzoico de 4-(4'-dimetilaminofenilazo) (DABCYL), ácido sulfónico de 5-(2'-aminoetilo)aminonaftaleno-1 (EDANS), ácido disulfónico de 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2, 2', acridina, isotiocianato de acridina, r-amino-N-(3-vinilsulfonil)fenilnaftalimida-3,5, disulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Brilliant Yellow, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina, 7-amino-4-trifluorometilcularina (cumarina 151), cianosina, 4', 6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5"-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5"-dibromopirogalol-sulfonftaleína (Bromopyrogallol Red), 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenilo)-4-metilcumarina dietilentriamina pentaacetato, ácido disulfónico de 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2', ácido disulfónico de 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2', 4-dimetilaminofenilazofenilo-4'-isotiocianato (DABITC), isotiocianato de eosina, eritrosina B, isotiocianato de eritrosina, etidio, 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), QFITC (XRITC), fluorescamina, IR144, IR1446, isotiocianato de verde de malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, rojo de fenol, B-ficoeritrina, o-ftaldialdehído, pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil-1-pireno, rojo reactivo 4, cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, rodamina B, rodamina 123, rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101, tetrametilrodamina, riboflavina, ácido rosólico y derivados de quelato de terbio.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde R comprende una etiqueta detectable y una molécula inactivadora. Particularmente en esta realización, el indicador que comprende la molécula inactivadora se activa mediante una enzima o un producto de esta.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde la molécula indicadora o una porción de esta se libera tras la interacción con una enzima. Particularmente en esta realización, la molécula indicadora comprende una etiqueta detectable que se libera tras la interacción con la enzima.

En otra realización, se proporciona en la presente un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R, en donde la molécula indicadora comprende un sustrato que es específico para una enzima específica de la herida, que forma un producto sobre el que actúa la enzima. Particularmente en esta realización, la enzima específica de la herida es una proteasa. Más particularmente en esta realización, el indicador comprende un sustrato que es específico para una enzima específica de la herida seleccionada del grupo que consiste en MMP-1 (colagenasa),<m>M<p>-2 (gelatinasa A), MMP-3 (estomelisina 1), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (gelatinasa B), elastasa neutrófila humana (HNE), catepsina G, activador del plasminógeno tipo urocinasa (uPA) y lisozima. Especialmente en esta realización, el indicador comprende un sustrato que es específico para MMP-2 y M<m>P-9 o una combinación de estos.

En otra realización, se proporciona en la presente una composición que comprende un portador y un material para apósitos de heridas que comprende un compuesto de Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M es un polímero gelificante; R es una molécula indicadora; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y R. Particularmente en esta realización, la composición es una composición farmacéutica. Más particularmente en esta realización, la composición farmacéutica comprende un compuesto antibiótico o un péptido cicatrizante. Especialmente en esta realización, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en plactamas, fluoroquinolonas, aminoglicósidos, tetraciclinas, glicilciclinas y polimixinas y/o el péptido cicatrizante es el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDG<f>).

En otra realización, se proporciona en la presente una composición que comprende un artículo que comprende un material de apósito para heridas como se describió anteriormente.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para diagnosticar el estado de una herida en un sujeto que lo necesita, que comprende poner en contacto la herida con el material de apósito para heridas descrito anteriormente para permitir la conversión de la molécula indicadora en una señal detectable y detectar la señal. Particularmente en esta realización, la conversión de la molécula indicadora en una señal detectable se lleva a cabo mediante una proteasa específica de la herida, por ejemplo, una proteasa específica de la herida seleccionada del grupo que consiste en MMP-1 (colagenasa), MMP-2 (gelatinasa<a>), MMP-3 (estomelisina 1), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (gelatinasa B), elastasa neutrófila humana (HNE), catepsina G, activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) y lisozima. Especialmente en esta realización, el método comprende diagnosticar una herida crónica o una herida infectada.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para diagnosticar el estado de una herida en un sujeto que lo necesita, que comprende poner en contacto la herida con el material para apósitos de heridas descrito anteriormente para permitir la conversión de la molécula indicadora en una señal detectable y detectar la señal; evaluar un parámetro que es una actividad o nivel de una enzima específica de la herida en la herida; comparar el parámetro con un nivel de umbral y determinar si la herida es crónica o está infectada en el caso de que el nivel del parámetro en la herida sea más alto que el nivel de umbral. En esta realización, el parámetro es una cantidad o actividad de una proteasa específica de la herida se selecciona del grupo que consiste en MMP-1 (colagenasa), MMP-2 (gelatinasa A), MMP-3 (estomelisina 1), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (gelatinasa B), elastasa neutrófila humana (HNE), catepsina G, activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) y lisozima. Particularmente en esta realización, el método de diagnóstico se realizain situ.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para tratar una herida en un sujeto que lo necesita, que comprende poner en contacto la herida con el material para apósitos de heridas descrito anteriormente. Particularmente en esta realización, el material de apósito se aplica por vía tópica o dérmica en el sitio de la herida.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para preparar el compuesto de la Fórmula I de acuerdo con lo expuesto anteriormente, en donde L está ausente, que comprende conjugar el polímero gelificante M con una región indicadora R, en donde M y R son cada uno, individualmente, como se describe anteriormente. Particularmente en esta realización, el polímero gelificante M está conjugado con la región indicadora R a través de un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace peptídico, un enlace glicosídico, un enlace éster, un enlace oxiéster, un enlace amida, un enlace amido, un enlace oxiamido, un enlace éter, un enlace sulfonilo, un enlace sulfinilo, un enlace sulfonamida, un enlace alcoxi, un enlace alquiltio, un enlace alquilamino, o una combinación de estos. Especialmente en esta realización, el polímero gelificante M está conjugado con la región indicadora R a través de un enlace glicosídico o un enlace peptídico. En otra realización, se proporciona en la presente un método para preparar un compuesto de Fórmula I de acuerdo con lo expuesto anteriormente, en donde L está presente, que comprende conjugar el polímero gelificante M con el ligador L para generar una molécula precursora M-L; conjugar la molécula precursora M-L a una región indicadora R, en la que M, L y R son cada uno, individualmente, como se describió previamente. Particularmente en esta realización, el polímero gelificante M está conjugado con el ligador L y/o el ligador L está conjugado con la región indicadora R a través de un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace éster, un enlace oxiéster, un enlace amida, un enlace amido, un enlace oxiamido, un enlace éter, un enlace sulfonilo, un enlace sulfinilo, un enlace sulfonamida, un enlace alcoxi, un enlace alquiltio, un enlace alquilamino, o una combinación de estos.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para preparar un compuesto de Fórmula I de acuerdo con lo expuesto anteriormente, en donde L está presente, que comprende, conjugar el ligador L con el indicador R para generar una molécula precursora L-R; conjugar la molécula precursora L-R a un polímero gelificante M, en donde M, L y R son cada uno, individualmente, como se describió anteriormente. Particularmente en esta realización, el polímero gelificante M está conjugado con el ligador L y/o el ligador L está conjugado con la región indicadora R a través de un enlace covalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace éster, un enlace oxiéster, un enlace amida, un enlace amido, un enlace oxiamido, un enlace éter, un enlace sulfonilo, un enlace sulfinilo, un enlace sulfonamida, un enlace alcoxi, un enlace alquiltio, un enlace alquilamino, o una combinación de estos.

En otra realización, se proporcionan en el presente material de apósito para heridas que comprenden un compuesto que comprende la estructura M-L-PEP (Fórmula II), en donde M es un polímero gelificante; PEP es un péptido y al menos un aminoácido; y L es un ligador que está ausente o presente, y L, cuando está presente, conecta M y PEP. En otra realización, se proporcionan en la presente materiales de apósitos para heridas seleccionados del grupo que consiste en:

en donde n = 200-4000.

Se entiende que otras realizaciones y configuraciones de la tecnología en cuestión resultarán evidentes para los expertos en la materia de nivel medio a partir de la siguiente descripción detallada, en donde se muestran y describen diversas configuraciones de la tecnología en cuestión a modo de ejemplo o ilustración. Como se realizará, la tecnología en cuestión es capaz de otras y diferentes configuraciones y sus varios detalles son susceptibles de modificación en varios otros aspectos, todo esto sin apartarse del alcance de la tecnología en cuestión. En consecuencia, las figuras y la descripción detallada deben considerarse de naturaleza ilustrativa y no restrictiva. Breve descripción de las figuras

Para comprender la presente descripción, se describirá ahora a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntos en los que se ilustran las realizaciones y ejemplos de las describciones y, junto con las descripciones a continuación, sirven para explicar los principios de la descripción.

La figura 1 muestra la cuantificación de la eficacia de la enzima del polímero 12 mediante el uso de un estudio basado en fluorescencia.

Las figuras 2A-2C muestran imágenes de muestras de polímero 12 usadas en el estudio basado en fluorescencia de la figura 1.

La figura 2A muestra las muestras como se observan bajo luz ambiental.

La figura 2B muestra las muestras como se observan bajo luz UV.

La figura 2C muestra las etiquetas de muestras individuales.

La figura 3 muestra la cuantificación de la eficacia de la enzima del polímero 17 (pretratado con PBS) mediante el uso de un estudio basado en fluorescencia: eluyente después del período de inmersión en PBS.

La figura 4 muestra la cuantificación de la eficacia de la enzima del polímero 17 (pretratado con PBS) mediante el uso de un estudio basado en fluorescencia: el sólido se volvió a suspender en PBS después del período de inmersión en PBS inicial.

La figura 5 muestra el tiempo promedio hasta el cierre durante las pruebas de escarificación en modelos (las barras de error muestran SD) para las líneas celulares de los pacientes A, F y G. Las barras rojas resaltan las muestras en forma de fibra; las barras azules representan muestras en forma de polvo.

Las figuras 6A-6D muestran micrografías confocales para 12, polvo de CMC-PEG-NH2, paciente A, ensayo de escarificación de 0,066 mg/mL. Las líneas de puntos rojas representan el área de escarificación, la proliferación de fibroblastos se puede observar entre T=1 h (sin células presentes en el canal) y T=68 h (las células llenan el canal).

La figura 6A muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 1 hora.

La figura 6B muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 30 horas.

La figura 6C muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 50 horas.

La figura 6D muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 68 horas.

Las figuras 7A-7D muestran micrografías confocales para 12, polvo de CMC-PEG-NH2, paciente A, ensayo de escarificación de 0,66 mg/mL. Las líneas de puntos rojas representan el área de escarificación, la proliferación de fibroblastos se puede observar entre T=1 h (sin células presentes en el canal) y T=68 h (las células llenan el canal).

La figura 7A muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 1 hora.

La figura 7B muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 30 horas.

La figura 7C muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 50 horas.

La figura 7D muestra la proliferación de fibroblastos como se observó en 68 horas.

La figura 8 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, donde el gráfico muestra el diámetro de la red durante 7 días - Paciente A.

La figura 9 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, donde el gráfico muestra el diámetro de la red durante 7 días - Paciente F.

La figura 10 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, donde el gráfico muestra el diámetro de la red durante 7 días - Paciente G.

La figura 11 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, en donde las fotografías indican la diferencia en el diámetro de la red en los días 3 y 7 - Paciente A.

La figura 12 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, en donde las fotografías indican la diferencia en el diámetro de la red en los días 3 y 7 - Paciente F.

La figura 13 muestra los resultados de estudios con el modelo de matriz de colágeno, en donde las fotografías indican la diferencia en el diámetro de la red en los días 3 y 7 - Paciente G.

La figura 14 muestra un diagrama esquemático para un sistema CMC y LC modificado con péptido potencial para la detección de proteasas, en donde (a) muestra la configuración inicial del sistema que mostraría la alineación de LC homeotrópica (oscuro si se observa con lentes polarizados cruzados), (b) muestra la escisión del péptido que libera el lípido en progreso, (c) muestra el lípido escindido en contacto con los LC, lo que iniciaría la realineación de LC plana (coloreado si se observa con lentes polarizados cruzados).

Las figuras 15A-15D muestran micrografías que muestran cuadrículas de TEM (microscopio electrónico de transmisión) llenadas con cristal líquido 4'-n-pentil-4-ciano-bifenilo (5CB) tras la aplicación del gel de CMC. La figura 15A muestra las cuadrículas de<t>E<m>llenadas con 5CB antes de la aplicación de la alineación de LC homeotrópica de hidrogel CMC.

La figura 15B muestra las cuadrículas de TEM llenadas con 5CB después de la aplicación de hidrogel CMC a T=0; cambia a alineación de LC plana.

La figura 15C muestra las cuadrículas de TEM llenadas con 5CB después de la aplicación de hidrogel CMC a T=2 minutos (alineación de LC plana) (panel izquierdo) y después de la aplicación de hidrogel CMC a T=5 minutos (alineación de LC plana) (panel derecho).

La figura 15D muestra las cuadrículas de TEM llenadas con 5CB después de la aplicación de hidrogel CMC a T=10 minutos (retención de alineación de LC plana) (panel izquierdo) y después de la aplicación de hidrógeno CMC a T=90 minutos (alineación de LC plana retenida) (panel derecho).

Descripción detallada de la invención

Varios aspectos se describirán ahora de manera más completa a continuación. Sin embargo, tales aspectos pueden representarse en muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitativos a las realizaciones expuestas en la presente; en su lugar, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta descripción será minuciosa y completa, y transmitirá completamente su alcance a los expertos en la materia de nivel medio.

I. Definiciones

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se pretende que cada valor intermedio entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado esté abarcado dentro de la descripción. Por ejemplo, si se indica un intervalo de 1 |im a 8 |im, se pretende que también se describan explícitamente 2 |im, 3 |im, 4 |im, 5 |im, 6 |im, y 7 |im. así como el intervalo de valores mayores de, o iguales a, 1 |im, y el intervalo de valores menores de, o iguales a, 8 |im.

Las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un "polímero" incluye un único polímero así como dos o más polímeros iguales o diferentes, la referencia a un "excipiente" incluye un único excipiente así como dos o más excipientes iguales o diferentes, y similares.

La palabra "alrededor" cuando inmediatamente precede un valor numérico significa un intervalo de más o menos 10% de ese valor, por ejemplo, "alrededor de 50" significa 45 a 55, "alrededor de 25,000" significa 22,500 a 27,500, etc., a menos que el contexto de la descripción indique lo contrario, o sea inconsistente con la interpretación. Por ejemplo, en una lista de valores numéricos como "alrededor de 49, alrededor de 50, alrededor de 55", "alrededor de 50" significa un intervalo que se extiende a menos de la mitad de los intervalos entre los valores anteriores y posteriores, por ejemplo, más de 49,5 a menos de 52,5. Además, las frases "menor de alrededor de" un valor o "mayor de alrededor de" un valor se deberían entender a la vista de la definición del término "alrededor" proporcionado en la presente.

"Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi total o completamente, por ejemplo, 80%-95% o mayor de alguna cantidad dada, por ejemplo, al menos 85%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, al menos 99,9%, o mayor% en peso o volumen, o cualquier otro parámetro que se mida. "Sustancialmente libre" significa casi total o completamente ausente de alguna cantidad determinada, como estar presente a un nivel menor de alrededor de 1% a alrededor de 20% de una cantidad determinada, por ejemplo, menor de 10%, menor de 9%, menor de 8%, menor de 7%, menor de 6%, menor de 5%, menor de 4%, menor de 3%, menor de 2%, menor de 1%, menor de 0,5%, menor de 0,1% o menor% en peso o volumen, o cualquier otro parámetro que se mida. En algunas realizaciones, "sustancialmente libre" significa presencia a un nivel menor de, o igual a, 1-5% en peso de la composición farmacéutica.

II. Composiciones y sistemas para usar en un apósito para heridas

Se proporcionan en la presente materiales de apósito para heridas modificados para su uso en apósitos para heridas para el tratamiento y el diagnóstico de heridas y el manejo de heridas, en donde los materiales de apósito para heridas, cuando se usan, indican la presencia de niveles enzimáticos elevados en una heridain situ.

Como se usa en la presente, una "herida" se refiere a la alteración física de la continuidad o integridad de la estructura del tejido. "Cicatrización" se refiere a la restauración de la integridad del tejido. Se entenderá que esto puede referirse a una restauración parcial o total de la integridad del tejido. El tratamiento de una herida se refiere a la promoción, mejora, progresión, aceleración o avance de una o más etapas o procesos asociados con el proceso de cicatrización.

La herida puede ser aguda o crónica. Las heridas crónicas, que incluyen úlcera de decúbito, úlceras venosas en la pierna y úlcera del pie diabético, se pueden describir simplemente como heridas que no cicatrizan. Si bien la patogénesis molecular exacta de las heridas crónicas no se comprende por completo, se reconoce que es multifactorial. A medida que se deterioran las respuestas normales de las células residentes y migratorias durante la lesión aguda, estas heridas se caracterizan por una respuesta inflamatoria prolongada, una remodelación defectuosa de la matriz extracelular (MEC) de la herida y una falla de la reepitelización.

La herida puede ser cualquier herida interna, por ejemplo, donde se mantiene la integridad estructural externa de la piel, tal como hematomas o úlceras internas, o heridas externas, particularmente heridas cutáneas, y en consecuencia el tejido puede ser cualquier tejido corporal interno o externo. En una realización, el tejido es piel (tal como piel humana), es decir, la herida es una herida cutánea, tal como una herida dérmica o epidérmica.

La piel humana se compone de dos capas distintas, la epidermis y la dermis, debajo de la cual se encuentra el tejido subcutáneo. Las funciones principales de la piel son proporcionar protección a los órganos y tejidos internos contra traumas externos e infecciones patógenas, sensación y termorregulación.

La capa más externa de la piel, la epidermis, tiene un espesor de alrededor de 0,04 mm, es avascular, está compuesta por cuatro tipos de células (queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans y células de Merkel) y se estratifica en varias capas de células epiteliales. La capa epitelial más interna de la epidermis es la membrana basal, que está en contacto directo con, y sujeta la epidermis a, la dermis. Toda división celular epitelial que ocurre en la piel tiene lugar en la membrana basal. Después de la división celular, las células epiteliales migran hacia la superficie externa de la epidermis. Durante esta migración, las células se someten a un proceso conocido como queratinización, a través del cual los núcleos se pierden y las células se transforman en células no vivas resistentes, planas y fuertes. La migración se completa cuando las células alcanzan la estructura epidérmica más externa, el estrato córneo, una capa de células escamosas seca e impermeable que ayuda a prevenir la desecación del tejido subyacente. Esta capa de células epiteliales muertas se desprende continuamente y se reemplaza por células queratinizadas que se desplazan a la superficie desde la membrana basal. Debido a que el epitelio epidérmico es avascular, la membrana basal depende de la dermis para su suministro de nutrientes.

La dermis es una capa de tejido altamente vascularizada que suministra nutrientes a la epidermis. Además, la dermis contiene terminaciones nerviosas, linfáticos, proteína de colágeno y tejido conectivo. La dermis tiene un espesor de alrededor de 0,5 mm y está compuesta predominantemente por fibroblastos y macrófagos. Estos tipos de células son en gran parte responsables de la producción y el mantenimiento del colágeno, la proteína que se encuentra en todos los tejidos conectivos animales, incluida la piel. El colágeno es el principal responsable de la naturaleza elástica y flexible de la piel. El tejido subcutáneo, que se encuentra debajo de la dermis rica en colágeno, proporciona la movilidad de la piel, el aislamiento, el almacenamiento de calorías y la sangre a los tejidos que están encima de ella.

Las heridas se pueden clasificar en una de dos categorías generales, heridas de espesor parcial o heridas de espesor total. Una herida de espesor parcial está limitada a la epidermis y dermis superficial, sin daño alguno de los vasos sanguíneos dérmicos. Una herida de espesor total implica la ruptura de la dermis y se extiende a las capas del tejido más profundas, lo que implica la ruptura de los vasos sanguíneos dérmicos. La cicatrización de la herida de espesor parcial se produce por regeneración simple del tejido epitelial. La cicatrización de heridas de espesor total es más compleja. Las heridas cutáneas contempladas en la presente pueden ser heridas de espesor parcial o de espesor total.

Las heridas contempladas en la presente incluyen cortes y laceraciones, incisiones quirúrgicas o heridas, punciones, raspaduras, rasguños, heridas por compresión, abrasiones, heridas por fricción (por ejemplo, dermatitis del pañal, ampollas de fricción), úlceras por decúbito (por ejemplo, úlceras por presión o úlceras de la cama); heridas por efecto térmico (quemaduras por fuentes de frío y calor, ya sean de manera directa o por conducción, convección o radiación, y por fuentes eléctricas), heridas químicas (por ejemplo, quemaduras ácidas o alcalinas) o infecciones patógenas (por ejemplo, virales, bacterianas o fúngicas), que incluyen, forúnculos abiertos o intactos, erupciones cutáneas, imperfecciones y acné, úlceras, heridas crónicas (que incluyen heridas asociadas con la diabetes, como úlceras en la parte inferior de la pierna y el pie, úlceras venosas en la pierna y úlceras por presión), sitios donantes y receptores de injertos/trasplantes de piel, afecciones por la respuesta inmune, por ejemplo, psoriasis y eccema, úlceras estomacales o intestinales, heridas bucales, que incluyen úlceras de la boca, cartílago o hueso dañado, heridas por amputación y lesiones corneales.

Materiales de apósitos para heridas y formulaciones de estos:

Las realizaciones descritas en la presente proporcionan materiales de apósito para heridas, que pueden usarse para diagnosticar y/o tratar heridas crónicas. Los apósitos pueden comprender polímeros gelificantes, fibras no gelificantes, o una combinación de estos. Los materiales de apósito para heridas descritos en la presente se usan en métodos para detectar el nivel de una o más enzimas en una herida de mamífero. En algunas realizaciones, los materiales de apósitos para heridas descritos en la presente se usan en métodos para diagnosticar una herida crónica en un mamífero. En algunas realizaciones, los materiales de apósitos para heridas descritos en la presente se usan en métodos para diagnosticar una herida infectada en un mamífero. En otras realizaciones, los materiales de apósitos para heridas descritos en la presente se usan en métodos para tratar una herida en un mamífero. En realizaciones adicionales, los materiales de apósitos para heridas descritos en la presente se usan en métodos para tratar una herida crónica en un mamífero.

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de Fórmula I:

Fórmula I

en donde M es un polímero gelificante; R es una región que comprende una molécula indicadora; y L es un ligador que conecta M y R. En una realización, el ligador (L) está presente. En otra realización, el ligador (L) está ausente, en cuyo caso, el material de apósitos para heridas comprende un compuesto de fórmula M-R, en donde M y R son cada uno, individualmente, como se describió anteriormente.

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de Fórmula II:

Fórmula

en donde M es un polímero gelificante; PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; y L es un ligador que conecta M y PEP. En una realización, el ligador (L) está presente. En otra realización, el ligador (L) está ausente, en cuyo caso, el material de apósitos para heridas comprende un compuesto de fórmula M-R, en donde M y R son cada uno, individualmente, como se describió anteriormente.

En realizaciones específicas, el material de apósitos para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II no contiene ligadores, en donde el indicador (R) o el péptido (PEP) está asociado, de forma covalente o no covalente, directamente con el polímero gelificante. Como se entiende en la técnica, los enlaces covalentes implican el intercambio de electrones entre los átomos unidos. Por el contrario, los enlaces no covalentes pueden incluir, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones electrostáticas, interacciones de enlaces de hidrógeno, interacciones fisicoquímicas, fuerzas de Van der Waals, interacciones de ácido de Lewis/base de Lewis o combinaciones de estos. Particularmente, en tal caso donde el ligador está ausente, el péptido se une o conjuga al polímero gelificante mediante interacción covalente.

El término "péptido" incluye el péptido así como las sales farmacéuticamente aceptables del péptido. Típicamente, un péptido comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 o más residuos de aminoácidos que están unidos entre sí mediante enlaces covalentes, por ejemplo, un enlace peptídico. "Residuo de aminoácido" significa las unidades de aminoácidos individuales incorporadas en los péptidos de la descripción. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" significa un aminoácido natural o sintético, así como análogos de aminoácidos, estereoisómeros y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. En esta definición se incluyen los aminoácidos naturales tales como: 1. Histidina (His) 2. Isoleucina (Ile) 3. Leucina (Leu) 4. Lisina (Lys) 5. Metionina (Met) 6. Fenilalanina (Phe) 7. Treonina (Thr) 8. Triptófano (Trp) 9, Valina (Val) 10. Arginina (Arg) 11. Cisteína (Cys) 12. Glutamina (Gln) 13. Glicina (Gly) 14. Prolina (Pro) 15. Serina (Ser) 16. Tirosina (Tyr) 17. Alanina (Ala) 18. Asparagina (Asn) 19, Ácido aspártico (Asp) 20. Ácido glutámico (Glu) 21. Selenocisteína (Sec); aminoácidos no naturales: citrulina; cistina; ácido gamma-aminobutírico (GABA); ornitina; derivados de teanina y derivados de aminoácidos tales como betaína; carnitina; carnosina creatina; hidroxitriptófano; hidroxiprolina; N-acetil cisteína; S-adenosil metionina (SAM-e); taurina; tiramina Se emplean particularmente los aminoácidos que contienen cadenas laterales reactivas, por ejemplo, cisteína, serina, treonina, lisina, arginina, aspartato/asparagina, glutamato/glutamina, glicina, alanina, etc.

En ciertas realizaciones, el péptido se puede modificar, por ejemplo, a través de la adición, eliminación, sustitución de uno o más aminoácidos, a través de la derivación de uno o más aminoácidos, o ciclización, etc. En particular, los péptidos se modifican en el Carboxi-terminal (C-terminal) o el amino-terminal (N-terminal) mediante la adición, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos. Particularmente, los péptidos se modifican en el C-terminal mediante la adición de al menos un aminoácido, especialmente un aminoácido que contiene cadenas laterales reactivas, por ejemplo, cisteína, serina, treonina, lisina, arginina, aspartato/asparagina, glutamato/glutamina, glicina, alanina, etc., en donde la cadena lateral reactiva se puede emplear en la conjugación con una etiqueta tal como un colorante. Especialmente en esta realización, los péptidos se modifican para que contengan residuos adicionales de cisteína o serina en el C-terminal, donde el grupo azufre de cisteína o el grupo hidroxilo de serina se usa para acoplarse con colorantes fluorescentes.

En una realización específica, el péptido que contiene un aminoácido adicional que comprende una cadena lateral reactiva, por ejemplo, un grupo s H de cisteína, se puede acoplar a un colorante mediante química clic. En la presente, la reacción entre un 1,2-aminotiol y un 2-cianobenzotiazol (CBT) se puede usar para producir luciferina, que es fluorescente. La fluorescencia de la luciferina se puede cuantificar mediante espectrometría después de un lavado, usar para determinar la presencia relativa de la molécula que tiene el 1,2-aminotiol. Si se desea la cuantificación de la proteína que no tiene 1,2-aminotiol, la proteína de interés puede escindirse para producir un fragmento con una N' Cys que es vulnerable a la 2-CBT. Véase Liang et al.,J. Angew.Chem.,Int. Ed., 48, 965, 2009.Polímero gelificante (M):

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante es un compuesto seleccionado de celulosa, celulosa químicamente modificada, pectina, alginato, quitosano, quitosano modificado, ácido hialurónico, polisacárido o polímero derivado de goma, o un derivado de estos o cualquier mezcla o combinación de estos.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante se selecciona de celulosa, carboximetilcelulosa (CMC), celulosa oxidada (o un derivado de esta), etilsulfonato de celulosa (CES), pectina, alginato, quitosano, quitosano modificado, ácido hialurónico, polisacárido o polímero derivado de goma, o cualquier combinación o mezcla de estos.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante es celulosa o celulosa químicamente modificada, por ejemplo, carboximetilcelulosa, una celulosa oxidada o un derivado de esta, etilsulfonato de celulosa.

En una realización, el polímero gelificante es un derivado de un compuesto polimérico, por ejemplo, derivado de celulosa. El término "derivado" como se usa en la presente incluye sales, amidas, ésteres, enoléteres, enolésteres, acetales, cetales, ortoésteres, hemiacetales, hemicetales, ácidos, bases, solvatos, hidratos o profármacos del polímero gelificante. Por ejemplo, en donde el polímero es celulosa, los grupos hidroxilo (-OH) de la celulosa se pueden hacer reaccionar parcial o totalmente con diversos reactivos para formar derivados con propiedades útiles, por ejemplo, ésteres de celulosa y éteres de celulosa (-OR). En una realización, el derivado de celulosa se selecciona de carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, metiletilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa. Tales derivados los pueden preparar con facilidad los experto en la materia de nivel medio mediante el uso de métodos conocidos para tal derivatización. En ciertas realizaciones, los derivados se pueden administrar a animales o humanos sin efectos tóxicos sustanciales y son farmacéuticamente activos o son profármacos. Los tipos representativos de derivados de celulosa se describen en las patentes estadounidenses Nos. 7,544,640 y 9,561,188.

