KR20010049506A - 동시 포워드 및 리버스 аво 혈액군 측정방법 - Google Patents

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Abstract

육안 검출 시스템과 형광을 기본으로 하는 표지 검출 시스템 둘 다를 사용하는 동시 포워드 및 리버스 혈액형 분류 시험(simultaneous forward and reverse blood group testing)이 기재되어 있다. 포워드 및 리버스 시험을 개별적으로 수행할 수 있지만, A 및 B 응집체를 동시에 검출 및 판별할 수 있다.

Description

동시 포워드 및 리버스 АВО 혈액군 측정방법 {Simultaneous determination of forward and reverse ABO blood group}
본원에는 각종 특허 및 논문이 참조되어 있다. 본원에 기재 및 청구된 발명의 현재 시점에서 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기술의 상태를 더욱 충분히 기재하기 위해 이들 전문을 참조로 인용한다.
본 발명은 혈액군 측정 분야, 특히 포워드 및 리버스 혈액군(forward and reverse blood group) 시험의 동시 측정에 관한 것이다.
혈액군 혈액 시험은 환자와 관련된 수혈 또는 조직 이식 전에 혈액 제공자와 수혈자인 환자 사이의 혈액 세포 적합성(compatability) 측정을 필요로 한다. 혈액 세포의 적합성은 환자의 혈청에 함유된 항체와 혈액 제공자의 혈액 세포 상에 존재하는 항원 사이에 면역학적 반응이 일어나지 않는 것을 기준으로 하여 결정한다.
모든 개체의 적혈구 표면에 다수의 상이한 혈액군 항원이 발견되었다. 유전되는 이들 항원은 일란성 쌍둥이를 제외한 모든 개체 간에 유일한 것으로 생각되는 조합으로 존재한다. 혈액형 분류(blood grouping)는 일반적으로 시험할 항원에 대한 항체를 사용하여 어떠한 항원이 존재하고 부재하는지를 결정하기 위해 적혈구를 시험하는 방법이다. 또한, 적혈구 상에 특정 적혈구 항원을 갖지 않는 경우, 혈청이 당해 항원에 대한 항체를 함유할 수 있다. 혈청 중의 항체의 존재 여부는 이전에 개인의 면역 시스템이 특정 항원 또는 이와 매우 유사한 것의 공격을 받고 이에 반응하였는지의 여부에 따라 달라진다. 예를 들면, 적혈구가 A형인 사람, 즉 적혈구 상에 "A" 항원을 갖는 사람은 혈청 중에 항-B 항체를 갖는다. 따라서, 이러한 개인이 B형 혈액을 제공받는 경우, 심각한 임상학적 결과가 나타날 가능성과 함께 면역학적 반응이 일어난다.
추가의 고려 사항으로서, 사람 신체가 화분, 식품, 세균 및 바이러스의 항원에 끊임없이 노출된다는 것을 주목해야 한다. 명백하게도 이들 "천연" 항원 중 일부는 사람 혈액군 항원과 매우 유사하여 항체를 생산할 수 있는 거의 모든 사람들이 항체를 생산하도록 자극한다. 따라서, 적혈구가 역항원(reciprocal antigen)을 갖지 않는 사람의 혈청에 특정 항체가 존재할 것으로 예상된다. 이것은 특히 ABO 시스템에 적용된다. 따라서, 종종 환자/공급자 혈청에 대해 제2 확인 시험을 수행한다. 혈청 중의 ABO 혈액군 시스템의 예상되는 항체에 대한 시험을 "리버스" 혈액형 분류라 지칭한다.
ABO 혈액형 분류 시스템의 항체는 일반적으로 면역 글로불린 M(IgM)이다. 이들 항체는 분자당 10개의 항원 결합 부위를 갖는다. IgM 항체는 적혈구들 사이의 거리에 닿을 정도로 충분히 크기 때문에, 이들을 원심분리하는 경우, 이들 세포는 "세포-항체-세포-항체" 격자에 함께 결합되고 응집체 중에 함께 덩어리 상태로 남게 된다. 예를 들면, 항-A를 혈액군 A 또는 혈액군 AB 세포에 가하고 혼합물을 원심분리하는 경우, 이들 세포를 재현탁시키는 경우에 덩어리로 남게 된다. 동일한 항체의 경우, O군 및 B군 세포는 각각의 세포로서 재현탁된다. 한가지 항체, 예를 들면, IgM 항체에 의해 유도된 응집을 직접 응집이라 지칭한다.
수혈 분야에서, 위에 기재된 이유 때문에 가장 빈번하게 수행되는 시험은 ABO 혈액군의 측정이다. 당해 분야의 현 기술은 적혈구 상의 A, B 및 간혹 A+B 항원을 개별적으로 시험하는 것(포워드 유형)과 혈청 또는 혈장 중의 항-A 및 항-B 항체에 대한 확인(교차-체크) 시험(리버스 유형)이다. 따라서, 최소 4가지의 개별적인 시험을 수행하지만, 보통 7가지의 개별적인 시험(적혈구 샘플 상의 A, B, A+B 항원 및 A1, A2, B, O 시약 적혈구를 사용한 혈청/혈장 샘플 중의 항-A와 항-B)을 수행한다. 각각의 혈액형 분류 실험(포워드 유형 및 리버스 유형)의 결과가 일치해야 한다. 따라서, 미국에서만 혈액 센터에서 혈액군을 측정하기 위해 연간 약 1억 4백만회의 시험을 수행하고 있다.
1900년대 초반 이후, 아쉬비(Ashby)[참조: J. Exp. Med. 29:267(1919)]와 쿰브스(Coombs)[참조: Brit. J. Exp. Pathol. 26:255(1945)]의 연구와 함께 "란트슈타이너(Landsteiner)"법[참조: Science, 73:405(1931), Landsteiner]으로서 공지된 일반적인 접근방법은 혈액군 항체(예: 항-A 또는 항-B)를 함유하는 표준 실험실 시험관에 환자의 적혈구를 넣고 혼합하여 항체/항원 결합 반응이 일어나도록 한 후, 원심분리하는 것이었다. 시험할 항원이 존재하는 경우, 항체/항원 결합이 일어나 환자의 적혈구가 응집된다. 시험관을 손으로 흔들어 저부의 "덩어리진" 세포의 원심분리된 버튼(button)을 제거한다. 이어서, 제거된 세포가 "덩어리진" 것인지 아닌지의 여부와 어느 정도로 덩어리진 것인지를 주관적으로 결정한다.
1900년대 중반 동안에는, 이러한 기술을 단순화하여 시험의 주 특성을 최소화하고 실패율을 감소시켰다. 적합성 시험결과는 비흡수성이거나 특정 경우에는 흡수성인 습윤성 시험 슬라이드 또는 일부 이상의 표면에 필수적인 면역화학적 시약을 갖는 시험 카드를 사용하여 다소 영구적으로 기록할 수 있는 것으로 인식된다. 이와 관련하여, 미국 특허 제2,770,572호, 제2,850,430호, 제3,074,853호, 제3,272,319호, 제3,424,558호, 제3,502,437호, 제3,666,42호 및 유럽 특허원 제#0 104 881-A2호에는, 당해 시험 카드 및 관련된 장치의 예를 선택하는 것이 기재되어 있다. 마이크로플레이트 내에서의 혈액형 분류의 이점은 다수의 샘플 조작의 용이함, 기구 및 결과의 컴파일화 및 처리를 위한 컴퓨터 인테페이싱을 사용한 응집 반응의 객관적인 측정을 포함한다. 컴퓨터로 제어되는 로보트와 고출력 분광광도 판독기를 포함하는 다수의 값비싼 전용 시스템이 혈액 은행 자동화를 위해 도입었다[참조: Transfusion 33:384(1992), Chung, et al.].
