JPS62112067A - サブセツト分析方法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、フロー血球計算法により粒子の単一試料から
粒子の複数の部分母集団（５ｕｂｐｏｐｕｌａｔ　ｉｏ
ｎ　）を測定するために螢光強度の定ｌ的測定に用いる
方法および組成物に関する。

発明の背景 フロー血球計算は、血液および他の生物組繊細胞の構成
成分を含む複数の異種粒子の分析および分類のための迅
速かつ高精度の方法である。フロー血球計算を用いる場
合、粒子を含む流体流をレーザー光源により生じた光線
に通すことにより粒子を計算し、分類することができる
。光線を通過した粒子は照射光を散乱させ、異る角度に
おける散乱光の強度の測定は該粒子の大きさ、形、密度
および表面形態についての情報を提供する。分析する粒
子の螢光色素標識は、粒子を分析するための光の示差屈
折に基く通常用いられる別法を提供する。螢光色素標識
粒子を計算または分類する場合、照射光による励起後標
識粒子により発せられる選択された波長範囲内の螢光の
存在または不存在は、該分析を行った際に測定されるパ
ラメーターである。螢光色素標識は、光屈折の測定に依
存する方法と比較して、特定の生体化学物質の定滑が可
能であるという点で、特に、生物起源の粒子の計算をす
る場合に優れている。

非常に多くの用途に、粒子の単一試料中の粒子の度数の
部分母集団を区別する分析と定義されるサブセット（５
ｕｂｓｅｔ　）分析は多くの時間および費用の節約にな
る。しかし、通常の方法に関連して用いられる１つのレ
ーザーおよび２つの螢光検出手段しか含まない通常入手
し得るフロー血球計算器は、多くて２種類の螢光染料の
測定に限定されており、したがって、いずれかの１つの
試料中の粒子の２種類の部分母集団しか区別することが
できない。単一試料中で区別できる部分母集団の数を増
加させるための大部分の成果は、非常に高性能な装置の
使用に依存している。かかる装置は、２つまたはそれ以
上の励起レーザーおよび充分な数の螢光検出手段を包含
し、３種類またはそれ以上の螢光色素から螢光を検出す
る。これらの高性能装置を用いてさえ、単一試料中てて
区別できる部分母集団の数は、利用できる螢光色素の限
定された数により制限される。さらに、これらの高性能
装置の広範囲の使用、特に１通常の臨床診断に対しては
、その非常に高い価格により制限される。

広く利用できる装置を用いた寸ブ？−ｙｈ分析の方法の
必要性が依然みして満されていないことは、かかる方法
を開発する努力が続けられていることから明らかである
。フルワイラ＝（Ｆｕｌｗｙｌｅｒ　）の米国特許第４
４９９（１５２号において、単一試料の細胞から度数の
細胞の部分母集団を区別する方法が開示されている。こ
の方法は、異る予備選択した比率のフルオレセインおよ
びローダミンにて１００％標識した抗体分子を有する数
種類の細胞特異的抗体を用いる。標識した抗体を含有す
る試薬と反応した後、測定した螢光色素比と予備選択し
た螢光色素比を比較しおよびそれぞれの螢光色素比を有
する細胞の数を合計することにより細胞を区別し、計算
を行なう。

最近、単一試料からの限定された数の部分母集団の分析
を許容するサブヱヅ１分析ンて広く利用できる装置およ
び螢光色素標識抗体を用いた他の方法が開示されている
。エッチ・エム・シャピロ、プラクティカル・フロー・
サイトメトリー（５ｈａｐ　ｉ　ｒｏ　。

Ｈ，Ｍ、、　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ　）　。

１２７〜１２８　（１９８５）　　参照。この方法によ
れは、数種類の異る細胞種を含有する試料を１種麹の螢
光色素にて標識したそれぞれの抗体分子を有する３欅類
の異る抗体を含有する試薬と混合する。

第１の細胞種に特異的な抗体は螢光色素Ａにて標識され
、第２の細胞種に特異的な抗体は螢光色素Ｂにて標識さ
れおよび第３の細胞種に特異的な抗体は、約１／２　　
の第３細胞種特異的抗体分子が螢光色素Ａにて標識され
、残りの第３細胞種特異的抗体が螢光色素Ｂにて標識さ
れるように螢光色素ＡおよびＢにて標識される。全ての
第３細胞種特異的抗体は、同一の抗原親和性を有し、し
たがって、第３細胞種に関するそれぞれの螢光色素の最
大測定強度は、１種類の螢光色素に結合した同一抗原親
和性を有する抗体のみが用いられる場合の最大測定強度
より小さい。螢光色素ＡおよびＢを含有する試薬との反
応後、励起レーザー通過時にすブ′セットは異る色の光
を発する。例えば、螢光色素Ａが赤色および螢光色素Ｂ
が緑色である場合、第１細胞種は赤色光のみを発し、第
２細胞種は緑色光のみを発しおよび第３細胞種は赤およ
び緑色光を発する。したがって、第３細胞種は、赤色お
よび緑色からの緑色から赤色を分離することにより計算
され、分離される。

前記文献の方法は、通常螢光色素にて標識された抗体分
子を１００％有する螢光色素標識抗体を用いる。精度上
、計算する細胞を過剰の抗体のもとて標識することを要
するので、細胞分離は、螢光色素標識細胞間の定量的は
差、すなわち、細胞がある種の色を発するか否が、また
は、予め選択した色の比に相当する色の比を発するか否
かに限定される。前記文献に欠けているのは、螢光強度
の定量的測定に基づくサブｔ−／μの識別法である。

発明の要約 本発明は、螢光強度の定量分析を用いてサブセット分析
を行なうための方法の知見に存する。本発明方法は、単
一螢光色素を用いて単一試料から粒子の１以上のサブセ
ットを測定することを可能きする。さらに、２種類の螢
光色素を用いる本発明方法を使用すれば、単一試料から
測定できるサブセットの数はさらに増加する。

本発明方法によれば、測定するそれぞれのサブセットは
、異る量の選択した螢光色素にて標識される。ついで、
フロー血球計算方法を用いる場合。

それぞれのサブセット中の粒子の数を０％から１、　Ｏ
０％（用いる装置および装置の設定により測定できる最
大螢光強度を意味する）までの間（１００％を含む）の
それぞれの測定範囲内の螢光強度を示す粒子の数を合計
することにより測定する。それぞれのサブセット中の粒
子の数の測定に加え、該粒子は、螢光強度の測定に基づ
く標準細胞分類方法を用いて分離できる。

本発明のもう１つの態様において、サブセット分析を行
なう際に２種類の螢光色素が用いられる。

測定するそれぞれのサブセットは、いずれか１種類のサ
ブ’ｉ−，，Ｉ−の　粒子に対するそれぞれの螢光色素
の量が０％から１００％最大標識（１００％螢光強度を
生じる螢光色素量を意味する）までの間（１００％を含
む）にあるように１種類または２種類の螢光色素にて標
識される。ついで、該粒子サブセットは、該粒子により
示されるそれぞれの螢光色素の螢光強度の定置的測定に
基づいて計算しまたは分類する。

本発明は、さらに、本発明方法に用いるために企図され
た試薬を包含する。

第１図は、畔希釈フイコエリトリン結合ヒト・サプレッ
サーＴ−細胞抗体にてリンパ球の試料を染色することに
より得られた螢光分布を示すグラフである。

第２図は、非希釈フイコエリトリン結合ヒト・ヘルパー
Ｔ−細胞抗体にてリンパ球の試料を染色することにより
得られた螢光分布を示すグラフである。

第３図は、ヒト・サプレッサーＴ−細胞に対する非希釈
フイコエリトリン結合抗体およびヒト・ヘルパーＴ−細
胞に対する非結合抗体にて希釈したヒト・ヘルパーＴ−
細胞に対するフイコエＩＪ　ｌ−リン結合抗体にてリン
パ球の試料を染色することにより得られた螢光分布を示
すグラフである。

第４図は、ヒト・サプレッサーＴ−細胞に対する非希釈
フイコエリトリン結合抗体、ヒト・ヘルパー′Ｆ−細胞
に対する非結合抗体にて希釈したヒト・ヘルパーＴ細胞
に対するフイコエリトリン結合抗体およびヒ１−Ｔ−細
胞に対する希釈フルオレセイン結合抗体にて単核細胞の
試料を染色することにより得られた螢光の２パラメ一タ
表示である。

第５図は、ヒト単核白血球に対する非希釈フルオレセイ
ン結合抗体および非希釈フイコエリトリン結合抗体、ヒ
）Ｂ−細胞に対する非希釈フルオレセイン結合抗体、ヒ
トＴ−細胞に対する非結合抗体にて希釈したヒトＴ−細
胞に対するフルオレセイン結合抗体、ヒト・サプレッサ
ーＴ−細胞に対するフイコエリトリン結合抗体、ヒト・
ヘルパーＴ−細胞に対する非結合抗体にて希釈したヒト
・ヘルパー　Ｔ　−細胞に対するフイコエリトリン結合
抗体およびヒト・天然キラー細胞に対するフイコエリト
リン結合抗体にて単核細胞の試料を染色することにより
得られた螢光の２パラメ一タ表示である。

発明の詳細 な説明は、螢光強度の定ｌ的測定を用いて１粒子の単一
試料から粒子の多数の部分母集団を測定する方法（サブ
セット分析）に関する。本発明の方法によれば、１種類
の螢光色素のみを用いる場合、１試料からの粒子の少な
くとも２種類の螢光色素標識サブセットを計算または分
類でき、２種類の螢光色素を用いた場合、２から５種類
またはそれ以上の螢光色素標識サブセットを分析するこ
とができる。

フロー血球計算を用いて粒子を計算する１つの方法は、
まず該粒子を螢光色素標識することを必要とする。従来
法によれば、ある種の螢光色素にて染色される試料中の
全ての粒子は、該粒子の螢光強度を用いる装置により測
定できる最大螢光強度またはほぼその程度にする螢光色
素のｉ辻吉同湿度まで染色される。ついて、該染色粒子
を含む試料をフロー血球計算器に通し、染色および未染
色粒子を計算し、その軸として螢光強度および細胞数を
何するヒストグラムを作成する。第１図および第２図は
、計算する粒子が細胞である場合に作成されたヒストグ
ラムの例である。例えば、第１図において明らかなよう
に、縦座標付近のピーク（Ａ）により示される複数の細
胞は、本質的に螢光染料を欠いており、螢光強度スケー
ルの最遠方端の極めて近くのピーク（Ｂ）により示され
るより少数の細胞は、螢光色素にて強く染色されている
。