En otra realización, el derivado es una sal del compuesto polimérico, por ejemplo, sales de Li+, Na+, K+, Rb+, Mg2+, Ca2+, Sr2+, o Ba2+, preferentemente Na+, K+, Mg2+, Ca2+. Se conocen en la técnica sales de celulosa, ésteres de celulosa y éteres de celulosa, tales como sales de sodio o calcio.

En algunas realizaciones, el compuesto de polímero gelificante puede contener una combinación o mezcla de uno o más de los compuestos mencionados con anterioridad. El término "combinación" incluye compuestos que contienen más de un componente, que pueden estar conjugados o no conjugados entre sí. En una realización, el compuesto de polímero gelificante comprende una combinación de uno o más de los compuestos mencionados con anterioridad que están conjugados entre sí, por ejemplo, mediante interacción covalente o no covalente. Como un ejemplo particular, el polímero gelificante puede comprender una combinación de pectina y carboximetilcelulosa. Véase, Ninan et al.,CarbohydrPolym.15 de octubre de 2013; 98(1):877-85; PMID: 23987424.

En algunas realizaciones, los compuestos incluyen mezclas de los compuestos poliméricos mencionados con anterioridad. El término "mezcla" se refiere a una integración de dos o más sustancias sin que se produzca una reacción por medio de la cual perderían sus propiedades individuales. Por ejemplo, una mezcla del compuesto A y compuesto B puede contener cualquier relación en peso de compuesto A y compuesto B, de manera que el peso total de la mezcla ascendería a 100%, por ejemplo, relación en peso de 99:1 del compuesto A/compuesto B o relación en peso de 1:99 del compuesto A/compuesto B. Una mezcla típica puede contener alrededor de 2, 3, 4, 5 o más de los compuestos poliméricos mencionados con anterioridad.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante está en forma de polvo o fibra, o una combinación de estos. En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante está en forma de fibra. Las fibras gelificantes son fibras higroscópicas que al absorberse el exudado de la herida se vuelven húmedas, resbaladizas o gelatinosas y, por lo tanto, reducen la tendencia de las fibras circundantes a adherirse a la herida. Las fibras gelificantes pueden ser del tipo que retienen su integridad estructural en la absorción del exudado o pueden ser del tipo que pierden su forma fibrosa y se convierten en un gel sin estructura. Las fibras gelificantes con preferencia tienen una absorbencia de al menos 2 gramos de solución salina al 0,9% por gramo de fibra (medida por el método de hinchamiento libre).

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas comprende fibras no gelificantes. En algunas realizaciones, las fibras no gelificantes se seleccionan de fibra de celulosa (por ejemplo, algodón o lyocell/TENCEL), poliéster, nylon, viscosa, aramida, acrílico, elastano (LYCRA), poliolefina, polilactida, seda y lana natural o sintética. En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas comprende polímeros gelificantes y fibras no gelificantes.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante está en forma de polvo. En ciertas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, se prefiere el polímero gelificante en polvo con respecto a la fibra gelificante fibrosa debido al mayor grado de sustitución (DoS) del polímero gelificante en polvo. En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, se prefiere la fibra gelificante fibrosa con respecto al polímero gelificante en polvo.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I o la Fórmula II, el polímero gelificante tiene un DoS de al menos 0,2, al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,8, al menos 0,9, al menos 1,0, al menos 1,1, al menos 1,2, al menos 1,3, al menos 1,4, al menos 1,5, al menos 2,0 o más. El término DoS se entiende en la técnica. Por ejemplo, en el contexto de la química de celulosa donde cada unidad de anhidroglucosa (p-glucopiranosa) tiene tres grupos reactivos (hidroxilo); DoS puede variar, por lo tanto, desde cero (celulosa) a tres (celulosa completamente sustituida).

Ligador (L):

En algunas realizaciones, en donde el material de apósito para heridas comprende un ligador, el ligador se puede unir al polímero gelificante de forma covalente o no covalente. Como se entiende en la técnica, los enlaces covalentes implican el intercambio de electrones. Por el contrario, los enlaces no covalentes pueden incluir, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones electrostáticas, interacciones de enlaces de hidrógeno, interacciones fisicoquímicas, fuerzas de Van der Waals, interacciones de ácido de Lewis/base de Lewis o combinaciones de estos. Particularmente, el ligador está unido o conjugado al polímero gelificante mediante interacción covalente.

En una realización, el ligador químico es un ácido carboxílico que tiene de 2 a 10 átomos de carbono, particularmente de 4 a 8 átomos de carbono o especialmente de alrededor de 4 a 6 átomos de carbono.

En otra realización, el ligador es un monómero o un polímero neutro seleccionado del grupo que consiste en un alcohol polihídrico etoxilado, un polímero de polivinilpirrolidona, un polipropileno, un polialquilenglicol, una poliamina, que incluye éteres, amidas y ésteres de estos.

En una realización, el polímero neutro es polipropileno, aunque también se puede usar un monómero de este que comprende propileno. El polipropileno (PP) es una de las poliolefinas más importantes y más usadas como material de matriz debido a su baja densidad, bajos costos de producción, flexibilidad de diseño y reciclabilidad. Debido a que el polipropileno es hidrófobo, puede ser incompatible con superficies polares, tal como celulosa. Este problema se puede resolver mediante la incorporación de polipropileno funcionalizado, tal como poli(propileno-injerto-anhídrido maleico) (PP-g-MA), en el material compuesto, en donde los grupos anhídrido carboxílico pueden proporcionar un enlace covalente a la celulosa. Véase, Spoljaric et al.,Composites: Part A40, 791-799, 2009.

En una realización, el ligador de polímero neutro es un polialquilenglicol, aunque también se puede usar un monómero de este que comprende alquilenglicol. El término "polialquilenglicol" se refiere a polímeros de polialquilenglicol lineales o ramificados tales como polietilenglicol, polipropilenglicol y polibutilenglicol. Una subunidad de polialquilenglicol es una única unidad de polialquilenglicol. Por ejemplo, un ejemplo de una subunidad de polietilenglicol sería un etilenglicol, -O-CH2-CH2-O- o propilenglicol, -O-CH2-CH2-CH2-O-, rematado con un hidrógeno en el punto de terminación de la cadena. Otros ejemplos de poli(alquilenglicol) incluyen, entre otros, PEG, derivados de PEG tales como metoxipoli(etilenglicol) (mPEG), poli(óxido de etileno), PPG, poli(tetrametilenglicol), poli(óxido de etileno-óxido de co-propileno), o copolímeros y combinaciones de estos.

En otra realización, el polímero neutro es una poliamina, aunque también se puede usar un monómero de este que comprende una amina. El término "poliamina" se refiere a polímeros que tienen una funcionalidad amina en la unidad de monómero, incorporados en la estructura principal, como polialquileniminas, o en un grupo colgante como polivinil aminas.

Particularmente, el ligador es un PEG o un derivado de PEG tal como metoxipoli(etilenglicol) (mPEG), poli(óxido de etileno), PPG, poli(tetrametilenglicol), poli(óxido de etileno-óxido de co-propileno), o copolímeros y combinaciones de estos.

En otra realización, otros ligadores hidrófilos o hidrófobos también se pueden usar como ligadores, siempre que sean flexibles, por ejemplo, ligadores que no contengan enlaces dobles o estructuras cíclicas o que contengan solo unos pocos enlaces dobles o estructura cíclica. Los ejemplos representativos incluyen, por ejemplo, polialquileno, polihidroxialquileno, succinato de polialquileno, polilactida, etc., con longitudes de cadena de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de cadena. La longitud de cadena de los polialquilenglicoles puede variar desde 3 unidades (MW de aproximadamente 150 Da) hasta, porejemplo,aproximadamente 100 (MW de aproximadamente 5000). La cantidad relativa de polialquilenglicol con respecto al polisacárido puede variar de aproximadamente 1/200 a aproximadamente 1/1, especialmente de aproximadamente 1/50 a aproximadamente 1/1,5, dependiendo del espesor requerido y la flexibilidad requerida del producto. Veáse la patente estadounidense No. 9,089,614 y US PGPUB No. 2005-0079155.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la fórmula I o la fórmula II, el ligador L comprende de 1 a aproximadamente 20 unidades monoméricas, por ejemplo, del polímero natural, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más unidades monoméricas. En realizaciones específicas, el ligador comprende de 1 a aproximadamente 5 unidades de etilenglicol o un derivado de este, de 2 a aproximadamente 5 unidades de etilenglicol o un derivado de este, de 2 a aproximadamente 8 unidades de etilenglicol o un derivado de este, de 2 a aproximadamente 10 unidades de etilenglicol o un derivado de este o de 5 a aproximadamente 10 unidades de etilenglicol o un derivado de este.

En algunas realizaciones, el ligador L comprende una porción química que es un producto de una reacción nucleofílica. En general, el término "nucleófilo" se reconoce en la técnica con el significado de un grupo químico que tiene un par reactivo de electrones que reacciona con un compuesto desplazando un grupo saliente (comúnmente otro nucleófilo), tal como ocurre por lo general en la química alifática como unimolecular (conocido como "SN1") o reacciones bimoleculares ("SN2"). Los ejemplos de nucleófilos incluyen compuestos no cargados tales como aminas, mercaptanos y alcoholes, y grupos cargados tales como alcóxidos, tioles, tiolatos, carbaniones y una variedad de aniones orgánicos e inorgánicos. Los nucleófilos aniónicos ilustrativos incluyen, entre otros, aniones simples tales como azida, cianuro, tiocianato, acetato, formiato o cloroformiato y bisulfito.

En algunas realizaciones, el ligador L comprende un aducto de maleimida-tiol. Las maleimidas son particularmente útiles para la conjugación con sustancias que contienen tiol, por ejemplo, aminoácidos que contienen tiol tales como cisteína. Un grupo tiol reacciona con una maleimida al agregarse a través del enlace doble para formar un tioéter. Las maleimidas son selectivas para el tiol de cisteína sobre metionina, histidina o tirosina. La reacción de maleimidas con aminas generalmente requiere un pH más alto que la reacción de maleimidas con tioles. La hidrólisis de maleimidas compite significativamente con la modificación con tiol, particularmente por encima de pH 8. Véase US PGPUB No. 2007-0087446.

En algunas realizaciones, L comprende un producto conjugado de haloacetamida-tiol. Las haloacetamidas, por ejemplo, iodoacetamida o bromoacetamida, también pueden usarse para fijarse de manera covalente con el grupo tiol de aminoácidos, por ejemplo, cisteína.

En algunas realizaciones, el ligador L comprende un compuesto que contiene un tiol o un disulfuro, que se puede usar análogamente a maleimida. Ver, Zalipsky et al.,Bioconjug. Chem.6, 150-165, 1995; Greenwald et al.Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.17, 101 - 161, 2000; y Herman et al.,Macromol. Chem. Phys.195, 203-209, 1994. Véase también la patente estadounidense No. 7,432,330.

Indicadores y marcadores:

En algunas realizaciones, los materiales de apósito para heridas comprenden una región que comprende una molécula indicadora. Particularmente, el indicador es un sustrato para uno o más marcadores específicos de la herida, por ejemplo, enzimas que se encuentran en un entorno de herida. Como se usa en la presente, una "enzima específica de la herida" es una enzima que se expresa diferencialmente en una herida. Por "expresión diferencial" se entiende que el nivel o la actividad de la enzima es mayor o menor en el microentorno de la herida en comparación con otros sitios, por ejemplo, tejido normal o tejido circundante. Particularmente, la expresión diferencial implica un mayor nivel de expresión o actividad de la enzima en el microentorno de la herida en comparación con el tejido normal o no dañado. La expresión diferencial de la enzima se puede analizar mediante medios de rutina. Por ejemplo, los niveles de enzima en una muestra se pueden analizar mediante ensayos ELISA u otros inmunoensayos. Las actividades de la enzima se pueden analizar al medir las tasas de pérdida de un sustrato y/o las tasas de formación del producto, por ejemplo, mediante el uso de espectroscopía de masas o HPLC. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen en la sección de Ejemplos.

En una realización, el marcador es una enzima seleccionada del grupo que consiste en hidrolasas, proteasas, esterasas y peroxidasas.

En una realización, el marcador es una hidrolasa. Como se usa en la presente, una "hidrolasa" o "enzima hidrolítica" es una enzima que cataliza la hidrólisis de un enlace químico, por ejemplo, esterasas y nucleasas (ruptura de enlaces éster); glicolasas (ruptura ligadores glicosídicos); peptidasas (ruptura de enlaces peptídicos), etc.

En una realización, el marcador es una enzima proteasa. La proteasa puede ser una proteasa específica de secuencia o genérica. Particularmente, la expresión "proteasa específica de secuencia" significa una proteasa que reconoce una secuencia específica de un péptido para su digestión (por ejemplo, caspasa) y se distingue de una proteasa genérica (por ejemplo, tripsina) que descompone secuencialmente un péptido desde uno de sus extremos o digiere un péptido de una manera no específica de secuencia. Para la especificidad de la secuencia, la secuencia de aminoácidos del sustrato peptídico puede comprender cuatro o más residuos de aminoácidos (a.a.). El sitio de reconocimiento y el sitio de digestión pueden estar cerca el uno del otro.

Como se usa en la presente, la expresión "péptido sustrato para una proteasa" significa un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína, que es reconocida por la proteasa como un sustrato para su actividad proteasa, por ejemplo, como un sustrato que se puede escindir en uno o más productos. En algunas realizaciones, los materiales de apósito para heridas comprenden una región peptídica que comprende una secuencia peptídica que comprende una pluralidad de aminoácidos. El término "pluralidad" significa dos o más unidades, por ejemplo, aminoácidos, aunque las unidades individuales no necesitan ser estructural y/o funcionalmente diferentes.

En una realización, el péptido comprende aminoácidos naturales. En otras realizaciones, también pueden usarse péptidos sintéticos que contienen uno o más aminoácidos no naturales.

En ciertas realizaciones, se puede usar una pluralidad de sustratos, cada uno de los cuales es específico para una enzima particular. En otras realizaciones, también se puede usar una pluralidad de sustratos, cada uno de los cuales es específico para una pluralidad de enzimas.

En una realización, la enzima proteasa es una exopeptidasa o una endopeptidasa. Las exopeptidasas degradan la estructura solo cerca de los extremos de la cadena de péptidos; las endopeptidasas son capaces de escindir los enlaces internos dentro del péptido. Estas clases también se dividen en subgrupos: cisteína-proteasa, serinaproteasa, treonina-proteasa, aspártico-proteasa, glutámico-proteasa, metalo-proteasa, etc. Cada una puede digerir enlaces de proteína específicos por hidrólisis del enlace peptídico.

En una realización, la proteasa es específica de una herida. Como se usa en la presente, una "proteasa específica de la herida" es una proteasa que se expresa diferencialmente en una herida. Por "expresión diferencial" se entiende que el nivel o la actividad de la proteasa es mayor o menor en el microentorno de la herida en comparación con otros sitios, por ejemplo, tejido normal o tejido circundante. Particularmente, la expresión diferencial implica un mayor nivel de expresión o actividad de la proteasa en el microentorno de la herida en comparación con el tejido no dañado. La expresión diferencial de las proteasas se puede analizar mediante medios de rutina. Por ejemplo, los niveles de proteasas en una muestra se pueden analizar mediante ensayos ELISA u otros inmunoensayos. Las actividades de las proteasas se pueden analizar al medir las tasas de pérdida de un sustrato de péptido y/o las tasas de formación del producto, por ejemplo, mediante el uso de espectroscopía de masas o HPLC. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen en la sección de Ejemplos.

En una realización, la proteasa específica de la herida se selecciona del grupo que consiste en MMP-1 (colagenasa), MMP-2 (gelatinasa A), MMP-3 (estomelisina 1), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (gelatinasa B), elastasa neutrófila humana (HNE), catepsina G, activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) y lisozima.

En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para colagenasa. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para MMP-2. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para Mm P-3. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para colagenasa de neutrófilos. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para gelatinasa. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para elastasa neutrófila humana. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para catepsina G. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para activador del plasminógeno tipo urocinasa. En algunas realizaciones, el sustrato es una secuencia peptídica específica para lisozima. En algunas realizaciones, el sustrato es un azúcar que es escindible por la lisozima.

En una realización específica, la proteasa específica de la herida es una metaloproteinasa de matriz (MMP) seleccionada del grupo que consiste en MMP-1, MMP-2, MMP-8 y MMP-9 (colagenasa), o una combinación de estas. MMP-1 (acceso UNIPROT No. P03956 [humano] y Q9EPL5 [ratón]) también se conoce como colagenasa intersticial y colagenasa de fibroblasto. MMP-2 (acceso UN<i>PROT No. P08253 [humano] y P33434 [ratón]) también se conoce como gelatinasa. MMP-8 (acceso UNIPROT No. P22894 [humano] y O70138 [ratón]) también se conoce como colagenasa de PMNL (MNL-c L). MMP-9 (acceso UNIPROT No. P14780 [humano] y P41245 [ratón]) también se conoce como gelatinasa B (GELB).

En una realización específica, la MMP es MMP-2 o MMP-9, o una combinación de estas.

En algunas realizaciones, los niveles de actividad de metaloproteinasa de matriz (MMP) de alrededor de 5 U/mL a alrededor de 30 U/mL, incluidos todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 6 U/mL, alrededor de 7 U/mL, alrededor de 8 U/mL, alrededor de 9 U/mL, alrededor de 10 U/mL, alrededor de 11 U/mL, alrededor de 12 U/mL, alrededor de 13 U/mL, alrededor de 14 U/mL, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 16 U/mL, alrededor de 17 U/mL, alrededor de 18 U/mL, alrededor de 19 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de 21 U/mL, alrededor de 22 U/mL, alrededor de 23 U/mL, alrededor de 24 U/mL, alrededor de 25 U/mL, o más, indican una infección crónica de la herida. Como se entiende en la técnica, las unidades de actividad (U) se usan típicamente para describir la actividad catalítica enzimática, donde una unidad (U) se refiere a la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 micromol (pmol) de sustrato por minuto. Por lo tanto, 1 unidad de enzima (U) = 1 pmol/min, en donde pmol se refiere a la cantidad de sustrato convertido.

En una realización específica, la MMP es MMP-2 o MMP-9, en donde los niveles de actividad de MMP-2 y MMP-9 de al menos 10,5 U/mL indican infección crónica de la herida.

Cualquier péptido escindible por MMP se puede usar de acuerdo con la realización descrita en la presente. Por ejemplo, véase la Tabla 1 de la patente estadounidense No. 7,148,194.

La Tabla 1 muestra los diversos sustratos y su especificidad para diferentes isoformas de MMP humanas. Los datos se presentan en la Tabla 3 de Nagase et al. (“Substrate specificity of MMPs”, enMatrix Metalloproteinase Inhibitors in Cáncer Therapy,Clendeninn & Appelt Eds.,Springer Science Media New York,2001).

Tabla 1

En otra realización, la proteasa específica de la herida de la invención es elastasa de neutrófilos humanos (HNE) (acceso UNIPROT Nos. P08246 [humano] y Q3UP87 [ratón]) es una proteinasa de serina en la misma familia que la quimotripsina y tiene una amplia especificidad de sustrato. Secretada por neutrófilos y macrófagos durante la inflamación, destruye las bacterias y tejido huésped. En una realización, el sustrato para detectar HNE tiene una secuencia central Alanina-Alanina-Prolina-Valina (AAPV). En otra realización, el sustrato para HNE es Ala-Pro-Glu-Glu-Ile/Met-Arg-Arg-Gln (APEEI/MRRQ) (Kasperkiewicz y et al.,PNAS USA,111(7):2518-2523, 2014, Korkmaz et al.,Methods Mol Biol.,844:125-138, 2012).

En alguna realización, los niveles de la actividad de elastasa de neutrófilos humanos de alrededor de 5 U/mL a alrededor de 30 U/mL, incluidos todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 6 U/mL, alrededor de 7 U/mL, alrededor de 8 U/mL, alrededor de 9 U/mL, alrededor de 10 U/mL, alrededor de 11 U/mL, alrededor de 12 U/mL, alrededor de 13 U/mL, alrededor de 14 U/mL, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 16 U/mL, alrededor de 17 U/mL, alrededor de 18 U/mL, alrededor de 19 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de 21 U/mL, alrededor de 22 U/mL, alrededor de 23 U/mL, alrededor de 24 U/mL, alrededor de 25 U/mL o más, indican una infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de elastasa de neutrófilos humanos de al menos 9,6 U/mL indican infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de elastasa neutrófila humana de al menos 22,9 U/mL indican infección crónica de la herida.

Los subgrupos de MMP y HNE tienen diferentes mecanismos cuando interactúan con las proteínas en una herida y, por lo tanto, como se podría esperar, cada uno tiene un método diferente de inhibición de cicatrización de las heridas.

En otra realización, la enzima específica de herida es lisozima. La lisozima (acceso UNIPROT Nos. P61626 [humano] y P08905 [ratón]) es una glicósido hidrolasa y su función principal es destruir las paredes celulares de las bacterias. Hidroliza los enlaces p (1^4) entre el ácido N-acetilmurámico y los residuos de N-acetil-D-glucosamina en el peptidoglicano y también entre los residuos de N-acetil-D glucosamina en la quitodextrina. El sustrato natural para la lisozima es la capa de peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. Sin embargo, se han usado diversos sustratos de baja masa molecular que incluyen productos de degradación de mureína así como compuestos sintéticos para diversos ensayos de lisozima fotométrica, isotópica e inmunológica. Holtje et al.,EXS,75:105-10, 1996. Los siguientes sustratos de lisozima de baja masa molecular están disponibles en Sigma Aldrich, Saint Louis, MO:4-metilumbeliferil p-D-N,N',N"-triacetil-quitotriosida (catálogo de Sigma número M5639) y 4-nitrofenil p-D-N,N',N"-triacetil-quitotriosida (catálogo de Sigma número N8638).

En algunas realizaciones, los niveles de actividad de lisozima de alrededor de 1000 U/mL a alrededor de 10,000 U/mL, que incluyen todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 1100 U/mL, alrededor de 1200 U/mL, alrededor de 1300 U/mL, alrededor de 1400 U/mL, alrededor de 1500 U/mL, alrededor de 1600 U/mL, alrededor de 1700 U/mL, alrededor de 1800 U/mL, alrededor de 1900 U/mL, alrededor de 2000 U/mL, alrededor de 2100 U/mL, alrededor de 2200 U/mL, alrededor de 2300 U/mL, alrededor de 2400 U/mL, alrededor de 2500 U/mL, alrededor de 2600 U/mL, alrededor de 2700 U/mL, alrededor de 2800 U/mL, alrededor de 2900 U/mL, alrededor de 3000 U/mL, alrededor de 3250 U/mL, alrededor de 3500 U/mL, alrededor de 3750 U/mL, alrededor de 4000 U/mL, alrededor de 4250 U/mL, alrededor de 4500 U/mL, alrededor de 4750 U/mL, alrededor de 5000 U/mL, alrededor de 5250 U/mL, alrededor de 5500 U/mL, alrededor de 5750 U/mL, alrededor de 6000 U/mL, o más, indican infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de la lisozima de al menos 4800 U/mL indican infección crónica de la herida.

Aún en una realización adicional, la enzima específica de la herida es peroxidasa, más específicamente, una mieloperoxidasa (MPO). La MPO (acceso UNIPROT Nos. P05164 [humano] y P11247 [ratón]) es una peroxidasa que se encuentra en los granulocitos neutrófilos. En presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) y un haluro (más comúnmente, cloruro) produce las sustancias antimicrobianas hipoclorito, oxígeno singlete (1O2), cloro (Cl2) y radicales hidroxilo (OH^). La MPO se puede detectar mediante el uso de tetrametilbenzidina o 4-benzoilamino-2,5-dimetoxianilina. Véase, Andrews et al.,Anal Biochem,127(2):346-50, 1982; Klebanoff et al.,J. Leukocyte Biol.,77, 598-625, 2005.

Aun en una realización adicional, la enzima específica de la herida es catepsina G (acceso UNIPROT Nos. P08311 [humano] y P28293 [ratón]), que es una de las tres proteasas de serina de la familia de la quimotripsina que se almacenan en los gránulos azurófilos. Los sustratos específicos de catepsina G tienen la secuencia Ala-Ala-Pro-Phe o Ala-Ala-Pro-Met (catálogo de Sigma Aldrich Nos. S7388 y M7771).

En algunas realizaciones, los niveles de actividad de catepsina G de alrededor de 10 U/mL a alrededor de 100 U/mL, que incluyen todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de 25 U/mL, alrededor de 30 U/mL, alrededor de 35 U/mL, alrededor de 40 U/mL, alrededor de 45 U/mL, alrededor de 50 U/mL, alrededor de 55 U/mL, alrededor de 60 U/mL, alrededor de 65 U/mL, alrededor de 70 U/mL, alrededor de 75 U/mL, alrededor de 80 U/mL, alrededor de 85 U/mL, alrededor de 90 U/mL, alrededor de 95 U/mL, alrededor de 100 U/mL, alrededor de 110 U/mL, alrededor de 120 U/mL, o más, indican infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de catepsina G de al menos 50 U/mL, al menos 40 U/mL, al menos 30 U/mL, al menos 20 U/mL, al menos 15 U/mL o al menos 10 U/mL indican infección crónica de la herida.

En algunas realizaciones, la enzima específica de la herida es activador del plasminógeno tipo urocinasa (acceso UNIPROT Nos. P00749 [humano] y P06869 [ratón]), que es una proteasa de serina implicada en la degradación de la matriz extracelular y posiblemente migración y proliferación de células tumorales. Un sustrato específico para urocinasa tiene un motivo básico Arg-Val o Lys-Val. Véase, Rijken et al.,Biochem Biophys Res Commun.,174(2):432-8, 1991.

En algunas realizaciones, la una o más enzimas son esterasas. Una esterasa es una hidrolasa que divide ésteres en un ácido y un alcohol en una reacción química con agua. En una realización específica, el sustrato para esterasa es diacetato-5-maleimida de fluoresceína.

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden sustratos que son capaces de detectar una pluralidad de enzimas, por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más de las enzimas mencionadas anteriormente. Tales composiciones pueden incluir, por ejemplo, una pluralidad de sustratos conjugados con el mismo polímero en gel o polímeros en gel diferentes.

En ciertas realizaciones, los sustratos están etiquetados. El término "etiqueta", como se usa en la presente, se refiere a cualquier sustancia unida a un agente de unión a epítopo, u otro material de sustrato, en el que la sustancia es detectable mediante un método de detección. Ejemplos no limitativos de etiquetas adecuadas incluyen moléculas luminiscentes, moléculas quimioluminiscentes, fluorocromos, agente de inactivación fluorescente, moléculas coloreadas, radioisótopos, escintilantes, biotina, avidina, estreptavidina, proteína A, proteína G, anticuerpos o fragmentos de estos, polihistidina, Ni2+, etiquetas Flag, etiquetas myc, metales pesados y enzimas (que incluyen fosfatasa, peroxidasa y luciferasa alcalina). Tales métodos son conocidos en el estado de la técnica.

En ciertas realizaciones, los sustratos se etiquetan con una etiqueta que es una etiqueta detectable. Una etiqueta detectable es una porción, cuya presencia se puede determinar directa o indirectamente. Generalmente, la detección de la etiqueta implica la creación de una señal detectable tal como, por ejemplo, una emisión de energía. La etiqueta puede ser de naturaleza química, de péptido o de ácido nucleico aunque no es tan limitada. La naturaleza de la etiqueta usada dependerá de una variedad de factores, que incluye la naturaleza del análisis que se realiza, el tipo de fuente de energía y detector usado y el tipo de polímero, analito, sonda y componentes de fijación específicos del analito primario y secundario. La etiqueta debería ser compatible estérica y químicamente con los constituyentes a los que está unida.