겔 형태의 시약으로 충전된 특수 마이크로튜브 내의 적혈구 항원 및 항체 반응의 검출율이 향상된 혈액형 분류 키트 제품이 도입되었다[참조: Transfusion 30:109(1990), Lapierre, et al.]. 스코트(Scott)[참조: Transfusion Med. Rev. 5:60(1991)]는 혈액형 분류를 위한 종말점으로서 적혈구 응집 반응을 사용하는 데 있어서의 근본적인 문제를 극복하기 위한 고체 상 기술을 사용하는 것을 검토하였다. 최근, 그로웨(Growe) 등[참조: Transfusion Med. Rev. 10:44(1996)]은 혈액 센터 뿐만 아니라 병원 수혈 시험실에서 사용할 수 있는, RBC 항원의 자동화된 혈액형 분류와 혈청 항체 스크린 과정의 실행 및 용도를 보고하였다. 샘플의 혈액군을 측정하는 이들 방법에서는 특정 혈액형 분류 시약과 함께 7가지 이상의 상이한 웰을 사용해야 한다. 대규모 혈액형 분류에 사용되는 모든 방법은 필수적으로 응집을 기본으로 하며 하나의 튜브/웰 속에서 단지 하나의 항원 또는 항체 유형을 측정하기 위한 것이었다. 형광 표지된 시약을 사용하는 개별적으로 동정가능한 반응이 혈액형 분류에 사용되는 것으로 또한 보고되어 있다[참조: 미국 특허 제4,550,017호 및 제4,748,129호].
현재의 방법들은 종말점으로서 적혈구 응집을 이용한다. 위에서 논의한 바와 같이, 이것은 슬라이드 표면 상의 시험관, 마이크로플레이트 및 컬럼 응집 시험에서 수행된다. 마이크로플레이트와 컬럼 응집 시험의 두 가지 방법은 수동적으로 수행되거나 자동화 장치에 의해 수행될 수 있다. 모든 방법은 포워드 및 리버스 유형 둘다를 수행하는 데 세포로부터 혈청(또는 혈장)을 분리함을 필요로 한다.
본 발명의 목적은 혈액 샘플을 분리하지 않고, ABO 혈액군의 포워드 및 리버스 시험을 동시에 수행함으로써 혈액 검사 횟수를 감소시키는 것이다.
도 1은 동시 포워드 및 리버스 ABO 혈액군 분류의 4가지 색상 레이저 주사 혈구 분석법(laser scanning cytometry)을 도시한 그래프이다.
도 2는 동시 포워드 및 리버스 혈액형 분류의 예상되는 결과를 도시한 것이다.
도 3은 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 각각 상이한 산란을 나타내는 녹색 응집체, 오렌지색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체를 도시한 것이다.
도 4는 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 오렌지색 응집체, 녹색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체의 상대적 위치를 도시한 것이다.
도 5는 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 오렌지색 응집체, 녹색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체의 상대적 위치(밀도)를 도시한 것이다.
도 6은 CAT 시스템에서의 B 혈장의 리버스 시험의 육안 검출을 도시한 것이다. 표지된 시약 A 및 B 세포를 B 혈장과 혼합하면 갈색 응집체가 형성되며, 이것은 원심분리 후, CAT 시스템의 겔 컬럼 상부에서 관찰된다. 반응하지 않은 표지된 시약 B 세포는 컬럼 저부에서 관찰된다.
따라서, 포워드 및 리버스 혈액형 분류를 단일 시험으로 수행하면서 바람직하게는 시험하기 전에 혈액 샘플을 분리할 필요가 없는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 당해 방법에 의해 혈액 은행 기술자가 적혈구 상의 혈액군 항원 뿐만 아니라 혈청 속의 임상학적으로 중요한 항체를 동시에 측정하는 것이 가능하다. 당해 방법은 수행되는 개별적인 시험 횟수를 상당히 감소시킨다. 즉, 혈액 센터에서 수행되는 시험 횟수가 1년에 약 5천만 내지 1억회 감소되어 시간과 비용이 상당히 절감된다. 본 발명자들은 시약 적혈구(RBC)로부터 샘플 RBC를 판별하여 이들의 응집체가 구별되도록 하는 방법을 개발하였다. 또한, 본원에 기재된 당해 신규 방법은 표지된 혈액형 분류 항원 시약을 사용하여 샘플 속에서 예비형성된 항체로부터 이들의 반응을 구별한다. 본 발명의 시험은 혈액 샘플을 분리할 필요가 없으므로 전혈(WB)로 수행할 수 있다. 본원에 기재된 시험은 자동 장치에서 이용할 수 있으며, 여기서는 혈청으로부터 세포를 분리할 필요가 없어 더욱 유리하다. 또한, 포워드 및 리버스 시험의 동시 검출에 의해 혈액형을 분류하여 혈액형을 확인하는 데 필요한 시험 횟수가 감소된다(포워드 및 리버스 시험).
본 발명의 형광 표지 양태에서는, 포워드 시험에서 모노클로날 항체를 표지시킨다. 리버스 시험의 경우, 시약 적혈구를 표지시킨다. 추가의 이점은 혼합된 적혈구 집단을 (육안으로 또는 자동 판독기를 통해) 구별할 수 있다는 데 있다. 예를 들면, 리버스 시험을 2회 시험하는 대신 1회 시험하여, 수행되는 시험 횟수를 감소시킬 수 있다. 추가로 항체 스크린에 적용할 수 있으며, 여기서는 2회의 별도의 시험 대신에 2세포 풀(pool)을 함께 사용하여, 수행되는 시험 횟수를 감소시킬 수 있다.
육안 시스템의 경우에 세포를 착색시키는 능력은 튜브, 마이크로플레이트, 슬라이드 및 컬럼 응집 기술(CAT; Column Agglutination Technology), 및 시험 플랫폼(flatform), 예를 들면, 비트로스(Vitros)TM250, 750 또는 950[오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드(Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.), MA 로체스터 소재] 슬라이드법을 사용하여 현존하는 혈액군 시험 플랫폼에 사용할 수 있다.
뱌스(Vyas) 등은 미국 특허 제5,776,711호에서 "동시" ABO 및 RH(D) 혈액형 분류 또는 항체 스크린 방법을 기재하였다. 그러나, 당해 발명은 이와 유사하게 ABO 혈액군을 수행하는 시험 횟수를 감소시키고자 하는 반면, 샘플의 ABO 적혈구 ABO 상태 뿐만 아니라 A 및/또는 B 항원에 대한 항체의 존재를 동시에 시험한다. 또한, 본 발명은 분리된 혈청 및 적혈구 성분보다는 전혈을 사용한다. 표지된 시약 적혈구의 즉각적인 사용은 뱌스 등의 합성 비이드의 사용과는 상이하다.
ABO 혈액군의 동시 분석은 시약 적혈구를 적합한 형광 색소로 표지시키고 형광 색소 표지를 갖는 적합한 모노클로날 항체를 선택함으로써 수행할 수 있다. 세포 및 응집체는 레이저 주사 혈구 분석법에 의해 현미경 슬라이드 또는 이의 동등물 위에서 측정할 수 있다. 슬라이드 위의 세포를 레이저 주사 광원으로 조사한다. 전형적으로, 사용되는 레이저 광원은 청색 아르곤 이온 레이저 및/또는 적색 헬륨-네온 레이저를 포함한다. 형광 및 광 산란은 레이저 스캐닝 사이토미터(Laser Scanning Cytometer)[컴퓨사이트(Compucyte), MA 캠브리지 소재]를 사용하여 측정할 수 있다.
포워드 및 리버스 시험의 동시 측정에서의 레이저 주사 혈구 분석법의 사용은 아래와 같다. 세포 또는 세포 그룹(응집체)에 레이저 광 비임을 주사하는 경우, 조사광이 세포 또는 세포 그룹에 의해 산란되고 산란 강도는 세포(또는 응집체) 크기 및 형상과 관계가 있다. 예를 들면, 각각의 적혈구는 작은 응집체보다 광을 덜 산란시키고, 또한 작은 응집체는 큰 응집체보다 광을 덜 산란시킨다.
이와 마찬가지로, 세포 또는 세포 그룹(응집체)에 레이저 광 비임을 주사하는 경우, 조사광에 의해, 세포와 결합되어 있는 형광 색소(들)로부터 형광이 유도될 수 있다. 형광 색소가 시약 적혈구당 비교적 균일하게 결합되어 있는 경우, 형광 감도는 응집체 크기와 관계가 있다. 예를 들면 개별적인 적혈구는 작은 응집체보다 덜 형광이고, 또한 작은 응집체는 큰 응집체보다 덜 형광이다.
상이한 유형의 응집체를 구별하는 데 있어서, 광 산란과 형광을 조합하여 이용하는 경우가 각각의 파라미터 하나만을 이용하는 경우보다 더 신뢰성이 높다.