同様に、第２図において、未染色細胞は縦座標付近のピ
ーク（Ｃ）にあり、染色細胞は螢光強度スケールの遠方
端付近のピーク（Ｄ）にある。したがって、第１図およ
び第２図は、螢光強度の定性的差異に基づ〈従来の細胞
分析の方法を示している。

螢光の定性的測定による前記方法とは逆に、本発明方法
は、螢光強度の定は的測定を用い、粒子・を分析する。

拉モの単−試料からの粒子の硅数のサブセットを計算ま
たは分類する本発明方法の第１工程は、他のサブセット
からの粒子に適用した■吉異る走の螢光色素にてそれぞ
れのナブセッ［・からの粒子を標識量ることである。つ
いで、好ましくは、フロー血球計算器を用いて、それぞ
れの粒子により示された螢光強度を測定し２、異る量の
螢光色素にてそれぞれのサブセットを標識することによ
り選択したそれぞれの螢光強度濃度を有する粒子の全数
を測定し、測定した螢光強度の定寸的差に基づいて細胞
を分類する１゜ その最も複雑でない変形において、本発明方法は、１種
類の螢光色素を用いて２種類のサブセットを区別するた
めに用いられる。分析する粒子の母集団内にて、一方の
サブセットはより多量の螢光色素、好ましくは、サブセ
ットの螢光強度を用いる装置および装置の設定により測
定可能な最大螢光強度またはほぼその程度にする螢光色
素同位ばて標識しく飽和標識）、もう一方のサブセット
はより少量の螢光色素、好ましくは、２種類のサブセッ
トを分析する場合には、このサブセットの螢光強度を第
】の寸ブ′亡ットの螢光強度の１／′２から２／３　　
にする螢光色素量にて標識する。標識が終了したら、螢
光強度の定は的差に基づいて計算および分離を行なうた
め（（該　粒子をフロー血球計算器に通す。

第３図は、単一螢光色素にて本発明方法を用いテリンパ
球の２種類のサブセットをフロー血球計算により計算す
ることによって作成したヒストグラムの例である。飽和
標識細胞は、螢光強度軸の遠方端付近のピーク（Ｅ）に
より表わされる。より少量の螢光色素にて染色された細
胞は、螢光強度軸に沿ったほぼ中央のピーク（Ｆ）によ
り表わされる。ピーク（Ｅ）および（Ｆ）の面積は、そ
れぞれのサブセット内の細胞の数の測定値を与える。

１師類の螢光色素を用いる本発明方法に従ってより多数
のサブセット講滲を分析するためには。

より多数の区別できる螢光色素標識量を選択し、計算す
るサブセットに付着させる。３棟類のサブセットを計算
する場合、好ましくは、該　粒子は１／３飽和標識、２
／３飽和標識および飽和標識する。

１種類の螢光色素にて粒子の４棟類のサブセットを計算
するため（では、好ましくは、該サブセットは１／４　
　飽和標識、１／′２　　飽和標識、　　３／’４　　
飽和標識および飽和標識する。同様に、４種類以上の数
のサブセット内、用いる区別可能な螢光色素標識量の数
を漸次増加させることにより分析する（後記参照）。

本発明方法によれは、螢光強度の差は、サブセット分析
を行ζうために測定されたパラメーターである。したが
って、サブセット分析は、それぞれのサブセットの螢光
強゛度が測定を行なうために用いる装置および装置の設
定によって区別できるよう充分に異っていることを必要
とする。第３図を参照することにより明らかなように、
異る螢光色素標識量寸の数を増やして用いる場合には、
１つのサブセットを表わすピークおよび最も近接したピ
ークの間の距離は減少する。サブセットの螢光強度が非
常に類似している場合、ピー　りは本竹的に重なり、該
サブセット分析の有効性および信頼性を危くする。した
がって１本発明方法および１種類の螢光色素を用いる場
合、用いることのできる異る量の螢光色素標識の数５し
たがって、分析できるサブセットの数は、測定する螢光
強度にそれぞれのサブセットが実質的（Ｃ重ならないよ
うに異る螢光色素量にて標識できる数に制限される。

測定する螢光色素強度に実質的に重なる原因とならない
異る螢光色素量にて標識できるサブセットの数は、用い
るフロー血球計算器または他の装置に含まれる対数増幅
器のダイナミックレンジの増加に直接比例して増加する
。通常利用できるフロー血球計算器Ｃ土、３植類のダイ
ナミックレンジを有する増幅器を装着している。しかし
、少なくとも６種類の対数のダイナミックレンジを有す
る増幅器は他の適用に利用でき、広く用いられる。

例えば、６種類の対数ダイナミックレンジを有する装置
を用いる場合、該装置によって検出できる最大螢光強度
は、３棟類の対数を有する装置によって検出できる最大
螢光強度より大きい。したがつて、飽和染色螢光色素量
はより多く、かつ、より多数の区別できる螢光色素標識
量を分析する標識サブセットに利用できる。

測定する螢光色素強度に実質的に重なる原因とならない
異る螢光色素量にて標識できるサブセットの数は、また
、該サブセットの粒子か螢光色素標識される均一性の関
数である。したがって、本発明方法を用いれば、より不
均一（高変動係数）に螢光色素標識された組繊細胞のよ
うな生物粒子のサブセットの数より多数のより均一（低
変動係数）に標識できる合成粒子のサブセットを識別で
きる。本明細書に記載のごとく、区別できるサブセット
とは、それらを標識した螢光色素に基因する定量的に測
定した螢光強度またはそれらを１種類より多くの螢光色
素にて標識する場合、少な（とも１種類の螢光色素が実
質的に重なり合わないように螢光色素標識したサブセッ
トを意味する。

区別できる螢光色素量とは、粒子を標識する螢光色素の
螢光強度の定量的差に基づいて、他のサブセットの螢光
色素標識粒子から該サブセットを区別できるようにする
粒子のサブセットの粒子に付着した螢光色素標識のｌま
たは該粒子を１種類より多数の螢光色素にて標識する場
合、螢光色素の少なくとも１種類を意味する。

２種類の螢光色素を用いる本発明方法を使用すると単一
試料から分析できるサブセットの数か増加する。１種類
の螢光色素を用いる場合、該サブセットは、１次元、す
なわち、１種類の螢光色素の螢光強度に分離される。第
２の螢光色素は、サブセットの分離に用いる他の次元に
利用できる。

２種類の螢光色素を用いる場合、サブセットは１種類ま
たは２種類の区別できる量の螢光色素にて標識され、そ
れぞれの螢光色素の螢光強度の定量的測定に基ついて分
離される。

第４図は、粒子がリンパ球である粒子の２種類のサブセ
ットを区別するため、本発明方法および２種類の螢光色
素を用いて作成したヒストクラムを表わす。それぞれの
サブセラｌ−（Ｇ）および（■りは、緑色螢光強度が螢
光強度スケールのほぼ中央部になるように緑色を発する
螢光色素にて標識した。サブセット（Ｇ）は、また、赤
色を発する螢光色素にて飽和標識し、サブセット（Ｈ）
は、また。

区別できる量の同じ赤色を発する螢光色素にて標識した
。したがって、サブセット（Ｇ）および（Ｈ）は、縦座
標付近のピーク（Ｉ）によって示される実質的に未標識
細胞から区別され、それぞれの螢光色素の螢光強度の定
ｌ的測定に基づき相互に区別される。

２種類の螢光色素を用いる本発明方法によれば、２種類
のサブセットを区別するために用いる標識法の拡張は５
種類のサブセットの分離に用いられる。

異る量の２種類の螢光色素にて５種類のサブセットを標
識するために用いることのできる１つの態様は、 （＋）第１サブセツトを第１螢光色素にて飽和標識し、 （１１）第２サブセツトを第２螢光色素にて飽和標識し
、 （ｉｌｌ　）第３サブセツトを第１螢光色素にて飽和標
識しおよび第２螢光色素にて飽和標識し、（１ｖ）第４
サブセツトを第１螢光色素にて飽和標識しおよび飽和標
識に用いる量と区別できる量の第２螢光色素にて標識し
、および （Ｖ）第５サブセツトをそれぞれの螢光色素にて飽和標
識する際に用いる対応する量と区別できる量のそれぞれ
の螢光色素にて標識する ことからなる。

第５図は、前記の赤色および緑色を発する螢光色素にて
螢光色素標識した粒子の５種類のサブセットのフロー血
球計算分析によって作成されたヒストグラムである。サ
ブセラ）　（Ｋ）は緑色螢光色素にて飽和標識され、サ
ブセット（Ｎ）は赤色螢光色素にて飽和標識され、サブ
セラｌ−（Ｊ）は両方の螢光色素にて飽和標識され、サ
ブセラｌ−（Ｌ）は赤色螢光色素にて飽和標識されおよ
び飽和標識量と区別できる量の緑色螢光色素にて標識さ
れおよびサブセラｌ−（Ｍ）はそれぞれの螢光色素の対
応する飽和標識量と区別できる量のそれぞれの螢光色素
にて標識される。第５図から明らかなように１粒子の第
５のザブセットは、２種類の螢光色素の螢光強度の定置
的測定に基づいて区別される。それぞれのピークの面積
はそれぞれのサブセットの細胞の数の測定値を示す、。

２種類の螢光色素を用いる本発明方法を使用すると、２
種類から５種類の間および５種類より多い数のサブセッ
トに関するサブセット分析は、１種類または２種類の区
別できる量の螢光色素にてそれぞれのサブセットを標識
することによりおよび螢光強度の定置的測定に基づいて
サブセットを分離および計算または分類するためにフロ
ー血球計算器を用いることにより行なわれる。１種類の
螢光色素とともに本発明方法を用いる場合に明らかなよ
うに、２種類の螢光色素を用いて分析できるサブセット
の最大数は、それぞれのサブセットに対して測定した螢
光強度に実質的に重なる原因とならない異る量の螢光色
素にて標識できるサブセットの数に制限される。しかし
、２種類の螢光色素を用いれば、単一試料から分析でき
るサブセットの最大数は、測定した螢光強度に実質的に
重なる原因１ｒｌる量の１種類の螢光色素にて標識した
サブセットが区別できる量の第２の螢光色素にてこれら
のサブセットを標識することによっても分離されるため
、１種類の螢光色素を用いて分析できる最大数よりも多
い。