La etiqueta se puede detectar directamente, por ejemplo, por su capacidad para emitir y/o absorber radiación electromagnética de una longitud de onda particular. Una etiqueta se puede detectar indirectamente, por ejemplo, por su capacidad para unir, reclutar y, en algunos casos, escindir otra porción que en sí misma puede emitir o absorber luz de una longitud de onda particular (por ejemplo, una etiqueta del epítopo tal como el epítopo FLAG, una etiqueta de la enzima tal como peroxidasa de rábano, etc.). Por lo general, la etiqueta detectable se puede seleccionar del grupo que consiste en etiquetas detectables directamente, tal como una molécula fluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, R-ficoeritrina, Cy-3, Cy-5, Cy-7, Texas Red, Phar-Red., aloficocianina (APC), amina de fluoresceína, eosina, dansilo, umbeliferona, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6 carboxirodamina (R6G), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido benzoico de 4-(4'-dimetilaminofenilazo) (DABCYL), ácido sulfónico de 5-(2'-aminoetilo)aminonaftaleno-1 (EDANS), ácido disulfónico de 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2, 2', acridina, isotiocianato de acridina, r-amino-N-(3-vinilsulfonil)fenilnaftalimida-3,5, disulfonato (Lucifer Yellow VS), N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Brilliant Yellow, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina, 7-amino-4-trifluorometilcularina (cumarina 151), cianosina, 4', 6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5"-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5"-dibromopirogalol-sulfonftaleína (Bromopyrogallol Red), 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenilo)-4-metilcumarina dietilentriamina pentaacetato, ácido disulfónico de 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2', ácido disulfónico de 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2', 4-dimetilaminofenilazofenilo-4'-isotiocianato (DABITC), isotiocianato de eosina, eritrosina B, isotiocianato de eritrosina, etidio, 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), QFITC (XRITC), fluorescamina, IR144, IR1446, isotiocianato de verde de malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, rojo de fenol, B-ficoeritrina, o-ftaldialdehído, pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil-1-pireno, rojo reactivo 4 (Rojo Brillante 3B-A Cibacron®), cloruro de sulfonilo de lisamina rodamina B, rodamina B, rodamina 123, rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101, tetrametilrodamina, riboflavina, ácido rosólico y derivados de quelato de terbio), una molécula quimioluminiscente, una molécula bioluminiscente, una molécula cromogénica, un radioisótopo (por ejemplo, P32 o H3, 14C, 125I y 131I), una molécula de resonancia del espín de electrones (como, por ejemplo, radicales de nitroxilo), una molécula de densidad de electrones u óptica, una molécula de transducción o transferencia de carga de electrones, una molécula electromagnética tal como una microesfera o partícula magnética o paramagnética, un nanocristal o nanopartícula semiconductores (tales como puntos cuánticos descritos, para ejemplo, en la patente estadounidense No. 6,207,392 y disponible en el comercio de Quantum Dot Corporation y Evident Technologies), un metal coloidal, un nanocristal de oro coloidal, una molécula de resonancia magnética nuclear y similares.

La etiqueta detectable también se puede seleccionar del grupo que consiste en etiquetas detectables indirectamente tales como una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense No.

4,737,456); oxidasas de sacáridos tales como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; oxidasas heterocíclicas como uricasa y xantina oxidasa acopladas a una enzima que usa peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa), un sustrato de enzima, una molécula de afinidad, un ligando, un receptor, una molécula de biotina, un molécula de avidina, una molécula de estreptavidina, un antígeno (por ejemplo, etiquetas epitópicas tales como el epítopo FLAG o HA), un hapteno (por ejemplo, biotina, piridoxal, digoxigenina de fluoresceína y dinitrofenol), un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una microesfera, etc. Los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, F(ab)2, Fd y fragmentos de anticuerpos que incluyen una región CDR3.

En algunas realizaciones, los sustratos se conjugan con fluoróforos donantes y aceptores, respectivamente, que forman un par de FRET. Se puede usar FRE<t>, por ejemplo, en un formato de matriz para determinar si un anticuerpo secundario particular está unido independientemente de la identidad del analito al que se une. Alternativamente, el componente de fijación secundario se puede etiquetar de manera detectable sin etiquetar el componente de fijación primario. El etiquetado del componente de fijación secundario también es útil para establecer la orientación del ácido nucleico unido a este. La FRET sola generalmente requiere una sola fuente de excitación (y, por lo tanto, longitud de onda) y, por lo general, un solo detector. El detector se puede establecer en el espectro de emisión del fluoróforo donante o aceptor. Se establece en el espectro de emisión de fluoróforo del donante si se detecta FRET mediante la inactivación de la fluorescencia del donante. Alternativamente, se establece en el espectro de emisión de fluoróforo aceptor si se detecta FRET mediante emisión de fluoróforo aceptor. En algunas realizaciones, se pueden detectar las emisiones de FRET tanto de fluoróforos donantes como aceptores. En aún otras realizaciones, el donante se excita con luz polarizada y se detecta la polarización de ambos espectros de emisión.

En una realización, la etiqueta detectable es compatible con ensayos basados en FRET. FRET requiere el uso de un par de fluoróforos FRET. Los pares de fluoróforos FRET son dos fluoróforos que son capaces de someterse a FRET para producir o eliminar una señal detectable cuando se colocan cerca unos de otros. Los ejemplos de donantes incluyen Alexa 488, Alexa 546, BODIPY 493, Oyster 556, Fluor (FAM), Cy3 y TMR (Tamra). Los ejemplos de aceptadores incluyen Cy5, Alexa 594, Alexa 647 y Oyster 656. Cy5 puede funcionar como donante con Cy3, TMR o Alexa 546, como un ejemplo. FRET debería ser posible con cualquier par de fluoróforos que tenga máximos de fluorescencia espaciados a 50-100 nm entre sí.

El sustrato puede etiquetarse de una manera no específica en secuencia además del etiquetado de código de barras descrito en la presente. Por ejemplo, si el polímero es un ácido nucleico tal como<a>D<n>, entonces su estructura principal puede teñirse con una etiqueta de estructura principal. Los ejemplos de tinciones de estructura principal que etiquetan ácidos nucleicos en una manera no específica en secuencia incluyen colorantes intercalados tales como fenantridinas y acridinas (por ejemplo, bromuro de etidio, yoduro de propidio, yoduro de hexidio, dihidroetidinio, homodímero-1 y -2 de etidio, monoazida de etidio y ACMA); aglutinantes de ranura menor tales como indoles e imidazoles (por ejemplo, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 y DAPI); y diversas tinciones de ácido nucleico tales como naranja de acridina (también capaz de intercalación), 7-AAD, actinomicina D, LDS751 e hidroxistilbamidina. Todas las tinciones de ácido nucleico mencionadas anteriormente están disponibles en el comercio de proveedores tales como Molecular Probes.

Otros ejemplos adicionales de tinciones de ácido nucleico incluyen los siguientes colorantes de Molecular Probes: colorantes de cianina tales como SYTOX BLUE, SYTOX GREEN, SYTOX ORANGE, POPO-1, POPO-3, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, JOJO-1, LOLO-1, BOBO-1, BOBO-3, PO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-1, BO-PRO-3, TO-PRO-1, TO-PRO-3, TO-PRO-5, JO-PRO-1, LO-PRO-1, YO-PRO-1, YO-PRO-3, PICOGREEN, OLIGREEN, RIBOGREEN, SYBR GOLD, SYBR GREEN I, SYBR GREEN II, SYBR DX, SYTO-40, -41, -42, -43, -44, -45 (AZUL), SYTO-13, -16, -24, -21, -23, -12, -11, -20, -22, -15, -14, -25 (VERDE), SYTO-81, -80, -82, -83, -84, -85 (naranja), SYTO-64, -17, -59, -61, -62, -60, -63 (rojo).

En algunas realizaciones, la molécula indicadora comprende un cromóforo o un fluoróforo. En realizaciones adicionales, el cromóforo es un resto azo, un resto nitro, un resto triarilmetano, un metino, antraquinona, un resto polieno o ftalocianina. En algunas realizaciones, la molécula indicadora es un colorante. Se prevé que el colorante puede ser, entre otros, rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, dipirrometenborodifluoruro, naftalimida, una ficobiliproteína, proteínas de clorofila de peridinio, conjugados de estos y combinaciones de estos. Ejemplos no limitativos de los colorantes incluyen fluoresceína, 6-FAM, rodamina, Texas Red, California Red, iFluor594, tetrametilrodamina, una carboxirrodamina, carboxirrodamina 6F, carboxirhodol, carboxirrodamina 110, Cascade Blue, Cascade Yellow, cumarina, Cy2®, Cy3®, Cy3,5®, Cy5®, Cy5,5®, Cy7®, Cy-Chrome, DyLight 350, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800, ficoeritrina, PerCP (proteína peridinina clorofila-a), PerCP-Cy5,5, JOE (6-carboxy-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), NED, ROX (5-(y-6-)-carboxi-X-rodamina), HEX, Amarillo Lucifer, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Alexa Fluor® 350, Alex Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa F luor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, 7-amino-4-metilcoumarin-3-ácido acético, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY ® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, o conjugados de estos, o combinaciones de estos. En algunas realizaciones, la molécula indicadora es ácido dimetilaminoazobencenosulfónico (dabsilo) o un derivado de dabsilo. En algunas realizaciones, la molécula indicadora es fluoresceína, un derivado de fluoresceína o un compuesto que contiene fluoresceína.

En algunas realizaciones, la molécula indicadora es un lípido. En algunas realizaciones, el lípido es un derivado fosfolípido sintético. En algunas realizaciones, el derivado fosfolípido sintético es DDPC, DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, POPC o DEPC. En algunas realizaciones, el derivado fosfolípido sintético es DLPC, DMPC, o DPPC. En algunas realizaciones, el derivado fosfolípido sintético es DLPC. En algunas realizaciones, el derivado fosfolípido sintético es DMPC. En algunas realizaciones, el derivado fosfolípido sintético es DPPC.

En algunas realizaciones, la molécula indicadora está comprendida en un fragmento detectable que se escinde del material de apósito para heridas al entrar en contacto con una enzima. En algunas realizaciones, la molécula indicadora no está comprendida en el fragmento que se escinde del material de apósito para heridas al entrar en contacto con una enzima. En algunas realizaciones, la molécula indicadora se visualiza a simple vista. En algunas realizaciones, la molécula indicadora se visualiza bajo luz UV. En algunas realizaciones, la molécula indicadora se visualiza mediante el uso de una lámpara fluorescente.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I, R comprende opcionalmente un fragmento inactivador. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador evita que la molécula indicadora fluoreszca. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador es un grupo protector. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador es un grupo acetato.

Se describe en la presente, en ciertas realizaciones, materiales de apósitos para heridas modificados que contienen una secuencia diana para una o más enzimas. En algunas realizaciones, la escisión catalizada con enzima libera un fragmento detectable. El fragmento detectable puede comprender una molécula indicadora. La medición cualitativa o cuantitativa de los niveles de fragmentos detectables permite una determinación de la presencia o ausencia de infección en la herida.

En algunas realizaciones, la escisión catalizada con enzima libera un fragmento no detectable. En algunas realizaciones, la interacción de la enzima con el material de apósito para heridas escinde un fragmento inactivador, y permite que fluorezca una molécula indicadora unida al material de apósito para heridas. La medición cualitativa o cuantitativa de la fluorescencia permite una determinación de la presencia o ausencia de infección en la herida. Se describe en la presente, en ciertas realizaciones, materiales de apósitos para heridas modificados con péptidos que contienen una secuencia diana para una o más proteasas. La escisión catalizada con proteasa libera un fragmento de péptido detectable. El fragmento de péptido detectable comprende una molécula indicadora. La medición cualitativa o cuantitativa de los niveles de fragmentos peptídicos detectables permite una determinación de la presencia o ausencia de proteasas elevadas en la herida. En algunas realizaciones, la escisión catalizada con enzima libera un fragmento no detectable. En algunas realizaciones, la interacción de la enzima con el material de apósito para heridas escinde un fragmento inactivador, y permite que fluorezca una molécula indicadora unida al material de apósito para heridas. La medición cualitativa o cuantitativa de la fluorescencia permite una determinación de la presencia o ausencia de infección en la herida.

En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I, R comprende un fragmento inactivador. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador impide que la molécula indicadora fluorezca. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador es un grupo protector. En algunas realizaciones, el fragmento inactivador es un grupo acetato. En algunas realizaciones de un material de apósito para heridas de la Fórmula I, R comprende una porción química que es un producto de reacción nucleofílica. En algunas realizaciones, R comprende un aducto de maleimida-tiol. En algunas realizaciones, R comprende un producto conjugado de haloacetamida-tiol. En algunas realizaciones, R comprende un producto conjugado de haloacetamida.

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de la Fórmula la:

Fórmula

en donde R es una región que comprende una molécula indicadora; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000, por ejemplo, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, que incluyen todos los valores unitarios entre, por ejemplo, 201, 202, 203, etc. En realizaciones adicionales, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido.

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de la Fórmula Ib:

Fórmula

en donde R es una región que comprende una molécula indicadora; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000, por ejemplo, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, que incluyen todos los valores unitarios entre, por ejemplo, 201, 202, 203, etc. En realizaciones adicionales, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y un aminoácido. En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de la Fórmula IIa:

Fórmula IIa<m>—L _ P E P

en donde M es un polímero gelificante seleccionado de celulosa, celulosa químicamente modificada, pectina, alginato, quitosano, ácido hialurónico, polisacárido o polímero derivado de goma, o cualquier combinación de estos; PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; y L es un ligador que conecta M y PEP, en donde L comprende una o más subunidades de polietilenglicol o subunidades de polipropileno.

En algunas realizaciones, el material de apósito para heridas tiene la estructura de la Fórmula IIb:

Fórmula

en donde PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000. En otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200.

En algunas realizaciones, el material para apósitos de heridas tiene la estructura de la Fórmula IIc:

Fórmula IIc

en donde PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000, por ejemplo, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, que incluyen todos los valores unitarios entre, por ejemplo, 201, 202, 203, etc. En realizaciones adicionales, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200.

Composiciones:

Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a composiciones que contienen los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II. Tales composiciones pueden prepararse mediante métodos convencionales.

Una vez formulada, la composición de reserva resultante de los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II se puede modificar adicionalmente en la forma deseada, por ejemplo, geles, bálsamos, lociones, cremas, pastas, pomadas, etc. mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante portadores, agentes gelificantes, emolientes, tensioactivos, humectantes, potenciadores de viscosidad, emulsionantes, etc. Véanse, por ejemplo, WO 2011/126384 y WO 2013/004953.

Los portadores para usar en la composición pueden incluir, entre otros, agua, glicerina, diglicerina, derivados de glicerina, glicoles, derivados de glicol, azúcares, ésteres y éteres etoxilados y/o propoxilados, urea, PCA de sodio, alcoholes, etanol, alcohol isopropílico, y combinaciones de estos. En una forma de realización, el portador es propilenglicol. Típicamente, la composición contiene un portador en una cantidad que va de alrededor de 1% en peso de la composición a alrededor de 99,9% en peso de la composición, más típicamente que va de alrededor de 2% en peso de la composición a alrededor de 95% en peso de la composición, y más típicamente que va de alrededor de 5% en peso de la composición a alrededor de 90% en peso de la composición.

Los agentes gelificantes termorreversibles se definen como ingredientes que son solubles, parcialmente solubles o miscibles en un portador hidrófilo a temperaturas elevadas, tales como 50°C, en donde los agentes tienen la capacidad de espesar el portador cuando se enfrían a 25°C, pero serán menos viscosos a 50°C cuando sea necesaria la aplicación en un sustrato. Los portadores hidrofílicos adecuados incluyen agua, glicoles, por ejemplo, propilenglicol. Los agentes gelificantes termorreversibles para usar en la composición pueden incluir sales de ácidos grasos tales como estearato de sodio, palmitato de sodio, estearato de potasio. Estas sales se pueden agregar a la composición o se pueden crear in situ mediante la adición del ácido graso y la neutralización con una base apropiada. Un ejemplo de formación in situ de la composición es proporcionar ácido esteárico e hidróxido sódico para producir estearato sódico. Otros agentes gelificantes termorreversibles comunes podrían incluir, por ejemplo, polietilenglicoles y derivados tales como PEG-20, diestearato de PEG-150, tetrastearato de pentaeritritilo PEG-150, IPDI de distearet-75, IPDI de distearet-100, alcoholes grasos, por ejemplo, alcohol cetílico, ácidos grasos tales como ácido esteárico, ácido hidroxiesteárico y sus derivados, y combinaciones de estos.

Además del portador y el agente gelificante termorreversible, la composición puede contener varios otros ingredientes y componentes. Ejemplos de otros ingredientes que se pueden incluir en la composición son emolientes, esteroles o derivados de esterol, grasas o aceites naturales y sintéticos, potenciadores de viscosidad, modificadores de reología, polioles, tensioactivos, alcoholes, ésteres, siliconas, arcillas, almidón, celulosa, partículas, hidratantes, formadores de película, modificadores de deslizamiento, modificadores de superficie, protectores de la piel, humectantes, filtros solares y similares.

Composiciones y/o preparaciones farmacéuticas:

Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a composiciones y/o preparaciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos mencionados anteriormente de la Fórmula I o la Fórmula II y un portador. La frase "aceptable desde el punto de vista farmacéutico" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, sales, composiciones, formas de dosis, etc., que son, dentro del alcance de un criterio médico razonable, adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y/u otros mamíferos sin un exceso de toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, de forma proporcional con una relación razonable de beneficio/riesgo. En algunos aspectos, la expresión "aceptable desde el punto de vista farmacéutico" significa aprobado por un ente regulador del gobierno federal o estatal, o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea habitualmente reconocida, para su uso en mamíferos (por ejemplo, animales) y, más particularmente, en seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Ejemplos de tales composiciones incluyen aquellas adaptadas para: (a) aplicación tópica, por ejemplo, artículos (por ejemplo, gasas, almohadillas, hisopos, apósitos), cremas, pomadas, geles, lociones, etc.; (b) administración parenteral, por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como una solución o suspensión estéril; (c) administración oral, aplicación externa (por ejemplo, soluciones orales que incluyen soluciones o suspensiones acuosas y no acuosas), comprimidos, bolos, polvos, gránulos, pelets para mezclar con piensos, pastas para aplicar en la lengua, etc.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más agentes antibióticos. Como se usa en la presente, la expresión “antibiótico” o “agente antimicrobiano” se refiere a una sustancia que inhibe el crecimiento de microorganismos o que los destruye. Preferentemente, el antibiótico es útil para contener la virulencia de un agente infeccioso y/o tratar una enfermedad infecciosa. Antibiótico también se refiere a sustancias semisintéticas en donde una forma natural producida por un microorganismo, por ejemplo, levadura u hongo, está estructuralmente modificada.

Preferentemente, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en p-lactamas (que incluyen, inhibidores de plactamasa y cefalosporinas), fluoroquinolonas, aminoglicósidos, tetraciclinas y/o glicilciclinas y/o polimixinas. También se puede emplear cualquier combinación de agentes antimicrobianos, por ejemplo, al menos una p-lactama y al menos una fluoroquinolona; al menos un aminoglicósido y una cefalosporina; al menos un inhibidor de p-lactama y uno de p-lactamasa, opcionalmente junto con un aminoglicósido, etc.

Como se usa en la presente, el término inhibidor de "p-lactama" incluye penicilinas y derivados de penicilina naturales y semisintéticos, por ejemplo, penicilina benzatínica, bencilpenicilina (penicilina G), fenoximetilpenicilina (penicilina V), penicilina procaína y oxacilina; meticilina, dicloxacilina y flucloxacilina; temocilina; amoxicilina y ampicilina; azlocilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina y piperacilina; biapenem, doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem, panipenem y PZ-601; cefalexina, cefalotina, cefazolina, cefaclor, cefuroxima, cefamandol, cefotetan, cefoxitina, cefotaxima y cefpodoxima; cefepima y cefpiroma; cefadroxilo, cefixima, cefprozilo, cefalexina, cefalotina, cefuroxima, cefamandol, cefepima y cefpiroma; cefoxitina, cefotetan, cefmetazol y flomoxef; tigemonam, nocardicina A y tabtoxina; ácido clavulánico, moxalactama y flomoxef. Las fluoroquinolonas incluyen ciprofloxacina, garenoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, levofloxacina y moxifloxacina. Los aminoglicósidos incluyen, por ejemplo, kanamicina, amikacina, tobramicina, dibekacina, gentamicina, sisomicina, netilmicina, neomicina B, neomicina C, neomicina E (paromomicina) y estreptomicina, que incluyen derivados sintéticos, claritromicina y azitromicina. Las tetraciclinas incluyen compuestos naturales (por ejemplo, tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, demeclociclina) o agentes semisintéticos (por ejemplo, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, rolitetraciclina). Las glicilciclinas (por ejemplo, minociclina/tigeciclina) derivan de tetraciclinas. Las polimixinas incluyen, por ejemplo, polimixina B y polimixina E (colistina).

En ciertas realizaciones, las composiciones pueden contener un antibiótico a una concentración de 0,1 mg/mL, 0,5 mg / L, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 31 mg/mL, 32 mg/mL, 33 mg/mL, 34 mg/mL, 35 mg/mL, 36 mg/mL, 37 mg/mL, 38 mg/mL, 39 mg/mL, 40 mg/mL, 41 mg/mL, 42 mg/mL, 43 mg/mL 44 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/m, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 300 mg/mL, 400 mg/mL, 500 mg/mL o más. Por ejemplo, imipenem y ertapenem se pueden usar en concentraciones de 50, 30, 20, 15, 10, 5 y 1 mg/mL.

Apósitos para heridas:

En ciertas realizaciones de la presente se describen apósitos para heridas que comprenden materiales de apósitos para heridas como se describen en la presente, por ejemplo, compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II. En algunas realizaciones, los apósitos para heridas consisten esencialmente en los materiales de apósitos para heridas como se describen en la presente, por ejemplo, un compuesto de la Fórmula I o la Fórmula II.

En una realización, el apósito para heridas descrito en la presente es biocompatible, biodegradable, no inmunogénico y de fácil acceso en el comercio.

En una realización, los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II se proporcionan en forma de partículas, tales como partículas de fibra o partículas de polvo, que, opcionalmente, contienen un medicamento. En particular, los materiales contienen preferentemente fibras de CMC.

Las composiciones pueden comprender preferentemente una mezcla íntima del material de apósito y otros compuestos. Por ejemplo, en una realización, la mezcla íntima comprende una solución o dispersión mixtas del material del apósito y un portador adecuado, tal como un solvente, o una composición sólida que se produce mediante la eliminación del solvente de tal solución o dispersión. En esta realización, el material del apósito constituye al menos 5%, con mayor preferencia al menos 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 90% o más% en peso del material. En ciertas realizaciones preferidas, el material consiste esencialmente en el material del apósito.

Otros componentes del material pueden incluir 0-25% en peso, por ejemplo de alrededor de 1 a alrededor de 20% en peso, de uno o más de otros polisacáridos biocompatibles, por ejemplo alginatos tales como alginato de sodio o alginato de calcio, derivados de almidón tales como sodio glicolato de almidón, derivados de celulosa tales como metilcelulosa o carboximetil celulosa, o glicosaminoglicanos tales como ácido hialurónico o sus sales, sulfato de condroitina o sulfato de heparano. Los materiales también pueden comprender hasta alrededor de 25% en peso, por ejemplo de alrededor de 1 a alrededor de 20% en peso, de una o más proteínas estructurales seleccionadas del grupo que consiste en fibronectina, fibrina, laminina, elastina, colágeno y mezclas de estos. Preferentemente, la proteína comprende colágeno y, con mayor preferencia, consiste esencialmente en colágeno. Los materiales también pueden comprender hasta alrededor de 20% en peso, preferentemente de alrededor de 2% a alrededor de 10% en peso, de agua. Los materiales también pueden contener 0-40% en peso, por ejemplo de alrededor de 5 a alrededor de 25% en peso, de un plastificante, preferentemente un alcohol polihídrico tal como glicerol o sorbitol. En ciertas realizaciones, los materiales también pueden comprender hasta alrededor de 10% en peso, por ejemplo de alrededor de 0,01 a alrededor de 5% en peso, típicamente de alrededor de 0,1 a alrededor de 2% en peso, de uno o más agentes terapéuticos de cicatrización de heridas, tales como medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, acetaminofeno), esteroides, anestésicos locales, agentes antimicrobianos o factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos o factor de crecimiento derivado de plaquetas). El agente antimicrobiano puede comprender, por ejemplo, un antiséptico, un antibiótico o mezclas de estos. Los antibióticos preferidos incluyen tetraciclina, penicilinas, terramicinas, eritromicina, bacitracina, neomicina, polimicina B, mupirocina, clindamicina y mezclas de estos. Los antisépticos preferidos incluyen plata, incluso plata coloidal, sales de plata que incluyen sales de uno o más de los polímeros aniónicos que componen el material, sulfadiazina de plata, clorhexidina, povidona yodada, triclosán, sucralfato, sales de amonio cuaternario y mezclas de estos. De acuerdo con la invención, estos apósitos para heridas medicinales proporcionan una liberación sostenida de los agentes terapéuticos a medida que el material del apósito se descompone durante el uso.

Todos los porcentajes mencionados anteriormente son en función de peso seco. Preferentemente, la relación en peso del material de apósito para heridas con respecto a otros materiales y agentes auxiliares va de alrededor de 1:99 a alrededor de 99:1. Con mayor preferencia, la relación en peso está en el intervalo que va de alrededor de 1:9 a alrededor de 9:1, con mayor preferencia está en el intervalo que va de alrededor de 4:1 a alrededor de 1:4, aún con mayor preferencia está en el intervalo que va de alrededor de 2:1 a alrededor de 1:2.

El material puede estar en cualquier forma conveniente, como por ejemplo polvo, microesferas, escamas, una alfombrilla o una película.

En ciertas realizaciones, el material está en forma semisólida o de pomada en gel para aplicación tópica.

En ciertas realizaciones, el material está en forma de una esponja bioabsorbible liofilizada o secada con disolvente para su aplicación sobre una herida crónica. Preferentemente, el tamaño promedio de poro de la esponja está en la región de 10-500 pm, con mayor preferencia de alrededor de 100-300 pm. Se ha hecho una esponja adecuada mediante la liofilización o secado con disolvente de una dispersión acuosa que comprende compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II, junto con agentes terapéuticos adecuados.

Aún en otras realizaciones, el material está en forma de una película flexible, que puede ser continua o interrumpida (por ejemplo, perforada). Preferentemente, la película flexible comprende un plastificante para darle flexibilidad, tal como glicerol.

La fácil accesibilidad de ambos polímeros formadores de gel, por ejemplo, derivados de celulosa, que tienen un intervalo de propiedades controlables significa que las propiedades de las composiciones de la presente invención pueden controlarse en un grado excepcional. En particular, se puede controlar la tasa de absorción biológica, porosidad y densidad de los materiales.

En una realización de la presente se proporcionan materiales de apósitos para heridas en forma de lámina, que tienen una capa activa de una composición que comprende compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II. La capa activa normalmente sería la capa en contacto con la herida que está en uso, pero en algunas realizaciones se podría separar de la herida por medio de una lámina superior permeable a los líquidos. En una realización, el área de la capa activa va de alrededor de 1 cm2 a alrededor de 400 cm2 particularmente de alrededor de 4 cm2 a alrededor de 100 cm2.

En otra realización, el material de apósito para heridas comprende además una lámina de respaldo que se extiende sobre la capa activa del lado opuesto al lado que enfrenta a la herida de la capa activa. Preferentemente, la lámina de respaldo es más grande que la capa activa de manera que una región marginal de un ancho que va de 1 mm a 50 mm, preferentemente de 5 mm a 20 mm, se extiende alrededor de la capa activa para formar un apósito adhesivo. En esos casos, la lámina de respaldo está preferentemente recubierta con un adhesivo de grado médico sensible a la presión al menos en su región marginal.

En realizaciones en donde el material de apósito comprende una lámina de respaldo, la lámina posterior es sustancialmente impermeable a los líquidos. En otra realización, la lámina de respaldo es semipermeable, por ejemplo, la lámina de respaldo es preferentemente permeable al vapor de agua, pero no es permeable al agua líquida o al exudado de la herida. Preferentemente, la lámina de respaldo también es impermeable a microorganismos. Las láminas de respaldo conformables y continuas adecuadas tendrán preferentemente una tasa de transmisión de vapor de humedad (MVTR) de la lámina de respaldo en soledad que va de 300 a 5000 g/m2/24 horas, preferentemente de 500 a 2000 g/m2/24 horas a 37,5°C a y a razón de una diferencia de humedad relativa que va del 100% al 10%. El espesor de la lámina de respaldo está preferentemente en el intervalo que va de 10 a 1000 micrómetros, con mayor preferencia de 100 a 500 micrómetros.