또한, 이들 두 가지 파라미터 이외에, 형광 색소와 공액 결합된 모노클로날 항체를 사용하여 당해 세포(및 응집체)를 표지시킬 수 있다. 조사되는 레이저 비임에 의해 여기될 때, 세포에 의해 방출된 형광은 세포 또는 응집체에 대한 이들 모노클로날 항체의 결합에 대한 추가의 정보를 제공하여 세포 또는 응집체의 아집단(subpopulation)을 구별할 수 있다.
ABO 동시 측정을 위한 5개의 파라미터(포워드 산란, 사이드 산란(side scatter) 및 3가지 형광 채널)의 도트 그래프(dot plot)가 도 1에 제시되어 있다.
당해 분야의 숙련가들이라면 또한 유동 혈구 분석법(flow cytometry) 또는 형광 현미경법을 사용하여 ABO 혈액군의 동시 분석을 수행할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
유동 혈구 분석법에서는, 측정할 세포 또는 응집체를 빠르게 이동하는 유체 스트림 중심에 도입하고, 일정한 속도로 단일 파일을 직경이 작은 오리피스(orifice)로부터 강제 유동시킨다. 입자들은 주위를 둘러싼 유체 차단층에 의해 유체역학적으로 스트림 중심으로 집중된다. 스트림 내의 세포들은 광원에 의해 조사되는 측정 스테이션을 통과하고 2.5×102내지 106세포/분의 속도에서 측정한다. 세포 측정시에는 레이저 광원을 사용한다. 사용되는 전형적인 레이저 광원은 아르곤 이온 레이저(UV, 청색 및 녹색 광), 크립톤 레이저(황색 및 적색 광), 헬륨-카드뮴 레이저(UV 및 청색 광) 및 헬륨-네온 레이저(적색 광)을 포함한다. 형광 및 광 산란은 유동 혈구 분석기, 예를 들면, 사이토론앱솔루트 플로우 사이토미터(CytoronAbsoluteTMFlow Cytometer)(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴저지주 래리탄 소재)를 사용하여 측정할 수 있다.
형광 현미경법에서, 측정할 세포 및 응집체를 현미경 슬라이드 또는 이의 동등물 위에서 판독한다. 전형적으로 세포는 백색 광원 또는 실질적인 단색 광원을 조사한다. 또한, 본원에서는 레이저 광원을 단색 광원으로서 사용할 수 있다. 응집체의 존재는 백색광을 사용하여 평가하고, 관련된 형광은 단색광 및 적합한 필터를 사용하여 평가한다. 이들 중 한가지 또는 이들 둘다의 판독은 육안에 의한 판독 또는 자동 판독을 이용할 수 있다.
또한, 본원에서 고려되는 포워드 및 리버스 혈액형 분류에 육안 검출 기술을 사용할 수 있다. 컬럼 응집 시험(CAT)을 이용하는 당해 방법은 바이오뷰 카세트를 사용할 수 있다(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴욕주 로체스터 소재). 이러한 카세트는 미립자 매트릭스가 첨가된 컬럼을 함유한다. 이러한 매트릭스는 완충액에 분산된 적합한 혈액형 분류 항체로 적층시켜 초기 반응 영역을 형성할 수 있다.
CAT는 자동 판독기 시스템을 사용하여 응집 결과를 해석할 수 있다. 이러한 판독기는 CAT를 수행하는 완전 자동 시스템인 오르토 오토뷰(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴욕주 로체스터 소재)에 장착되어 있다. 자동 판독기는 CCD(charged coupled device) 단색 비디오 카메라, 화상 프로세싱 보드 및 IBM-호환성 PC로 구성된 컴퓨터 화상 시스템이다. 먼저 판독기는 이후에 반응 분류 프로그램에 의해 사용되는 반응 피쳐(reaction feature)들을 추출하기 위한 화상 프로세싱 소프트웨어에 의해 디지탈화되고 프로세싱되는 반응의 화상을 얻는다. 이들 피쳐들을 사용하여 반응들을 네가티브 및 포지티브 부류로 분리하고 7가지 통상적인 반응 부류 또는 등급 중 하나로 번역한다. 선형 통계 패턴 인식 도구인 판별 분석(discriminate analysis)을 사용하여 네가티브 반응과 약한 반응(weak reaction)을 구별하다.
또한 CAT에 사용되는 또 다른 판독기는 바이오뷰 리더(BioVueTMReader) 2(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴욕주 로체스터 소재)이다. 이 판독기는 12개의 바이오뷰 카세트용 자동 적재기와 할로겐 램프 광원 및 RBC 파장을 근거로 하여 세포 동정이 가능하여 응집 결과를 해석하는 화상 분석 피쳐를 갖는다. 화상 획득은 CCD 카메라와 디지탈 보드로 수행한다.
본 발명은 (a) 혈액 샘플을 검출가능한 표지에 결합되어 있는 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계, (b) 혈액 샘플을 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계, (c) 샘플을 혈구 분석하는 단계 및 (d) 혈구 분석법에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여, 혈액을 분석하는 방법을 제공한다. 혈액 샘플은 전혈일 수 있으며, 위의 단계 (a)와 (b)에서 사용된 혈액 샘플은 동일한 비분할 샘플이거나, 동일한 환자로부터 채혈된 샘플의 상이한 부분일 수 있다. 항체에 결합된 검출가능한 표지는 형광 표지, 예를 들면, FITC, BODIPY, 피코빌리프로테인(피코에리트린 포함), 피코빌리프로테인의 에너지-전달 공액체, 페리디닌 클로로필린 단백질, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), AMCA, 반응성 인도카보시아닌, TRITC, 알로피코시아닌(APC), 피코시아닌(PC) 및 인도디카보시아닌(Cy5TM)일 수 있다. 반대로, 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원은 FITC, BODIPY, 피코에리트린을 포함하는 피코빌리프로테인, 피코빌리프로테인의 에너지-전달 공액체, 페리디닌 클로로필린 단백질, 캐스케이드 블루, AMCA, 반응성 인도카보시아닌, TRITC, 알로피코시아닌(APC), 피코시아닌(PC) 및 인도디카보시아닌(Cy5TM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광 색소일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 표지된 항-A 및 표지된 항-B 항체가 담긴 제1 용기 및 (b) 표지된 A군 항원 및 표지된 B군 항원을 갖는 표지된 시약 적혈구가 담긴 제2 용기를 포함하는 혈액 분석 키트에 관한 것이다. 항-A 항체는 IgM-FITC를 포함하고 항-B 항체는 IgM-FITC를 포함할 수 있다. 시약 적혈구는 A1, A2, B 및/또는 O군이고, 반응성 염료(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)), 친유성 염료(예를 들면, 메로시아닌 540 또는 DiIC18(3)-DS), 반응성 친유성 염료, 막 구조와 반응하는 염료 및, 형광 염료와 공액 결합된 모노클로날 항체(이들 모노클로날 항체는 적혈구 상의 통상적인 구조와 반응한다)(예를 들면, 항-글리코포린-PE 공액체)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광 색소로 표지될 수 있다. 바람직하게는 형광 색소는 DiIC18(3)-DS이다. 키트는 컬럼 응집 기술(CAT) 카세트, 예를 들면, 바이오뷰 카세트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 (a) 혈액 샘플을 검출가능한 표지에 결합되어 있는 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계, (b) 혈액 샘플을 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계, (c) 샘플을 혈구 분석 또는 형광 현미경 분석하는 단계 및 (d) 혈구 분석 또는 형광 현미경 분석에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여, 동시 포워드 및 리버스 ABO 혈액형 분류를 수행하기 위한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 혈액 샘플을 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계, (b) 혈액 샘플을 A 항원을 갖는 시약 적혈구 및 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계, (c) 샘플을 육안 분석하는 단계 및 (d) 육안 분석에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여, 혈액을 분석하기 위한 것이다. 단계(b)의 시약 적혈구는 염색될 수 있다. 당해 방법은 컬럼 응집 기술에 의해 수행될 수 있으며 결과는 자동 판독기, 예를 들면, 오르토 오토뷰 시스템(Ortho AutoVueTMSytem) 자동 판독기 또는 오르토 바이오뷰 리더(Ortho BioVueTMReader) 2에 의해 자동 판독할 수 있다.
도 1은 동시 포워드 및 리버스 ABO 혈액형 분류의 4가지 색상 레이저 주사 혈구 분석법을 도시한 그래프이다.
도 1의 패널 A는 A형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(side)(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 어떠한 결과도 검출되지 않는다. 게다가, 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석된 사이드 산란으로부터 어떠한 결과도 얻을 수 없다.