本発明により分析する粒子の試料のそれぞれのサブセッ
トの範囲内のそれぞれの粒子をその量がいずれかの他の
サブセットの粒子に付着させた１棟類または２種類以上
の螢光色素の量と区別できる同じ量の１棟類または２種
類以上の螢光色素にて標識しなければならない。分析す
る粒子の種類としては、合成粒子および生物起源の粒子
が挙げられる。該方法は、例えば、米国特許第３７９０
４９２号の記載と同様にして生成したミクロスフェアを
分析するためおよび他のポリマー物質を分析するために
有用である。本発明方法により分析する生物起源の粒子
としては、血球および血液の他の構成成分および粉砕さ
れた柔組織細胞が挙げられる。

螢光色素を用いる粒子の標識の方法は、標識される粒子
の種類により異る。螢光色素を標識したポリビニルクロ
リドおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーは、
モノマー混合物中に充分量の１種類または２種類の螢光
色素を含有させ、常法により重合した際に生成し、所望
する量の螢光色素を有するポリマーを得る。好ましくは
、モノマー混合物に加える螢光色素の量の１つは、生成
するポリマーの螢光強度が用いる装置および装置の設定
により検出できる螢光強度の上限またはほぼその程度で
あるよって選択される。ついで、この量の希釈物を用い
である範囲の量の螢光色素を有する他のポリマーを標識
する。

赤血球および赤血球前駆体、単核細胞および単核細胞前
駆体および血小板を含む血液の構成成分および他の組繊
細胞のような生物粒子は、該試料中に含まれるサブセッ
トの１つの細胞の抗原に対して親和性を有し、他のサブ
セットの細胞の抗原に対して顕著な親和性を有しない螢
光色素結合抗体、好ましくは、モノクローナル抗体と反
応することにより螢光色素標識される。細胞抗原親和性
においで所期の特異性を有する螢光色素結合モノクロー
ナル抗体は、ベクトン・デイキンソン・イムノサイトメ
トリー・システムズ・オン・マウンテン・ビュー、カリ
ホルニア、コウルター・イムノロジー・オン・バイアレ
ア、フロリダ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ
Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ
、　ＣｏｕｌｔｅｒＩｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｈ
ｉａｌｅａｈ、　　Ｆｌｏｒｉｄａ　）のようなおよび
その他の種々の製造業者から入手できる。

さらに、細胞種特異性抗体は、ジー・コーラ−および′
シー・ミルスタイン、コンティニュアス・カルチャーズ
・オン・フユーズド・セルズーセクレツテイング・アン
チボディー・オン・プレデファインド・スペシフィシテ
ィー、ネイチャー（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、ａｎｄ　Ｃ，Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、　ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＣｕｌｔｕｒ
ｅｓ　ｏＥ　Ｆｕｓｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｓｅｃｒｅｔｉ
ｎｇＡｎｔｉｂｏｄｙ　　ｏｆ　　Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅ
ｄ　　５ｐｅｃｉｆｉｃｉむγ。

Ｎａｔｕｒｅ　、）　、　２５６　：　４９５　（１９
７５）　　の記載のような標準モノクローナル抗体方法
に従って調製される。あまり好ましくはないが、特異的
抗体は、ポリクローナル抗体を製造する常法によって調
製される。製造したら、特異的抗体を常法により螢光色
素結合させる。ティー・エッチおよびティー・イー・ダ
ブリュー・フェルトカンプ、ザ・コンジュゲーション・
オン・フルオレセイン・インチオシアネート・ツー・ア
ンチボディーズ：工。

エクスペリメンツ・オン・ザ・コンディションズ・オン
・コンジュゲーション、イムノロジー（Ｔｈｅ、　Ｔ、
　Ｈ，ａｎｄ　Ｔ、Ｅ、Ｗ、　Ｆｅｌ　ｔｋａｍｐ。

Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎ　ｌ５ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｔｏ　　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ　　：　　Ｉ＋　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
　ｏｎ　　ｔｈｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　。

１８　：　８６５　（１９７０）：ティー・エッチおよ
びティー・イー・ダブリュー・フエルトカンプ・コンジ
ュゲーション・オン・フルオレセイン・インチオシアネ
ート・ツー・アンチボディーズ：■。

ア・レプロデューシブル・メソッド、イムノロジ−（Ｔ
ｈｅ、　Ｔ、Ｈ，ａｎｄ　Ｔ、Ｅ、Ｗ、　Ｆｅｌ　ｔｋ
ａｍｐ。

Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎ　ｌ５ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｔｏ　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ　：　’ｆｌ、　Ａ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌ
ｅＭｅｓｈｏｄ、ＩｍｍｕｎｏｌＯｇｙ）、１８　：　
　８７５　（１９７０）：ブイ・ティー・オイら、フル
オレセント・フィコビリプロティン・コンジュゲーツ・
フォー・アナリシーズ・オン・セルズ・アンド・モレキ
ュールズ、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー（Ｏ
ｉ、Ｖ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ
　Ｐｈｙｃｏｆｉｌｉ　−ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅｓ　　ｆｏｒ　　Ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆＣｅ
ｌｌｓ　　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ、）　。

９３　：　　９８１　　（１９８２）参照。

抗体タンパクに対する螢光色素の直接結合の別法上して
は、該抗体の一定部分を選択した量の１種類または２種
類の螢光色素を含有するリポソームに固定する。リポソ
ームは、エル・ディー・レーザーマン、イムノロジック
・ターゲツティング・オン・リポソームズ・イン・リポ
ソームズ、ドラッグズ・アンド・イムノコンペテント・
セル・ファンクションズ、シー・ニコラウおよびＴ−・
パラフ編、アカデミツク・プレス（Ｌｅ５ｓｅｒｍａｎ
。

Ｌ、Ｄ、、　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　　Ｔａｒｇｅｔ
ｉｎｇ　ｏｆＬｉｐｏｓｏｍｅｓ　　ｉｎ　Ｌｉｐｏｓ
ｏｍｅｓ、　Ｄｒｕｇｓ　　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、ｅ
ｄ、Ｃ。

Ｎ１ｃｏｌａｕ　　ａｎｄ　　Ａ、Ｐａｒａｆ、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　）（１９８１）　　に記載
されているような公知の方法によって調製され、抗体に
固定される。選択した量の１種類または２種類の螢光色
素が公知の前駆体によってリポソームに負荷される。リ
ポソームを用いる螢光色素結合抗体は、３種類の対数よ
り多くのダイナミックレンジを有する増幅器を包含する
装置を用いて分析するサブセットのいくつかに付着され
ているような多量の螢光色素を有する抗体を処方する場
合に好ましい。

抗体タンパクへの螢光色素の直接結合のもう１つの別法
においては、該抗体の一定部分を螢光色素標識したミク
ロスフェアに結合する。螢光色素標識したミクロスフェ
アは、好ましくは、選択した量の１種類または２種類の
螢光色素をモノマー混合物中に加えることにより前記と
同様にして調製される。かくして調製したら、ついで螢
光色素標識したミクロスフェアを公知方法により抗体に
結合する。

分析する生物粒子の試料は１分離すべき試料中のサブセ
ットの細胞の特異的抗原に対して個々に親和性を有する
１種類または２種類以上の螢光色素結合抗体を試料に加
えることてより標準螢光抗体法を用いて螢光色素標識さ
れる。該螢光色素結合抗体は、それぞれのサブセットが
区別できる螢光色素量にて標識されるように、すなわち
、２種類のサブセットが区別できない量の２種類の螢光
色素にて標識されないように選択される。区別できない
量の第１螢光色素にて標識されたいずれの偵 ２）ｅサブセットも区別できる量の第２の螢光色素にて
標識しなければならない。

多数のサブセットは、好ましくは、第１サブセツトを螢
光色素の１つにて飽和標識し、第２サブセツトを第２螢
光色素てて飽和標識しおよび第３サブセツトをそれぞれ
の螢光色素にて飽和標識すルコとにより分析する。追加
のサブセットは、少なくともＩＮ類の螢光色素の螢光強
度の定量的測定に基づいて区別できるように１種類また
は２種類の螢光色素にて標識される。

１種類の螢光色素（でて標識される粒子の試料中のそれ
らのサブセラｉ・の飽泪標識は４最適ンζは、該試料を
そのサブセットの粒子（・ζ特異的な抗原（／こ対して
親和性を有する過剰濃度の螢光色素結合抗体と混合する
ことにより行なわれる。２種類の螢光色素にて標識され
るそれらのサブセットの粒子の飽和標識は、最適には、
該サブセットの細胞の抗原に対し特異的親和性を有する
過剰濃度の第１螢光色素結合抗体および該サブセットの
細胞の抗原に対し特異的親和性を有する過剰０度の第２
抗体であって、該第２抗体が異る螢光色素に結合してい
るものと該試料を混合することにより行なわれる。

１種類または２種類以上の螢光色素にて未飽和標識され
るそれらのサフパセットの標識は、好ましくは、該試料
と飽和標識に用いられる濃度より低温度の螢光色素結合
抗体を混合することにより行なわれ、粒子の他のいずれ
かのザブセットに付着させた量の螢光色素と区別できる
債の螢光色素にて該サブセットの細胞を標識する。異る
螢光色素に結合した飽和標識隈より少ない量の２種類の
抗体にて細胞のサブセットを標識するためには、該抗体
濃度は、細胞の２種類のサブセットが区別できない量の
２種類の螢光色素にて標識されないように選択しなけれ
ばならない。抗体過剰の条件下にて結合が行なわれる場
合、該細胞に対する抗体結合がより確実かつ予測可能で
あるため、未飽和標識濃度の螢光色素結合抗体は、理想
的には、得られた抗体１度がサブセットの粒子上の全て
の利用できる抗体結合部位に結合するためて必要な濃度
を越えるように、同一抗原親和性を有する螢光色素非結
合抗体にて螢光色素結合抗体を希釈することにより調製
される。