La MVTR del apósito en su totalidad es menor que la de la lámina de respaldo en soledad porque la lámina con aberturas obstruye parcialmente la transferencia de humedad a través del apósito.

Los polímeros adecuados para formar la lámina de respaldo incluyen poliuretanos y acrilatos y metacrilatos de polialcoxialquilo. Preferentemente, la lámina de respaldo comprende una capa continua de una espuma de poliuretano bloqueado de alta densidad que es principalmente de célula cerrada. Un material adecuado de lámina de respaldo es una película de poliuretano.

En apósitos para heridas que comprenden una lámina de respaldo que comprende un adhesivo, la capa adhesiva debería transmitir el vapor de humedad y/o estar modelada para dejar pasar el vapor de agua. La capa adhesiva es preferentemente una capa adhesiva sensible a la presión que transmite continuamente el vapor de humedad del tipo usado convencionalmente para apósitos para heridas de tipo adhesivo, por ejemplo, un adhesivo sensible a la presión a base de copolímeros de éster de acrilato, etil éter de polivinilo y poliuretano. Los adhesivos sensibles a la presión a base de poliuretano se pueden usar selectivamente.

En otra realización, el apósito puede comprender capas adicionales de un artículo absorbente multicapa que se puede formar entre la capa activa y la lámina protectora. Por ejemplo, estas capas pueden comprender una película de plástico con aberturas para brindar soporte a la capa activa en uso, en cuyo caso las aberturas de la película se alinean preferentemente en coincidencia con las aberturas de la capa de hidrogel.

Además, en otras realizaciones, el apósito puede comprender una capa absorbente entre la capa activa y la lámina protectora, especialmente si el apósito es para usar en heridas que exudan. La capa absorbente opcional puede ser cualquiera de las capas usadas convencionalmente para absorber fluidos, suero o sangre de heridas en la técnica de cicatrización de heridas, lo que incluye gasas, telas no tejidas, superabsorbentes, hidrogeles y mezclas de estos. Preferentemente, la capa absorbente comprende una capa de espuma absorbente, tal como una espuma hidrófila de poliuretano de célula abierta. En otras realizaciones, la capa absorbente puede ser una banda fibrosa no tejida, por ejemplo una banda cardada de fibras cortadas viscosas.

En ciertas realizaciones, el apósito para heridas puede estar protegido por una lámina de cubierta extraíble. La lámina de cubierta se forma normalmente a partir de material termoplástico flexible. Los materiales adecuados incluyen poliésteres y poliolefinas. Preferentemente, la superficie que enfrenta el adhesivo de la lámina de cubierta es una superficie de liberación. Es decir, una superficie que solo se adhiere débilmente a la capa activa y al adhesivo sobre la lámina de respaldo para ayudar a desprender la capa de hidrogel de la lámina de cubierta. Por ejemplo, la lámina de cubierta puede estar formada a partir de un plástico no adherente tal como un fluoropolímero, o puede tener un recubrimiento de liberación tal como un recubrimiento de liberación de silicona o fluoropolímero. En una realización, el apósito para heridas es estéril y se empaca en un recipiente impermeable a microorganismos.Kits:

En ciertas realizaciones, la tecnología descrita proporciona kits que comprenden, en un compartimiento o compartimientos separados, los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II, opcionalmente junto con un excipiente, portador o aceite. Además, los kits pueden comprender ingredientes adicionales, por ejemplo, agentes gelificantes, emolientes, tensioactivos, humectantes, potenciadores de viscosidad, emulsionantes, etc., en uno o más compartimientos. Los kits pueden comprender opcionalmente instrucciones para formular un artículo para diagnosticar, detectar o tratar heridas, por ejemplo, heridas crónicas o infectadas. Los kits también pueden comprender instrucciones para usar los componentes en el tratamiento de heridas, ya sea individualmente o en conjunto.

En una realización relacionada, la tecnología descrita proporciona kits que comprenden un paquete y al menos un artículo absorbente (descrito anteriormente) que comprende las composiciones mencionadas anteriormente. De manera alternativa, los kits pueden comprender los componentes individuales por separado, opcionalmente junto con información secundaria, usable en o con el paquete.

Otras realizaciones descritas en la presente se refieren al uso de la composición para la preparación de un apósito para el tratamiento de una herida. Preferentemente, la herida es una herida crónica, por ejemplo, una herida seleccionada del grupo que consiste en úlceras venosas, úlceras por decúbito y úlceras diabéticas.

Superficies:

Las realizaciones de la tecnología descrita proporcionan además superficies que comprenden los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II anteriormente mencionados, en donde el indicador o péptido está orientado para permitir la unión a un componente, por ejemplo, una enzima. Preferentemente, la superficie es una superficie de un soporte sólido. Numerosos y variados soportes sólidos son conocidos por los expertos en la materia de nivel medio. Los soportes sólidos útiles incluyen carbohidratos poliméricos naturales y sus derivados sintéticamente modificados, reticulados o sustituidos, tales como agar, agarosa, ácido algínico reticulado, gomas guar sustituidas y reticuladas, ésteres de celulosa, especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxílicos, ésteres de celulosa mixtos y éteres de celulosa; polímeros naturales que contienen nitrógeno, tales como proteínas y derivados, incluidas las gelatinas reticuladas o modificadas; polímeros de hidrocarburos naturales, tales como látex y caucho; polímeros sintéticos que pueden prepararse con estructuras adecuadamente porosas, tales como polímeros de vinilo, que incluyen polietileno, polipropileno, poliestireno, polivinilcloruro, polivinilacetato y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros y terpolímeros de los policondensados anteriores, tales como poliésteres, poliamidas, y otros polímeros, tales como poliuretanos o poliepóxidos; materiales inorgánicos porosos tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalinotérreos y magnesio, lo que incluye sulfato de bario, sulfato de calcio, carbonato de calcio, silicatos de metales alcalinos y alcalinotérreos, aluminio y magnesio; y óxidos o hidratos de aluminio o silicio, tales como arcillas, alúmina, talco, caolín, zeolita, gel de sílice o vidrio (estos materiales pueden usarse como filtros con los materiales poliméricos anteriores); y mezclas o copolímeros de las clases anteriores, tales como copolímeros de injerto obtenidos inicializando la polimerización de polímeros sintéticos en un polímero natural preexistente.

En una realización, el soporte es un pozo de una placa de matriz, por ejemplo, una micromatriz. Los métodos para construir tales matrices son conocidos en la técnica, por ejemplo, Cao et al.,Appl Environ Microbiol.,77 (23): 8219 8225, 2011. Cada compuesto de la Fórmula I o la Fórmula II (o el indicador solo) se puede detectar por triplicado para eliminar datos irregulares debido a defectos físicos en el conjunto.

Sistemas:

Las realizaciones de la tecnología descrita proporcionan además sistemas de diagnóstico que comprenden las composiciones y/o kits mencionados anteriormente.

Los diversos componentes de los sistemas de diagnóstico pueden proporcionarse en una variedad de formas. Por ejemplo, los compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II (por ejemplo, compuestos que contienen indicadores de péptidos) se pueden proporcionar como un reactivo liofilizado. Estos reactivos liofilizados se pueden premezclar antes de la liofilización de manera que cuando se reconstituyan formen una mezcla completa con la proporción adecuada de cada uno de los componentes listos para usar en el ensayo. Además, los sistemas de diagnóstico de la presente invención pueden contener un reactivo de reconstitución para reconstituir los reactivos liofilizados del kit. Las realizaciones descritas en la presente se refieren además a sistemas de detección de LC. Un sistema de detección de LC realiza, como método de detección, una supervisión de un cambio en la alineación de cristales líquidos (LC) de 5CB. Para hacer que este sistema de detección de LC se ajuste a una estructura de CMC, se agrega un lípido a la parte de la secuencia de péptidos que se escindiría. Una vez liberado, el lípido provocaría un cambio de alineación en 5CB. La alineación de 5C<b>se puede detectar por medio de lentes polarizados cruzados y muestra un cambio de oscuro a brillante; el sistema comprendería la contención de los LC en la alineación correcta hasta el punto de uso y también podría implicar el uso de lentes polarizados cruzados y un microscopio para la detección y/o visualización.

En algunas realizaciones, el apósito para heridas comprende un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula Ia:

en donde R es una región que comprende una molécula indicadora; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000. En otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido.

En algunas realizaciones, el apósito para heridas comprende un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula Ib:

Fórmula

en donde R es una región que comprende una molécula indicadora; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000. En otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, R es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y un aminoácido.

En otro aspecto, en la presente se proporcionan apósitos para heridas que comprenden un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula II:

Fórmula IIM-L-PEP

en donde M es un polímero gelificante; PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; y L es un ligador que conecta M y PEP.

En algunas realizaciones, el apósito para heridas comprende un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula IIa:

Fórmula IIaM -L-PEP

en donde M es un polímero gelificante seleccionado de celulosa, celulosa modificada químicamente, pectina, alginato, quitosano, quitosano modificado, ácido hialurónico, polisacárido o polímero derivado de goma, CES, celulosa oxidada (o un derivado de esta), o cualquier combinación de estos; PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; y L es un ligador que conecta M y PEP, en donde L comprende una o más subunidades de polietilenglicol o subunidades de polipropileno.

En algunas realizaciones, el apósito para heridas comprende un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula IIb:

Fórmula IIb

en donde PEP es una región peptídica que comprende una molécula indicadora y al menos un aminoácido; m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y n es un número entero seleccionado de 200 a 4000. En otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 300 a 3500. En aún otras realizaciones, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200.

En algunas realizaciones, el apósito para heridas comprende un material de apósito para heridas que tiene la estructura de la Fórmula IIc:

Fórmula IIc

Métodos para preparar compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II:

Las realizaciones proporcionadas en la presente se refieren adicionalmente a los métodos para preparar compuestos de la Fórmula I o la Fórmula II, que incluyen precursores de estos. El término "precursor" incluye cualquier compuesto que se emplea como un reactivo para generar un producto intermediario o final.

En una realización, se proporciona en la presente un método para preparar un compuesto de la Fórmula I que comprende la estructura M-R, en donde M es un polímero gelificante que comprende una pluralidad de monómeros seleccionados del grupo que consiste en celulosa, carboximetilcelulosa (CMC), celulosa oxidada (o un derivado de esta), etilsulfonato de celulosa (CES), pectina, alginato, quitosano, quitosano modificado, ácido hialurónico, polisacárido o polímero derivado de goma, o cualquier combinación o mezcla de estos y R es una región indicadora, que comprende, conjugar el polímero gelificante con la molécula indicadora, por ejemplo, mediante enlace covalente. En una realización, el indicador R es un sustrato para un marcador específico de herida, por ejemplo, una enzima específica de herida tal como una hidrolasa, y más específicamente una proteasa, como se describió anteriormente. En esta realización, el sustrato para el marcador específico de la herida comprende, por ejemplo, un sustrato hidrolizable, por ejemplo, un aminoácido, un azúcar, un péptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido, o una combinación de estos.

En una realización, el polímero gelificante se conjuga con la molécula indicadora a través de un péptido, un glicosídico, una amida, un éster, un éter, un anhídrido o un enlace similar. Como se usa en la presente, se forma un "enlace peptídico" mediante la reacción de condensación entre dos aminoácidos, en donde el resto ácido de uno reacciona con la porción de amino del otro para producir un enlace peptídico (-CO-NH-) entre los dos aminoácidos ácidos. Como se usa en la presente, se forma un "enlace glicosídico" entre el grupo hemiacetal o hemicetal de un sacárido (o una molécula derivada de un sacárido) y el grupo hidroxilo de algún compuesto tal como un alcohol. Una sustancia que contiene un enlace glicosídico es un glicósido. El término "glicósido" ahora también se extiende para cubrir también compuestos con enlaces formados entre grupos de azúcares hemiacetales (o hemicetales) y varios grupos químicos distintos de hidroxilos, tales como -SR (tioglicósidos), -SeR (selenoglicósidos), -NR1R2 (N-glicósidos), o incluso -CR1R2R3 (C-glicósidos). El término “amida” tal como se usa en la presente se refiere ya sea a --N(R1)--C(=O)-- como a --C(=O)--N(R1)-- en donde R1 se define en la presente como para incluir hidrógeno así como otros grupos. El término "amida sustituida" se refiere a la situación en la que R1 no es hidrógeno, mientras que el término "amida no sustituida" se refiere a la situación en la que R1 es hidrógeno. El término "éster" se refiere a un compuesto químico derivado de un ácido (orgánico o inorgánico) en donde al menos un grupo hidroxilo está reemplazado por un grupo alcoxi. Los ésteres tienen una fórmula genérica -C(=O)-OR1 o R1-C(=O)-O- en donde R1 se define en la presente como para incluir hidrógeno, así como otros grupos. Los tipos representativos de "ésteres" incluyen, entre otros, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, cicloalquilo y heterociclilo de grupos ácidos, que incluyen, entre otros, ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fosfínicos, ácidos sulfónicos, ácidos sulfínicos y ácidos borónicos. El término “sulfonilo” representa un grupo de la fórmula — SO2-alquilo o —SO2-arilo en donde “alquilo” incluye radicales de hidrocarburo monovalentes saturados que tienen restos o combinaciones lineales, ramificados o cíclicos de estos y contiene 1-20 átomos de carbono, preferentemente 1-5 átomos de carbono y "arilo" incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un hidrógeno, como fenilo o naftilo, opcionalmente sustituido por 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo halógeno, hidroxi, tiol, amino, nitro, ciano, acilo, aciloxi, sulfonilo, sulfinilo, alquilamino, carboxi, éster, éter, amido, ácido sulfónico, sulfonamida, alquiltio, oxiéster. El término "sulfinilo" representa un grupo de la fórmula —SO-alquilo o —SO-arilo en donde "alquilo" y "arilo" se definieron anteriormente. El término "sulfonamida" representa un grupo de fórmula —SO2NH2. El término "oxiéster" significa un grupo de fórmula —O—COO-alquilo u —O—COO-arilo en donde "alquilo" y "arilo" se definieron anteriormente. El término "éter" significa un grupo de fórmula alquilo-O-alquilo o alquilo-O-arilo o arilo-O-arilo en donde "alquilo" y "arilo" se definieron anteriormente. El término "amido» significa un grupo de fórmula —CONRR' en donde R y R' se seleccionan independientemente del hidrógeno, "alquilo" o "arilo". El término "oxiamido" significa un grupo de fórmula —O—CONRR' en donde R y R' se seleccionan independientemente del hidrógeno, "alquilo" o "arilo". El término "alcoxi", como se usa en la presente, incluye grupos —O-alquilo en donde "alquilo" se definió anteriormente. El término "alquiltio», como se usa en la presente, incluye grupos alquilo en donde "alquilo" se definió anteriormente. El término "alquilamino», como se en la presente, incluye grupos —NHalquilo o —N(alquilo)2 en donde "alquilo" se definió anteriormente.

Los métodos para conjugar restos reactivos para generar glicosídico, péptido, éster, oxiéster, amida, amido, oxiamido, éter, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida u otros enlaces tales como alcoxi, alquiltio, alquilamino, etc. son conocidos en la técnica y están más descritos en los ejemplos.

En otra realización, se proporciona en la presente un método para preparar un compuesto de la Fórmula I que comprende la estructura M-L-R, en donde M y R son, cada uno, como se describió anteriormente y L es un ligador que es un monómero o un polímero de un polímero neutro, por ejemplo, un polímero seleccionado del grupo que consiste en un alcohol polihídrico etoxilado, un polímero de polivinilpirrolidona, un polipropileno, un polialquilenglicol, una poliamina, lo que incluye éteres, amidas y ésteres de estos.

En una realización, M está conjugado con L a través de un primer éster, oxiéster, amida, amido, oxiamido, éter, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, alcoxi, alquiltio, alquilamino o un enlace similar. Asimismo, en esta realización, el ligador L está conjugado con la región indicadora R a través de un segundo éster, oxiéster, amida, amido, oxiamido, éter, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, alcoxi, alquiltio, alquilamino o un enlace similar. Los dos enlaces pueden ser idénticos o diferentes, por ejemplo, M puede conjugarse con L mediante un enlace éster mientras que L puede conjugarse con R mediante un enlace peptídico.

En una realización, el compuesto de Fórmula I que tiene la estructura M-L-R se sintetiza al conjugar en primer lugar el polímero gelificante M con el ligador L para generar un precursor M-L y luego conjugar el precursor M L con la región indicadora R para generar el compuesto de la Fórmula I.

De manera alternativa, el compuesto de la Fórmula I que tiene la estructura M-L-R se sintetiza al conjugar en primer lugar el ligador L con la región indicadora R para generar el precursor L-R, que luego se conjuga con el polímero gelificante M para generar el compuesto de la Fórmula I.

Además, el compuesto de la Fórmula I que tiene la estructura M-L-R se puede sintetizar en una única cámara de reacción o en cámaras de reacción múltiples.

A continuación se presenta una descripción retrosintética representativa de esquemas potenciales de reacción empleados en la síntesis de un compuesto de la Fórmula I:

Esquema de reacción retrosintético I

TU, DIPEA, DMF

1 ) Intercambio lomeo NaVhr

Síntesis de Wi mamson de etere21 TBAH

NaOH »SC°C 3)DMF. CMP-I, trietilamina 4 °C

<J B>2,2-(etilendioxi)bis(etilamina) PEG-diamina protegida con Boc clonnada

17.

PEG-diamina protegida con Boc

Métodos diagnósticos y terapéuticos:

En una realización, las composiciones, los materiales de apósito, los artículos, los kits y los sistemas descritos en la presente son útiles para diagnosticar o tratar heridas, particularmente heridas crónicas o infectadas. Aunque puede diagnosticarse y/o tratarse cualquier tipo de herida, las realizaciones son particularmente adecuadas para diagnosticar y tratar heridas que exudan fluido de herida. Por ejemplo, la herida puede ser una herida crónica o aguda. Los ejemplos representativos de heridas crónicas incluyen, por ejemplo, úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras por decúbito, úlceras diabéticas y úlceras crónicas de etiología desconocida. Los ejemplos representativos de heridas agudas incluyen, por ejemplo, laceración traumática aguda, tal vez como resultado de una incisión quirúrgica intencional.

Como se usa en la presente, el término "fluido de herida" se refiere a cualquier exudado de herida u otro fluido (de manera adecuada, sustancialmente sin sangre) presente en la superficie de la herida, o que se elimina de la superficie de la herida por aspiración, absorción o lavado. La determinación, medición o cuantificación se lleva a cabo adecuadamente en el fluido de herida que se ha eliminado del cuerpo del paciente, pero también se puede realizar en el fluido de heridain situ.El término "fluido de herida" normalmente no se refiere a sangre o plasma tisular alejado del sitio de la herida. El fluido de herida es fluido de herida de mamífero, adecuadamente fluido de herida humana.

En una realización, el método de diagnóstico comprende poner en contacto una herida con al menos una composición que comprende un compuesto de Fórmula I o Fórmula II, un material de vendaje que comprende tales compuestos, artículo que comprende tales materiales o compuestos, kits que comprenden los materiales o compuestos, o un sistema que comprende tales materiales o compuestos descritos en la presente; y midiendo un parámetro asociado con la herida. En una realización específica, el parámetro que se mide es un nivel o actividad de una hidrolasa específica de la herida. Particularmente, el parámetro que se mide es la actividad de la hidrolasa.

En las realizaciones mencionadas anteriormente, la medición puede hacersein situoex situ.Tal como se usa en la presente, el término"in situ"se refiere a procesos, eventos, objetos o componentes que están presentes o tienen lugar dentro del contexto del sistema o dispositivo, incluido el entorno circundante, por ejemplo, el material biológico con el que la composición, el artículo, el sistema o el dispositivo está en contacto. Como ejemplo, una reacciónin situpuede referirse a la reacción de los diversos componentes presentes en el dispositivo (por ejemplo, compuesto de Fórmula I o Fórmula II), incluidos los componentes proporcionados por el tejido cutáneo humano (por ejemplo, exudado de la herida que contiene la enzima). El término se contrasta conex situ,que se refiere al exterior del entorno.

En una segunda realización, la medición se realizaex situ,por ejemplo, retirando el fluido de herida para su análisis en el aparato o dispositivo de la invención.

Adecuadamente, la medición se realizain situ.

En una realización de diagnóstico, el método comprende determinar un nivel de un indicador, por ejemplo, un producto de un sustrato sobre el que actúa una enzima específica de la herida. Más específicamente, el método comprende determinar un nivel de un producto de enzima hidrolasa. Como se usa en la presente, el término "determinar" incluye medir un valor numérico de la actividad o nivel de la hidrolasa; establecer si la actividad o nivel cae por encima o por debajo de un intervalo predeterminado; y/o comparando el valor numérico de actividad o nivel con un estándar de control. El patrón de control puede comprender determinar un nivel o actividad de la hidrolasa en un material de biopsia obtenido de una zona no dañada o de un sujeto sano.

En una realización específica, el término "determinar" comprende medir el parámetro (por ejemplo, actividad o nivel) de al menos una proteasa específica de heridas seleccionada del grupo que consiste en MMP-1 (colagenasa), MMP-2 (gelatinasa A), MMP-3 (estomelisina 1), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (gelatinasa B), elastasa neutrófila humana (HNE), catepsina G, activador del plasminógeno de tipo urocinasa (uPA), y lisozima, o una combinación de estos; establecer si el parámetro excede un primer umbral predeterminado; y/o comparar el valor numérico del parámetro con un estándar de control. El patrón de control puede comprender determinar un parámetro de la proteasa en un material de biopsia obtenido de una zona no dañada o de un sujeto sano. En realizaciones relacionadas, el término "determinar" comprende establecer si un promedio ponderado (suma ponderada) de los parámetros asociados con una pluralidad de proteasas mencionadas anteriormente excede un valor de umbral predeterminado para la media ponderada.

En una realización particular, el parámetro es el nivel de actividad del analito (por ejemplo, una proteasa) en un fluido de herida. Típicamente, la actividad de un analito individual se expresa en términos de unidades/mL.

En otra realización, el parámetro es el nivel del analito (por ejemplo, proteasa) en un fluido de herida. Típicamente, el término cantidad también es indicativo de la actividad de un analito particular.

Cuando se usa en la presente, el término "cantidad combinada" o "actividad combinada" se refiere a un único valor numérico que resulta de la aplicación de una función matemática a una pluralidad de valores, por ejemplo, las cantidades obtenidas para un número de analitos individuales. Por ejemplo, el término "cantidad combinada" o "actividad combinada" puede referirse a la suma o producto de un grupo de valores individuales. Típicamente, el término "cantidad combinada" o "actividad combinada" se refiere a la suma de un grupo de valores individuales. Por ejemplo, en realizaciones adecuadas, la cantidad de elastasa se refiere a actividad similar a elastasa (por ejemplo, u/mL) y la cantidad de metaloproteinasa (MMP) se refiere a la concentración total del analito respectivo (por ejemplo, en ng/mL).

Cuando se usa en la presente, el término "cuantificar" se refiere a medir una cantidad numérica absoluta de un analito/s o sustrato/s en particular en una muestra, dentro de los márgenes de error experimental.

El término "marcador" o "analito" se refiere a cualquier entidad química que se identifica o determina usando los aparatos, dispositivos, kits o métodos definidos en la presente. Los marcadores o analitos determinados o identificados por los aparatos, dispositivos, kits o métodos de la presente invención son productos escindidos de las enzimas mencionadas anteriormente.

Cuando se usa en la presente, el término "intervalo predeterminado" se refiere a un intervalo o perfil de datos que un experto en la materia entendería que es indicativa de una subclase particular del paciente. Por ejemplo, el intervalo predeterminado puede ser un intervalo o perfil de datos que es típico de una herida que respondería bien a un tratamiento de herida particular, tal como terapia antibiótica. Alternativamente, el intervalo predeterminado puede referirse adecuadamente a un intervalo de datos que es típico de una herida que no respondería bien a un tratamiento de herida particular, tal como terapia antibiótica.

Cuando se usa en la presente, el término "umbral predeterminado" se refiere a un nivel mínimo que un experto en la materia de nivel medio determinaría indicativo de una herida no cicatrizante basándose en el análisis estadístico de niveles determinados para cicatrización conocida y heridas no cicatrizantes, por ejemplo como se explica más anteriormente. Para que la prueba sea clínicamente útil, el umbral debe establecerse en un nivel apropiado para que las heridas que no cicatrizan con alta actividad de proteasa se identifiquen correctamente. Aumentar el umbral aumentará la probabilidad de que solo heridas que no cicatrizan superen el umbral. Sin embargo, si el umbral es demasiado alto, las heridas que no cicatrizan debido a un alto nivel de proteasas no se identificarían y clínicamente esto significaría que no recibirían el tratamiento de modulación de la proteasa requerido.

Cuando se usa en la presente, el término "estándar de control" o "control" se refiere a un conjunto o perfil de datos que se puede usar como referencia o comparación para definir o normalizar otro punto de datos o conjunto de datos.

Por ejemplo, el término "control" o "estándar de control" puede ser un conjunto o perfil de datos que indica una subclase particular de paciente. Adecuadamente, el estándar de control puede ser un conjunto de datos o un perfil indicativo de estado de cicatrización o no cicatrización de herida.

Adecuadamente, en otros aspectos o realizaciones de la presente invención, el "control" o "estándar de control" puede ser un conjunto de datos o perfil que puede usarse como una herramienta comparativa para permitir que una persona capacitada determine si una herida es probable que sea sensible o no sensible a un tratamiento de heridas, como el tratamiento con antibióticos. En una realización, el estándar de control es un conjunto de datos o perfil indicativo de un paciente que no responde bien al tratamiento de heridas. Típicamente, el estándar de control es un conjunto de datos o un perfil indicativo de un paciente que responde bien al tratamiento de la herida. Los pacientes que tienden a responder bien al tratamiento de la herida como se describe en el presente exhiben una menor cantidad combinada o actividad de hidrolasas que los pacientes que tienden a no responder bien al tratamiento. Por ejemplo, los pacientes que tienden a responder bien al tratamiento de la herida como se describe en la presente exhiben cantidades combinadas más bajas de al menos una hidrolasa específica de la herida.

En una realización, el nivel de umbral de actividad de la metaloproteinasa de matriz (MMP) va de alrededor de 5 U/mL a alrededor de 30 U/mL, lo que incluye todos los valores intermedios, como, por ejemplo, alrededor de 6 U/mL, alrededor de 7 U/mL, alrededor de 8 U/mL, alrededor de 9 U/mL, alrededor de 10 U/mL, alrededor de 11 U/mL, alrededor de 12 U/mL, alrededor de 13 U/mL, alrededor de 14 U/mL, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 16 U/mL, alrededor de 17 U/mL, alrededor de 18 U/mL, alrededor de 19 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de 21 U/mL, alrededor de 22 U/mL, alrededor de 23 U/mL, alrededor de 24 U/mL, alrededor de 25 U/mL, o más, indican una infección crónica de la herida. Como se entiende en la técnica, las unidades de actividad (U) se usan típicamente para describir la actividad catalítica enzimática, en donde una unidad (U) se refiere a la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 micromol (pmol) de sustrato por minuto. Por lo tanto, 1 unidad de enzima (U) = 1 pmol/min, en donde pmol se refiere a la cantidad convertida de sustrato.

En una realización, el nivel de umbral de actividad de la elastasa neutrófila humana va de alrededor de 5 U/mL a alrededor de 30 U/mL, lo que incluye todos los valores intermedios, como, por ejemplo, alrededor de 6 U/mL, alrededor de 7 U/mL, alrededor de 8 U/mL, alrededor de 9 U/mL, alrededor de 10 U/mL, alrededor de 11 U/mL, alrededor de 12 U/mL, alrededor de 13 U/mL, alrededor de 14 U/mL, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 16 U/mL, alrededor de 17 U/mL, alrededor de 18 U/mL, alrededor de 19 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de 21 U/mL, alrededor de 22 U/mL, alrededor de 23 U/mL, alrededor de 24 U/mL, alrededor de 25 U/mL, o más, indican una infección crónica de la herida.