도 1의 패널 B는 B형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 및 시험용 RBC(녹색 포지티브) 둘 다의 응집체의 존재가 확인된다. 혼합된 형광(혼합된 녹색 및 오렌지색)을 갖는 특정 응집체가 검출된다.
도 1의 패널 C는 AB형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 응집체는 관찰되지 않지만, 시험용 RBC(녹색 포지티브) 응집체의 존재는 확인된다. 혼합된 형광(혼합된 녹색 및 오렌지색)을 갖는 특정 응집체가 검출된다.
도 1의 패널 D는 O형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 응집체는 관찰되지만, 시험용 RBC(녹색 포지티브) 응집체는 관찰되지 않는다.
도 2는 동시 포워드 및 리버스 혈액형 분류의 예상되는 결과를 도시한 것이다. 도 2a는 표지된 A 시약 RBC 및 표지된 항-B와 A형 전혈과의 혼합물이 응집되지 않음을 나타낸다.
도 2b는 표지된 A 시약 RBC 및 표지된 항-B와 B형 전혈과의 혼합물의 경우, B RBC-항-B(녹색)의 응집체 및 항-A-A 시약 세포(오렌지)의 응집체가 형성된다.
도 2c는 표지된 A 시약 RBC 및 표지된 항-B와 AB형 전혈과의 혼합물의 경우, AB RBC-항-B(녹색)의 응집체가 형성된다.
도 2d는 표지된 A 시약 RBC 및 표지된 항-B와 O형 전혈과의 혼합물의 경우, 항-A-A 시약 세포(오렌지)의 응집체가 형성된다.
도 3은 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 각각 상이한 산란을 나타내는 녹색 응집체, 오렌지색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체를 도시한 것이다.
도 4는 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 오렌지색 응집체, 녹색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체의 상대적 위치를 도시한 것이다.
도 5는 녹색 대 오렌지색 최대 화소 스펙트럼 상에서 오렌지색 응집체, 녹색 응집체 및 혼합된 오렌지색/녹색 응집체의 상대적 위치(밀도)를 도시한 것이다.
도 6은 CAT 시스템에서의 B 혈장의 리버스 시험의 육안 검출을 도시한 것이다. 표지된 시약 A 및 B 세포를 B 혈장과 혼합하면 갈색 응집체가 형성되며, 이것은 원심분리 후, CAT 시스템의 겔 컬럼 상부에서 관찰된다. 반응하지 않은 표지된 시약 B 세포는 컬럼 저부에서 관찰된다.
본 발명에 따라서, 동시 포워드 및 리버스 ABO 혈액군 시험이 다양한 양태로 기술된다. 본 발명에서는 카세트 형태로 제조 및 시판되고 있는 컬럼 응집 기술(CAT) 반응 및 분리 용기(상품명: 바이오뷰, 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴욕주 로체스터 소재)를 사용할 수 있다. 결과는 위에 기재된 바와 같은, 오토뷰 오토리더 컴퓨터 화상 시스템 또는 바이오뷰 리더 2를 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 기재된 시험을 수행하기 위한 기타 수단은 튜브, 마이크로플레이트, 슬라이드 및 시험 플랫폼, 예를 들면, 비트로스 슬라이드법을 사용한다. 결과는 유동 혈구 분석기, 예를 들면, 사이토론앱솔루트 플로우 사이토미터 또는 레이저 스캐닝 사이토미터 또는 위에 언급된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
리버스 혈액형 분류에 전형적으로 사용되는 시약 RBC는 이들 표면에 A1, A2, B 항원을 갖거나 어떠한 ABO 항원(A1형, A2형, B형, O형)도 갖지 않는다. 이들 세포는 시약 RBC의 응집을 유발하는 예비형성된 항체를 검출하는 데 사용된다. 포워드 유형 시험의 경우, 모노클로날 항-A 및 항-B를 사용하여 샘플 적혈구 표면에 존재하는 이들 각각의 항원을 검출한다.
본 발명의 교시의 범위에는, 예를 들면, D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Jsa, Fya, Fyb, Jka, Jkb, Lua및 Lub를 포함한 기타 혈액군 항원 및 또 다른 다수의 혈액군 항원의 존재를 동시에 측정하는 것이 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 포워드 또는 리버스 유형 혈액군 시험의 형광 또는 육안 검출이 가능하며, 바람직한 양태에서, 동시 포워드 및 리버스 혈액군 시험이 가능하다.
형광 검출 시스템
형광 시험 양태에서, 시약 RBC, 모노클로날 항-A(마우스 모노클로날 IgM으로부터 정제한 것임) 또는 항-B(마찬가지로 마우스 모노클로날 IgM으로부터 정제한 것임), 또는 이들 세가지 모두를 형광 염료로 표지시키고, (1) 시약 RBC와 순환 항체와의 응집체 및 (2) 모노클로날 항-A 또는 항-B 항체와 RBC 표면 항원과의 응집체를 예를 들면, 컴퓨사이트 레이저 스케닝 사이토미터를 사용하여 488nm 레이저로 검출한다. 또한, 항혈청은 형광 표지시킬 필요는 없지만 광 산란에 의해 검출할 수 있다. 추가로, 레이저 유동 혈구 분석기, 예를 들면, 오르토 사이토론앱솔루트 플로우 사이토미터를 사용하여 결과를 측정할 수 있다. 또한, 형광 현미경법을 사용할 수 있다.
동시 포워드 및 리버스 유형의 경우, 표지된 B 시약 RBC가 A군 WB의 존재하에 FITC 표지된 항-A와 함께 존재하는 시험을 수행한다(참조: 도 1의 패널 A 및 도 2a, 실시예 1). FITC-표지된 항-A는 WB 샘플 중의 A 적혈구와 응집되어 녹색 응집체를 형성할 수 있다. WB의 혈장 중의 예비형성된 항-B는 오렌지색 표지된 시약 B RBC와 응집하여 오렌지색 응집체를 형성할 수 있다. B, AB 및 O WB를 사용하여 유사한 시험을 수행한다(참조: 도 1의 패널 B 내지 D, 도 2a 내지 2d).
녹색 및/또는 오렌지색 응집체의 존재를 기준으로 하여, 네 가지 구별되는 반응 형태가 관찰되며, 이것은 네 가지 주요 ABO 혈액군 각각과 상호관련되어 있다(참조: 표 1). 따라서, 한 시험에서 포워드 및 리버스 유형을 동시 측정함으로써 ABO 혈액군을 측정한다. 역으로, A, B, AB 또는 O WB의 존재하에, 표지된 A1시약 RBC 및 FITC 표지된 항-B를 혼합한다. 다시, 녹색 및/또는 오렌지색 응집체의 존재를 기준으로 한, 네 가지 구별되는 응집 형태가 관찰되며, 이들 각각은 특정 ABO 혈액군에 상응한다. 따라서, 2가지 시험을 수행하여 ABO 혈액군을 측정 및 확인하다(참조: 표 1). 혼합된 형광(혼합된 녹색 및 오렌지색)을 갖는 특정 응집체가 검출된다(참조: 도 3 내지 5). 이것은 표지되지 않은 세포 응집체 내부 또는 근처의 표지된 세포의 포획/인접 또는 표지된 세포 응집체 내부 또는 근처의 표지된 항체의 포획 또는 인접으로부터 초래된다. 혼합된 녹색/오렌지색 응집체의 존재는 결과 해석에 방해되지 않는다. 시험 2를 사용하여 ABO군 각각에 대한 대표적인 데이타 시트를 표 1에 나타내었다.
ABO 혈액군을 측정 및 확인하기 위한 반응 형태
시험 1 시험 2
WB 샘플 군 FITC 항-A(녹색 응집체) 오렌지색 시약 B 세포(오렌지색 응집체) FITC 항-B(녹색 응집체) 오렌지색 시약 A1세포(오렌지색 응집체)
ABABO +0+0 +00+ 0++0 0+0+
표 1의 결과는 컴퓨사이트 레이저 스캐닝 사이토미터를 사용하여 측정한다. 그러나, 표지된 항혈청의 존재 또는 부재하에 응집체를 측정하기 위한 기타 수단을 고려할 수 있으며, 이러한 수단은 위에 논의된 방법을 포함하되 이들에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 각종 시험을 개별적으로 또는 이들을 조합하여 수행할 수 있지만, 본 발명의 바람직한 방법은 포워드 및 리버스 시험을 동시에 수행하는 것이다.