未飽和標識計の１種類または２種類の螢光色素にて生物
粒子のサブセットを標識するための別法は、それぞれの
抗体の分子に付着させる螢光色素分子の数を変化させる
ことからなる。それぞれの抗体分子に結合する螢光色素
分子の最大数は、生物粒子を過剰量の螢光色素結合抗体
と反応させた場合、該粒子の螢光強度を用いる装置およ
び装置の設定（てより測定できる最大螢光強度またほぼ
はその程度にする量の螢光色素にて該粒子が標識される
ように選択される。試料中に残留しでいるすブ払／）−
の粒子は、それらの粒子さより少数の螢光色素分子を有
する抗体分子を反応させることにより区別できる螢光色
素量にて標識される。それぞれの抗体分子に付着しでい
る螢光色素の数の違いは、螢光色素結合抗体の形成に用
いられる混合物中の螢光色素濃度の変更および螢光色素
を結合する抗体を螢光色素含有混合物にさらす期間の変
更を包含する常法を用いて達成される。

本発明には種々の螢光色素が用いられる。かかる螢光色
素は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、
インドカルボシアニン類、インドジカルボシアニン類、
オ牛サジカルボシアニン、チオカルボシアニン類、チオ
ジカルボシアニン類、メロシアニン５４０を包含する種
々のシアニン染料およびサフラニンＯおよびスルホロー
ダミンを包含する。さらに、本発明に用いられる螢光色
素は、米国特許第４５２（１１１０号に記載されている
フイコエリトリン、アロフィコシアニンおよびその他の
ようなフィコビリタンパク質を包含する。

２種類の螢光色素を用いる本発明の好ましい具体例にお
いて、該螢光色素は、それらの励起波長が単一光源によ
って生じる波長の範囲内にあるように、すなわち、あま
り高性能でない単一レーザー・フロー血球計算器および
他の単一光源装置の使用が可能であるように選択される
。

本発明は、本発明方法に従って分析する粒子を螢光色素
標識するために用いられる試薬を包含する。１種類の螢
光色素を用いる生物細胞のサブセット分析を行なうため
に用いられる試薬は、サブセットの１つの細胞に特異的
な抗原に対してそれぞれ親和性を有するいくつかの螢光
色素結合抗体からなる。それぞれの螢光色素結合抗体は
、細胞のそれぞれのサブセットが区別できる量の螢光色
素にて標識されるように選択された異る濃度の試薬中に
存在する。細胞の二次最大螢光色素標識は、好ましくは
、該螢光色素結合抗体に対する抗原親和性と同一である
充分量の螢光色素結合抗体を該試薬中に含有させること
によって行なわれ、該非結合抗体は、それぞれのサブセ
ットを区別できる量の螢光色素にて標識する螢光色素結
合抗体濃度を生成させるために希釈するのに用いられて
いる。

したがって、本発明を用いて１種類の螢光色素にて２種
類のサブセットを分析するために用いられる試薬は、例
えば、それらの細胞を飽和標識するのに充分な濃度の１
つのサブセットの細胞に特異的な抗原に親和性を有する
螢光色素結合抗体および第１サブセツト細胞特異的抗体
の濃度の約１／２から２／３の濃度の第２サブセツト細
胞特異的抗体を生ずるのに充分な量の螢光色素に結合し
ていないそれらの同一抗体にて希釈した第２サブセツト
の細胞に特異的な抗原に対し親和性を有する螢光色素結
合抗体を包含する。より多数のサブセットを分析するた
めに用いられる試薬は、螢光色素結合抗体の累進的希釈
物をそれぞれのサブセットに加えることにより調製する
。しかし、該試薬に含有される螢光色素結合抗体の濃度
は、他のサブセットのそれぞれと区別できる量の螢光色
素標識にてそれぞれのサブセットの細胞を標識するのに
充分量っていなければならない。

さらに、１種類の螢光色素にて２種類のサブセットを分
析するために用いる試薬は、例えば、抗体過剰の条件下
にて粒子のサブセットと該抗体を反応させて飽和標識粒
子を生じるように充分な数の螢光色素分子に結合した１
つのサブセットに特異的な抗体および同条件下にて反応
し、て約１／２から２／３の飽和標識螢光色素量を有す
る粒子を生じるようなより少数の螢光色素分子に結合し
た第２サブセツトに特異的な抗体を包含する。それ以上
の数のサブセットは、２群のサブセット特異的抗体が、
かかる抗体にて標識したサブセットを区別できな（する
量の螢光色素に結合されないならば、漸次より少数の螢
光色素分子に結合したサブセット特異的抗体を有する試
薬を用いて分析される。

２種類の螢光色素を用いて生物粒子のサブセット分析を
行なうのに用いる好ましい試薬は、好ましくは、細胞を
標識するための該試薬の堕用が区別できない量の２種類
の螢光色素を含有する細胞の２種類のサブセットを生じ
ないように選択した種々の濃度の螢光色素結合抗体を包
含する。したがって、該試薬は、該試薬と混合した際、
１種類の区別できない量の螢光色素にて標識した全サブ
セットが区別できる量の残りの螢光色素にて標識される
ように選択した濃度の螢光色素抗体を含有する。該試薬
中に含有される種々の濃度の螢光色素結合抗体は、好ま
しくは、抗原特異性様の非結合抗体にて該螢光色素結合
抗体を希釈することにより調製される。

サブセット分析のために企図された２種類の螢光電素試
薬に含有される螢光色素結合抗体ａ縮物の１つの例とし
て、 １）第１螢光色素に結合した１つのサブセントの粒子に
特異的な抗原に対して親和性を有する抗体、１１）第２
螢光色素に結合した第２サブセツトの粒子に特異的な抗
原に対して親和性を有する抗体、１１１）第１螢光色素
に結合した第３サブセツトの粒子に特異的な抗原に対し
て親和性を有する抗体および抗原親和性様の非結合抗体
にてほぼ均一に希釈した第２螢光色素に結合した第３サ
ブセツトの粒子に特異的な抗原に対して親和性を有する
抗体、ＩＶ）抗原親和性様の非結合抗体にてほぼ均一に
希釈した第１螢光色素に結合した第４サブセツトの粒子
に特異的な抗原に対して親和性を有する抗体および抗原
親和性様の非結合抗体にてほぼ均一に希釈した第２螢光
色素に結合した第４サブセツトの粒子に特異的な抗原に
対して親和性を有する抗体 が挙げられる。

この試薬は、異る抗原特異的抗体のそれぞれが、全ての
有効な抗原結合部位を標識するのに必要な債を越える充
分な借にて存在するように充分な僅にて細胞の試料に加
えられる。より多数のサブセットを分析するための試薬
は、細胞の母集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　）に加える
場合、細胞の２種類のサブセットが区別できない量の２
種類の螢光色素にて標識されないよう螢光色素結合抗体
の濃度が充分異っていることが必要であるということに
よって制限された螢光色素結合抗体の累進的希釈物を用
いて同様に調製される。

さらに、２種類の螢光色素を含有する試薬は、螢光色素
結合抗体と反応した際、２種類のサブセットが区別でき
ない量の２種類の螢光色素にて標識されないような異る
数の螢光色素分子に結合した適当に選択したサブセット
特異的抗体を含有する。

本発明は、さらに、サブセット分析を行なう際に用いる
装置の作動をモニターするためおよび生物組織の異る試
料中の抗体結合部位の数の変化を検出するために標準と
して用いられる螢光色素標識粒子を包含する。用いる粒
子の種類としては、リポソームおよびミクロスフェアの
ようす合成高分子物質が挙げられる。ミクロスフェアお
よびリポソームは前記のごとく調製され、螢光色素標識
される。該粒子を標識するために用いる１種項またはそ
れ以上の螢光色素は、該粒子が標準として用いられる試
料を標識するために用いられる１種項またはそれ以上の
螢光色素と同様の励起および発光スペクトルをそれらが
をするように選択される。好ましくは、該粒子を標識す
るために用いる１種類またはそれ以上の螢光色素は、冷
却下または、例えば、ベンジルアルコールもしくは塩化
ベンザルコニウムを含有する標準保存溶液中にて安定で
ある。標準として用いる粒子は、好ましくは、低角度光
強度、９０度光強度および大きさが次の標定を分析する
ための試料中に含まれる粒子と異るように選択される。

サブセット分析に用いる装置を検査するためまたは抗体
結合部位の数の試料間の差を検出するために、区別でき
る量の１種類または２種類の螢光色素にて標識された標
準粒子の２種類またはそれ以上のサブセットの混合物を
調製する。サブセットの数および標準粒子のサブセット
の螢光強度は。

好ましくは、それらが、ついで分析する試料中のサブセ
ットの数および粒子の螢光強度に近似するように選択さ
れる。ついで、標準粒子の混合物を分析する試料に加え
、該試料とともに分析する。

さらに、標偵　粒子の混合物を試料の粒子とともに分析
する。

実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 有核血球の単離 分析するサブセットが有核血球である以下のそれぞれの
実施例において、血液の残存する構成成分から有核細胞
を分離するために次の方法を用いた。

バキュテイナー・システムズ・オン・ラザフォ−ド、ニ
ューシャーシー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ
ｓｏｆ　Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ
ｙ　）から入手したヘパリンナｌ−ＩＪウム含有減圧容
器を用いて末梢静脈から静脈切開により正常ボランティ
アカ）らヒト血液を集めた。４人から血液を得、メトリ
シェードナトリウム／ブイコル分離媒体（リンホプレツ
プ；ニエガード・アンド・カンパＴ−、オス口、／ルウ
ｘ　−（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　；　Ｎｙｅｇａａｒｄ
　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　。

０ｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ　）　）５　ｍＱ上に全血約
８ｍＱを加層することにより有核細胞を単離した。フィ
ニルは、密度勾配として用いられるエピクロルヒドリン
とショ糖を架橋することにより製造した不活性、非イオ
ン合成高分子である。全血および分離媒体含有チューブ
を２０℃にて４０分間、４００ＸＧにて遠心分離した。