En una realización específica, los niveles de actividad de elastasa neutrófila humana umbral de al menos 9,6 indican infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de elastasa neutrófila humana de al menos 22,9 U/mL indican infección crónica de la herida.

En una realización, el nivel de umbral de la actividad de lisozima va de alrededor de 1000 U/mL a alrededor de 10000 U/mL, que incluyen todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 1100 U/mL, alrededor de 1200 U/mL, alrededor de 1300 U/mL, alrededor de 1400 U/mL, alrededor de 1500 U/mL, alrededor de 1600 U/mL, alrededor de 1700 U/mL, alrededor de 1800 U/mL, alrededor de 1900 U/mL, alrededor de 2000 U/mL, alrededor de 2100 U/mL, alrededor de 2200 U/mL, alrededor de 2300 U/mL, alrededor de 2400 U/mL, alrededor de 2500 U/mL, alrededor de 2600 U/mL, alrededor de 2700 U/mL, alrededor de 2800 U/mL, alrededor de 2900 U/mL, alrededor de 3000 U/mL, alrededor de 3250 U/mL, alrededor de 3500 U/mL, alrededor de 3750 U/mL, alrededor de 4000 U/mL, alrededor de 4250 U/mL, alrededor de 4500 U/mL, alrededor de 4750 U/mL, alrededor de 5000 U/mL, alrededor de 5250 U/mL, alrededor de 5500 U/mL, alrededor de 5750 U/mL, alrededor de 6000 U/mL, o más, indican infección crónica de la herida. En una realización específica, los niveles de actividad de la lisozima de al menos 4800 U/mL indican infección crónica de la herida.

En una realización, el nivel de umbral de la actividad de catepsina G va de alrededor de 10 U/mL a alrededor de 100 U/mL, que incluyen todos los valores entre, por ejemplo, alrededor de 15 U/mL, alrededor de 20 U/mL, alrededor de

25 U/mL, alrededor de 30 U/mL, alrededor de 35 U/mL, alrededor de 40 U/mL, alrededor de 45 U/mL, alrededor de 50 U/mL, alrededor de 5 U/mL, alrededor de 60 U/mL, alrededor de 65 U/mL, alrededor L, alrededor de 75 U/mL, alrededor de 80 U/mL, alrededor de 85 U/mL, alrededor de 90 U/mL, alrededor de 95 U/mL, alrededor de 100 U/mL, alrededor de 110 U/mL, alrededor de 120 U/mL, o más, indican infección crónica de la herida. En algunas realizaciones, los niveles de actividad de catepsina G de al menos 50 U/mL, al menos 40 U/mL, al menos 30 U/mL, al menos 20 U/mL, al menos 15 U/mL o al menos 10 U/mL indican infección crónica de la herida.

Las realizaciones descritas en la presente se refieren adicionalmente al tratamiento de heridas crónicas o infectadas usando las composiciones, materiales, artículos, apósitos, kits y/o sistemas descritos en la presente. La realización terapéutica incluye, poner en contacto una composición, material, artículo, vendaje, kit, sistema o dispositivos de la invención con un sujeto que lo necesite. Opcionalmente, el método puede incluir la determinación de si el sujeto está respondiendo al tratamiento.

Un experto en la materia de nivel medio podría identificar fácilmente si las heridas "responden al tratamiento" o no. En particular, el experto en la materia de nivel medio será capaz de determinar fácilmente los niveles de las proteasas identificadas en las presentes reivindicaciones que son predictivas o indicativas de una buena respuesta o mala respuesta al tratamiento de heridas, particularmente al tratamiento con apósitos para heridas que comprenden celulosa oxidada. Los términos "responde" y "respondedor/es" tal como se usan en la presente se refieren a heridas que se considera que responden bien al tratamiento de heridas, particularmente al tratamiento con un agente farmacológico, por ejemplo, antibióticos. De manera similar, "no responde" y "no respondedor/es" se refieren a heridas que no se consideran que responden bien al tratamiento de heridas, particularmente al tratamiento con el agente farmacológico, por ejemplo, antibióticos. Por ejemplo, se considera que los pacientes que exhiben más del 50% de cierre de la herida después de 4 semanas de tratamiento de la herida responden a el tratamiento.

En ciertas realizaciones, un paciente puede diagnosticarse y tratarse simultáneamente con las composiciones, artículos, sistemas o dispositivos descritos en la presente. Cuando se usa en la presente, el término "simultáneamente" significa realizar los objetivos establecidos, por ejemplo,diagnóstico y tratamiento, juntos.

En ciertas realizaciones, un paciente puede diagnosticarse secuencialmente y tratarse con las composiciones, artículos, sistemas o dispositivos descritos en la presente. Cuando se usa en la presente, el término "secuencialmente" significa que los objetivos establecidos, por ejemplo,diagnóstico y tratamiento, están separados temporal o espacialmente, por ejemplo,diagnóstico antes del tratamiento o diagnóstico después del tratamiento o una combinación de estos, por ejemplo, 1 er diagnóstico ==> tratamiento ==> 2 ° diagnóstico.

Las realizaciones descritas en la presente permiten además que un cuidador o un paciente determine de forma rápida y fiable si una herida es probable que no cicatrice, y que seleccione una terapia apropiada en base a esta determinación. Por ejemplo, las heridas que no cicatrizan pueden requerir la aplicación de vendajes para heridas especiales tales como vendajes para heridas que comprenden agentes terapéuticos específicos, para promover la curación. Por consiguiente, las realizaciones descritas en la presente proporcionan métodos de tratamiento de una herida, por ejemplo, heridas crónicas o infectadas, que comprenden determinar si una herida se está curando o no, seguido de aplicar un vendaje para heridas que comprende un agente terapéutico a la herida si no cicatriza.

Las realizaciones descritas en la presente proporcionan métodos y ensayos para diagnóstico o detección de heridas infectadas. Los métodos son adecuados para la detección de agentes infecciosos bacterianos. En una realización, las heridas están infectadas con bacterias gramnegativas. Las bacterias gramnegativas típicas incluyen proteobacterias tales comoE. coli, Salmonella, Pseudomonas y Helicobacter y cianobacterias.Cuando se clasifican en relación con la medicina, incluyenPseudomonas aeruginosayHemophilus influenzaeque causan la alteración del sistema respiratorio,Escherichia coli yProteusmirabilisque causan la alteración del sistema urinario, yHelicobacter pyloriyBacillus Gaertnercausan la alteración del sistema alimentario y micrococos tales comoNeisseria meningitidis, Moraxella catarrhalisyNeisseria gonorrhea.

En otra realización, las heridas están infectadas con bacterias grampositivas. Por "bacterias grampositivas" se entiende una bacteria o bacterias que contienen ácido teicoico (por ejemplo, ácido lipoteicoico y/o ácido teicoico de pared), o un glicopolímero funcionalmente equivalente (por ejemplo, un ramnopolisacárido, ácido teichurónico, arabinogalactano, lipomanano y lipoarabinomanano) en su pared celular. Ejemplos no limitantes de glicopolímeros funcionalmente equivalentes se describen en Weidenmaieret al., Nature,6 : 276-287, 2008.

Las bacterias incluyen bacterias patógenas que infectan huéspedes mamíferos (por ejemplo, huéspedes bovinos, murinos, equinos, primates, felinos, caninos y humanos). Los ejemplos de tales bacterias patógenas incluyen, por ejemplo, miembros de una especie bacteriana tal comoBacteroides,Clostridium,Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Haemophilus, Legionella, Mycobacterium, Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio o Listeria.Algunos ejemplos clínicamente relevantes de bacterias patógenas que causan enfermedades en un huésped humano incluyen, entre otros,Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella aborus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia. pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis resistente a vancomicina, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), Escherichia coli enteropatógena, E.coli O157: H7, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, S almonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Staphylococcus aureusresistente a la vancomicina (VSA), Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae y Yersinia pestis.

En otra realización, las bacterias infecciosas se seleccionan del grupo que consiste enClostridium difficile, Enterobacteriacearesistentes a Carbapenem (CR-Klebsiellaspp; CR-E. coli)yNeisseria gonorrhoeae.En otra realización, las bacterias infecciosas se seleccionan del grupo que consiste enAcinetobactermultirresistente,Campylobacterresistente a fármacos,enterobacteriasproductoras de p-lactamasa de espectro extendido (ESBL),enterococoresistente a vancomicina,pseudomonas aeruginosaresistente a múltiples fármacos, resistente a fármacosSalmonellano tifoidea,Salmonella enterica serovar Typhiresistente a fármacos,Shigellaresistente a fármacos,Staphylococcus aureusresistente a la meticilina (SÁRM),Streptococcus pneumoniaeresistente a fármacos yTuberculosisresistente a fármacos. En otra realización, las bacterias infecciosas se seleccionan entre el grupo que consiste enStaphylococcus aureusresistentes a la vancomicina,Streptococcusde Grupo Á resistente a la eritromicina, clindamicina de Grupo B resistente aStreptococcus.

En ciertas realizaciones, las heridas crónicas o infectadas se encuentran en sujetos huéspedes. Preferentemente, los huéspedes son mamíferos, por ejemplo, un roedor, un humano, un animal de ganado, un animal de compañía o un animal no domesticado o salvaje. En una realización, el sujeto puede ser un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejillo de indias, etc. En otra realización, el sujeto puede ser un animal de ganado. Ejemplos no limitantes de animales de ganado adecuados pueden incluir cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, llamas y alpacas. En aún otra realización, el sujeto puede ser una mascota. Los ejemplos no limitantes de animales de compañía pueden incluir mascotas tales como perros, gatos, conejos y pájaros. En aún otra realización, el sujeto puede ser un animal de zoológico. Como se usa en la presente, un "animal de zoológico" se refiere a un animal que se puede encontrar en un zoológico. Los animales pueden incluir primates no humanos, grandes felinos, lobos y osos. En una realización ejemplar, el sujeto es un ser humano.

En un aspecto, se proporcionan métodos para detectar niveles de una o más enzimas en una herida del mamífero, comprendiendo el método las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de vendaje para heridas en contacto con la herida del mamífero.

En algunas realizaciones, el método para detectar el nivel de una o más enzimas en una herida del mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de vendaje para heridas en contacto con la herida del mamífero.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para detectar niveles de una o más enzimas en una herida de mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En algunas realizaciones, el método para detectar el nivel de una o más enzimas en una herida de mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En un aspecto, se proporcionan métodos para detectar niveles de una o más proteasas en una herida del mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de vendaje para heridas en contacto con la herida del mamífero.

En algunas realizaciones, el método para detectar el nivel de una o más proteasas en una herida del mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de vendaje para heridas en contacto con la herida del mamífero.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para detectar niveles de una o más proteasas en una herida de mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En algunas realizaciones, el método para detectar el nivel de una o más proteasas en una herida de mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para diagnosticar una herida crónica en un mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero.

En algunas realizaciones, el método para diagnosticar una herida crónica en un mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para diagnosticar una herida crónica en un mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En algunas realizaciones, el método para diagnosticar una herida crónica en un mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (c) comparar la determinación cuantitativa con una o más muestras de referencia.

En otro aspecto, en la presente se proporcionan métodos para tratar una herida en un mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (d) administrar tratamiento médico al mamífero; en donde el tratamiento médico comprende tratamiento con antibióticos solo cuando la concentración de moléculas indicadoras indica que la herida de mamífero es crónica.

En algunas realizaciones, el método para tratar una herida en un mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida del mamífero; (b) comparar visualmente el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; (c) obtener una determinación cualitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; y (d) administrar tratamiento médico al mamífero; en donde el tratamiento médico comprende tratamiento con antibióticos solo cuando la concentración de moléculas indicadoras indica que la herida de mamífero es crónica.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para tratar una herida en un mamífero, en donde el método comprende las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; (c) comparar el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (d) administrar tratamiento médico al mamífero; en donde el tratamiento médico comprende tratamiento con antibióticos solo cuando la concentración de moléculas indicadoras indica que la herida de mamífero es crónica.

En algunas realizaciones, el método para tratar una herida en un mamífero consiste esencialmente en las etapas de: (a) colocar el material de apósito para heridas descrito en la presente en contacto con la herida de mamífero; (b) obtener una determinación cuantitativa de la concentración de moléculas indicadoras en el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero; (c) comparar el material de apósito para heridas en contacto con la herida de mamífero con una o más muestras de referencia; y (d) administrar tratamiento médico al mamífero; en donde el tratamiento médico comprende tratamiento con antibióticos solo cuando la concentración de moléculas indicadoras indica que la herida de mamífero es crónica.

Preferentemente, el diagnóstico y el tratamiento se realizanin situ.Las realizaciones descritas en la presente permiten por lo tanto el diagnóstico y tratamiento de heridas de una manera fácil, no invasiva. Por ejemplo, el diagnóstico puede hacerse en tiempo real y el tratamiento puede aplicarse a la herida infectada o al paciente (sistémicamente) y el progreso del tratamiento de la herida se supervisa en tiempo real, por ejemplo, la disipación de la señal generada por la molécula indicadora debido a la cicatrización de heridas.

EJEMPLOS

Las estructuras, materiales, composiciones y métodos descritos en la presente pretenden ser ejemplos representativos de la invención, y se entenderá que el alcance de la invención no está limitado por el alcance de los ejemplos. Los expertos en la materia reconocerán que la invención se puede poner en práctica con variaciones en las estructuras, materiales, composiciones y métodos descritos, y tales variaciones se consideran dentro del ámbito de la invención.

Lista de abreviaciones:

Tal como se usaron anteriormente, y a lo largo de la descripción de la invención, se entenderá que las siguientes abreviaturas, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

ACN o MeCN acetonitrilo

Bn bencilo

BOC o Boc carbamato de terc-butilo

t-Bu terc-butilo

CMC carboximetilcelulosa

DCE dicloroetano (ClCH2CH2Cl)

DCM diclorometano (CH2Ch)

DIPEA o DIEA diisopropiletilamina

DMAP 4-(N,N-dimetilamino)piridina

DMF dimetilformamida

DMSO dimetilsulfóxido

equiv equivalente/s

Et etilo

EtOH etanol

EtOAc acetato de etilo

Fmoc carbamato de fluorenilmetilo

HBTU N,N,N',N-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronio hexafluorofosfato

HPLC cromatografía líquida de alta resolución

Me metilo

MeOH metanol

MS espectroscopía de masas

RMN resonancia magnética nuclear

PBS solución salina amortiguada con fosfato

RP-HPLC cromatografía líquida de alta presión y fase inversa

TFA ácido trifluoroacético

THF tetrahidrofurano

Para los polímeros que se muestran en los ejemplos siguientes, n es un número entero seleccionado de 400 a 3200.

Se disolvió fibra de carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC) (443 mg, 1,08 mmol) en agua desionizada (44 mL) para producir una solución al 1%. Se agregó resina de intercambio iónico Dowex 650C Monosphere para producir la CMC acidificada (CMC-H). Las monoesferas se eliminaron por filtración y luego se agregó hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH) al 40% (ac) hasta que el pH fue de 8-9. Se agitó la solución resultante durante 30 minutos antes de liofilizarla durante la noche. Se disolvió el material liofilizado (0.38 g) en 40 mL de DMF seca en nitrógeno con agitación y calentamiento suave durante un período de alrededor de 1 h. La solución resultante era turbia y blanquecina. Se enfrió la solución a alrededor de 4°C. Se agregó yoduro de 2-cloro-N-metilpiridinio (CMP-I) (0,33 g, 1,3 mmol) a esta solución agitada. Poco después de esto, también se agregó compuesto 1-b (0,5 g, 2 mmol) junto con 3 gotas de DCM seco y algunas gotas de trietilamina seca. La mezcla de reacción se mantuvo a 4°C y se agitó durante 3 horas, después de lo cual adoptó un color más oscuro casi marrón. Se agregó acetona al 95% (ac) (80 mL) lentamente y se agitó durante 20 minutos a 4°C y luego se mantuvo a 4°C durante la noche. Se separó el precipitado blanco resultante de la solución marrón mediante filtración. Se lavó luego el material con acetona cinco veces mediante el siguiente método: agregar 40 mL de acetona al 99,5%, mezclar y someter a ultrasonido durante alrededor de 1 minuto, filtrar la acetona y recolectar el producto sólido. Esto produjo un material esponjoso sólido y blanquecino. Se retiró la acetona restante a presión reducida. Se lavó el sólido en etanol (20 mL x 1) seguido de acetona (20 mL x 3). En cada lavado, se sometió a ultrasonido la solución de lavado durante 1 minuto antes de la filtración para recolectar el sólido. Se colocó el sólido (compuesto 1-c) en el evaporador rotatorio de alto vacío durante 45 minutos. Peso = 0,288 g. FTIR: 3360, 3320 (N-H/ O-H), 2875 (C-H), 1650 con hombro (amídico C=O de BOC), 1590 (C=O de CMC).

Para evaluar la solubilidad del compuesto 1-c, se usó el siguiente método: Se pesó el compuesto 1-c en viales de espectrometría de masas (~0,0013 g por vial). Se agregó alrededor de 1 mL del disolvente requerido al vial. Se evaluaron visualmente las muestras para determinar la solubilidad en los siguientes puntos de tiempo: inicialmente, después de calentar suavemente a 40 °C durante 1 minuto, después del ultrasonido durante 10 segundos, y después de dejarlo a temperatura ambiente durante la noche. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble.

El compuesto 1-c (0,05 g, 0,11089 mmol) se pesó y se cortó en piezas lo más pequeñas posibles. Se agregó TFA al 10% en DCM (10 mL) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente y reactivo volátiles se eliminaron mediante un evaporador rotatorio de alto vacío. El sólido restante se sometió a un azeótropo tres veces para eliminar cualquier TFA restante al reducir su punto de ebullición: se agregó tolueno (10 mL x 3) al producto sólido y se agitó antes de eliminarlo mediante el evaporador rotatorio de alto vacío para proporcionar el polímero 1 como un sólido blanquecino. Peso = 0,0524 g. FTIR: 3326 (N-H/ O-H), 2891 (C-H), 1668 (C=O estiramiento de uretano). Análisis elemental (sal de TFA): Carbono: Esperado ~43%; Real = 38,90%. Hidrógeno: Esperado ~5,8%; Real = 5,43%. Nitrógeno: Esperado ~4,4%; Real = 0,28%. El grado de sustitución es 0,28/ 4,38 = 0,06.

Se determinó la solubilidad del polímero 1 de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble.

Se evaluó la determinación cualitativa de la aminación del Polímero 1 mediante la prueba de Kaiser a base de ninhidrina. Se prepararon tres reactivos: (1) 500 mg (0,5 g) de ninhidrina en 10 mL en EtOH; (2) 80 g de fenol en 20 mL de EtOH; y (3) 2 mL de 0,001 M de Kc N diluidos a 100 mL con piridina. Se colocó una muestra del Polímero 1 (10-20 mg) en un matraz de fondo redondo. Se agregaron al matraz de tres a cinco gotas de cada reactivo. El matraz se calentó a 100°C mediante un baño de aceite y un condensador de reflujo y se agitó durante 5 min. Se observó visualmente cualquier cambio de color. Se detectó un color azul oscuro/violeta, lo que indica presencia de amina.

Ejemplo 2: Preparación del polímero 2

Se preparó una solución de Fmoc-Fe-OH (0,0267 g, 0,069 mmol), HBTU (0,0262 g, 0,069 mmol), DIPEA (0,015 mL, 0,090 mmol) y DMF seca (0,82 mL). Se preparó una columna plástica de separación de 15 mL con una frita de polietileno de 10 pm y se unió una punta luer. Se agregó el polímero 1 (0,034 g, 0,097 mmol) a la columna y luego la solución de aminoácidos. Se colocó una tapa sobre la columna y se selló adicionalmente con parafilm. Se colocó la columna en un rotor de sangre a temperatura ambiente durante la noche. Se drenó la solución mediante presión reducida y se lavó el producto sólido con EtOH para proporcionar el polímero 2 como un sólido blanco. Peso = 0,0266 g. Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la ausencia de aminas terminales. FTIR: 3324 (N-H/ O-H), 3281 (O-H), 2898 (C-H), 1720 (C=O aromático), 1666 (C=O estiramiento de uretano), 1660, (C=O estiramiento de amida de Fmoc).

Se determinó la solubilidad del polímero 2 de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble.

Se colocó el polímero 2 en una solución de piperidina: DMF (1:4 v/v, 6 mL) durante alrededor de 2 horas. Después, se lavó el producto desprotegido resultante con EtOH antes de realizar una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de amina libre. Se agregó este producto desprotegido (0,080 g, 0,15 mmol) a una columna plástica de separación de 15 mL configurada con una frita de polietileno de 10 pm y una punta luer. Se preparó una solución de Fmoc-Phe-OH (0,063 g, 0,16 mmol), HBTU (0,062 g, 0,16 mmol), DIPEA (0,23 mL, 1,8 mmol) y DMF seca (6 mL) y se agregó a la columna. Se colocó una tapa sobre la columna y se selló adicionalmente con parafilm. Se colocó la columna en un rotor de sangre a temperatura ambiente durante la noche. Se drenó la solución mediante presión reducida y se lavó el producto sólido con EtOH (10 mL x3) para proporcionar el producto de acoplamiento como un sólido rojo. Peso = 0,0691 g. Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la ausencia de aminas terminales. Se lavó el producto de acoplamiento con DCM. FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2866 (C-H), 1730 (C=O aromático), 1651+hombro (C=O, amida de F) y/o (C=O estiramiento de amida de F-Fmoc), 1587 (C=O estiramiento de uretano).

Para eliminar el grupo Fmoc, el producto de acoplamiento se colocó en una solución de piperidina: DMF (1: 4 v/v, 6 mL) durante alrededor de 2 horas. El producto desprotegido resultante se lavó a continuación con EtOH (10 mL x3) y DCM (10 mL) para proporcionar el polímero 3 como un sólido rojo quebradizo. Peso = 0,0638 g, rendimiento = 62%. Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de aminas terminales. FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2866 (C-H), pico muy pequeño 1730 (C=O aromático), 1651 sin hombro (C=O, amida de F), 1587 (estiramiento de uretano C=<o>).

[Nota: FTIR sugiere que una pequeña cantidad de Fmoc permanece en el producto final].

Ejemplo 4: Preparación del polímero 4

Síntesis de intermediario 4-c

Se colocó Fmoc-Lys-OH^HCl (0,0405 g, 0,100 mmol) en un matraz de fondo redondo, y se le agregó gota a gota una mezcla 5:2 de 1,4-dioxano: K2CO3 al 10% (ac) (3 mL). Se agitó la mezcla y se agregó cloruro de Dabsyl (0,033 g, 0,10 mmol) a la mezcla, la cual luego se agitó a temperatura ambiente durante la noche, abierta a la atmósfera. Se diluyó la solución con 150 mL de agua. Se separaron las capas, y se extrajo la capa acuosa con éter dietílico (10 mL x3). Se secaron y concentraron las capas orgánicas combinadas. Se purificó el material crudo mediante cromatografía de columna flash (10:90 MeOH/DCM) para proporcionar el compuesto 4-c. RMN-1H (400 MHz, CDCh con una gota de CD3OD) 8.55; 7,79; 7,65; 7,52; 7,26; 7,17; 6,69; 6,59; 5,19; 5,06; 4,78; 4,28; 4,17; 4,08; 3,97; 3,57; 3,55; 3,35; 3,05; 2,87; 2,14; 1,99; 1,63; 1,41; 1,21; 0,83; 0,03.

Síntesis del polímero 4

Se preparó una solución del compuesto 4-c (0.0160 g, 0,024 mmol), HBTU (0,00925 g, 0,0244 mmol), DIPEA (0,23 mL, 1,8 mmol) y DMF seca (6 mL). Se preparó una columna plástica de separación de 15 mL con una frita de polietileno de lOpm y una punta luer. Se agregó el polímero 3 (0,0230 g, 0,084 mmol) a la columna y luego la solución de aminoácidos. Se colocó una tapa sobre la columna y se selló adicionalmente con parafilm. Se colocó la columna en un rotor de sangre a temperatura ambiente durante la noche. Se drenó la solución mediante presión reducida y se lavó el producto sólido con EtOH (10 mL x3) para proporcionar el producto de acoplamiento como un sólido rojo, que se lavó con DCM. Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la ausencia de aminas terminales. FTIR: 3346 (N-H/ O-H), 2912 (C-H), 1730 (C=C aromático de Dabsyl), 1652 (C=O, amida de aminoácido), 1591 (C=O uretano).

Se colocó el producto de acoplamiento en una solución de piperidina: DMF (1:4 v/v), (6 mL) durante alrededor de 2 horas. El producto desprotegido resultante se lavó a continuación con EtOH (10 mL x3) y DCM (10 mL) para proporcionar el polímero 4 como un sólido rojo/marrón quebradizo. Peso = 0,0368 g, rendimiento = 56%. Se realizó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de aminas terminales. FTIR: 3335 (N-H/ O-H), 2918 (C-H), 1651 (C=O, amida de aminoácido o Fmoc), 1589 (C=O uretano).

Ejemplo 5: Preparación del polímero 5 (mediante el uso de CMC en polvo)

Se disolvió carboximetilcelulosa de sodio (NaCMC) de DoS 0,7 (2,0 g, 8.33 mmol) en agua desionizada (180 mL) para producir una solución al 1%. Se agregó resina de intercambio iónico Dowex 650C Monosphere con agitación durante 10 minutos. Se eliminaron las monoesferas por filtración antes de agregar hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH) al 40% (ac) en alícuotas de 0,1 mL hasta que el pH fue de 8-9 (3,5 mL, 36,14 mmol). Se agitó la solución resultante durante 30 minutos antes de liofilizarla durante siete días.

Se disolvió el material liofilizado en DMF seca (240 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno; se requirió agitación y calentamiento suave durante un período de alrededor de 2 horas. Se enfrió la solución a alrededor de 4°C antes de agregar yoduro de 2-cloro-N-metilpiridinio (CMP-I) (1,5 g, 5,8 mmol) con agitación vigorosa. Se agregó 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (1,3567 g, 9,17 mmol) a la reacción, junto con trietilamina seca (5 mL). Se mantuvo la reacción 4°C y se agitó durante un mínimo de 3 horas, y luego se agregó etanol al 95% (ac) (80 mL) y se agitó durante 10 minutos a 4 °C. Se agregó lentamente acetona al 99% (200 mL) con agitación para precipitar el producto que se filtró y se lavó con acetona (3 x 200 mL). El producto se concentró al vacío para producir un sólido blanquecino. Peso = 1,908 g, rendimiento = 68%. FTIR: (Vmax/ cm'1) 3267 (N-H/ O-H), 2916/ 2873 (C-H), 1739 (acetona), 1650 (C=O, amida del producto acoplado), 1588 (C=O de CMC), 1401/1314/1257/1037, RMN MAS CP 13C: CMC 0,7 DoS (material de inicio): 8 C (13,000Hz, CP MAS) 61,7 (C6 ), 74,5 (C7, C2, C5), 82,5 (hombro, C3), 97,0 (C4), 103,3 (C1), 177 (C=O); CMC- PEG diamina: 8 C (13,000Hz, CP MAS) 13,4 (C14), 20,1 (no asignado), 23,4 (no asignado), 30,6 (C9), 61,7 (C6 ), 70 (hombro, C7), 74,5 (C2, C5), 82,5 (C3), 95 (C4), 103,3 (C1), 113 (no asignado), 142 (no asignado), 152 (no asignado), 169,7 (C=O del ligador), 177,1 (C=O de C<m>C). Análisis elemental: Esperado del producto si la DoS de la materia prima era 0,7: Masa 306 g/mol: C 45%, H 7%, N 6%; (d) Real: C 43%, H 7%, N 4%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor de 47% se han sustituido y ahora contienen el grupo ligador. Prueba cualitativa de Kaiser: positiva, lo que indica presencia de amina libre. Los datos de UV obtenidos a 570 nm se equipararon a 4,6 |imol de amina, según una curva de calibración en función de valina como referencia estándar.