형광 염료를 사용하여 시약 세포(리버스 유형의 경우) 및 모노클로날 항-A 및 항-B 항체(포워드 시험의 경우)를 표지시킨다. 시약 세포를 표지시키는 데 바람직한 형광 표지는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌-5,5'-디설폰산(DiIC18(3)-DS)을 포함한다. 이 염료는 488nm의 청색 아르곤 레이저 광으로 여기되는 경우, 세포가 오렌지색 형광을 나타내도록 한다. 당해 양태에 유용한 기타 형광 표지는 반응성 염료(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)), 친유성 염료(예를 들면, 메로시아닌 540), 반응성 친유성 염료(DiI의 클로로메틸벤즈아미도 및 메틸벤즈아미도 유도체, DiI의 설폰화 유도체 및 DiO의 설폰화 유도체), 막 구조와 반응하는 염료 및, 형광 염료와 공액 결합된 모노클로날 항체(이들 모노클로날 항체는 적혈구 상의 통상적인 구조와 반응한다)(예를 들면, 항-글리코포린-PE 공액체)를 포함한다.
모노클로날 항체를 표지시키는 데 바람직한 형광 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 포함한다. FITC 표지는 이러한 항체가 결합된 세포가 488nm의 청색 아르곤 레이저로 여기되는 경우에 녹색 형광을 나타내도록 한다. FITC는 488nm의 청색 아르곤 레이저로 여기될 수 있는 단백질-반응성 저분자량 형광 색소염료의 하나이며, 이들은 어느 것이나 본 발명에서 모노클로날 항체 표지 목적에 유용하다. 이러한 부류의 또 다른 예는, 마찬가지로 위의 레이저로 여기되는 경우에 녹색 형광을 나타내는 BODIPY [몰리큘러 프로브스(Molecular Probes), OR 유겐 소재]이다. 기타의 매우 유용한 형광 색소는 피코빌리프로테인(예를 들면, 피코에리트린(PE)), 피코빌리프로테인의 에너지-전달 공액체(예를 들면, 듀오크롬(DuoChrome)TM[벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 캘리포니아주 샌 조세 소재], Cy5TM(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴저지주 래리탄 소재), 및 기타 물질) 및 페리디닌 클로로필린 단백질(PerCPTM(벡톤 딕킨슨, 캘리포니아주 샌 조세 소재))을 포함한다. 위의 염료는 모두 488nm의 청색 아르곤 레이저에 의해 여기되지만, 여기 파장 광원과 발광 염료의 다른 조합도 가능한다. 특정 예는 캐스케이드 블루 및 7-아미노-4-메틸코우마린-3-아세트산(AMCA)과 UV 여기; 피코에리트린, 반응성 인도카보시아닌(Cy3TM) 및 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TRITC)와 녹색 여기; 알로피코시아닌(APC), 피코시아닌(PC) 및 인도디카보시아닌(Cy5TM)과 적색 여기를 포함한다.
또한, 위에 기재된 형광 시험 시스템에 대하여, 형광 표지(FITC)로 항혈청을 표지할 필요는 없다. 당해 분야의 숙련가의 기술의 범위내에서, 이러한 크기와 유형의 입자에 대해 적합한 조건으로 설정된 광 산란을 기준으로 하여 응집체를 검출할 수 있다.
리버스 시험 조건
응집 반응 결과를 최적화하기 위해, 먼저 표지된 시약 RBC와 표지된 모노클로날 항체 대 전혈의 작업 비율을 측정한다. 따라서, 응집 반응의 판독은 최대화되고 과량의 표지는 사용되지 않는다. 실패 네가티브(false negatives)의 수가 감소하므로, 적합한 시험 비율을 측정한 결과, 특이성이 향상된다.
RBC의 표지화
DiIC18(3)-DS 표지된 시약 RBC를 사용하는 리버스 유형의 경우, 목적하는 시약 RBC 대 전혈의 비율은, 당해 비율의 시약 RBC가 WB 내의 상대적 항체에 대해 특이적으로 응집되는 능력을 기준으로 하여 측정한다. 특히, 표지된 A1시약 RBC를 B군 전혈과 다양한 비율로 혼합한다. 5%, 10% 및 40% 시약 RBC 현탁액을 시험하여 작업 시약 RBC 농도를 측정한다. 2μM DiI-DS 용액을 사용한다. 표지된 RBC를 사이토론앱솔루트 플로우 사이토미터 상에서 분석하고 평균 형광을 측정한다. 약 5% 내지 약 10% 농도의 RBC가 유용하며, 약 5% RBC 현택액이 가장 바람직하다. 왜냐 하면, RBC의 농도가 낮을수록 평균 형광이 비교적 밝기 때문이다. 그러나, 충분히 검출가능한 형광 또는 배경 위에 검출가능한 갯수의 형광 결과를 제공하는 시약 RBC 농도 및 실용성, 예를 들면, 시약 용적의 관점에서 방해되지 않는 농도 이하를 사용할 수 있다. 표 2는 사용된 DiI-DS 농도에서, 시험된 시약 RBC의 다양한 비율에서 수득된 평균 형광을 나타낸다.
평균 형광
네가티브 대조군5% RBC10% RBC40% RBC 28758345
DiI-DS 농도 범위
본 발명의 리버스 혈액형 분류에 유용한 DiI-DS 농도 범위을 측정하기 위해, DiI-DS의 5가지 상이한 최종 농도를 5% RBC 현탁액에 대하여 시험한다. 이들 세포를 사이토론앱솔루트 상에서 분석하고 평균 형광 및 %CV(변이 계수)를 측정한다. 당해 양태에서는, 포지티브로 시험된 5 내지 40μM의 Dii-DS 농도 또는 20% 미만의 %CV로 충분히 밝은 시그널을 제공하는 임의의 농도를 고려한다. 40μM 용액은 최소량의 CV로 가장 밝은 시그널을 갖기 때문에 바람직하다(참조: 표 3).
평균 형광 %CV
40μM20μM10μM5μM2μM네가티브 대조군 1861691381196528 71017203552
리버스 혈액형 분류 - DiI 표지된 RBC 및 전혈(WB)
이어서, 오렌지색 표지된 A군 시약 RBC가 A군 또는 AB군 WB가 아니라 B군 또는 O군 WB 중에 응집되는 조건을 측정한다. 역으로, 표지된 B 시약 RBC가 B군 또는 AB군 WB가 아니라 A군 또는 O군 WB와 오렌지색 응집체를 형성하는 조건을 측정한다. 488nm의 청색 아르곤 레이저 광을 사용하여 컴퓨사이트 레이저 스캐닝 사이토미터의 최대 화소 맵 상에서의 오렌지색 및 녹색 시그널의 상대적 위치에 의해 착색된 응집체를 측정한다.
WB 대 표지된 RBC의 비율을 상이한 조합을 제조하여 측정하고 표준 혈액 은행 혈청학 기술을 사용하여 시험한다. 결과를 육안과 현미경으로 관찰한다. WB 시험을 위해 5% 현탁액을 사용한다. 응집 현상이 관찰된다. 그러나, 본 발명자들은 시험 혼합물 중의 RBC의 농도가 일정한 응집 결과를 제공하는데는 불충분함을 밝혔다(참조: 표 4).
5% A군 DiI-DS WB 용적 A군 WB* O군 WB
25㎕25㎕40㎕ 5㎕25㎕10㎕ NegNegNeg PosPosPos
*네가티브 대조군
5% 표지된 RBC 현탁액을 40%로 농축시키고 이 현탁액 5㎕를 WB 5㎕에 가한다. 결과가 유리하고 응집 현상이 관찰되므로, 다른 비율은 시험하지 않았다.
포워드 혈액형 분류 - FITC 표지된 항체 및 전혈
먼저, 표지된 모노클로날 항체를 사용하는 포워드 유형의 경우, 유사한 방식으로 목적하는 표지된 항체 대 WB의 비율을, 표지된 항체가 WB 내의 상대적 세포 항원에 대해 특이적으로 응집되는 능력을 기준으로 하여 측정한다. 특히, FITC 표지된 항-A를 A WB로 적정하여, B 또는 O WB가 아니라 A 또는 AB WB 중에 녹색 응집체가 형성되는 조건을 측정한다. 역으로, 표지된 항-B가 A군 또는 O군 WB가 아니라 B 또는 AB WB와 녹색 응집체를 형성하는 조건을 측정한다. 488nm의 청색 아르곤 레이저 광을 사용하여 컴퓨사이트 레이저 스캐닝 사이토미터의 최대 화소 맵 상에서의 오렌지색 및 녹색 시그널의 상대적 위치에 의해 착색된 응집체를 측정한다.