ついで、表層を回収し、１％蚤ウシ血清アルブミンおよ
び０．（１５％アジ化ナトリウムを含有するデルベツコ
ーズ（ｄｅｌｂｅｃｃｏ’ｓ　）　ＩＪン酸塩緩衝生理
食塩水溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＡＺ緩衝液）　、ｐＨ７
，２中２回洗浄した。該細胞を該緩衝液中に再＠局し、
フロー血球計算器およびコールタ−（Ｃｏｕｌ　ｔｅｒ
　）計算のような標準粒子計算法を用いて計算し、２Ｘ
１０７細廁／ｍＱの最終謡度に調整した。ヨウ化プロピ
ジウム染色を用いると９５％以上の細胞か生存している
ことが判明した。

実施例２ フロー血球計算分析 以下の実施例にて言及したフロー血球計算器を用いた全
ての分析は、コールタ−・エレクトロニクス・オン・バ
イアレア、フロリダ（ＣｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎ
ｉｃｓ　ｏＥ　Ｈｉａｌｅａｈ　、　ト’１ｏｒｉｄａ
　）　　製のＥＰＩＣ５７５３フロー血球計算器を用い
て行なった。螢光色素フイコエリトリンおよび／または
フルオレセインを用いる場合、４８８ｎｍの励起波長に
て５００ｍｗの光を用いた。また、直角光散乱シグナル
用の４８８ｎｍダイクロイックミラーおよび４８８ｎｍ
バンドパス、励起波長を遮断するための５１５ｎｍ干渉
フィルターおよび５１５　ｎｍロングパスフィルター、
フルオレセイン／フィコエツトリンジグナルを分離する
ための５６０　ｎｍグイクロイックミラー、フイコエリ
トリンシグナル用の５９０ｎｍロングパスフィルター、
フルオレセインシグナル用の５２５　ｎｍ帯域フィルタ
ーおよび前方角光散乱シグナル用の１．５００フイルタ
ーを用いた。

単核細胞を分析する場合、９０°光散乱および前方角光
散乱を用いてゲートをこれらの細胞のまわりに取付け、
いずれの凝集または介在物も除去した。

実施例３ 生物粒子の螢光色素標識 粒子を含有する試料と問題のサブセットの粒子に特異的
な抗原に対して親和性を有する螢光色素結合抗体を混合
することによって全生物粒子を螢光色素標識した。螢光
色素結合および非結合モノクローナル抗体は商業製造者
から購入した。

細胞の全標識は、４℃にて９６−ウェルＶ底プレート中
標準螢光抗体染色条件下にて行なった。

対照ウェルは、ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＡＺ緩衝液を加えるこ
とにより最終容積とした適当な非結合抗体またはその組
合せを用いて準備した。約１×１０６細胞を含有する５
０μｅの細胞）イ濁液を適当な量の螢光色素とともにそ
れぞれのウェルに加え、試料を３０分間インキュベート
した。

インキュベーション後、まず５０μｇのＰ１３Ｓ−ＢＳ
Ａ−ＡＺ緩衝液、ついて２０μｇの胎児子ウソ血清をそ
れぞれのウェルに加え、該プレートを１０分間４℃にて
４００ｘＧで遠心分離した。ついで上清を除去し、細胞
ペレットを２００μｅのＰＢＳ−ＢＳＡ−ＡＺ中に再）
背？蜀した。

実施例４ １種類の螢光色素を用いた単一試料７Ｊ）らの２種類の
サブセットの分析 フイコエリトリン結合モノクローナル抗体を用いて、ヒ
ト血液から調製した単核細胞の試料から単核細胞の２種
類のサブセットを分析した。分析したサブセットは、サ
プレッサーＴ−細胞およびヘルパーＴ−細胞であった。

ヒト・サプレッサーＴ−細胞に特異的なフイコエリトリ
ン結合抗−Ｌｅｕ−２ａモ／クローナル抗体およびヒト
・ヘルパーＴ−細胞に特異的なフィコエ’）　ｌ−ＩＪ
ン結合および非結合抗−Ｌｅｕ−３ａモノクローナル抗
体を含有する試薬を用いて該サブセットを標識した。フ
ィコエＩＪ　ｌ−ＩＪン結合および非結合抗体は、ベク
トンーデ・イギンソン・イムノサイトメトリー・システ
ムズ、マウンテン・ビュー、カリホルニア（Ｂｅｃｔｏ
ｎ、−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　、〜１ｏｕｎｔａｉｎＶｉｅ
ｗ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。

フイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−２ａ抗体は２５μｙ
精製イムノグロブリン／ｍＱの濃度にて得、希釈せずに
用いた。、２５μｙ精製イムノグロブリン／　ｍＱ、の
濃度にて得たフイコエリトリン抗−Ｌｅｔｘ　−Ｃａ抗
体は、使用前に１００μｙ精製イムノグロブリン／　ｍ
Ｑ、の濃度の非結合抗−Ｌｅｕ−３ａ抗体にて希釈１．
た。】、５μｅの非結合抗体稠製物を１３μｅのフイコ
エリトリン結合抗体調製物に加えることによって抗−Ｌ
ｅｕ−Ｃａ抗体を希釈した。細胞標識試薬は、２０μｅ
のフイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−２ａ調製物、１５
μｇの希釈フイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ　−３ａ調
製物および全量を８０μ４にするのに充分なＰＢＳ−Ｂ
ＳＡ−ＡＺ緩衝液を含有した。

第３図は、３種類の対数ダイナミック増幅器を取付けた
フロー血球計算器および標準粒子計算法を用いて、標識
１．た単核細胞の螢光強度を定量的に測定すること（こ
よって得た結果を示すグラフである。ピークｔＦ）は、
希釈フイフエリトリン結合抗体にて標識したヘルパーＴ
−細胞を表わし、ピーク（Ｅ）は非希沢フイコエＩＪ　
ｌ−ＩＪン結合抗体にて標識したサブレツザーＴ−細胞
を表わす。それぞれのピークの面積は、それぞれのサブ
セットの細胞の数の尺度である。

第３図は、螢光強度の定量的測定によって得られた結果
を示しており、かつ、サプレッサーＴ−細胞がこれらの
細胞の螢光強度を用いた装置の設定により測定可能なほ
ぼ上限近くにする量の螢光色素にて標識されているとい
うことを示している。

螢光強度軸上のピーク（Ｆ）の位置によって示されてい
るように、ヘルパーＴ−細胞は、これらの細胞の螢光強
度をサプレッサーＴ−細胞の螢光強度の約２／３にする
量の螢光色素にて標識された。

しかし、好ましくは、ヘルパーＴ−細胞およびサプレッ
サーＴ−細胞は、これらのサブセットの相対螢光強度が
逆になるように螢光色素標識される。このもう１つの標
識は、単核細胞の試料をへ・レバーＴ−細胞が標識され
る量より多くかつ区別できる量の螢光色素にてサブレツ
ザーＴ−細胞を標識するような充分量の非希釈フイコエ
リトリン結合抗−Ｌｅｕ−Ｃａ抗体および適当に希釈し
たフイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−２ａ抗体と反応さ
せることにより行なわれる。かくして標識され、ヘルパ
ー丁−細胞およびサプレッサーＴ−細胞を示すピークは
、第３図に示したオーダーとは逆のオーダーにて螢光強
度尺度上に示される。

したかつて、１種類の螢光色素を用いて、赤色螢光強度
の定量的な差に基づきヘルパーＴ−細胞およびサプレッ
サーＴ−細胞が分離される。

実施例５ １種類の螢光色素を用いる単一試料からの３種項のサブ
セットの分析 フルオレセイン結合モノクローナル抗体を用いて、細胞
の３種類のサブセットをヒト血液単核細胞の試料から分
析する。単核白血球、サプレッサーＴ−細胞およびヘル
パーＴ−細胞が分析されるサブ築ンＦである。該単核白
血球は、リポソームに固定したフルオレセインを含有す
るリポソームに共有的に結合した単核白血球特異的抗体
にて標識される。リポソーム中のフルオレセインの量は
、標識した単核白血球の螢光強度が、６種類の対数ダイ
ナミック増幅器を取付りた標準フロー血球計算器により
測定できる最大強度より大きくなく、かつ、サプレッサ
ーＴ−ｉ胞の螢光強度の約２倍になるように選択される
。サプレッサーＴ−細胞は、単核白血球の螢光強度の約
１／２の螢光強度を有するこれらの細胞が生じるフルオ
レセイン結合抗−Ｌｅｕ　−２ａ抗体にて標識される。

ヘルパーＴ−細胞は、該ヘルパーＴ−細胞の螢光強度が
サプレッサーＴ−細胞の螢光強度の約１／２になるよう
に充分な非結合抗−Ｌｅｕ−３ａ抗体にて希釈したフル
オレセイン結合抗−Ｌｅｕ　−３ａ抗体にて標識される
。

ついで、細胞の試料をそれぞれのサブセットの細胞を分
離し、計算する６種類の対数ダイナミック増幅器を有す
る標準フロー血球計算器Ｉこ通す。この実施例に記載し
たように細胞の試料を標識して、いずれの２種類のサブ
セットの螢光強度も実質的に重なり合わない最大螢光強
度を有する単核白血球、中位の螢光強度を有するサプレ
ッサーＴ−細胞および最低の螢光強度を有するヘルパー
Ｔ−細胞を得る。

実施例６ ２種類の螢光色素を用いる単一試料からの２種類のサブ
セットの分析 フイコエリトリン結合およびフルオレセイン結合抗体を
用いて、ヒト血液から調製した単核細胞の試料力）ら単
核細胞の２種類のサブセットを分析した。分析するサブ
セットは、サプレッサーＴ−細胞およびヘルパーＴ−細
胞である。ヒト・サプレッサーＴ−細胞に特異的なフイ
コエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−２ａモ／クローナル抗体
、抗原親和性様の非結合抗体にて希釈したヒト・ヘルパ
ーＴ−細胞に特異的なフイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ
　−３１モノクロナ一ル抗体および抗原親和性様の非結
合抗体にて希釈したヒト単核細胞に特異的なフルオレセ
イン結合抗−Ｌｅｕ−４抗体を含有する試薬にて該サブ
セットを標識した。実施例４に示したごとく、好ましく
は、サプレッサーおよびヘルパーＴ−細胞の赤色螢光強
度は逆になる。全ての螢光色素結合および非結合抗体は
ベクトンーデイキンソン・イム／サイトメトリー・ンス
テムズ、マウンテン・ビュー、カリホルニアから入手し
た。

フイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ　−’；ｌ　ａ抗体は
、２５μｇ精製イムノグロブリン／ｍＱの濃度にて得、
希釈せずに用いた。１．５μｅの非結合抗体調製物を１
３μ４のフイコエＩＪ　ｌ−ＩＪン結合抗体調製物に加
えることにより１００μｇ精製イムノグロブリン／ｍＱ
の濃度で得た非結合抗−Ｌｅｕ−３ａ抗体にて２５μｙ
精製イム／グロブリン／ｒｎＱの濃度にて得たフイコエ
リトリン結合抗−Ｌｅｕ−３ａ抗体を希釈した。３μｇ
のフルオレセイン結合抗体調製物を１μｇの非結合抗体
調製物に加えることにより２００μｙ精製イムノグロブ
リン／ｍＱの濃度で得た非結合抗−Ｌｅｕ　−４抗体に
て１００μｙ精製イムノグロブリン／ｒｎＱの濃度で得
たフルオレセイン結合抗−Ｌｅｕ−４抗体を希釈した。

細胞標識試薬は、２０μｅのフイコエリトリン結合抗−
Ｌｅｕ　−２ａ調製物、１５μｅの希釈フイコエリトリ
ン結合抗−Ｌｅｕ−３ａ調製物、５μｅの希釈フルオレ
セイン結合抗−Ｌｅｕ　−４調製物および全量を８０４
にするのに充分なＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｂ　Ｓ　Ａ　−ＡＺ緩
衝液を含有した。

第４図は、この実施例の試薬にて染色したＴ−細胞のす
７゛乞ツにの螢光強度の定量的測定を示している。緑色
螢光は一方の軸にて表示され、赤色螢光は他方の軸にて
表示される。ヘルパーＴ−細胞およびサプレッサーＴ−
細胞は、はぼ同等の緑色螢光強度を有しているが、サプ
レッサーＴ−細胞の赤色螢光強度がヘルパーＴ−細胞の
赤色螢光強度と有意に重なり合わないような充分具った
赤色螢光強度を有している。したがって、標準７０−血
球計算器によりなされた螢光強度の定量的測定に基づい
て、同一の緑色螢光強度を有するサプレッサーＴ−細胞
およびヘルパーＴ−細胞を赤色螢光強度の定検的差に基
ついて分離する。

実施例７ ２種類の螢光色素を用いる単一試料からの５種類のサブ
セットの分析 いくつかはフイコエリトリンまたはフルオレセインのい
ずれかに結合し、いくつかは結合していない７種類の異
るモノクローナル抗体を用いて、区別するパラメータと
して定量的螢光強度測定を用い単核細胞の単一試料から
ヒト単核細胞の５種項のサブセットを分析した。分析し
たサブセットは、サプレッサーＴ−細胞、ヘルパーＴ−
細胞、天然キラー細胞、単核白血球およびＢ−細胞であ
った。ヒトＢ−細胞に対するフルオレセイン結合Ｂ１抗
体およびヒト単核白血球に対するフルオレセイン結合Ｍ
Ｏ２抗体はコールタ−・イムノロジーから入手した。残
りの抗体はベクトンーディキンソン・イムノサイトメト
リー・システムズから入手した。

つぎの抗体調製物が区別できる螢光色素量とともに５種
類のサブセットを標識するのに用いられた。製造業者か
ら入手したような非希釈調製物を製造業者の指示１こ従
って復元後便用した。

１）５０μｙ精製イムノグロブリン／ｍＱの濃度のヒト
天然キラー細胞に特異的なフイコエリトリン結合抗−Ｌ
ｅｕ−１１Ｃ抗体； ＩＩ）　１００〜２００　μｌ　（Ｄ反応容量中（Ｄ　
Ｉ　Ｘ　１０６ｍ胞を飽和標識するのに５μｅて充分で
あるような抗体濃度のヒトＢリンパ球に特異的なフルオ
レセイン結合抗Ｂ１抗体； １１ｉ）　１００〜２００μｆｆ（７）反応容！中ノＩ
　Ｘ　１０６ｍ胞を飽和標識するのに５μｇで充分であ
るような抗体濃度のヒト単核白血球に特異的なフルオレ
セイン結合抗−ＭＯ２抗体； ｌｖ）　１００〜２００μ（１（Ｄ反応容積中（１）　
Ｉ　Ｘ　１０６細胞を飽和標識するのに２０μｐて充分
であるようｔｌａ度のヒト単核白血球に特異的なフイコ
エリトリン結合抗−Ｌｅ　ｕ　−Ｍ　３抗体； ）１００μｙ精裏イムノグロブリン／ｒｎＱの濃度を有
する３μｅの結合抗体を２００μＩＮ製イムノグロブリ
ン／　ｍＱの濃度を有する１μｅの非結合抗−Ｌｅｕ−
４抗体に加えることによって調製したヒトＴ−リンパ球
に特異的な希択フルオレセイ〉′結合抗−Ｌｅｕ−４抗
体； Ｖｌ）　２５μｇ１ｍＱＲ４製イムノグロブリフ、’ｍ
Ｑの濃度のヒト・サプレッサー′ｒ−細胞に特異的なフ
イコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−２ａ抗体；およびＶｌ
ｉ）　２５μｙ精製イムノグロブリン／ｍＱの濃度を有
すル１３．０　ｔｔ（１（Ｄ結合抗体を１０（１１４精
製イム／りロブリン／ｍＱの濃度を有する１、５μｅの
非結合抗−Ｌｅｕ−３ａ抗体に加えることによって調製
したヒト・ヘルパーＴ−細胞に特異的な希釈フイコエリ
トリン結合抗−Ｌｅｕ−３μ抗体。

５種類の単核細胞サブセットを差別的に標識するのに用
いた試薬は、以下の量の前記の抗体調製物を包含する。

１）２０μａのフイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ−１１
＊＋）Ｓμｅのフルオレセイン結合抗−８１ｉｔｉ）　
５μｅのフルオレセイン結合抗−ＭＯ２ＩＶ）　２０μ
ｇのフイコエリトリン結合抗−Ｌｅ　ｕ　−Ｍ　３Ｖ）
　５μａの希釈フルオレセイン結合抗−１ｅｕ−４■１
）２０μｅのフイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ　−２ａ
および １１）１５μｅの希釈フイコエリトリン結合抗−Ｌｅｕ
−３ａ。

この試薬にてヒ１４核細胞の試料を標識した後、分析の
ために該試料を３種類の対数ダイナミックレンジ増幅器
を取付けた標準単一レーザー・フロー血球計算器に通し
た。第５図は該試料から分離した５種類のサブセットの
ヒストグラムである。

第５図から、該サブセットは、一方の軸上の緑色螢光色
素（フルオレセイン）の螢光強度のプロット定量測定お
よび他方の軸上の赤色螢光色素（フイコエＩＪ　トＩＪ
ン）の螢光強度の定量的測定により２次元に分離される
ことがわかる。これらの測定を用いれば、２種類のサブ
”ｔ・γトは完全に重なり合ってそれらを区別できなく
なることはない。それぞれピーク＋Ｌ＋および（別によ
り示されるサプレッサーＴ−細胞およびヘルパーニす細
１抱サブセットの細胞は同量のフルオレセインにて標識
されるが、これらの細胞は区別できる量のフィコエＩＪ
　トＩＪンにて標識されるため区別てきる。実施例４；
こて述べたように、好ましくは、サプレッサーＴ−細胞
オヨヒヘルパーＴ−細胞は、これらの２種類のサブセッ
トの相対的赤色螢光強度かこの実施例（ご示された相対
的赤色螢光強度と逆になるようにフイコエリトリン標識
される。

実施例８ ２種類の螢光色素を用いた弔−試料からの７種類のサブ
セットの分析 いくつかはフイコエリトリンまたはフルオレセインのい
ずれかに結合し、いくつかは結合していない９種類の異
るモノクローナル抗体を用（１て、区別するパラメータ
ーとして定量的螢光強度測定を用い有核血球の単一試料
からヒト有核血球の７種類のサブセットを分析する。分
析するサブセットは、サプレッサーＴ−細胞、ヘルパー
Ｔ−′＠胞、天然キラー細胞、単核白血球、１３−細胞
、帯状核細胞および成熟好中球である。

区別できる螢光色素量にて該サブセットを標識する場合
、コールタ−・イムノロジーから入毛したヒトＢ−細胞
に対するフルオレセイン結合Ｂｌ抗体およびヒト単核白
血球に対するフルオレセイン結合Ｍｏ２抗体を使用する
。帯状核細胞および好中球に対する抗体を除く残りの抗
体は、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズから得られる。帯状核細胞および全ての好
中球に対する抗体は標準モノクローナル抗体法を用いて
調製される。一方の抗体は、帯状核細胞を含む全ての好
中球に特異的な抗原に対して親和性を有しており（ＳＫ
＆Ｆ−ＭＡＲ−１（１１）、第２の抗体は帯状核細胞の
みに特異的な抗原に対して親和性を有しティる（　ＳＫ
＆Ｆ−ＭＡＲ−１０２）。

さらに、好中球および帯状核細胞に対する抗体は、それ
らか同一の抗原決定因子に競合して結合しないようおよ
びいずれの抗体もその標的抗原に対する他の抗体の親和
性を実質的に減じないように選択される。ＳＫ＆Ｆ−Ｍ
ＡＲ−１（１１はリポソームを含有するフルオレセイン
に直接結合し、ＳＫ＆Ｆ−ＭＡＲ−１０２はフイコエリ
トリンに直接結合する。

以下の抗体調製物は、区別できる螢光色素着にて７種類
のサブセットを標識する場合に試薬として用いられる。

サプレッサーＴ−細胞、ヘルパーＴ−細胞、Ｔ−細胞、
天然キラー細胞、単核白血球およびＢ−細胞に対する抗
体は前記実施例７と同様にして用いられる。ＳＫ＆Ｆ−
ＭＡＲ−１（１１抗体は、好中球の緑色螢光強度を単核
白血球の緑色螢光強度の約２倍にする量のフルオレセイ
ンを含有するリポソームに直接結合される。ＳＫ＆Ｆ−
ＭＡＲ−１０２は、帯状核細胞の赤色螢光強度を単核白
血球の赤色螢光強度とほぼ同等にする量のフイコエリト
リンに結合される。