Se determinó la solubilidad del polímero 5 de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble

Se empapó el polímero 5 en DMF seca (6 mL) durante 20 minutos en un tubo de filtración. El compuesto 4-c (0,0416 g, 0,063 mmol) y HBTU (0,2893 g, 0,8571 mmol) se agregaron junto con DIPEA (0,2 mL, 0,8571 mmol). El tubo se aseguró y se rotó en un mezclador de laboratorio durante la noche a temperatura ambiente. Se filtró el sobrenadante y se lavó el sólido restante con DMF (3 x 3 mL) y metanol (3 x 5 mL) antes de secarse al vacío. Peso = 0,1285 g (45% de rendimiento). Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de amina libre. FTIR: 3313 (N-H, O H), 2862 (O-H), 1747 (C=O de amida), 1587 (C=O de CMC), 1404/ 1315 / 1023. Análisis elemental: Carbono: Esperado 51%; Real = 40%. Hidrógeno: Esperado 5%; Real = 6%. Nitrógeno: Esperado 5%; Real = 4%.

Se examinó la solubilidad del polímero 6 de la siguiente manera. Se colocó una pequeña cantidad del polímero 6 en dos placas de Petri de fondo de vidrio separadas. Se saturó el material se saturó ya sea con amortiguador de laboratorio general de pH 4 o con amortiguador de HPO4/MgCl2 de pH 9 (20 pL cada uno). Cada uno se visualizó con el lente óptico de ampliación x 10 del microscopio óptico Zeiss Axioimager, con x 10 de ampliación extra en el ocular.

Ambas muestras formaron hidrogeles al contacto con el amortiguador. Bajo el microscopio, los agregados de polvo parecían estar gelificados y contenían el color rojo de Dabsyl. Algunas áreas tenían mayor concentración de color que otras, pero la distribución del color se observó a lo largo de la muestra. Se repitió este experimento para el compuesto de materiales de inicio 4-c y para el polímero 5, No hubo color visible en la muestra del polímero 5; se observó la estructura de polvo de hidrogel. La muestra del compuesto 4-c era completamente roja y no formaba un hidrogel.

Se disolvió polvo de carboximetilcelulosa sódica (NaCMC) (2,0 mg, 8,3 mmol, DoS = 0,7) en agua desionizada (200 ml) con agitación, sonicación durante 60 segundos y calentamiento suave durante 30 minutos. A la solución se le añadió clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) (1,92 g, 10,01 mmol) con agitación. Se encontró que el pH era 8 y se ajustó a pH = 6 con la adición de HCl 1,0 M (3 gotas). Se añadió L-cisteína (0,50 g, 4,1 mmol) a la reacción con agitación. Luego se encontró que el pH era 8 y se ajustó nuevamente usando HCl para alcanzar pH 6 (~ 1 ml). La reacción se dejó en agitación durante la noche antes de realizar la diálisis (membranas de diálisis Medicell de 12-14 KDa) contra HCl 1 M (700 ml), luego HCl 1 M más NaCl al 1 % (700 ml), luego HCl 0,5 M (700 ml), cada uno de los cuales se realizó a 10 °C durante 60 min en la oscuridad. La solución resultante se liofilizó para proporcionar el Polímero 7. FTIR: 3296 (N-H, O-H), 2972/2930 (C-H), 2733 (pequeño), 2522 (S-H de C), 2089 (v pequeño), 1730 (C=O ácido de Cys), 1681 (amida), 1633 (C=O de CMC), 1469 (hombro), 1382/ 1346/ 1221/ 1107, 1051. 13C CP MAS NMR: 14 (C11), 18 (no asignado), 24 (no asignado), 43 (C9), 58 (no asignado), 62 (C6 ), 74 (C2, 3, 5, 7), 82 (C4), 103 (C1 ), 173 (carbonilo C8 de amida). Análisis elemental: Se esperaba del producto si la DoS de la materia prima fuera 0,7: Masa 299 g/mol: C 40 %, H 6 %, N 3 %, S 6 %; Real: C 34%, H 8%, N 8%, S 1,4%. Por lo tanto, de todos los monómeros, aproximadamente el 16% contiene el grupo ligador.

La solubilidad del polímero 7 se determinó de manera similar a la del compuesto 1-c. Se encontró que el polímero 7 era insoluble en agua, DMF, acetona, MeOH, EtOH y DCM.

Semolió el polímero 5 (1,00 g, 2,86 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (25 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Cys(StBu)-OH (3,7 g, 8.6 mmol), HBTU (2,87 g, 8.57 mmol) y DIPEA (1,10 mL, 8.57 mmol) con agitación a temperatura ambiente, abiertos al aire (se usaron un tubo de centrífuga y un rotor de laboratorio para facilitar la mezcla durante la noche). Se sometió a ultrasonido la mezcla durante 30 segundos antes de dejarla en agitación durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (20 mL x5) y MeOH (20 mL x5). El producto resultante se secó bajo vacío para producir el compuesto 8-b como un sólido blanquecino. 13C CP MAS RMN: 20 (no asignado), 30 (C9), 32 (C19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 55 (C16), 61 (C6), 70-74 (ancho, C2,3,5,7), 82 (hombro, C4), 92 (C17), 96 (no asignado), 103 (C1), 120 (C24), 127 (C25,26,27), 141 (C28), 145 (hombro, C23), 157 (C20, C=O carbamato), 171 (C8 carbonilo de amida), 177 (C8 carbonilo de CMC), 191 (no asignado), 221/227 (posible contaminante).

El compuesto 8-b (0,5 g) se colocó en un rotor de laboratorio en una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (10 mL) durante alrededor de 2 h. El producto desprotegido resultante se lavó después con EtOH (50 mL x3) y DCM (50 mL x3) para proporcionar el compuesto 8-c como un sólido blanquecino. Este proceso se repitió para eliminar por completo el grupo Fmoc.

Se agregó el compuesto 8-c (0,30 g, 0,54 mmol) a un matraz de fondo redondo y se purgó con gas nitrógeno. Se disolvió tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (0,307 g, 1,07 mmol) en agua desionizada (1,3 mL) y se agregó a la reacción con agitación junto con MeOH (2,6 mL). El sistema se mantuvo en nitrógeno a temperatura ambiente con agitación durante 1 h antes de filtrarse y lavarse con las siguientes soluciones: MeOH/agua 2:1 (90 mL), MeOH/agua 1:2 (90 mL), agua al 100% (90 mL), MeOH al 100% (90 mL). El sólido resultante se secó al vacío para producir el polímero 8 como un sólido blanquecino. Se repitió este proceso para reducir completamente el disulfuro. 13C CP MAS RMN: 30 (C9, 19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 54 (C16), 60 (C6 ), 70-74 (ancho, C2,3,5,7), 82 (hombro, C4), 92 (C17), 97 (no asignado), 102 (C1), 120 (C24), 127 (C25,26,27), 141 (C28), 156 (C20, C=O carbamato), 171 (C8 carbonilo de amida), 177 (C8 carbonilo de CMC), 191 (no asignado), 221 (no asignado). Análisis elemental: Esperado del producto si la DoS de la materia prima era 0,7: Masa 390 g/mol: C 43%, H 6%, N 6%, S 5%; Real: C 46%, H 7%, N 4%, S 3,5%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor de 50% contiene el grupo ligador.

El polímero 5 (1,0 g, 2,714 mmol) se dispersó en PBS (25 mL) con calentamiento, agitación y ultrasonido suaves. El recipiente de reacción se purgó con gas nitrógeno. A una solución de reactivo de Traut (0,600 g, 4,304 mmol) en PBS (50 mL), se agregó EDTA (0,044 g, 0,15 mmol). Una vez que se disolvió por completo, se agregó esta solución a la mezcla de reacción, que se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 1 hora. El producto resultante se separó por filtración y se lavó con PBS (3 x 10 mL) y metanol (3 x 10 mL). Luego, el producto sólido pulverulento blanco/blanquecino se secó al vacío y se almacenó en nitrógeno. Peso = 1,2413 g (91%). El color amarillo de una prueba de Ellman indica que algo de tiol libre estaba todavía presente, posiblemente en los materiales de inicio restantes sin reaccionar. En una prueba cuantitativa, hubo alrededor de 0,06 mmol/g de grupos SH presentes. FTIR: 3315 (N-H/O-H), 2957/2934/2870 (C-H), 1644 (C=O, amida del producto acoplado), 1593 (C=O de CMC), 1412/1322/1022, Hubo un pico muy pequeño para S-H a 2059 cm-1.5 C (13,000Hz, CP MAS): 176,7 (C8 , C=O de CMC), 172,2 (C8 , C=O de amida), 156,0 (C15, pico pequeño) 121,0, 103,0 (C1), 81,3 (C7, hombre), 74,4 (C2,C3,C4,C5), 61,7 (C6 ), 38.9 más hombro (C9,C10,C11,C12,C13,C14). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 414 g mol-1: C 43%, H 7%, N 6%, S 4%. Real: C 40%, H 7%, N 4%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 47% contiene el grupo ligador.

Se pesó el polímero 9 (0,150 g, 0,316 mmol) en un matraz de fondo redondo y se purgó con nitrógeno. El reactivo de Ellman (0,375 g, 0,947 mmol) se disolvió en PBS (20 mL) y se agregó al polímero 9. La reacción se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. El producto de disulfuro intermedio 10-a se filtró y se lavó con PBS (3 x 20 mL) y metanol (1 x 20 mL) antes de secarse al vacío para producir el intermediario 10-a como un sólido en polvo de color blanco/amarillo pálido. Peso = 0,133 g (60% de rendimiento). El color amarillo de una prueba de Ellman indica que un poco de tiol libre estaba todavía presente, posiblemente en los materiales de inicio restantes sin reaccionar. En una prueba cuantitativa, había aproximadamente 0,33 mmol/g de grupos S-H presentes. FTIR: 3310 (N-H/ O-H), 2911/ 2875 (C-H), 1727 (C=O ácido carboxílico), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1592 (C=O de CMC). Hubo un pico muy pequeño para S-H de alrededor de 2059 cirr1. 8 C (10,000 Hz, CP MAS): 222,37 (banda lateral giratoria), hombro de 172,5 (C8 , C=O de CMC), 172,5 (C8 , C=O de amida, posiblemente también algo del grupo ácido en el reactivo de Ellman), 156,0 (C15, pico pequeño) 123,7 (banda lateral giratoria), 144,5 (región aromática del reactivo de Ellman), 103,0 (C1), 96,79, 82,25 (C7, hombro), 74,5 (C2, C3, C4, C5), 61,4 (C6 ), 39,3 más hombro (C9, C10, C11, C12, C13, C14), pico pronunciado de 32,2 (posible contaminante). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 553 g mol'1: C 43%, H 6%, N 6%, S 6%. Real: C 39%, H 6%, N 4%, S 1,45%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 17% contiene el grupo ligador.

El producto de disulfuro intermedio 10-a (0,1 g, 0,1422 mmol), ácido mercaptobenzoico (0,11 g, 0,7112 mmol) y metanol: agua (proporción 4:1, 5 mL) se combinaron y se agitaron durante 2 h a TA en atmósfera de nitrógeno. El producto resultante se filtró y se lavó con metanol (3 x 10 mL), DCM (3 x 10 mL) y se lavó adicionalmente con metanol (3 x 10 mL) antes de secarse al vacío para producir el polímero 10 como un polvo sólido amarillo. Peso = 0,0821 g (87% de rendimiento). El color amarillo oscuro de una prueba de Ellman indica que un poco de tiol libre estaba todavía presente, posiblemente en los materiales de inicio restantes sin reaccionar. En una prueba cuantitativa, había aproximadamente 2,97 mmol/g de grupos S-H presentes. FTIR: 3293 (N-H/ O-H), 2910/ 2881/ 2849 (C-H), 1718 (C=O ácido carboxílico), 1638 (C=O, amida de producto acoplado), 1586 (C=O de CMC), 1553, 8 C (10,000 Hz, CP MAS): 177,4 (C8 , C=O de Cm C), 171,9 (C8 , C=O de amida, posiblemente también algo del grupo ácido en el ácido benzoico), picos anchos pequeños de 130/143, 102,7 (C1), 96,79, 81,6 (C7, hombro), 74,1 (C2, C3, C4, C5), 62,5 (C6), 39,0 más hombro (C9, C10, C11, C12, C13, C14), pico pronunciado de 32,1 (posible contaminante). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 520 g mol-1: C 44%, H 6%, N 6%, S 6%. Real: C 37%, H 6%, N 3%.

Se realizó una secuencia de lavado adicional en agua para asegurar que cualquier subproducto se lavó de la estructura en el estado hinchado (tipo hidrogel). Se usaron amortiguador de fosfato pH 9 (100 mL), agua desionizada (20 mL), amortiguador de fosfato pH 9 (5 mL) y finalmente metanol (20 mL) para lavar el sólido que luego se secó al vacío para proporcionar el polímero 10 como un polvo sólido de color crema/blanco. Peso = 0,0482 g (51% de rendimiento). El color amarillo pálido de una prueba de Ellman indica que un poco de tiol libre estaba todavía presente, posiblemente en los materiales de inicio restantes sin reaccionar. En una prueba cuantitativa, había aproximadamente 0,31 mmol/g de grupos S-H presentes. FTIR: 3267 (N-H/ O-H), 2904/ 2866 (C-H), 2119 pico pequeño (S-H), 1638 (C=O, amida del producto acoplado), 1587 (C=O de CMC), 1547, Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 520 g mol-1: C 44%, H 6%, N 6%, S 6%. Real: C 38%, H 6%, N 3%, S 0,65%.

La solubilidad de los polímeros 9 y 10 se determinó de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble

Ejemplo 11: Preparación de polímero 11

Se agregaron aminofenil fluoresceína (0,005 g, 0,0180 mmol), HBTU (0,0136 g, 0,036 mmol) y el polímero 5 (0,013 g, 0,036 mmol) a un matraz de fondo redondo de 25 mL con una barra agitadora y se purgó con N2(g). Se agregó DMF seca (5 mL) y la reacción se agitó a TA durante la noche cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz. La solución de reacción se filtró a través de un tubo de filtración y se lavó varias veces con DMF. El sobrenadante mantuvo un color naranja; se mantuvo junto con los lavados y se secó al vacío. El producto sólido se recuperó y se secó al vacío. Con el fin de maximizar el acoplamiento, y dado que el sobrenadante y los lavados tenían algo de color naranja, la reacción se repitió usando el sólido recuperado del sobrenadante y lavados como los reactivos. Peso = 0,012 g (43% de rendimiento). FTIR: 3367 (N-H/ O-H), 2932 (CH), 1702, 1655 (C=O, amida), hombro de 1555 (C=O de CMC), 1494 (C-C aromático de APF), 1437/ 1413/ 1387/ 1308, 1194 (C-C), 1106 (C-O de APF), 838 (flexión de C-H aromático fuera del plano).

Ejemplo 12: Preparación de polímero 12

Inicialmente, el polímero 8 se trató con TCEP para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro que se hubieran formado. Se disolvió TCEP (0,0243 g, 0,0848 mmol, 4 equiv) en 1 mL de agua y se agregó al polímero 8 (0,01 g, 0,0212 mmol) y se agitó a TA durante 30 minutos. El sólido se filtró y se lavó con agua (3 x 10 mL) y se liofilizó produciendo un polvo sólido de color crema/blanquecino que luego se lavó con DMF (3 x 10 mL).

El compuesto 12-a (0,0108 g, 0,0212 mmol, 1 equiv) se disolvió en 3 mL de DMF seca y se agregó al polímero 8 que había sido purgado con N2 (g). La reacción se agitó a TA durante la noche cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz. Después de agitarse durante la noche, la mezcla de reacción se había vuelto de color rojo y cuando se filtró, se recuperó solamente una cantidad muy pequeña de material sólido blanco (0,0022 g). La fase de solución se concentró al vacío para proporcionar el polímero crudo 12 como un sólido ceroso rojo.

Era probable que el producto y los materiales de inicio estuvieran presentes en el polímero crudo 12 y, por lo tanto, se requirieron lavados para purificar adicionalmente el material crudo. La mezcla era insoluble en hexano, etanol y cloroformo. Sin embargo, al sumergirse en agua desionizada y después de calentamiento y ultrasonido suaves, el sobrenadante se volvió un color naranja que probablemente sea el compuesto de material de partida 12-a. La solución se sometió a las siguientes etapas 5 veces: (1) adición de agua desionizada (5 mL), (2) calentamiento suave con agitación, (3) ultrasonido de 1 minuto repetida 3 veces y (4) filtración a través de una columna de filtración y filtro de frita. Se lavaron otros 50 mL de agua desionizada a través de la muestra sólida. Luego se filtró y se liofilizó durante la noche para eliminar el agua. Peso del producto: 0,01701 g (85% de rendimiento). FTIR: 3347 (N-H/ O-H), 2915/ 2851 (C-H), 1756 (C=O de éster / C=O de fluoresceína), 1716 (C=O de éster / C=O de fluoresceína), 1643 (C=O, amida del producto acoplado), 1608 (C=O de CMC/ estiramiento de C=C aromático), 1492 (estiramiento de C=C aromático), 1369 (estiramiento de CO de éster), 1246 (estiramiento de CO), 1152 (t-OH), 1110 (C-O de éster/ -OH), 842 (flexión de CH aromático fuera del plano).

Eficacia enzimática del polímero 12

La eficacia enzimática se examinó con esterasa (~50 unidades/mL logrados mezclando esterasa pura (0,01 mL) en PBS (0,99 mL).

La microscopía de la fluorescencia indicó una diferencia observable distinta en la fluorescencia entre la muestra del polímero 12 y la muestra de control (polímero 12 en PBS sin enzima), lo que demuestra que había actividad por parte de la enzima en el polímero para liberar los grupos éster de la fluoresceína unida.

El uso de un microscopio confocal permitió la visualización de la diferencia en fluorescencia entre el polímero 12 y la muestra de control. Configuración del microscopio: ganancia inteligente = 716 v, desplazamiento inteligente = -2,1%, aumento = x20, tamaño de agujero = 105,05 pm.

Para cuantificar y determinar con precisión la eficacia enzimática, se preparó un experimento adicional mediante el uso de una placa de 96 pocillos y un lector de placas (Fluostar Optima BMG Labtech con la excitación ajustada en 485 nm, la emisión ajustada en 590 nm y la ganancia ajustada en 1500). El polímero 12 se dispersó en 320 pL de PBS y se mezcló con vórtex. Se colocaron 40 pL de suspensión en 8 de los pocillos y se tomó una medición a modo de lectura de referencia. Se prepararon las siguientes soluciones: 58 unidades/mL de esterasa en PBS (una solución de enzima débil), 116 unidades/mL de esterasas en PBS (una solución de enzima fuerte), 1 M de NaOH (ac.).

N=2 pocillos tenían 40 pL de PBS agregado (control) en la dispersión de prueba solamente.

N=2 pocillos tenían 40 pL de solución de enzima débil colocados con pipeta en la dispersión de prueba.

N=2 pocillos tenían 40 pL de solución de enzima fuerte colocados con pipeta en la dispersión de prueba.

N=2 pocillos tenían 40 pL de solución de NaOH de 1 M colocados con pipeta en la dispersión de prueba.

Se registró otra lectura de fluorescencia inmediatamente después de la adición a el pocillo final, y desde entonces se tomaron registros después de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 minutos. Luego se cubrió la placa y se dejó durante la noche para obtener una lectura después de 24 h. Sin embargo, el detector de fluorescencia había alcanzado su límite y, por lo tanto, no se obtuvieron resultados significativos para este punto de tiempo. La Tabla 2 y la figura 1 muestran la lectura de fluorescencia en cada punto de tiempo menos la lectura de referencia (solo la suspensión de partículas).

Tabla 2.

Hay un ligero aumento de la fluorescencia emitida por el control negativo durante el período de 1 hora.

Como se esperaba, la fluorescencia de las soluciones de esterasas débiles y fuertes aumenta con el tiempo. La solución de esterasa fuerte parece haber alcanzado la máxima intensidad de fluorescencia que se puede medir con el instrumento a alrededor de 30 min (el punto de saturación de la máquina es de 65000). La figura 1 muestra el gráfico para la esterasa fuerte hasta los 30 min y traza la línea de tendencia para esta y la esterasa débil durante los 60 min completos.

Después de este experimento, cada solución (n=1 solamente) se retiró con pipeta fuera de su pocillo y se colocó con pipeta en el pocillo de un microscopio de fondo de vidrio para su examen a simple vista. También se colocó en la cámara UV ajustada según la configuración de longitud de onda larga y se tomaron imágenes (figuras 2A-2C).

En conjunto, esta evidencia sugiere que el método sintético fue exitoso y que la etapa de escisión de la enzima da una respuesta positiva que se puede cuantificar mediante espectroscopía de fluorescencia. La muestra de polímero 12 fluoresce incluso sin la adición de esterasa, lo que sugiere quizás un pequeño exceso de acoplamiento.

Ejemplo 13: Preparación del polímero 13 (usando fibra de CMC)

La fibra de NaCMC (2 x apósitos AQUACEL de 10x10 cm) con DoS de alrededor de 0,2-0,3 (1,97 g, 8.33 mmol) se separó a mano en pequeñas fibras abiertas y se dispersó en una solución de etanol/agua desionizada (80:20 v/v) (180 mL). Se agregó la resina de intercambio iónico Dowex 650C Monosphere para proporcionar la CMC acidificada (CMC-H) y se mezcló durante alrededor de 30 minutos. Las monosferas se eliminaron cuidadosamente por filtración y se agregó hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH) al 40% (ac.) hasta que el pH fue de 8-9. Se agitó la solución resultante durante 30 minutos antes de concentrarse al vacío. Se disolvió el material seco en DMF seca (150 mL) en nitrógeno. Fue necesario agitar durante la noche y la solución resultante fue muy viscosa con un color transparente/amarillo. Se agregó DMF seca adicional (100 mL) para reducir la viscosidad y la mezcla se enfrió a alrededor de 4°C y se agitó antes de agregar yoduro de 2-cloro-A/-metilpiridinio (CMP-I) (1,4875 g, 5,8 mmol). Poco después, se agregó el compuesto 5-b (1,3567 g, 9,17 mmol) junto con trietilamina seca (5 mL). La reacción se mantuvo a 4°C y se agitó durante la noche. El sólido se filtró y luego se lavó con acetona (3 x 100 mL) y luego con DMF (3 x 100 mL), se realizó ultrasonido durante las etapas de lavado para alentar a las fibras a dispersarse en la solución de lavado. El sólido se secó adicionalmente al vacío para producir el polímero 13 como fibras esponjosas/pulverulentas de col or blanquecino. Peso = 1,8365 g (60% de rendimiento). Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de aminas terminales (una lectura de 570 nm equivale a 3,08 pmol de amina). SS RMN: 8 (10,000Hz, CP MAS) 176,9 (C=O) 153,4, 142,4, 104,1 (C1), 96,8 (C4), 83,6 (C3), 74,2 (C7, C2, C5), 69,4 (C6 ), 61,9 (C6 , hombro). FTIR: 3325 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1648 (C=O, amida de producto acoplado), 1589 (C=O de CMC), 1543, 1408/ 1367/ 1265/ 1022, Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 318 g mol'1: C 45%, H 7%, N 6%. Real: C 42,5%, H 7%, N 3%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 35% contiene el grupo ligador.

La solubilidad del polímero 13 se determinó de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble.

Ejemplo 14: Preparación de polímero 14

El polímero 13 (0,250 g, 1,396 mmol) se colocó en un matraz de fondo redondo en una atmósfera de nitrógeno. El compuesto 14-a (90 mg, 0,679 mmol) se disolvió en DMF seca (5 mL) en una atmósfera de nitrógeno y se agregó al polímero 13 con agitación. Se agitó la mezcla de reacción durante 90 min a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno antes de filtrarse y lavarse con DMF (5 x 5 mL) y metanol (5 x 5 mL). El producto se concentró al vacío para producir el polímero 14 como un sólido pulverulento blanquecino. Peso = 0,1852 g (52% de rendimiento). Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de aminas terminales (una lectura de 570 nm equivale a 1,86 pmol de amina). FTIR: 3251 (N-H/ O-H), 2915/ 2874 (C-H), 1649 (C=O, amida de producto acoplado), 1583 (C=O de CMC), 1405/ 1316/ 1262/ 1020, Análisis elemental: expectativa de producto si la DoS de la materia prima era de 0,7: Masa 519 g mol'1: C 48%, H 5,8%, N 5,6%. Real: C 42,8%, H 6,95%, N 4,25%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 53% contiene el grupo ligador.

La solubilidad del polímero 14 se determinó de una manera similar a la del compuesto 1-c. Los datos se muestran a continuación: x indica material insoluble.

Ejemplo 15: Preparación de polímero 15

Se disolvió el polímero 5-a (preparado como en el Ejemplo 5 mediante 2,0 g de NaCMC) en DMF seca (150 mL) en una atmósfera de nitrógeno. Fue necesario agitar y calentar a ~50°C durante un período de ~2 h, así como ciclos múltiples de ultrasonido durante 1 minuto para proporcionar una solución transparente. Se enfrió la solución a ~4°C y se agitó antes de agregar yoduro de 2-cloro-N-metilpiridinio (CMP-I) (1,4875 g, 5,8 mmol). La solución se convirtió en una "gelatina" viscosa y se mezcló vigorosamente, y se agregaron otros 20 mL de DMF seca, los cuales se descompusieron y diluyeron el gel. Poco después de esto, se agregó 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (12,02 g, 2,02 mL, 9,17 mmol) junto con trietilamina seca (5 mL). La reacción se mantuvo a 4°C y se agitó durante la noche. Se enfrió la acetona (100 mL) a 4°C y se goteó lentamente la mezcla de reacción con agitación. Se filtró la mezcla en alícuotas de 20 mL para producir un sólido gelificado transparente y blanco. Se lavó este sólido en acetona (3 x 100 mL), etanol (3 x 100 mL), agua (1 x 100 mL), hexano (1 x 100 mL) y luego nuevamente con agua (1 x 100 mL) antes de concentrarlo durante alrededor de 15 minutos. Se liofilizó el producto resultante por un período de 3 días para proporcionar el polímero 5-a como un sólido ligero y esponjoso. Peso = 1,794 g (49% de rendimiento). Se usó una prueba de Kaiser para confirmar la presencia de aminas terminales (una lectura de 570 nm equivale a 1,86 pmol de amina). 13C RMN (101 MHz, ninguno) 8 176,51 (C8 , C=O de CMC), 171,09 (C8 , C=O de amida), 163,79 (nuevo pico), 153,15, 143,12, 103,40 (C1), 82,39 (C7), 75,81/ 73,99/ 70,07 (C2, C3, C4, C5), 60,81 (C6 ), 42,54/ 36,84 (C11, C12, C13, C14, C15, C16), 31,45 (C9, C14), 28.25, FTIR: Picos a 3239 (N-H/ O-H), 2865 (C-H), 1650 (C=O, amida del producto acoplado), 1586 (C=O de CMC), 1404/ 1388/ 1315/ 1256/ 1053. Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 369 g mol’1: C 47,5%, H 7%, N 4%. Real: C 45,5%, H 7,4%, N 5,1%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 87,5% contiene el grupo ligador.

Ejemplo 16: Preparación de polímero 16

El polímero 15 (1,000 g, 2,273 mmol) se trituró en un polvo fino y se mezcló con DMF (15 mL) durante 20 minutos. Se añadieron el Compuesto 8-a (1,14 g, 2,639 mmol), HBTU (2,59 g, 6,82 mmol) y DIPEA (1,19 mL, 6,82 mmol) con agitación a TA, abiertos al aire (un tubo de centrífuga y un rotor de laboratorio se usaron para facilitar la mezcla durante la noche). La mezcla se sometió a ultrasonido durante 30 s antes de dejarla en agitación durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). El producto intermedio acoplado resultante se secó al vacío. Se agregó este producto intermedio (850 mg) a una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (20 mL) y se hizo burbujear con gas nitrógeno para agitar la mezcla durante 1 hora, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió y el producto intermedio de amina se secó al vacío. Se agregó este producto intermedio de amina a un matraz de fondo redondo y se purgó con gas nitrógeno. Se disolvió TCEP (428 mg) en agua desionizada (2,6 mL) y se agregó al producto intermedio de amina con agitación, seguido de la adición de metanol (5,2 mL). El sistema se mantuvo bajo nitrógeno a TA con agitación durante 1 h antes de filtrarse y lavarse con las siguientes soluciones: metanol:agua 2:1 (90 mL), metanol:agua 1:2 (90 mL), agua 100% (90 mL), MeOH 100% (90 mL). El sólido resultante se secó al vacío para proporcionar el polímero 16 como un sólido pulverulento de color blanquecino. Peso = 0,3537 g (30% de rendimiento). El color amarillo de una prueba de Ellman indica que el tiol libre estaba presente. FTIR: 3349 (N-H/ O-H), 2917/ 2872 (C-H), 1716 (acetona), 1650 (C=O, amida de producto acoplado), 1593 (C=O de CMC), 1539, 1438/ 1313/ 1255/ 1028. 8 C (10,000Hz, CP MAS): 171,8 (C8 , C19) 156,5 (C=O residual de Fmoc), 142,3 (CHAr residual de Fmoc), 127,9 (CHAr residual de Fmoc), 120,08, 103,3 (C1), 82,6 (C7), 74,5 (C2, C3, C4, C5), 69,9 (x), 61.5 (C6 ), 49,5 (C20), 36,37 (C9, C18, C21), 29,52 (C10-18). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 440,7 g mol'1: C 45%, H 7%, N 5,4%, S 4,1%. Real: C 47,1%, H 6,74%, N 4,11%, S 0,80%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 20 % contiene el grupo ligador.