이어서, 형광 표지 대 항체의 비율을 측정한다. 표지된 항체 분획을 WB 50㎕ 용적을 사용하여 3가지 상이한 희석 배율로 시험한다(참조: 표 5).
WB: 군/용적 FITC 항-A: DiI/용적 반응 등급
A군 10㎕A군 10㎕O*군 10㎕O*군 10㎕A군 5㎕ 1:10 희석액 50㎕ 1:100 희석액 50㎕1:10 희석액 50㎕1:100 희석액 50㎕1:50 희석액 50㎕1:100 희석액 50㎕ 2+**1+NegNeg3+2+
* 네가티브 대조군** 문헌[참조: AABB Technical Manual, 12thedition; pg 607]에 정의된 바와 같은 등급 시스템
1:100 희석액이 LSC를 사용하는 경우에 가장 양호한 결과를 나타내어 이를 선택하여 추가로 시험한다. 이들 결과를 기준으로 하여, 50㎕의 FITC:항체를 사용하여 1:100의 희석 배율 및 DiI-DS 표지된 RBC 5㎕로 추가로 시험한다. 그러나, 사용되는 표지:항체의 범위는 배경 위에 검출가능한 형광(저부 말단에서) 및 프로존(prozone)(상부 말단)을 생성하는 임의의 농도일 수 있다.
육안 검출 시스템
적혈구의 색상을 변경할 수 있으므로 2세포 집단의 동시 시험을 육안 또는 분광 광학적으로(흡수 또는 반사에 의해), 즉 형광을 검출할 필요없이 수행할 수 있다. 예를 들면, 시안화물 또는 아지드화물에 노출된 적혈구는 밝은 적색에서 갈색으로 변하는 것으로 생각된다. 이렇게, 적색 응집체를 갈색 응집체로부터 육안으로 검출할 수 있다. 당해 양태에서는 적혈구 헤모글로빈의 고유 색상의 변경을 고려하는 반면, 또 다른 방법으로는, 적혈구에 발색단을 간단히 부착시키거나 또는 결합시켜 이들의 스펙트럼 특성을 검출가능하게 변경할 수 있다.
육안 검출 양태에서, 컬럼 응집법(CAT)를 이용하여, 예를 들면, 바이오뷰 카세트를 사용하여 포워드 및 리버스 시험을 수행할 수 있다. 본 발명의 매트릭스가 첨가된 컬럼 장치를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 컬럼 응집장치를 사용하여 포워드 혈액 분류 검정을 수행할 수 있다. 항혈청을 함유하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 생리학적으로 혼화성인 완충액에 분산시키고 미립자 매트릭스에 가하여 이들을 침지시킨 후, 매트릭스를 유입구 포트 쪽으로 확장시켜 초기 반응 영역을 형성시킨다. 적당량의 이들 항체는 일반적으로 항체의 항원 친화도 및 특이성에 따라, 당해 분야의 숙련가들에 의해 통상적으로 최적화될 수 있다. 당해 분야에 공지된 적합한 첨가제, 예를 들면, 고분자량 중합체 등을 함유할 수도 있는 완충액에 항체를 분산시켜 이들의 반응성을 강화시키고 비특이적 결합을 방지한다.
이들의 예는 폴리비닐, 덱스트란, 젤라틴 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 또한 저분자량 중합체를 첨가하여 용액의 밀도를 증가시킬 수 있다.
위의 설명에서, B형 혈액 세포에 대한 항체를 가하는 경우, 환자의 샘플에 함유된 B형 혈액 세포가 항체에 결합되어 매트릭스의 상부 근처에 포획된 응집된 세포 층을 형성한다. 이 실시예에서, A형 세포는 응집되지 않고 원심분리시 장치 저부로 분리된다. 종종, 환자의 세포가 약하게 반응하는 변이체를 함유할 수 있다. 온화한 반응은 컬럼 매트릭스에 걸쳐 더 작게 분산된 응집체에 의해 입증되는 반면, 네가티브는 매트릭스 컬럼의 저부에 버튼을 형성한다. 도 6은 컬럼 응집법을 사용함으로써 시약 A 및 B 세포가 별도로 표지되는 리버스 시험을 나타낸다. 제조업자의 지시에 따라 혈청 샘플이 컬럼 상부로 이동되고 이에 따라 튜브를 배양 및 원심분리한다. 시약 A 세포는 존재하는 항-A 항체와 응집체를 형성하는 반면, 시약 B 세포는 컬럼 저부로 통과하며, 이것은 혈청 샘플이 B형임을 나타낸다.
시약 RBC[어퍼마겐(AffirmagenR) A1및 B 세포, 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴저지주 래리탄 소재]를 최종 농도 0.2%에서 아지드화나트륨(NaN3)으로 처리한다. NaN3은 헤모글로빈 중의 철을 감소시켜 전형적인 적색에서 암갈색 또는 밤색으로 색상이 변한다. 동일한 어퍼마겐 로트로부터의 미처리 세포를 대조군으로서 사용한다. 미처리 대조군과 처리된 시험 세포를 제조업자의 지시에 따라 바이오뷰 리버스 카세트 속의 B군 혈청을 사용하여 독립적으로 시험한다(3 내지 5% 적혈구 10㎕ 및 혈청 40㎕, 이어서 제조업자의 지시에 따라, 바이오뷰 원심분리기 속에서 5분 동안 원심분리한다). B 혈청은 B 세포가 아니라 A1세포를 응집시키는 것으로 예상된다. 미처리 대조군과 처리된 세포의 응집체는 미처리 세포가 적색이고 처리된 세포가 갈색이라는 것을 제외하면 차이가 없다(본원의 실시예 2 및 표 6 참조).
위에 기재된 육안 검출 시스템을 사용한 응집체의 자동 측정은 오토뷰 오토리더 컴퓨터 화상 시스템 또는 바이오뷰 리더 2(이들 시스템 모두 위에 기재되어 있다)를 사용하여 결과를 얻을 수 있다.
위에 기재된 바와 같이 응집체를 육안으로 관찰하고자 하는 경우, 먼저 임의의 무색 세포 또는 세포에 부착된 무색 입자를 육안으로 인식가능한 응집 반응을 일으키는데 적합한 염료를 사용하여 염색하는 것이 바람직하다. 적혈구의 헤모글로빈은 염색하지 않아도 본래 위와 같은 적합한 색상을 제공한다. 직접 응집 연구는 위에 기재된 바와 같은 ABO 적혈구 뿐만 아니라, D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Jsa, Fya, Fyb, Jka, Jkb, Lua및 Lub등을 함유하는 혈액 세포에 대하여 수행할 수 있다. 이와 유사하게, 특정 항원 또는 항원 함유 세포에 대한 항체의 존재를 위해 혈청을 시험한 경우, 이들은 공지된 항원과 혼합할 수 있다. 공지되지 않은 혈청이, 제공된 공지된 항원에 대한 항체를 함유하는 경우, 반응물이 매트릭스로 또는 매트릭스를 통해 아래쪽으로 이동할 때 응집 및 포획되는 반면, 네가티브 혈청은 반응을 일으키지 않고 응집체도 포획되지 않는다.
본 발명의 방법을 혈액 혈청학 교재에 사용하기 위해 매우 상세하게 설명하였다. 그러나, 입자와 결합된 임의의 결합 리간드를 포함하는 동시 포워드 및 리버스 유형 결합 검정을 수행하여, 리간드가 포워드 및 리버스 둘 다의 방식으로 이의 결합 상대에 결합된 결과로서 입자가 반응하는 것이 본 발명의 범위에 포함됨을 알아야 할 것이다. 예를 들면, RBC 샘플로부터 분리된 혈장 또는 혈청을 사용하여 통상적으로 수행되는 "항체 스크린" 시험은 본원에 기재된 바와 같이 사용되는 표지된 시약 적혈구와 함께 전혈을 사용하여 수행할 수 있다. 또는 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있지만, 항체 스크린 또는 항체 동정을 수행하는 데 필요한 시험 횟수는 1개 표지되지 않은 시약 적혈구와 1개 표지된 시약 적혈구를 혼합하여 50% 감소시킬 수 있다. 비록 적혈구의 포워드 및 리버스 혈액 분류 시스템을 설명하였지만, 당해 분야의 숙련가라면 다른 시스템이 이러한 방식으로 최적화될 수 있음을 인식할 것이다.