螢光色素結合モノクローナル抗体を含有する試薬にてヒ
ト有核血球の試料を標識した後、分析のために該試料を
６種類の対数ダイナミックレンジ増幅器を有する標準単
一レーザー・フロー血球計算器に通す。この分析（こよ
り作成したヒストグラムは、緑色螢光強度軸がより広い
ダイナミックレンジを有し、好中球を示すピークが緑色
軸上最大強度の標識ピークとして現われ、帯状核細胞を
示すピークか好中球とほぼ同等の緑色螢光強度および単
核白血球とほぼ同等の赤色螢光強度を有する以外第５図
（こ示したヒストグラムと同じである。

この実施例では、用いた装置の光散乱ゲートは、単核お
よび多核白血球を包含し、赤血球および血小板を排除す
るために設置される。実施例４で述へたように、好まし
くは、サプレッサーＴ−細胞およびヘルパーＴ−細胞は
、これらの２種類のサブセットの相対的赤色螢光強度が
この実施例に示した相対的赤色螢光強度と逆になるよう
にフイコエリトリン標識される。

実施例９ 標準としての螢光色素標識粒子の使用 前記実施例７と同様に５種類のサブセットの分析に関し
て標準として用いられるミクロスフェアの混合物は、 ｌ）これらのミクロスフェアの緑色螢光強度を正常なド
ナーからの螢光色素標識Ｂ細胞と区別できナクスルのに
充分な遣の１，１′−ジドデシルシクロヘキサカルポシ
アニノにて標識したミクロスフェ１１）これらのミクロ
スフェアの赤色螢光強度を正常なドナーからの螢光色素
標識天然キラー細胞と区別できなくするのに充分な量の
スルホローダミンにて標識したミクロスフェア １ｉｉ）これらのミクロスフェアの緑色および赤色螢光
強度を正常なドナーからの螢光色素標識単核白血球と区
別できなくするのに充分な量のＤｉＯ−Ｃ（１２）−３
およびスルホローダミンにて標識したミクロスフェア １ｖ）これらのミクロスフェアの緑色および赤色螢光強
度を正常なドナーからの螢光色素標識サプレッサーＴ−
細胞と区別できなくするのに充分な量のＤｉＯ−Ｃ（１
２）　−３およびスルホローダミンにて標識したミクロ
スフェア ■）これらのミクロスフェアの緑色および赤色螢光強度
を正常なドナーからの螢光色素標識ヘルパーＴ−細胞と
区別できなくするのに充分な量のＤｉＯ−Ｃ（１２）−
３およびスルホローダミンにて標識したミクロスフエア を包含する。

ミクロスフェアの混合物をヒト弔核細宿の試料に加えた
後、分析するために該試料を３種類の対数ダイナミック
レンジ増幅器を取付けた標？’ｌｌ−レーザー・フロー
血球計算器に通した。かかる分析にて作成したヒストグ
ラムは第５図に示したものと同じである。さらに、Ｉ４
Ｌ核細胞の試料を通す直前にミクロスフェアをフロー血
球計算器に通し、ミクロスフェアの分析の際に作成した
ヒストグラムと細胞の試料の分析の際に作成［７たヒス
トグラムを比較すること１こよりフロー血球計算器の作
動をモニターする。

【図面の簡単な説明】 第１図は、四−希釈フイコエリトリン結合ヒト・ザブレ
ッサー′ｒ−細胞抗体にてリンパ球の試料を染色するこ
とにより得られた螢光分布を示ナグラフである。 第２図は、非希釈フイコエリトリノ結合ヒト・ヘルパー
Ｔ−細胞抗体にてリンパ球の試料を染色することにより
得られた螢光分布を示すグラフである。 第３図は、ヒト・サブツッサー１゛−紀１胞に肘する非
希釈フイコエＩＪ　ｌ−リン結合抗体およびヒトヘルパ
ーＴ−細胞に対する非結合抗体にて４択したヒト・ヘル
パー１′−＠飽に対する）・イコ工すトリン結合抗体に
てリンパ球の試料を染色するこみにより得られた螢光分
布を示すグラフである。 第４図は、ヒト・サブレッザーＴ−細胞に対する非希釈
フイコエリトリン結合抗体、ヒト・ヘルパーＴ−細１泡
に対する非結合抗体にて希釈１７たヒト・ヘルパーＴ細
胞に対するフイコエリトリン結合抗体およびヒト１゛−
細胞に対する布沢フルオレセイン結合抗体にて用核細胞
の試料を染色することにより得られた螢光の２パラメ一
タ表示である。 第５図は、ヒト単核白血球に対する非希釈フルオレセイ
ン結合抗体および非希沢フィコエｌ）　ｌ−１７ン結合
抗体、ヒ）Ｂ−細胞に対する非希釈フルオレセイン結合
抗体、ヒ１−Ｔ−細胞に対する非結合抗体にて希釈した
ヒ１−Ｔ−細胞に対するフルオレセイン結合抗体、ヒト
・サブ１ノツサ〜゛Ｉ”−細胞に対するフイコエリトリ
ン結合抗体、ヒト・ヘルパーＴ−細胞に対する非結合抗
体（ごて希釈したヒト・ヘルパーＴ−細胞に対するフイ
コエリトリン結合抗体およびヒト・天然キラー細胞に対
するフィコエＩＪ　ｌ−ＩＪン結合抗体にて単核細胞の
試料を染色することにより得られた螢光の２パラメ一タ
表示である。 特、？Ｆ　出ＮＵ人　スミスクライン・ベックマン・コ
ーポレイション′ 代理人弁理士青山　葆は力■る第 ４図 ＃数縁ｄ螢九強漫