La evaluación de solubilidad indica que el polímero 16 forma un hidrogel en amortiguador de pH 9 (^HPO^MgCh).Ejemplo 17: Preparación de polímero 17

Inicialmente, el polímero 16 se trató con TCEP para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro que se hubieran formado. Se disolvió TCEP (0,1685 g, 0,196 mmol, 4 equiv) en 1 mL de agua y se agregó al polímero 16 (0,0754 g, 0,147 mmol) y se agitó a TA durante 30 minutos. El sólido se filtró y se lavó con agua (3 x 10 mL) y se liofilizó produciendo un polvo sólido de color crema/blanquecino que luego se lavó con DMF (3 x 10 mL).

El compuesto 12-a (0,0250 g, 0,049 mmol, 1 equiv) se disolvió en 2 mL de DMF seca y se agregó al polímero 16 que había sido purgado con N2 (g). La reacción se agitó a TA durante la noche cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz. Después de agitarse durante la noche, la reacción no había cambiado de color. Se filtró y lavó un polvo sólido de color blanquecino de la siguiente manera, repitiendo cada paso 5 veces: (1) adición de agua desionizada (5 mL), (2) calentamiento suave con agitación, (3) ultrasonido de 1 minuto repetida 3 veces, (4) filtración a través de una columna de filtración y filtro de frita, y (5) lavado adicional con agua desionizada (20 mL). Se filtró el sólido resultante y se liofilizó durante 3 horas para proporcionar el polímero 17 como un producto blanquecino. Peso = 0,063 g (44% de rendimiento). FTIR: 3315 (N-H/ O-H), 2911/ 2869 (C-H), 1922, 1756 (C=O de éster / C=O de fluoresceína), 1720 (C=O de éster / C=O de fluoresceína), 1647 (C=O, amida del producto acoplado), 1591 (C=O de CMC/ estiramiento de C=C aromático), 1420 (estiramiento de C=C aromático), 1366 (estiramiento de CO de éster), 1248 (estiramiento de CO), 1050 (C-O de éster/ -OH), 894 (flexión de CH aromático fuera del plano). 8 C (10,000Hz, CP MAS): 171,0 (C8 , C19, C40) 153,1 (C22, C37), 141,7 (C-CAr), 127,0 (C-CAr), 102,4 (C1), 81,9 (C7, C33), 74,5 (C2, C3, C4, C5), 68.6 (C23, C34), 61,5 (C6), 46,7 (C20), 36,5 (C9, C18), 32,1 (C21), 29,5 (C10-17). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 0,7: masa 797,7 g mol-1: C 52%, H 5%, N 3,5%, S 2,1%. Real: C 42,8%, H 6,95%, N 4,02%, S 0,52%. Por lo tanto, de todos los monómeros, alrededor del 25% contiene el grupo ligador.

Eficacia enzimática del polímero 17

La eficacia enzimática se examinó con esterasa (~58 unidades/mL logrados mezclando esterasa pura (0,01 mL) en PBS (0,99 mL).

Para cuantificar y determinar con precisión la eficacia enzimática, se preparó un experimento adicional mediante el uso de una placa de 96 pocillos y un lector de placas (Fluostar Optima BMG Labtech con la excitación ajustada en 485 nm, la emisión ajustada en 590 nm y la ganancia ajustada en 1500). Preparación de las muestras: se remojaron 0,4 mg de polímero 17 en 640 pL de PBS durante 24 h. Después de remojar, la solución de PBS no se alteró y permaneció clara. Se centrifugó la mezcla para eliminar la mayoría de los sólidos, y en este punto la muestra de polímero 17 parecía haberse convertido en un hidrogel. Se filtró y analizó entonces el eluyente; el hidrogel sólido se mantuvo a un lado para realizarse una experimentación adicional. Se colocaron 40 pL del eluyente en pocillos con una mezcla exhaustiva antes de cada alícuota. Se tomó una medida a modo de lectura de referencia. Se prepararon las siguientes soluciones: 58 unidades/mL de esterasa en PBS (una solución de enzima débil), 116 unidades/mL de esterasas en PBS (una solución de enzima fuerte).

N=4 pocillos tenían 40 pL de PBS agregado (control) en la dispersión de prueba solamente.

N=4 pocillos tenían 40 pL de solución de enzima débil colocados con pipeta en la dispersión de prueba.

N=4 pocillos tenían 40 pL de solución de enzima fuerte colocados con pipeta en la dispersión de prueba.

Se registró otra lectura de fluorescencia inmediatamente después de la adición a el pocillo final, y a partir de entonces se tomaron registros cada 60 segundos durante 160 minutos. La figura 3 muestran la lectura de fluorescencia en cada punto de tiempo menos la lectura de referencia (solo la suspensión de partículas). El instrumento no alcanzó el punto de saturación durante este experimento como lo había hecho anteriormente. Como se esperaba, la fluorescencia de las soluciones de esterasas débiles y fuertes aumenta con el tiempo.

La fluorescencia de la muestra de control negativo (muestra sin enzima, solo PBS) aumentó ligeramente con el tiempo.

Además del experimento anterior, se realizó un experimento de control adicional mediante el uso del filtrado sólido. Se agregó el sólido a 640 pL de PBS, se mezcló con vórtex y se sometió a ultrasonido hasta que se observó una buena dispersión. Se analizó la solución mediante el uso del mismo método cinético descrito anteriormente (véase la figura 4 para encontrar resultados). En conjunto, esta evidencia sugiere que el método sintético fue exitoso y que la etapa de escisión de la enzima da una respuesta positiva que se puede cuantificar mediante espectroscopía de fluorescencia. El polímero 17 no es tan fluorescente como el polímero 12 en ausencia de esterasa, lo que indica que hay menos etiqueta fluorescente unida al polímero.

Ejemplo 18: Preparación de polímero 18

Se disolvió maleimida de metoxipolietilenglicol (compuesto 18-a) (0,01 g, 0,0543 mmol, 2,5 equiv) en 2 mL de DMF seca y se agregó al polímero 8 que se había purgado con N2 (g). La reacción se agitó a TA durante la noche cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz. Después de agitarse durante la noche, la mezcla de reacción se había vuelto de color rojo y, cuando se filtró, no hubo fase sólida. Se enjuagó el filtro con DMF (5 mL) y la solución se combinó y redujo al vacío para producir un aceite transparente/ amarillo (peso = 0,0106 g). Se vertió lentamente el agua desionizada enfriada (2 mL) en el aceite a 4°C y luego se liofilizó para producir el polímero 18 como un sólido ceroso blanquecino/rosado. Peso = 6,42 mg. Una prueba de Kaiser no cuantitativa indicó que no había aminas libres presentes. FTIR: ~3350 (pequeño, N-H/ O-H), 2881 (C-H), 2740 (C-H), 1964, 1710 (cetona cíclica de 5 miembros), 1665 (C=O, amidas), 1359 (estiramiento de C-O de éster), 1240 (estiramiento de C-O), 1145/ 1100 (C-O de éster / -OH), 842 (flexión de CH aromático fuera del plano).

La evaluación de solubilidad indicó una solubilidad fácil en cloroformo, PBS y DMF.

Ejemplo 19: Preparación de polímero 19

Se molió el polímero 5 (300 mg, 0,81 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (20 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Ala-OH (1,00 g, 2,31 mmol), HBTU (1,84 g, 4,86 mmol), EDC (100 mg, 0,52 mmol) y DIPEA (6,2 mL, 4,86 mmol) a un tubo de centrífuga grande y se purgaron con nitrógeno. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 19-a como un polvo blanquecino. Peso = 0,2932 g. Una prueba de Kaiser positiva indicó un acoplamiento incompleto. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1589 (C=O de CMC), 1403/ 1022, 896.

Se colocó el polímero 19-a (207 mg) en una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (20 mL) y se purgó con gas nitrógeno y se agitó durante 1 hora, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió, y el producto se secó para proporcionar el Polímero 19 como un polvo blanquecino. Peso = 0,345 g (60% de rendimiento). Una prueba de Kaiser positiva confirmó la presencia de amina libre. FTIR: 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1589 (C=O de CMC), 1403/1022, 896.

Se molió el polímero 19 (200 mg, 0,470 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (20 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Ala-OH (0,439 g, 1,41 mmol), HBTU (0,539 g, 1,41 mmol), EDC (270 mg, 1,41 mmol) y DIPEA (0,018 mL, 1,41 mmol) a un tubo de centrífuga grande y se purgaron con nitrógeno. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 20-a como un polvo blanquecino. Peso = 0,1576 g. Una prueba de Kaiser positiva indicó un acoplamiento incompleto. FTIR: picos a 3300 (N-H / O-H), 2900/ 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1584 (C=O de CMC), 1542 (), 1445/1403/ 1022, 899. Se colocó el polímero 20-a (158 mg) en una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (20 mL) y se purgó con gas nitrógeno y se agitó durante 1 hora, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió, y el producto se secó para proporcionar el Polímero 20 como un polvo blanquecino. Peso = 0,1391 g (58% de rendimiento). Una prueba de Kaiser positiva confirmó la presencia de amina libre. FTIR: picos a 3300 (N-H / O-H), 2900/ 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1584 (C=O de CMC), 1403/ 1025, 900.

Ejemplo 21: Preparación de polímero 21

Se molió el polímero 20 (150 mg, 0,2785 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (20 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Val-OH (0,282 g, 0,836 mmol), HBTU (0,317 g, 0,8356 mmol),<e>D<c>(160 mg, 0,836 mmol) y DIPEA (0,20 mL, 0,836 mmol) a un tubo de columna de filtración y se sellaron. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 21-a como un polvo blanquecino. Peso = 0,10967 g. Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina sin reaccionar. FTIR: Picos a 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1584 (C=O de CMC), 1403/1025.

Se colocó el polímero 21-a (100 mg) en una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (20 mL) y se agitó durante 1 hora, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió, y el producto se secó para proporcionar el Polímero 21 como un polvo blanquecino. Peso = 0,08020 g (47% de rendimiento). Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina libre. FTIR: Picos a 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1584 (C=O de CMC), 1453/1403/1024, 962/906/841.

Ejemplo 22: Preparación de polímero 22

Se molió el polímero 21 (100 mg, 0,165 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (10 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Val-OH (0,167 g, 0,494 mmol), HBTU (0,187 g, 0,494 mmol), EDC (95 mg, 0,494 mmol) y DIPEA (0,064 mL, 0,494 mmol) a un tubo de columna de filtración y se sellaron. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 22-a como un polvo blanquecino. Peso = 0,0603 g. Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina sin reaccionar.

Se colocó el polímero 22-a (60 mg) en una solución de piperidina: DMF (20:80 v/v), (20 mL) y se agitó durante 1 hora, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió, y el producto se secó para proporcionar el Polímero 22 como un polvo blanquecino. Peso = 0,0553 g (48% de rendimiento). Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina libre. FTIR: Picos a 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1585 (C=O de CMC), 1453/1403/ 1024/1095/ 1058, 961, 841.

Ejemplo 23: Preparación de polímero 23

Se molió el polímero 22 (50 mg, 0,707 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (10 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-Cys(StBu)-OH (716 mg, 2,122 mmol), HBTU (805 mg, 2,122 mmol), EDC (407 mg, 2,122 mmol) y DIPEA (0,274 mL, 2,122 mmol) a un tubo de columna de filtración y se sellaron. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 23-a como un polvo blanquecino. Peso = 0,0253 g. Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina sin reaccionar. FTIR: Picos a 3300 (N-H/ O-H), 2850 (C-H), 1748 (amida), 1648 (C=O, amida del producto acoplado), 1585 (C=O de CMC), 1453/1403/ 1024/1095/ 1058, 961, 841.

Se colocó el polímero 23-a (25 mg) en una solución de TCEP en agua (5 mL) y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con etanol (3 x 50 mL) y DCM (3 x 50 mL). Este proceso luego se repitió, y el producto se secó para proporcionar el Polímero 23 como un polvo blanquecino. Una prueba de Kaiser positiva indicó la presencia de amina libre. Este material se usó en el Ejemplo 24 sin caracterización adicional.

Se disolvió TCEP (0,0357 g, 0,125 mmol, 4 equiv) en 1 mL de agua y se agregó al polímero 23 (25,3 mg, 0,0312 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. El sólido se filtró y lavó con agua (10 mL x 3) y se liofilizó, lo que produjo un polvo sólido de color blanquecino/crema que luego se lavó con DMF (10 mL x 3).

Se disolvió diacetato de fluoresceína-5-maleimida (compuesto 12-a) (0,016 g, 0,0312 mmol, 1 equivalente) en 3 mL de DMF seca y se agregó al polímero 23 pretratado que había sido purgado con N2 (g). La reacción se agitó a TA durante la noche cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz. Se usó un rotor de laboratorio para facilitar el mezclado durante la noche. Se filtró el sólido y se lavó con DCM (5 x 20 mL), agua (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 24 como un polvo blanquecino. Peso = 0,0156 g (32% de rendimiento). FTIR: (Vmax/ cm-1) 3286 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1722 (acetona), 1647 (C=O, amida del producto acoplado), 1589 (C=O de CMC), 1545 (C-C de ar. fluoresceína), 1409/ 1317/ 1250/ 1024/ 894, 13C CP MAS RMN: CMC 0,7 DoS (material de inicio): 8 C (13,000Hz, CP MAS) 61,7 (C6 ), 74,5 (C7, C2, C5), 82,5 (hombro, C3), 97,0 (C4), 103,3 (C1), 177 (C=O); CMC- PEG diamina: 8 C (13,000Hz, CP MAS) 13,4 (C14), 20,1 (no asignado), 23,4 (no asignado), 30,6 (C9), 61,7 (C6 ), 70 (hombro, C7), 74,5 (C2, C5), 82,5 (C3), 95 (C4), 103,3 (C1), 113 (no asignado), 142 (no asignado), 152 (no asignado), 169,7 (C=O del ligador), 177,1 (C=O de CMC).

El polímero 13 se mezcló con DMF (30 mL) durante 20 minutos. Se añadieron el Fmoc-Cys (StBu)-OH (1,5 g, 3,5 mmol), HBTU (3,09 g, 8.14 mmol) y DIPEA (1,05 mL, 8.14 mmol) con agitación a TA, abiertos al aire (un tubo de centrífuga y un rotor de laboratorio se usaron para facilitar la mezcla durante la noche). Después de rotar durante la noche, el sólido se filtró y lavó con DCM (5 x 50 mL), metanol (5 x 50 mL) y de nuevo con<d>C<m>(5 x 50 mL). Se secó el producto resultante para proporcionar el Polímero 25 y se usó directamente en el siguiente ejemplo (Ejemplo 26).

Ejemplo 26: Preparación de polímero 26

Se preparó el polímero 26 mediante el uso de un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 12. Aspecto: blanquecino, polvo/sólido. Peso = 1,258 g (59% de rendimiento). FTIR: 3339 (N-H/ O-H), 2872 (C-H), 1736 (acetona), 1648 (C=O, amida de producto acoplado), 1549 (C=O de CMC), 1419, 1363, 1313, 1201, 8 C (10,000Hz, CP MAS): 30 (C9, 19), 39 (C10,11,12,13), 47 (C18, 22), 54 (C16), 60 (C6), 70-74 (ancho, C2,3,5,7), 83 (hombro, C4), 92 (C17), 97, 104 (C1), 120 (C24), 128 (C25,26,27), 142 (C28), 156 (pequeño, C20, carbamato de C=O), 171 (carbonilo de amida C8). Análisis elemental: se esperaba un producto si DoS de la materia prima era 1 y la conversión completa de grupos ligadores: masa 781 g mol'1: C 55%, H 7%, N 5%, S 8%. Real: C 46%, H 7%, N 2%, S (no realizado). Al tomar el aspecto S y calcular el% de N presente sobre el% de N posible (2/3,5) = 57% de acoplamiento de grupos ligadores. Al tomar el aspecto S y calcular el% de N presente sobre el% de N posible (2/3,5) = 57% de acoplamiento de grupos ligadores. Por lo tanto, de todos los monómeros, ~40% contiene el grupo ligador.

Ejemplo 27: Preparación de polímero 27

Se preparó una solución de aminofenil fluoresceína (5 mg, 0,018 mmol) y HBTU (14 mg, 0,036 mmol) en DMF seca (2,0 mL). Se agregó CMC-PEG-NH2 (5-a) (0,13 mg, 0,036 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente durante alrededor de 24 horas protegida de la luz mediante el uso de una cubierta de papel de aluminio. El producto se filtró, se lavó con etanol (10 mL x 3) y DMF (5 x 10 mL) y posteriormente se concentró al vacío, lo que produjo un producto rojo/naranja sólido (27) (12,0 mg, 43%). FTIR (vmax/ cm-1) 3367 (N-H/ O-H), 2932 (C-H), 1702 (amida de APF), 1655 (CONH, amida del producto acoplado), 1555 (HNCO, CMC), 1494, 1437, 1413, 1387 (ar. flexión de C=C), 1106 (OCH<r>, alcoxi APF), 838, 759, 722, 557 (ar. flexión de CH).

Ejemplo 28: Preparación de polímero 28

Se agitó CMC-Cys (7) (10 mg, 0,029 mmol 1 eq.) a temperatura ambiente durante 1 hora con TCEP (16,8 mg, 0,058 mmol, 4 eq.) en agua desionizada (1 mL) para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro no deseados. El sólido se filtró y lavó con agua (10 mL x 3), se liofilizó y luego se lavó de nuevo con DMF (10 mL x 3). Se disolvió diacetato de fluoresceína -5- maleimida (12-a) (11 mg, 0,029 mmol, 1 eq.) en DMF seco (3 mL) y se agregó a CMC-CYS en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se protegió de la luz. El producto se lavó con agua (3 x 100 mL) y DMF (1 x 100 mL), lo que produjo un sólido ceroso opaco (28) (0,017 g, 85%). FTIR (vmax/ cm'1) 3365 (O-H), 2971/2910, (N-H, CH) 2883 (SH), 1728 (COOH, ácido), 1677 (CONH, amida), 1640 (HNCO, péptido), 1598 (HNCOO, CMC), 1409, 1371 (COO), 1307 (ar. flexión de C=C), 1216, 1019 (CN, amina terciaria); solubilidad insoluble en agua, amortiguador de fosfato de pH9 y solventes comunes de laboratorio (acetona, metanol, etanol, THF, DCM y DMF).

Ejemplo 29: Preparación de polímero 29

Se molió CMC-PEG-NH2 (15) (1,000 g, 2,27 mmol) en un polvo fino y se mezcló con DMF (15 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-C(StBu)-OH (1,14 g, 2,639 mmol, 1,2 eq.), HBTU (2,59 g, 6,8181 mmol) y DIPEA (1,19 mL, 6,8181 mmol) con agitación a temperatura ambiente, durante la noche. El producto se filtró y lavó con DCM (5 x 20 mL) y metanol (5 x 20 mL) y luego se redujo al vacío. El producto protegido se desprotegió entonces con StBu, repitiendo cada etapa de desprotección 3 veces cada vez antes de reducirse al vacío, lo que produjo un polvo sólido blanco (29-a) (0,236 g, 5%). Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 176,52 (C-8 de la proporción de CMC), 171,84 (C-8 , C-19), 156,45, 142,32, 127,85- 120,08 (C-Ar, Fmoc), 113,93, 103,26 (C-1), 82,60 (C-4), 74,50 (C-2, C-3, C-5), 69,92 (C-7), 61,45 (C-6 ), 54,93 (C-20), 49,52, 47,30, 41,58, 38.72-23,08 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-15, C-16, C-17, C-18, C-20); FTIR (vmax/ cm'1) 3310 (O-H), 2915 (N-H, C-H), 2868 (S-H), 1731 (COOH, ácido), 1650 (CONH, amida del producto acoplado), 1592 (HNCOO, CMC), 1538 (HNCOO, péptido), 1441, 1417, 1361 (COO), 1310 (ar. flexión de C=C), 1252 (estiramiento de CO de amida), 1031 (CN, amina terciaria), 841; EA esperado para producto desprotegido C:45,3%, H:7,5%, N:4,7%, S:7,1%, encontrado C:47,1%, H:7,8%, N:6,7%, S:10,1%, por lo tanto, el rendimiento de acoplamiento es de 11%; Solubilidad insoluble en agua y solventes comunes de laboratorio (acetona, metanol, etanol, THF, DCM y DMF), soluble en amortiguador de fosfato de pH9 a lo largo del tiempo; prueba de Ellman positiva.

Se agitó CMC-Cys (29-a) (75,4 mg, 0,147 mmol 3 eq.) a temperatura ambiente durante 1 hora con TCEP (168.5 mg, 0,196 mmol, 4 eq.) en agua desionizada (1 mL) para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro no deseados. El sólido se filtró y lavó con agua (10 mL x 3), se liofilizó y luego se lavó de nuevo con DMF (10 mL x 3). Se disolvió diacetato de fluoresceína -5- maleimida (12-a) (25,0 mg, 0,049 mmol, 1 eq.) en DMF seca (2 mL) y se agregó a CMC-PEG-NH-CYS (29-a) en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se protegió de la luz. La mezcla de reacción se redujo al vacío; el producto se lavó cinco veces con agua (~75 mL) y se liofilizó, lo que produjo un polvo de color blanquecino (29) (63,0 mg, 44%). Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 176,38 (C-8 de la proporción de CMC), 171,00 (C-8 , C-19, C-38), 153,12 (C-22), 141,67, 135,49-, 119,80 (C-Ar, Fmoc, fluoresceína), 102,43 (C-1), 81,92 (C-4), 74,47 (C-2, C-3, C-5), 70,30 (C-7), 68.61, 61,45 (C-6 ), 46,73 (C-42), 36,47- 29,48 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-15, C-16, C- 17, C-18, C-20); FTIR (vmax/ cm-1) 3315 (O-H), 2911 (N-H, C-H), 2869 (S-H), 1922, 1720 (COOR, éster conjugado, fluoresceína), 1647 (CONH, amida del producto acoplado), 1591 (HNCOO, CMC), 1542 (CONH, péptido), 1420, 1366/ 1309, (Ar. flexión de C=C), 1248 (estiramiento de C-O), 1213, 1050 (CN, amina terciaria), 842, 581 (ar. flexión de CH); EA esperado C:51,1%, H:5,8%, N:3,7%, S:2,1%, encontrado C:42,8%, H:7,0%, N: 4,0%, S:0,5%, por lo tanto, el rendimiento de acoplamiento es de 24%.

Se dispersaron fibras de NaCMC de DoS 0,3 (2,0 g, 8.33 mmol) en una solución de etanol: agua desionizada (80:20 v/v) (180 mL) para producir una suspensión al 1%. Se añadió resina de intercambio iónico monoesférico Dowex 650C con agitación durante 30 minutos. Las monoesferas se retiraron mediante filtración antes de añadir hidróxido de tetrabutilamonio (TBAH) al 40% (ac) en alícuotas de 0,1 mL hasta que el pH fue de 8-9 (3,0 mL, 1,16 mmol). Se agitó la solución resultante durante 30 minutos antes de reducirse al vacío. El material similar a una película se disolvió en DMF seca (100 mL) en una atmósfera de nitrógeno; fue necesario agitar y calentar suavemente durante la noche, lo que resultó en una solución viscosa similar a un gel con una textura uniforme. La solución se enfrió a alrededor de 4°C y se agregó CMP-I (1,48 g, 5,8 mmol) con agitación vigorosa. Se añadió 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (1,36 g, 9,17 mmol) a la reacción, junto con trietilamina seca (3 mL). La reacción se mantuvo a 4°C y se agitó durante un mínimo de 3 horas, después de lo cual el sólido se filtró y lavó con 99% de acetona (3 x 100 mL) y DCM (3 x 100 mL); se realizó ultrasonido durante 1 minuto durante cada ciclo de lavado para alentar a los grupos de fibras a desenredar y liberar cualquier contaminante. Se redujo el producto al vacío para producir un sólido fibroso blanco (30-a) (1,8 g, 60%). Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 176,93 (C-8 de la proporción de CMC), 171,96 (C-8), 153,41, 142,40, 104,11, (C-1), 96,80, 83,55 (C-4), 74,18 (C-2, C-3, C-5), 69,39 (C-7), 61,89 (C-6), 40,48 (ancho, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14); FTIR (vmax/ cm'1) 3325 (O-H), 2872 (N-H, C-H), 1648 (CONH, amida del producto acoplado), 1589 (HNCOO, CMC), 1543, 1408, 1367 (CHO), 1314, 1265 (estiramiento de CO de amida), 1022 (CN, amina terciaria), 896; EA esperado C:41,7%, H:7,0%, N:2,3%, encontrado C:42,6%, H:6,3%, N:2,9%, por lo tanto, el rendimiento de acoplamiento es de 127%; Solubilidad insoluble en agua y solventes comunes de laboratorio (acetona, metanol, etanol, THF, DCM y DMF), soluble en amortiguador de fosfato de pH9 y PBS a lo largo del tiempo; prueba de Kaiser positiva, 3,08 p.mol de amina.

Se mezcló CMC-PEG-NH2 en forma de fibra (30-a) (1,0 g, 2,86 mmol) con DMF (30 mL) durante 20 minutos. Se agregaron Fmoc-C(StBu)-OH (1,5 g, 3,5 mmol), HBTU (3,09 g, 8.14 mmol) y DIPEA (1,10 mL, 8.57 mmol) con agitación a temperatura ambiente, durante la noche. El producto se filtró y lavó con DCM (5 x 50 mL), metanol (5 x 50 mL), nuevamente con DCM (5 x 50 mL) y luego se redujo al vacío, lo que produjo un polvo sólido blanco (30-b) (1,23 g, 59%). NOTA: El producto protegido no fue desprotegido con Fmoc o StBu en esta etapa. Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 176,38 (pico pequeño, C-8 de la proporción de CMC), 171,93 (C-8, C-15), 156,28 (C-20), 141,73, 127,61- 120,01 (C-Ar, Fmoc), 104,17 (C-1), 96,81, 87,27, 82,86 (C-4), 74,29 (C-2, C-3, C-5), 69,17 (C-7), 62,17 (C-6), 60,00 (C-21), 54,22 (C-16), 46,87 (C-22), 46,87, 39,36- 29,49 (C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-17, C-19); FTIR (vmax/ cm-1) 3339 (O-H), 2872 (N-H, C-H), 1736 (COOH, ácido), 1648 (CONH, amida del producto acoplado), 1549 (HNCOO, CMC), 1419, 1363 (COO), 1201, 1031 (CN, amina terciaria), 841; EA esperado C:44,6%, H:6,7%, N: 1,6%, S:2,5%, encontrado C:46,0%, H:6,5%, N:2,2%, S: no hay suficiente material disponible; Solubilidad insoluble en agua y solventes comunes de laboratorio (acetona, metanol, etanol, THF, DCM y DMF), soluble en amortiguador de fosfato de pH9 a lo largo del tiempo; prueba de Ellman positiva.