아래의 실시예는 단지 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
형광 검출 양태
파트 A - 시약 조제
친유성 형광 막 표지인 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌-5,5'-디설폰산(Dil-DS)[몰리큘러 프로브스 인코포레이티드, OR 유겐 소재]의 저장 용액을 Dil-DS 1mg 바이얼에 에탄올 1㎖[시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스 소재]를 가하고 격렬하게 혼합하여 1mg/1㎖ 농도로 제조한다. 저장 용액은 광차단 상태에서 6개월 동안 실온에서 저장할 수 있다.
저장 용액을 행크스 밸런스트 염 용액(HBSS: Hanks Balanced Salt Solution)(시그마)으로 80μM 농도로 희석하여 Dil-DS의 작업 용액을 제조한다. 사용하지 않는 작업 용액은 버린다.
파트 B - 적혈구(RBC) 혈광 표지화
혈액군형이 A1, B 및 O인 사람 수혈자로부터 전혈을 배큐테이너(Vacutainer) 아데닌 시트레이트 덱스트로스(ACD) 보존 튜브(벡톤-딕킨슨, 뉴저지주 플랜클린 레이크스 소재)에 수집한다. 약 3000×g에서 5분 동안 원심분리하여 RBC를 분리하고 인산염 완충액(PBS)[기브코(Gibco)] 3 내지 5㎖ 중에서 2회 세척하되, 각각의 세척 단계 후에 약 3000×g에서 5분 동안 원심분리한다. 희석제로서 HBSS를 사용하여 5% RBC 현탁액을 제조한다.
동용적(0.1 내지 5㎖)의 5% RBC 현탁액과 DiI-DS 작업 용액을 시험관 속에 합하고 광차단 상태에서 30분 동안 37℃에서 배양한다. 시험관을 10분 마다 손으로 간단하게 교반한다. 표지된 RBC를 PBS 3 내지 5㎖ 중에서 3회 세척하고 약 3000×g에서 5분 동안 원심분리한 후, HBSS에 재현탁시켜 5% 용액을 제조한다.
이뮤노카운트(Immunocount) IITM소프트웨어(오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드, 뉴저지주 래리탄 소재)를 사용하여 사이토트론앱솔르트 플로우 사이토미터 상에서 오렌지색 형광을 확인하였다.
RBC를 광 산란 파라미터를 기준으로 하여 통과시키고 통과된 RBC와 관련된 형광을 측정한다. 배경 위의 형광을 측정한 결과, 충분히 표지되었음을 알 수 있다. 형광 표지 대신에 동용적의 PBS(0.1 내지 5㎖)와 함께 배양시킨 동일한 RBC의 네가티브 대조군을 평행하게 유동시킨다.
파트 C - 항체의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지화
마우스 모노클로날 항-A, 클론 MH04 및 마우스 모노클로날 항-B, 클론 NB10.5A5를 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드 제조 설비로부터 조직 배양 형태로 수득한다. 모노클로날 항체를 표준 방법을 사용하여 부분 정제 및 농축시킨다.
정제된 항-A 및 항-B를 pH 9.5의 탄산염 완충액에 투석시키고 표준 프로토콜에 따라 FITC로 표지시킨다. FITC-표지된 항체를 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 FITC로부터 분리한다. 280nm 및 492nm에서 각각의 분획의 흡수율을 측정한다. 각각의 분획에 대한 F/P(플루오레세인/단백질) 몰 비를 아래의 수학식 1 내지 3을 사용하여 계산한다.
가장 높은 F/P 비를 갖는 3가지 분획을 본 발명의 형광 동시 포워드 및 리버스 시험 양태에 사용한다.
항-A 분획 F/P 비 항-B 분획 F/P 비
345 202632 345 362012
파트 D - 전혈(WB)의 동시 포워드/리버스 혈액형 분류 및 시험 해석-레이저 스캐닝 사이토미터(LSC)
항-B FITC 표지된 항체에 DiI-DS A 표지된 RBC를 희석시킨다. 항체를 2% 소 혈청 알부민 및 1% 아지드화나트륨과 함께 0.5㎖ PBS에 1:100으로 희석시킨다. 희석된 항체 9용적을 표지된 세포 1용적과 혼합한다. 표지된 세포/항체 혼합물 55㎕를 서브-파트(Sub-part) 1 내지 4에서와 같은 WB 5㎕에 가한다. 클레이-아담스(Clay-Adams)(뉴저지주 파시파니 소재) 세로퓨지(serofuge) 속에서 15초 동안 약 3500rpm에서 튜브를 원심분리한다. RBC를 온화하게 재현탁시킨다. 반응 혼합물 3㎕를 PBS 7㎕에 가한 후 커버슬립을 도포하여 슬라이드를 제조한다.
LSC(컴퓨사이트, MA 캠프리지 소재)를 사용하여 슬라이드를 분석한다.
서브-파트 1
본원의 파트 D의 물질과 방법을 사용하고, A형 전혈을 사용한다. A 전혈은 A 적혈구에 대한 항체를 함유하지 않으므로, 표지된 시약 적혈구와 응집체를 형성하지 않는다. 또한, A형 전혈 세포는 B 항원을 갖고 있지 않으므로, 항-B FITC와 응집체를 형성하지 않는다. 도 1의 패널 A는 A형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 예상한 바와 같이, 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 어떠한 결과도 검출되지 않는다. 게다가, 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석된 사이드 산란으로부터 어떠한 결과도 얻을 수 없다.
서브-파트 2
이어서, 본원의 파트 D의 물질과 방법을 사용하여 B형 전혈을 시험한다. B형 전혈은 A 적혈구에 대한 항체를 함유하므로, 표지된 시약 적혈구와 응집체를 형성한다. 또한, B형 전혈 세포는 B 항원을 발현하므로, 항-B FITC와 응집체를 형성한다. 도 1의 패널 B는 B형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 예상한 바와 같이, 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 및 시험용 RBC(녹색 포지티브) 둘 다의 응집체의 존재가 확인된다.
서브-파트 3
이어서, 본원의 파트 D의 물질과 방법을 사용하여 AB형 전혈을 시험한다. AB형 전혈은 A 적혈구에 대한 항체를 함유하지 않으므로, 표지된 시약 적혈구와 응집체를 형성하지 않는다. 그러나, AB형 전혈은 B 항원을 발현하므로, 항-B FITC와 응집체를 형성한다. 도 1의 패널 C는 AB형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 예상한 바와 같이, 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 응집체는 관찰되지 않지만, 시험용 RBC(녹색 포지티브) 응집체의 존재는 확인된다.
서브-파트 4
이어서, 본원의 파트 D의 물질과 방법을 사용하여 O형 전혈을 시험한다. O형 전혈은 A 적혈구에 대한 항체를 함유하므로, 표지된 시약 적혈구와 응집체를 형성한다. 그러나, O형 전혈은 B 항원을 발현하지 않으므로, 항-B FITC와 응집체를 형성하지 않는다. 도 1의 패널 D는 O형 전혈의 경우, 항-B FITC 및 A-표지된 RBC의 포워드(x-축) 및 사이드(y-축) 산란(각각, 녹색 최대 화소 및 오렌지색 최대 화소임)을 나타낸다. 응집 영역의 사이드 산란 플롯에 결과가 검출된다. 예상한 바와 같이, 이들 결과를 녹색 대 오렌지색 플롯에서 추가로 분석하는 경우, 시약 세포(오렌지색 포지티브) 응집체는 관찰되지만, 시험용 RBC(녹색 포지티브) 응집체는 관찰되지 않는다.
실시예 2
육안 검출 양태
파트 A - 착색된 적혈구의 조제
A1및 B군 적혈구의 시판 조제품(어머파겐R)을 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스 인코포레이티드(뉴저지주 래리탄 소재)로부터 구입한다. A1군 RBC 1㎖ 분획 2개를 바이얼로부터 취하고 별도의 튜브에 넣는다. 하나의 분획을 10% NaN3[맬린크로트(Mallinckrodt), KY 파리 소재] 20㎕와 혼합한다. 나머지 분획은 처리하지 않고 대조군으로서 사용한다. 각각의 튜브를 캡핑하고 내용물을 실온에서 16시간 동안 배양한다. 밤새 처리한 후, NaN3-처리된 RBC의 색상이 갈색이 되는 반면, 미처리 대조군 세포는 적색을 유지한다.