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）粒子のいずれかの他の部分母集団を標識する螢光
   色素量と区別できる螢光色素量にてそれぞれの部分母集
   団の、粒子を標識し、該試料の粒子の螢光強度を定量的
   に測定し、該粒子の螢光強度の定量的差を用いて粒子の
   複数の部分母集団を区別することを特徴とする粒子の単
   一試料中の粒子の複数の部分母集団の区別方法。
2. （２）それぞれの部分母集団の粒子を標識するために１
   種類の螢光色素を用いる前記第（１）項の方法。
3. （３）螢光色素標識された試料中の粒子が生物起源であ
   る前記第（２）項の方法。
4. （４）螢光色素標識された試料中の粒子が血液の構成成
   分である前記第（３）項の方法。
5. （５）粒子のいずれかの他の部分母集団を標識する螢光
   色素量と区別できる螢光色素量にて行なうそれぞれの部
   分母集団の■粒子の標識が、螢光色素結合抗体を該粒子
   に付着させることからなる前記第（４）項の方法。
6. （６）該螢光色素結合抗体がモノクローナル抗体である
   前記第（５）項の方法。
7. （７）さらに、粒子のいずれかの他の部分母集団を標識
   する螢光色素量と区別できる螢光色素量にて行なうそれ
   ぞれの部分母集団の■粒子の標識が、螢光色素結合抗体
   を該粒子に付着させる前に抗原親和性様の非結合抗体に
   て少なくとも螢光色素結合抗体のいくらかを希釈するこ
   とからなる前記第（６）項の方法。
8. （８）該螢光色素結合抗体をフイコエリトリン、フルオ
   レセイン、ローダミン、スルホローダミン、テキサスレ
   ッド、シアン染料、アロフイコシアニンまたは他のフイ
   コビリタンパク質と結合させる前記第（７）項の方法。
9. （９）該螢光色素結合抗体がフイコエリトリンまたはフ
   ルオレセインである前記第（８）項の方法。
10. （１０）粒子の単一試料中の粒子の２つの部分母集団を
    区別し、一方の部分母集団の粒子を螢光色素にて飽和標
    識し、もう一方のサブセットの粒子を飽和標識量と区別
    できる螢光色素量にて螢光色素標識する前記第（７）項
    の方法。
11. （１１）第１部分母集団の構成成分に特異的な抗原に対
    して親和性を有する充分な数の螢光色素結合抗体をその
    部分母集団の構成成分に付着させて第１部分母集団の螢
    光強度を、用いた装置および装置の設定により測定でき
    る最大螢光強度またはほぼその程度にし、螢光色素結合
    抗体を抗原親和性様の充分な非結合抗体にて希釈した後
    、第２部分母集団の構成成分に特異的な抗原に対して親
    和性を有する螢光色素結合抗体をその部分母集団の構成
    成分に付着させて第２部分母集団の螢光強度を第１部分
    母集団の螢光強度から区別し、試料の構成成分の螢光強
    度を定量的に測定し、および構成成分の螢光強度の定量
    的差を用いて構成成分の２種類の部分母集団を区別する
    ことを特徴とする、構成成分の単一試料からの血液の構
    成成分の２種類の部分母集団の区別方法。
12. （１２）該螢光色素結合抗体をフルオレセイン、フイコ
    エリトリン、ローダミン、スルホローダミン、テキサス
    レッド、シアン染料、アロフイコシアニンまたは他のフ
    イコビリタンパク質に結合させる前記第（１１）項の方
    法。
13. （１３）該螢光色素結合抗体をフルオレセインまたはフ
    イコエリトリンに結合させる前記第（１２）項の方法。
14. （１４）粒子のいずれかの他の部分母集団を標識する螢
    光色素量と区別できる螢光色素量にてそれぞれの部分母
    集団の粒子を標識するために第１および第２螢光色素を
    用い、かつ、区別できる量の第１螢光色素にて標識した
    いずれか２種類の部分母集団を区別できる量の第２螢光
    色素にて標識する前記第（１）項の方法。
15. （１５）螢光色素標識した試料中の粒子が生物起源であ
    る前記第（１４）項の方法。
16. （１６）螢光色素標識した試料中の粒子が血液の構成成
    分である前記第（１５）項の方法。
17. （１７）粒子のいずれかの他の部分母集団を標識する螢
    光色素量と区別できる螢光色素量にて行なうそれぞれの
    部分母集団の粒子の標識が、螢光色素結合抗体を粒子に
    付着させることからなる前記第（１６）項の方法。
18. （１８）該螢光色素結合抗体がモノクローナル抗体であ
    る前記第（１７）項の方法。
19. （１９）さらに、いずれかの他の部分母集団を標識する
    螢光色素量と区別できる螢光色素量にて行なうそれぞれ
    の部分母集団の粒子の標識が、螢光色素結合抗体を粒子
    に付着させる前に抗原親和性様の非結合抗体にて少なく
    とも螢光色素結合抗体のいくらかを希釈することからな
    る前記第（１８）項の方法。
20. （２０）用いる螢光色素が、それぞれ、単一光源によつ
    て生じうる波長の範囲内にある最適励起波長を有する前
    記第（１９）項の方法。
21. （２１）該螢光色素がフルオレセインおよびフイコエリ
    トリンである前記第（２０）項の方法。
22. （２２）血液の構成成分に特異的な抗原に対して親和性
    を有する充分な数の第１螢光色素結合抗体を第１部分母
    集団の構成成分に付着させて構成成分の第１部分母集団
    を第１螢光色素にて飽和標識し、それらの構成成分に特
    異的な抗原に対して親和性を有する充分な数の第２螢光
    色素結合抗体を第２部分母集団の構成成分に付着させて
    第２部分母集団の構成成分を第２螢光色素にて飽和標識
    し、それらの構成成分に特異的な抗原に対して親和性を
    有する充分な数の第１螢光色素結合および第２螢光色素
    結合抗体を第３部分母集団の構成成分に付着させて第３
    部分母集団の構成成分をそれぞれの螢光色素にて飽和標
    識し、それらの構成成分に特異的な抗原に対して親和性
    を有する充分な数の第１螢光色素結合抗体を構成成分の
    第４部分母集団の細胞に付着させて第４部分母集団の構
    成成分を第１螢光色素にて飽和標識しおよび第４部分母
    集団の構成成分に特異的な抗原に対して親和性を有する
    充分な数の第２螢光色素結合抗体を構成成分の第４部分
    母集団の細胞に付着させて第４部分母集団の構成成分を
    飽和標識量から区別できる螢光色素量にて標識し、およ
    び第５部分母集団の構成成分に特異的な抗原に対して親
    和性を有する充分な数の第１螢光色素結合抗体および第
    ２螢光色素結合抗体を第５部分母集団の構成成分に付着
    させてそれらの構成成分をそれぞれの螢光色素にて飽和
    標識する際に用いられる対応する量と区別できるそれぞ
    れの螢光色素の量にて標識し、それぞれの螢光色素に基
    因する螢光強度を測定することによつて試料の構成成分
    の螢光強度を定量的に測定し、および１種類または２種
    類の螢光色素の螢光強度の定量的差を用いて構成成分の
    ５種類の部分母集団を区別することを特徴とする第１お
    よび第２螢光色素を用いる構成成分の単一試料からの血
    液の構成成分の５種類の部分母集団の区別方法。
23. （２３）血液の構成成分の５つの部分母集団が単核白血
    球、Ｂリンパ球、天然キラー細胞、サプレッサーＴ−細
    胞およびヘルパーＴ−細胞である前記第（２２）項の方
    法。
24. （２４）第１および第２螢光色素がフルオレセイン、フ
    イコエリトリン、ローダミン、スルホローダミン、テキ
    サスレッド、シアニン染料、アロフイコシアニンおよび
    他のフイコビリタンパク質から選択される前記第（２２
    ）項の方法。
25. （２５）第１および第２螢光色素がフイコエリトリンお
    よびフルオレセインである前記第（２４）項の方法。
26. （２６）抗体が、試薬と反応後、細胞の部分母集団を区
    別できる螢光色素量にて標識するような相対的量である
    、構成成分の部分母集団の１つに特異的な抗原に対して
    、それぞれ、親和性を有している多数の螢光色素結合抗
    体からなることを特徴とする構成成分の試料からの血液
    の構成成分の複数の部分母集団を区別するための１種類
    の螢光色素試薬。
27. （２７）該螢光色素がフルオレセイン、フイコエリトリ
    ン、ローダミン、テキサスレッド、シアニン染料、アロ
    フイコシアニンまたは他のフイコビリタンパク質である
    前記第（２６）項の試薬。
28. （２８）該螢光色素がフルオレセインまたはフイコエリ
    トリンである前記第（２７）項の試薬。
29. （２９）構成成分の第１部分母集団に特異的な抗原に対
    して親和性を有する螢光色素結合抗体および試薬と反応
    後、構成成分の第１および第２部分母集団を区別できる
    螢光色素量にて標識するような抗原親和性様の非結合抗
    体にて希釈した構成成分の第２部分母集団に特異的な抗
    原に対して親和性を有する螢光色素結合抗体からなるこ
    とを特徴とする血液の構成成分の試料からの血液の構成
    成分の２種類の部分母集団を区別するための１種類の螢
    光色素試薬。
30. （３０）該螢光色素がフルオレセイン、フイコエリトリ
    ン、ローダミン、テキサスレッド、シアニン染料、アロ
    フイコシアニンまたは他のフイコビリタンパク質である
    前記第（２９）項の試薬。
31. （３１）該螢光色素がフルオレセインまたはフイコエリ
    トリンである前記第（３０）項の試薬。
32. （３２）抗体が、試料の構成成分と試薬を反応後、構成
    成分の部分母集団を区別できる螢光色素量にて標識する
    ような相対的量である、構成成分の部分母集団の１つに
    特異的な抗原に対して、それぞれ、別個に親和性を有し
    ている複数の螢光色素結合抗体からなることを特徴とす
    る構成成分の単一試料からの血液の構成成分の複数の部
    分母集団を区別するための２種類の螢光色素試薬。
33. （３３）該螢光色素がフルオレセイン、フイコエリトリ
    ン、ローダミン、テキサスレッド、シアニン染料、アロ
    フイコシアニンおよび他のフイコビリタンパク質から選
    択される前記第（３２）項の試薬。
34. （３４）２種類の螢光色素がフルオレセインおよびフイ
    コエリトリンである前記第（３３）項の試薬。
35. （３５）第１螢光色素に結合した第１部分母集団の構成
    成分に特異的な抗原に対して親和性を有する抗体、第２
    螢光色素に結合した第２部分母集団の構成成分に特異的
    な抗原に対して親和性を有する抗体、第１螢光色素に結
    合した第３部分母集団の構成成分に特異的な抗原に対し
    て親和性を有する抗体、第２螢光色素に結合した第３部
    分母集団の構成成分に特異的な抗原に対して親和性を有
    する抗体、第２螢光色素に結合した第４部分母集団の構
    成成分に特異的な抗原に対して親和性を有する抗体、第
    ４部分母集団の構成成分の螢光強度をいずれか一方また
    は両方の螢光色素にて標識した他の部分母集団と区別で
    きるようにするため充分な数の抗原親和性様の非結合抗
    体にて希釈した第１螢光色素に結合した第４部分母集団
    の構成成分に特異的な抗原に対して親和性を有する抗体
    、それぞれ、第５部分母集団の構成成分の螢光強度を一
    方または両方の螢光色素にて標識した他の部分母集団と
    区別できるようにするため充分な数の抗原親和性様の非
    結合抗体にて希釈した第１螢光色素に結合した第５部分
    母集団の構成成分に特異的な抗原に達して親和性を有す
    る抗体および第２螢光色素に結合した第５部分母集団の
    構成成分に特異的な抗原に対して親和性を有する抗体か
    らなることを特徴とする構成成分の単一試料からの血液
    の構成成分の５種類の部分母集団を区別するための２種
    類の螢光色素試薬。
36. （３６）Ｂ細胞に対して親和性を有する第１螢光色素結
    合抗体、天然キラー細胞に対して親和性を有する第２螢
    光色素結合抗体、単核白血球に対して親和性を有する第
    １螢光色素結合抗体および第２螢光色素結合抗体、Ｔ−
    細胞の第１螢光色素螢光強度を第１螢光色素にて飽和標
    識した他の部分母集団の細胞と区別できるようにするた
    め抗原親和性様の充分な数の非結合抗体にて希釈したＴ
    −細胞に対して親和性を有する第１螢光色素結合抗体、
    ヘルパーＴ−細胞に対して親和性を有する第２螢光色素
    結合抗体、およびサプレッサーＴ−細胞の第２螢光色素
    螢光強度を第２螢光色素にて飽和標識した細胞の他の部
    分母集団と区別できるようにするため抗原親和性様の充
    分な数の非結合抗体にて希釈したサプレッサーＴ−細胞
    に対して親和性を有する第２螢光色素結合抗体からなる
    ことを特徴とする細胞の単一試料からの単核細胞の５種
    類の部分母集団を区別する２種類の螢光色素試薬。
37. （３７）該螢光色素がフルオレセイン、フイコエリトリ
    ン、ローダミン、スルホローダミン、テキサスレッド、
    シアニン染料、アロフイコシアニンおよび他のフイコビ
    リタンパク質である前記第（３６）項の試薬。
38. （３８）該螢光色素がフルオレセインおよびフイコエリ
    トリンである前記第（３７）項の試薬。
39. （３９）区別できる螢光色素量にて標識した粒子の少な
    くとも２種類のサブセットからなることを特徴とする前
    記第（１）項の方法に標準として用いられる螢光色素標
    識した粒子の混合物。
40. （４０）該粒子が合成高分子物質からなる前記第（３９
    ）項の混合物。
41. （４１）該粒子をフルオレセイン、フイコエリトリン、
    ローダミン、スルホローダミン、テキサスレッド、シア
    ニン染料、エチジウムブロミド、アロフイコシアニンお
    よび他のフイコビリタンパク質から選択される１種類の
    螢光色素にて標識する前記第（４０）項の混合物。
42. （４２）該粒子をフルオレセインまたはフイコエリトリ
    ンと同様の励起および発光スペクトルを有する螢光色素
    にて標識する前記第（４０）項の混合物。
43. （４３）該粒子をフルオレセイン、フイロエリトリン、
    ローダミン、スルホローダミン、テキサスレッド、エチ
    ジウムブロミド、シアニン染料、アロフイコシアニンお
    よび他のフイコビリタンパク質から選択されるいずれか
    ２種類の螢光色素にて標識する前記第（４０）項の混合
    物。
44. （４４）該粒子をフルオレセインまたはフイコエリトリ
    ンと同様の励起および発光スペクトルを有する螢光色素
    にて標識する前記第（４３）項の混合物。