Se agitó CMC-PEG-Cys(Fmoc)StBu en forma de fibra (30-b) (0,5965 g, 1,265 mmol) a temperatura ambiente durante 30 min con TCEP (1,45 g, 5,060 mmol, 4 eq) en agua desionizada (3 mL) para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro no deseados. El sólido se filtró y lavó con agua (10 mL x 3), se liofilizó y luego se lavó de nuevo con DMF (10 mL x 3). Se disolvió diacetato de fluoresceína -5- maleimida (12-a) (0,125 mg, 0,240 mmol, 1 eq.) en DMF seca (15 mL) y se agregó a CMC-PEG-NH-CYS en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se protegió de la luz. La mezcla de reacción se redujo al vacío; el producto se lavó con DCM (3 x 50 mL), metanol (3 x 50 mL) y se redujo al vacío. Las fibras sólidas blanquecinas se lavaron entonces con agua (5 x 75 mL), con calentamiento, agitación y ultrasonido suaves antes de filtrarse y liofilizarse, lo que produjo fibras sólidas de color blanquecino (30) (1,10 g, 72%). Estado sólido 13C RMN (10,000 Mhz, CP MAS) 174,88 (C-8 de la proporción de CMC), 172,30 (C-8, C-15, C-34), 141,36, 129,34- 126,65 (C-Ar, Fmoc, fluoresceína), 104,58 (C-1), 86,94, 82,52 (C-4), 78.56- 72,96 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69,74, 61,45, 60,35 (C-6), 38.69- 21,02 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14); FTIR (vmax/ cm-1) 3315 (O-H), 2868 (N-H, C-H), 1728 (COOR, éster conjugado, fluoresceína), 1647 (CONH, amida del producto acoplado), 1542 (CONH, amida de acoplamiento de péptido, NHCOO CMC), 1419, 1364, (Ar. flexión de C=C), 1264 (estiramiento de C-O), 1152 (OCH<r>), 1018 (CN, amina terciaria), 879; EA esperado C:50,9%, H:6,9%, N:5,5%, S:1,0%, encontrado C:30,8%, H:8.6%, N: 1,3%, S: <0,3%, por lo tanto, el rendimiento de acoplamiento es de 24%.

Ejemplo 30: Preparación de polímero 31

Se agitó CMC-PEG-Cys(Fmoc)StBu en forma de polvo (23-a) (525 mg, 439 mmol) a temperatura ambiente durante 30 min con TCEP (503,4 mg, 0,1756 mmol, 4 eq) en agua desionizada (23 mL) para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro no deseados. El sólido se filtró y lavó con agua (50 mL x 3), metanol (50 mL x 3), etanol (50 mL x 3) y luego nuevamente con agua (50 mL x 3), luego se liofilizó y luego se lavó de nuevo con DMF (50 mL x 3). Se disolvió fluoresceína-5-maleimida (25 mg, 59 mmol, 0,1 eq.) en DMF seca (70 mL) y se agregó a CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc) en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se protegió de la luz. La mezcla de reacción se redujo al vacío; el producto se lavó con DCM (3 x 50 mL), metanol (3 x 50 mL), agua desionizada (3 x 50 mL), de nuevo con 3 x 50 mL de DSM y de nuevo con metanol (3 x 50 mL) y metanol (3 x 50 mL), y se redujo al vacío, lo que produjo un sólido blanquecino (31) (436 mg, 68%). Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 176,70 (C-8 de la proporción de CMC, C-39, C-41), 171,39 (C-8, C-15, C-18, C-21, C-26, C-30, C-45), 153,37 (C-33, C-51), 142,19 (C-36, C-37, C-Ar), 127,57- 120,48 (C-Ar), 103,85 (C-1), 102,63 (C Ar), 97,55, 82,31 (C-4), 74,34 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69,85 (C-23), 60,80 (C-6, C-27), 52,23- 48.37 (C-16, C-19, C-25, C-35), 42,10 (C-9, C-14, C-38); 38.70-25,05 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14), 18.45 (C-17, C-20, C-29), 14,11; FTIR (vmax/ cm’1) 3340/3294 (O-H), 2914/ 2862 (N-H, C-H), 1737 (COOH, ácido), 1645 (CONH, amida del producto acoplado/ COOR, éster conjugado, fluoresceína), 1593 (HNCOO, CMC), 1543 (CONH, péptido), 1414, 1375 (COO), 1343 (ar. flexión de C=C), 1262 (estiramiento de C-O), 1230, 1056 (CN, amina terciaria/ OCHR), 897, 841, 764 , 556 (ar. flexión de CH); EA esperado C:53,4%, H:6,0%, N:5,4%, S:1,5%, encontrado C:47,1%, H:6,7%, N: 4,1%, S:0,8%, por lo tanto, la conversión de acoplamiento es del 52%.

Ejemplo 32: Preparación de polímero 32

Se agitó CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc)StBu en forma de polvo (23-a) (175 mg, 146 mmol) a temperatura ambiente durante 30 min con TCEP (168 mg, 585 mmol, 4 eq) en agua desionizada (23 mL) para desacoplar cualesquiera enlaces disulfuro no deseados. El sólido se filtró y lavó con agua (50 mL x 3), metanol (50 mL x 3), etanol (50 mL x 3) y luego nuevamente con agua (50 mL x 3), luego se liofilizó y luego se lavó de nuevo con DMF (50 mL x 3). Se disolvió N-bromofenil maleimida (37 mg, 0146 mmol, 1 eq.) en D<m>F seca (20 mL) y se agregó a la CMC-PEG-NH-AAPVC(Fmoc) en una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se protegió de la luz. La mezcla de reacción se redujo al vacío; el producto se lavó con DCM (3 x 50 mL), metanol (3 x 50 mL), agua desionizada (3 x 50 mL), de nuevo con 3 x 50 mL de DSM y de nuevo con metanol (3 x 50 mL) y metanol (3 x 50 mL), y se redujo al vacío, lo que produjo un sólido blanquecino (32) (129 mg, 69%). Estado sólido 13C RMN (10,000 MHz, CP MAS) 171,16 (C-8, C-15, C-18, C-21, C-26, C-30, C-38, C-39), 153,33 (C-32), 142,03, 127,45-113,03 (C-Ar, Fmoc, fluoresceína), 102,74 (C-1), 97,09, 82,15 (C-4), 74,39 (C-2, C-3, C-5, C-7), 69,84, 61,21, 57,42 (C-6 , C-31), 47,91 (C-16, C-19, C-27), 38.76- 22,56 (C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14), 18.33-14,16 (C-17, C-20, C-29); FTIR (vmax/ cm'1) 3322 (O-H), 2901/ 2872 (N-H, C-H), 2103, 1788 (COOH, ácido), 1644 (CONH, amida del producto acoplado/ COOR, éster conjugado, fluoresceína), 1594 (HNCOO, CMC), 1544/ 1514 (CONH, péptido), 1349/1304 (ar. flexión de C=C), 1251 (flexión de C=C), 1230, 1025 (c N, amina terciaria/ OCHR), 898, 843, 738, 556 (ar. flexión de CH); EA esperado C:50,0%, H:6,1%, N:6,1%, S:1,8%, Br: 4,3% encontrado C:46,3%, H:6,7%, N: 5,2%, S:0,33%, Br: ninguno detectado, por lo tanto, la conversión de acoplamiento es del 17%.

Ejemplo 33

Escisión de enzimas/proteasas de péptidos

Se evaluó la actividad de proteasas específicas de la herida, que incluyen otras proteasas tales como tripsina, quimotripsina y termolisina. La tripsina escinde P1-P1', en donde P1 es Lys o Arg, y P1' no es específica (excepto cuando está seguida de prolina). La quimotripsina escinde P1-P1' en donde P1 es cualquier residuo amino aromático, Trp, Tyr o Phe, y P1' no es específica. La termolisina es una metaloendopeptidasa que escinde P2-P1-P1'-P2' en donde P1 no es específica, P1' es Leu, Phe, Ile, Val, Met, Ala y P2' no es Pro.

Las esterasas hidrolizan los enlaces éster de los ésteres de ácido carboxílico y, por lo tanto, se comportan de forma diferente a las proteasas, que hidrolizan específicamente las secuencias de aminoácidos. El sustrato usado para los ensayos enzimáticos es CMC-PEG-NH-Phe-Phe-Lys (Dabsyl) y la actividad enzimática se determinó mediante el uso de un método basado en UV-visible. La secuencia de Phe-Phe-Lys (Dabsyl) debería hidrolizarse mediante quimotripsina. Tripsina se usó como un control negativo ya que no debería escindir esta secuencia.

Se analizó la actividad de las enzimas en el sustrato CMC-PEG-NH-Cys-diacetato de fluoresceína maleimida mediante el uso de microscopía de fluorescencia confocal. Las partículas sólidas se observaron primero por sí solas y luego después de la adición de la solución de esterasa (~50 unidades/mL). Las imágenes de microscopía demuestran el aumento de fluorescencia observado cuando se agregó la solución de enzima a la muestra. La ventaja de usar este método es que se pueden visualizar las partículas y observar una diferencia en la intensidad de fluorescencia con la adición de una solución de enzima, que confirma el acoplamiento del diacetato de fluoresceína al polímero de CMC. Alternativamente, los lectores de múltiples placas se pueden usar para evaluar la escisión de los sustratos y los resultados cuantificados con la cinética de Michaelis-Menton.

En un experimento, se midió el efecto de la esterasa en el polvo de CMC-PEG-NH-Cys-diacetato de fluoresceína maleimida. En primer lugar, se dispersó polvo de CMC-PEG-NH-Cys-diacetato de fluoresceína maleimida (0,2 mg) en PBS (320 j L). Se requirió ultrasonido, mezcla con vórtex y calentamiento suave para dispersar el compuesto. Se agregaron 40<j>L de suspensión de sustrato a los pocillos de una placa de 96 pocillos, luego se agregó solución de esterasa débil (58 U/mL), solución de esterasa fuerte (116 U/mL) o PBS (control negativo) (40<j>L por pocillo). Se seleccionó un período de ciclo de 5 minutos durante 2 horas para tomar mediciones de fluorescencia.

Era de importancia usar dos concentraciones diferentes de la solución de esterasa para poder analizar cualquier diferencia en la velocidad de reacción. Se calculó el cambio en la intensidad de fluorescencia al deducir la lectura de punto de tiempo cero (valor inicial) a partir de cada punto de tiempo posterior.

Se observó un aumento de la fluorescencia en muestras incubadas con soluciones de esterasa débil (58 U/mL) y fuerte (116 U/mL), que aumentó con el tiempo. La solución de esterasa fuerte mostró un aumento de 3,5 veces la velocidad de la solución de esterasa débil antes de alcanzar el punto de saturación a alrededor de los 30 minutos (intensidad de 45000 unidades).

Efecto de la longitud del espaciador

Con el fin de investigar el efecto de una longitud de cadena de PEG más larga en el ensayo de esterasa, se registraron las mediciones de fluorescencia para 77 (diacetato de fluoresceína maleimida-PEG-NH-Cys (Fmoc) de CMC-"más largo"). En esta prueba, se realizaron 4 réplicas por muestra y se registraron ciclos de un minuto durante un período de tiempo de dos horas. Al igual que con el sustrato más corto, incubar el sustrato más largo (77) con la esterasa trajo como resultado la detección de fluorescencia. Las muestras de esterasa de 116 U/mL (fuertes) alcanzaron su punto máximo después de 40 minutos; las muestras de esterasa de 58 U/mL (débiles) alcanzaron su punto máximo después de 80 minutos. La velocidad de la reacción de esterasa de 116 U/mL fue del doble que la de la muestra de 58 U/mL, por lo que duplicar la concentración de la enzima provocó una duplicación de la velocidad. Las velocidades de reacción fueron significativamente menores que las del equivalente de ligador PEG más corto. Se esperaba esta reducción ya que la carga del péptido en la CMC era menor.

Incubar CMC-PEG-NH-Cys(Fmoc)-diacetato de fluoresceína maleimida (82) en forma de fibra con esterasa también genera resultados similares, en donde ambas soluciones de esterasa (58 y 116 U/mL) conducen a un aumento de la fluorescencia con el tiempo y una mayor velocidad de generación de productos fluorescentes a razón de mayores concentraciones de enzimas.

Escisión de CMC-PEG-NH-AAPVC-fluoresceína maleimida (forma de polvo, fibra de alginato e hidrocoloide) con elastasa: la secuencia de péptido AAPV es un sustrato para elastasa, con sitios previstos de escisión en P1 de Ala y Val. Para los compuestos que contenían esta secuencia de AAPV, se realizó un ensayo de elastasa de manera similar a los ensayos de esterasa. Se pusieron a prueba tres formas de sustratos: (a) forma de polvo; (b) alginato hilado húmedo con el compuesto en forma de fibra, y (c) gel hidrocoloide que contiene ya sea 0 ,8% u 8% del compuesto.

La incubación del compuesto solo con elastasa mostró un claro aumento en la fluorescencia a lo largo del tiempo. También se realizó el mismo experimento para evaluar el efecto de agregar una solución de elastasa en un gel hidrocoloide con 0,8% y 8% de carga de CMC-PEG-NH-AAPVC-fluoresceína de maleimida, en forma de polvo. Los resultados mostraron un aumento en la fluorescencia a lo largo del tiempo para los geles hidrocoloides cargados con CMC modificada en comparación con el control (gel hidrocoloide solo). El nivel de carga más elevado (8%) fue considerablemente más fluorescente que la muestra de carga inferior (0,8%). Se pusieron a prueba dos concentraciones diferentes de enzima; en este caso, solo hubo un ligero aumento de la fluorescencia de las muestras cuando se usó la solución de elastasa fuerte (0,5 mg/mL) en comparación con la solución de elastasa débil (0,1 mg/mL). Esto sugiere que la elastasa estaba en exceso incluso a 0,1 mg/mL y que el uso de CMC modificada tiene un efecto más significativo sobre la respuesta de fluorescencia.

Análisis de LC-MS de fragmentos escindidos

Se preparó un experimento para tratar de caracterizar los fragmentos producidos al agregar elastasa a CMC-PEG-NH-AAPVC-fluoresceína maleimida, en forma de polvo. Se agregó elastasa (0,5 mg/mL en PBS) a 78 y se incubó a 37°C; se recogieron alícuotas durante varios puntos de tiempo (1 minuto a 3 horas) y se conservaron al congelarlas inmediatamente en nitrógeno líquido. Se realizó HPLC en cada alícuota descongelada para separar los fragmentos y luego se realizó una espectrometría de masas para analizar su masa. El análisis confirmó la presencia de los fragmentos escindidos esperados durante la incubación con elastasa. Como se predijo, los sitios de escisión estaban en P1 de Ala y Val. Además, había alguna evidencia de fragmentos Pro; esto sugeriría que un sitio de escisión adicional en la posición P1 de Pro. Este resultado concuerda con el aumento de la fluorescencia registrado durante los ensayos de fluorímetros y además agrega evidencia de que el sistema es capaz de detectar enzimas específicas y dar una señal detectable.

Ejemplo 34

Estudios celulares: biocompatibilidad de dispositivos médicos

Un aspecto importante a considerar al diseñar un dispositivo médico es su seguridad biológica y otros factores tales como citotoxicidad, sensibilización, hemocompatibilidad, pirogenicidad, implantación, genotoxicidad, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva y del desarrollo, biodegradación, etc. El estudio de las interacciones entre nuevos materiales y células cultivadas in vitro pueden ofrecer un buen indicio de la toxicidad de estos materiales, y, por lo tanto, se usa una variedad de estos métodos (Eisenbrand et al.,Food Chem. Toxicol.2002, 40, 193-236). Se debe seleccionar un tipo de célula adecuado para que la prueba sea apropiada para el área del cuerpo y función relacionados con el uso final del dispositivo. El método puede ser cuantitativo o puramente visual, y las técnicas modernas permiten un punto de vista sofisticado de las interacciones celulares, como el uso de imágenes de video de lapso de tiempo de las células a través de un microscopio.

Células de relevancia para la cicatrización: las células de fibroblastos son importantes en el proceso de cicatrización. Comienzan a migrar hacia el lecho de la herida alrededor de 24 horas después de la lesión durante las últimas etapas de la fase inflamatoria. Modifican el entorno de la herida a lo largo de las fases de proliferación y epitelización mediante la producción de mediadores que incluyen proteasas como las MMP. Finalmente, los niveles de fibroblastos vuelven a los niveles normales en la etapa de remodelación y una vez que la nueva matriz extracelular de herida ha alcanzado una concentración suficiente (Bainbridge et al., J. Wound Care 2013, 22, 407-408). Por lo tanto, los fibroblastos son una línea celular adecuada para usar cuando se imita el proceso de cicatrización.

Metodología in vitro usada: se usaron dos métodos de células in vitro para seleccionar los materiales de CMC modificada con péptidos para obtener una idea inicial de su biocompatibilidad.

Fuente y cultivo de fibroblastos dérmicos humanos: los fibroblastos dérmicos humanos se habían aislado y almacenado previamente en condiciones apropiadas.

Se habían obtenido cultivos de fibroblastos normales con el consentimiento informado de los pacientes. Se excluyeron del estudio los pacientes con diabetes, inmunosupresión sistémica o evidencia de infección local. Tres líneas celulares de pacientes estaban disponibles para este estudio: pacientes A, F y G. Se tomó una biopsia de 6 mm del muslo del paciente. Se establecieron los cultivos mediante una técnica de suspensión de células individuales después de la degradación enzimática de las muestras. Brevemente, se incubó el tejido durante la noche con Dispase (2 mg/mL, Boehringer Mannheim, Lewes, Reino Unido) para separar el tejido epidérmico del tejido dérmico. Se desagregaron entonces las muestras de tejido dérmico durante la noche mediante la colagenasa bacteriana Clostridium histoliticum A (1 mg/mL, Boehringer Mannheim). Se mantuvieron los cultivos de fibroblastos en un medio que contiene suero fibroblástico (F-SCM) que contiene medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esenciales (1x), antibióticos (100 U/mL de penicilina G; 100 mg/mL de sulfato de estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B) y 1% (v/v) de suero fetal de ternero (FCS). Se mantuvieron los cultivos a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. En la confluencia, los fibroblastos se tripsinizaron y se volvieron a sembrar (1,5 x 105 células por matraz T75).

Metodología de ensayo de raspado de fibroblastos:

El ensayo de raspado es una técnica en la que una monocapa confluente de fibroblastos se cultiva en una superficie plana, luego esta superficie se "raspa" o "hiere" para crear un canal que separa dos áreas de células de fibroblastos. Se agrega la solución de muestra a la parte superior de las células y se supervisa el canal a lo largo del tiempo mediante microscopía confocal para ver cómo responden las células (Liang et al., Nat. Protocols 2007, 2, 329-333). Si el área circundante que contiene la muestra es propicio para las células, las células proliferarán y migrarán para llenar el canal durante el período de tiempo; si la muestra no es propicia, las células no migrarán y morirán.

Las células de fibroblastos dérmicos humanos se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (2 x 104 células por pocillo), se cultivaron hasta una confluencia del 80-90% y las monocapas se hirieron al raspar a lo largo de la superficie del plástico de cultivo de tejidos con una punta de pipeta de 200 pL. Las monocapas se lavaron con PBS y los compuestos se agregaron a razón de 0,66 mg/mL o 0,066 mg/mL en DMEM. Las células se volvieron a alimentar con F-SCM y se incubaron en condiciones de cultivo estándar en la etapa motorizada, calentada y gaseada de un microscopio confocal con sistema Cell-IQ.

Se recolectaron imágenes cada 20 minutos y se crearon películas mediante el uso del software Cell-IQ. Se completaron ensayos por triplicado para cada línea celular; Paciente A, F y G.

Metodología del modelo de matriz de colágeno:

Un modelo de matriz de colágeno es una herramientain vitroque representa la dermis durante la fase de reorganización de la cicatrización. En la presente, se usó una serie de redes de colágeno pobladas de fibroblastos (FPCL) para comparar las celulosas modificadas con péptidos con un control en términos de su efecto sobre la reorganización de las matrices de colágeno. En condiciones normales, cabría esperar que los FPCL se redujeran en diámetro debido a la reorganización de los fibroblastos, lo que demuestra que los procesos celulares avanzan de forma normal y que puede producirse una "cicatrización" (Carlson et al.,Wound Repair Regen.2004, 12, 134-147). Se usaron los fibroblastos derivados del cultivo por tripsinización para construir las redes de colágeno pobladas de fibroblastos (FPCL). El colágeno de cola de rata de tipo I se adquirió de First Link. Se agregaron 1,5 * 105 fibroblastos (en 750 pL de F-SCM) a placas bacteriológicas de 60 mm que contenían 2 * DMEM (40 partes 10 * DMEM, 10 partes de NaHCO3 (7,5% (p / v)), 4 partes de L-glutamina (200 mM), 4 partes de aminoácidos no esenciales (100 *), 140 partes de H20 y 5 partes de NaOH (1 M); 3 mL), 0,1 M de NaOH (750 pL), FCS (750 pL), 2,25 mL de colágeno de tipo I (1,7 mg/mL) y los compuestos de prueba (0,66 mg/mL). Se incubaron las placas a 37°C durante 60 minutos para permitir la polimerización del colágeno. Luego se separaron del borde de la placa y se agregaron 2 mL de F-SCM. Los FPCL se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%.

Se retuvo una forma circular durante el proceso de reorganización de FPCL, lo que permite medir el diámetro de las FPCL en los días 3 y 7. Para cada muestra, se realizaron experimentos en células de tres muestras diferentes de pacientes (n = 3).

Se pusieron a prueba siete materiales de CMC modificada junto con polvo de CMC y fibra de CMC a modo de valor inicial (tabla 3).

Tabla 3: Compuestos analizados durante la prueba celularin vitro

Resultados del ensayo de raspado de fibroblastos:

En general, los fibroblastos permanecieron viables y proliferaron para llenar el canal de raspado durante el período de prueba. Los resultados (figura 5) muestran el tiempo que tardan los fibroblastos en cerrar completamente el canal de raspado. Como se muestra en la figura 5, todas las muestras cerraron el canal dentro de las 70 horas. Se usó como referencia la muestra en polvo de CMC, ya que se sabe que es segura para su uso en aplicaciones de contacto con heridas. La fibra de CMC-PEG-NH2 era la única muestra en la que el raspado se cerró en un período de tiempo más corto que el control. El tiempo para cerrar el raspado del polvo de CMC-PEG-NH2 resultó más o menos equivalente al de las otras muestras de CMC modificada (~40 - 60 horas), lo que sugiere que las células pueden tener cierta preferencia por la estructura física de la muestra en forma de fibra.

Los raspados para el paciente A que contenía 0,066 mg/mL de 12, polvo de CMC-PEG-NH2 (figuras 6A-6 D) y el paciente A que contenía 0,66 mg/mL de 12, polvo de CMC-PEG-NH2 (figuras 7A-7D) se cerraron ambos por encima del tiempo a medida que los fibroblastos se replicaban y migraban al canal. Estas imágenes muestran que las células de fibroblastos no se ven afectadas por la insolubilidad de la muestra o la mayor concentración de la muestra y que aún pueden prosperar dentro y alrededor de la CMC modificada. Las figuras 6A y 7D son representativas de las observaciones de casi todas las pruebas realizadas en todas las muestras y líneas celulares de los pacientes A, F y G. Aunque el polvo de PEG-NH2 más largo en términos de CMC (No. 83) generó resultados anómalos en un estudio, cuando se repitió la prueba con muestras obtenidas de tres pacientes diferentes, los fibroblastos sí proliferaron y migraron.

Ejemplo 35: Modelo de matriz de colágeno

Durante los estudios del modelo de matriz de colágeno, las células de fibroblastos permanecieron viables en todas las muestras. Comparado con el control, se observó solo una reorganización ligeramente menor en las muestras de CMC modificada con la excepción de 83, polvo de PEG-NH2 más largo en términos de CMC, que mostró solo una reorganización limitada de fibroblastos mediante la prueba en comparación con las otras muestras (figuras 8 - 10 ). Se observó una diferencia significativa entre el compuesto 83 (polvo de PEG-NH2 más largo en términos de CMC; diámetro de red que va de alrededor de 40 mm a 60 mm el día 7) y el compuesto 12 (polvo de CMC-PEG-NH2; diámetro de red de alrededor de 15 mm-35 mm en el día 7); los resultados son evidentes a partir de las figuras 8-10, Los datos sin procesar, que son evidentes a partir de las fotografías de las figuras 11-13, muestran el efecto de cada uno de los compuestos 12, 83, 81, 74, 78, 80, polvo de CMC y fibra de CMC en el diámetro de red en los días 3 y 7 en muestras de células obtenidas de los pacientes A (figura 11), B (figura 12) y C (figura 13), respectivamente.Conclusión

El estudio demuestra que los materiales de CMC modificada no eran tóxicos para las células de fibroblastos. Además, no hubo diferencia entre los formatos de fibra y polvo, los ligadores espaciadores de PEG más largos o más cortos, o la adición de péptidos y los fragmentos detectables. Los fibroblastos sobrevivieron en todos los casos durante el modelo de matriz de colágeno; la reorganización fue solo un poco más lenta que el control para la mayoría de las muestras, excepto el polvo de PEG-NH2 más largo en términos de CMC, 83, que exhibió un efecto atenuado en comparación con otros compuestos.

Ejemplo 36 Estudios de cristal líquido (LC)

Disposición experimental de cristal líquido

Se realizó un estudio durante el cual se colocó gel de CMC sobre 5CB de cristal líquido y se supervisó el anclaje a lo largo del tiempo mediante un microscopio de polarización. Para preparar un estudio de LC, es necesario crear una cámara para permitir que el LC se mantenga dentro de un área determinada y para permitir la visualización mediante el uso de un microscopio de polarización. El confinamiento de la cuadrícula de TEM de 5CB se implementó de acuerdo con estudios publicados (Nazarenko et al.,Physical Review E 1999,60, R3495-R3497, Brake et al.,Langmuir2003, 19, 6436-6442).

Para crear un sistema experimental de cuadrícula de 5CB-TEM, primero el portaobjetos de vidrio, usado como una base, está preferiblemente libre de impurezas tales como grasa. La limpieza se realizó con la solución piraña, un fuerte agente oxidante que elimina toda la materia orgánica del vidrio. Debido a la fuerte naturaleza oxidante de la solución piraña, se tomaron precauciones adecuadas de seguridad para evitar el contacto con la piel y también evitar una explosión.

Se agregó ácido sulfúrico concentrado (~30 mL, grado 98%) a un recipiente que contenía el vidrio a limpiar, seguido de la adición lenta de peróxido de hidrógeno (~10 mL, 30%), y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se vertió la solución piraña y se lavó minuciosamente el vidrio con agua y alcohol. Finalmente, se neutralizó cuidadosamente la solución piraña de desecho. A continuación, se recubrió el vidrio con octadeciltriclorosilano (OTS). OTS es una molécula anfifílica de autoensamblaje de cadena larga que recubrirá la superficie del portaobjetos de vidrio y la volverá hidrófoba. Por lo tanto, 5CB se alinea con el anclaje homeotrópico a lo largo de la base de la cámara. Se colocaron las cuadrículas de TEM sobre el vidrio recubierto con OTS para que la cuadrícula para las soluciones de LC se mantenga dentro. Se agregó 5CB con cuidado a las cuadrículas de TEM mediante el uso de un tubo capilar para garantizar que cada cuadrícula esté suficientemente llena, pero no llena de más, como para crear un domo de solución en la parte superior de la cuadrícula. Al agregar 5CB a la cuadrícula de TEM, se verificó la alineación de 5CB mediante el uso de la lente polarizada cruzada de un microscopio óptico. 5CB es homeotrópico en esta etapa, lo que se debe a la alineación de los LC con el portaobjetos de vidrio recubierto con OTS.

El principio de detección de enzimas se basa en el cambio de la orientación de LC, tras la liberación de un lípido, por ejemplo DLPC. Se muestra un sistema potencial que usa CMC modificada con péptidos y LC de esta manera en la figura 14. A tales efectos, las figuras 15A-15D muestran micrografías que muestran cuadrículas de TEM llenas de 5CB tras la aplicación de gel de CMC.

Otras realizaciones

Se pueden repetir los ejemplos anteriores al sustituir los reactivos descritos genérica o específicamente y/o las condiciones de funcionamiento de la tecnología descrita por los usados en los ejemplos precedentes.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia de nivel medio. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden usar en la puesta en práctica o a prueba de la tecnología descrita, se describen métodos y materiales adecuados en los párrafos anteriores. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. En caso de conflicto, la presente descripción, incluidas las definiciones, prevalecerá.

Si bien se han mostrado y descrito en la presente realizaciones preferidas de la tecnología descrita, será obvio para las experto en la materia de nivel medio que las realizaciones solamente se proporcionan a modo de ejemplo. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la tecnología descrita.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un apósito para heridas que comprende un material para apósitos que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

en donde n = 200-4000.
2. Un apósito para heridas según la reivindicación 1, para uso en un método de tratamiento o diagnóstico de una herida.