파트 B - 리버스 바이오뷰 컬럼 시험-이중 컬럼 시험
하나의 컬럼 속에는 A1 세포 10㎕와 B군 혈청 40㎕를, 또 다른 컬럼 속에는 B 세포 10㎕와 B군 혈청 40㎕를 사용하여(표 6의 컬럼 3 및 4), 아지드화나트륨으로 처리된 세포를 표준 바이오뷰 리버스 카세트 속에서 시험한다. 대조군 세포인 미처리 A1 및 B 세포를 각각 컬럼 1 및 2에서 시험한다. 제조업자의 지시에 따라 원심분리한 후, 응집된 A1 세포는 미처리 대조군 세포(컬럼 1) 및 처리된 시험 세포(컬럼 3) 둘 다 비드 컬럼 상부에서 관찰되며, 이는 B군 혈청 중에 항-A가 존재함을 나타낸다. 응집되지 않은 B 세포는 미처리 대조군 세포(컬럼 2) 및 처리된 시험 세포(컬럼 4) 둘 다 컬럼 저부에서 관찰되며, 이는 항-B가 부재함을 나타낸다. 미처리 대조군 세포는 적색을 나타내고, 처리된 시험 세포는 갈색을 나타낸다. 이들 결과는 A1 및 B 세포를 처리하는 경우, 이들 세포의 비드 컬럼에서의 응집 능력이 손상되지 않음을 나타낸다.
파트 C - 리버스 바이오뷰 컬럼 시험-단일 컬럼 시험
실시예 2의 파트 B에서, A1 및 B 세포를 개별적인 컬럼에서 시험하여 샘플의 리버스 군을 결정하였다. 이어서, 하나의 컬럼에서, 미처리 A1 세포 10㎕(적색)와 처리된 B 세포 10㎕(갈색)를 B군 혈청 40㎕와 합한다. 원심분리 후, 2개의 구별되는 세포 집단이 관찰된다. 응집된 (A1) 세포는 비드 컬럼 상부에서 관찰되고 응집되지 않은 갈색 (B) 세포는 컬럼 저부에서 관찰된다(표 6의 컬럼 5). 이 결과는 정확한 리버스 그룹이 표준 2 컬럼 대신에 1 컬럼(1시험)에서 측정될 수 있음을 나타낸다. 역으로, 처리된 A1세포 10㎕와 미처리 B 세포 10㎕를 실시예 2의 파트 B에 따라 시험한 결과, 응집된 갈색 (A1) 세포와 응집되지 않은 적색 (B) 세포를 검출할 수 있다(표 6의 컬럼 6).
실시예 2의 파트 B와 C의 결과를 표 6에 나타내었다(참조: 도 6).
2개의 분리된 세포 집단의 육안 검출 및 구별
바이오뷰 리버스 컬럼 번호
1 2 3 4 5 6
RBC(각각 10㎕) A1untr B untr A1tr B tr A1untr +B tr A1tr +B untr
원심분리 후에 관찰된 반응 4+ 0 4+ 0 3-4+혼합됨 3-4+혼합됨
기술 적혈구가 비드 컬럼 상부에 존재 적혈구가 비드 컬럼 저부에 존재 갈색 세포가 비드 컬럼 상부에 존재 갈색 세포가 비드 컬럼 저부에 존재 적혈구가 비드 컬럼 상부에, 갈색 세포가 비드 컬럼 저부에 존재컬럼 내에 분산된 세포가 거의 없음 갈색 세포가 비드 컬럼 상부에, 적혈구가 비드 컬럼 저부에 존재컬럼 내에 분산된 세포가 거의 없음
주: 모든 컬럼은 지정된 적혈구 이외에 B 혈청 40㎕를 함유한다. untr: 미처리된 대조군 세포tr: NaN3처리된 세포
본 발명에 따라, 혈액 샘플을 분리하지 않고 ABO 혈액군의 포워드 및 리버스 시험을 동시에 수행함으로써, 혈액 검사 횟수를 감소시킬 수 있다.

Claims (24)

  1. (a) 혈액 샘플을 검출가능한 표지에 결합되어 있는 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계,
    (b) 혈액 샘플을 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계,
    (c) 샘플을 혈구 분석(cytometric analysis)하는 단계 및
    (d) 혈구 분석에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여 혈액을 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 혈액이 전혈인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (a)와 (b)에서 사용된 혈액 샘플이 동일한 비분할 샘플인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (a)와 (b)에서 사용된 혈액 샘플이 각각 동일한 환자로부터 채혈된 샘플의 상이한 부분인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 항체에 결합된 검출가능한 표지가 형광 표지인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 형광 표지가 FITC, BODIPY, (피코에리트린을 포함하는) 피코빌리프로테인, 피코빌리프로테인의 에너지-전달 공액체, 페리디닌 클로로필린 단백질, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), AMCA, 반응성 인도카보시아닌, TRITC, 알로피코시아닌(APC), 피코시아닌(PC) 및 인도디카보시아닌(Cy5TM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원이 FITC, BODIPY, (피코에리트린을 포함하는) 피코빌리프로테인, 피코빌리프로테인의 에너지-전달 공액체, 페리디닌 클로로필린 단백질, 캐스케이드 블루, AMCA, 반응성 인도카보시아닌, TRITC, 알로피코시아닌(APC), 피코시아닌(PC) 및 인도디카보시아닌(Cy5TM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광 색소인 방법.
  8. (a) 표지된 항-A 및 표지된 항-B 항체가 담긴 제1 용기 및
    (b) 표지된 A군 항원 및 표지된 B군 항원을 갖는 표지된 시약 적혈구가 담긴 제2 용기를 포함하는 혈액 분석 키트.
  9. 제8항에 있어서, 항-A 항체가 IgM-FITC를 포함하고 항-B 항체가 IgM-FITC를 포함하는 키트.
  10. 제8항에 있어서, 시약 적혈구가 A1, A2, B 및/또는 O군인 키트.
  11. 제10항에 있어서, 시약 적혈구가 반응성 염료(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)), 친유성 염료(예를 들면, 메로시아닌 540 또는 DiIC18(3)-DS), 반응성 친유성 염료, 막 구조와 반응하는 염료 및, 형광 염료와 공액 결합된 모노클로날 항체(이들 모노클로날 항체는 적혈구 상의 통상적인 구조와 반응한다)(예를 들면, 항-글리코포린-PE 공액체)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형광 색소로 표지된 키트.
  12. 제11항에 있어서, 형광 색소가 DiIC18(3)-DS인 키트.
  13. 제8항에 있어서, 컬럼 응집 기술(CAT; column agglutination technology) 카세트를 추가로 포함하는 키트.
  14. (a) 혈액 샘플을 검출가능한 표지에 결합되어 있는 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계,
    (b) 혈액 샘플을 표지된 A 항원 및 표지된 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계,
    (c) 샘플을 혈구 분석 또는 형광 현미경 분석하는 단계 및
    (d) 혈구 분석 또는 형광 현미경 분석법에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여, 동시 포워드 및 리버스 ABO 혈액형 분류(simultaneous forward and reverse ABO type)를 수행하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 혈액이 전혈인 방법.
  16. (a) 혈액 샘플을 항-A 및 항-B 항체와 반응시키는 단계,
    (b) 혈액 샘플을 A 항원을 갖는 시약 적혈구 및 B 항원을 갖는 시약 적혈구와 반응시키는 단계,
    (c) 샘플을 육안 분석하는 단계 및
    (d) 육안 분석에 의해 ABO형을 측정하는 단계를 포함하여, 혈액을 분석하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 혈액이 전혈인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 단계 (a)와 (b)에서 사용된 혈액 샘플이 동일한 비분할 샘플인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 단계 (a)와 (b)에서 사용된 혈액 샘플이 각각 동일한 환자로부터 채혈된 샘플의 상이한 부분인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 단계(b)의 시약 적혈구가 염색되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 분석이 컬럼 응집 기술에 의해 수행되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 컬럼 응집 기술이 바이오뷰(BioVueTM) 카세트를 사용하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 오르토 오토뷰 시스템(Ortho AutoVueTMSytem)을 사용하여 응집 결과를 해석하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 바이오뷰 리더(BioVueTMReader) 2를 사용하여 응집 결과를 해석하는 방법.
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