JPS58160866A - 螢光化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 螢光試験材料は、分子および細胞の分離、および分析の
ために重要な試薬である。それらの応用の特別な例とし
ては：（１）螢光流量血球測定、螢光−活性化細胞選別
、および螢光顕微鏡の方法（手段）による細胞の準集団
の固定および分離、（２）螢光免疫検査法おける第二の
種と結合する（例、抗原−抗体反応）物質の濃度の測定
、（３）螢光染色の技術によるグルおよび他の不溶性支
持体における物質の局在化を挙げることができる。これ
らの技術（方法）は、ヘルセンペルグらによって、“細
胞免疫学＃３版、２２章、ブラックウェル　サイエンテ
ィフィク　パプリケーション社、１９７８年（螢光−活
性化細胞の選別）およびゴールドマンによる“螢光抗体
法”アカデミツク　プレス社、ニューヨーク、１９６８
年（螢光顕微鏡および螢光染色法）に記載されている。

前記の目的のために＼螢光体（ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｒ）
を用いる場合、螢光体の選択について、多くの制約があ
る。一方の制約は、螢光体の特徴である吸収および発光
であり、化合物が検出されるサンプル（例、血液、尿、
脳を髄液）においてこのような化合物と連合している多
くのりガント、受容体、および物質が、螢光を発し、螢
光標識の正確な螢光測定を妨げる。他方、螢光体がリガ
ンドおよび受容体と結合（複合）することができ、この
ような結合が螢光体に影響を与えることも考慮すべきで
ある。多くの場合、他の分子との結合（複合）は、螢光
体の螢光特徴に実質的変化を与え、いくつかの場合、本
質的に螢光体の量子効率の破壊および減少をもたらす。

第三に考慮すべきことは、螢光体の量子効率である。こ
れに関して、一方では螢光分子が、隣接接触の場合、相
互作用し、自己−クエンチングを生ずる。他方では、螢
光体と他の化合物または容器壁との非特異結合、それ自
体によって、または螢光体が結合する化合物との抱合に
おいてのどちらかにある。

上記に示めされた方法の応用の可能性および価値は、好
ましい螢光物質の有効性に密接に関連している。特に、
長波長可視領域（黄−赤）において、発光する螢光物質
が必要である。広く螢光物質として使用されているフル
オレセインは、縁領域において、有用な発光体である。

しかしながら、好都合な赤螢光標識ロダミンは、フルオ
レセインより効果が薄いとされている。螢光活性化細胞
選別の分野で、この欠陥は、強い影響を与える。この強
力な、多方面にわたる、十分に可能性のある手段は、ま
た認識されておらず、それは一般に有効な螢光体の限界
を、とらえらでいるからである。

２および３−パラメーター螢光選別は、効果的に開発さ
れておらず、それは十分に、良い長波長発光実験材料が
入手困難だからである。

組織学、細胞学、免疫検査を含む他の手段（方法）は、
より長波長での高量子効率、吸収、および発光特性をも
つ螢光体、接合のための単純な作用（手段）を有する螢
光体および本質的に非一時異性妨害のない螢光体の使用
によって実際的に好ましい結果が得られる。

リガンド−受容体反応を含むシステムにおいて、螢光標
識体として、ビリン補欠分子族を有するタンパクを用い
る。ピリタンパクは容易に接合し、長波長可視領域にお
いて、吸収および発光の高量子効率を提供し、リガンド
−受容体反応を含む方法の感度および精度を高める。ピ
リタン・臂りは、各々に、併用して、または非−タンパ
ク性螢光体とともに使用することが可能である。

第１図は、フィコエリスリン−イムノグロブリン接合体
（ＰＥ−８−８−ＩｇＧ）およびその反応性前駆物質、
チオラート化フィコエリスリン（ＰＥ−ＳＨおよび活性
化イムノグロブリン（ＩｇＧ−８−８−Ｐｙｒ）　ノ＾
圧液体クロマトグラムを示す。

第２図は、ＰＫ−Ｂ−Ａ染色した抗−ＩｇＧイムノグロ
ブリンを帯びる牌細胞を含む細胞集団の螢光−活性化細
胞選別分析を示す。

第３ａ図は、標準フルオレセイン発光フィルターの組み
合わせを利用しての螢光顕微鏡による、標識した抗−イ
ムノグロブリンを含むアガロースビーズの混合物の視覚
化が可能である。その場合、いくつかのビーズは、ＰＥ
−Ｂ−Ａでｍａｌ（ｌ、イ（つかのビーズは、フルオレ
セイン−アビジンで標識化する。

第３ｂ図は、赤フィルターの組み合わせを利用しての螢
光顕微鏡下に、第３ａ図におけるように、同じ細胞集団
の視覚化を示す〇 特異結合対（ペアー）のメン；々−と（該対は、リガン
ドおよび受容体からなる）接合させたビリタンパク（ビ
リタンパクは、フィコビリタンノぜりと同じ意味をもつ
）を含んでなる組成物を提供する。これらの組成物は、
特異結合対の補体メンバーに、非−共有結合によって標
識化するために使用される。方法の広い多様性は、リガ
ンドもしくは受容体の存在の測定、分析、または検出の
ためにリガンドの受容体への拮抗的もしくは非拮抗的結
合が含まれる。それらの技術（手段）の多くは、補体メ
ンバーをもつ特異結合対の標識化したメンバーの非共有
結合の結果として螢光の存在もしくは不存在に依存する
。

本発明に係る接合体は、ビリタン・４りを共有的にまた
は非共有的に、通常は共有的に特別のリガンドもしくは
受容体に結合させることである。ビリタンパクりは、少
なくても約３０．０００ｄ　（ｄ−ダルトン）の分子量
をもち、更に一般的には少なくても約４０，０００ｄで
あシ、６００，０００もしくはそれ以上のダルトルのも
のもありうるが一般には約３００．０００ｄを越えるこ
とはない。

ビリタンパクは、通常２−３の異なったサブユニットか
らなり、そのサブユニットは、約１０．０（１０−６０
，０００分子量の範囲にある。ビリタンパクは、一般的
に、藻類およびシアンバクテリアの広範囲の変種から自
然の形態で得られるものを用いる。

ビリタン／Ｊ？りにおけるタンパクの存在は、タンノや
り性および非タンＩＪ？り性分子への結合（複合）のた
めの官能基の広範囲をもたらす。官能基としては、アミ
ノ基、チオ基、カルｙ＋？キシ基が含まれる〇いくつか
の例では、官能基を導入し、ビリタン・モジが他のタン
ノＪ？りと結合（複合）するために、特にチオ基が、望
ましい。

接合する受容体もしくはリガンドの性質によって、同じ
くビリタンノｌりの性質によって、二つの成分の割合は
、広範囲に変化し、その場合１つのりガントもしくは受
容体に複数のビリタン・やり、ま九は１つのビリタンパ
クに複数のりガントもしくは受容体とな沙うる。小感い
分子、すなわち分子量が２，０００　ｄ以下の場合、一
般的に平均して少なくても１つおよび約１００以下、通
常、約６０以下で、１つのビリタンノやりと結合しうる
。大きい分子、すなわち少なくても約２，０００分子量
、更に、一般的には、少なくても約５，０００分子量、
リガンド屯しくけ受容体に対するビリタンパクの割合は
、広く変化し、複数のビリタンｌ？りは、接合体におい
て存在する可能性がありまたは、複数の結合対メン・ぐ
−は、複合体に存在すあ可能性がある。更に、いくつか
の例で、錯体は、共有的に小さいリガンドをビリタンパ
クに結合させることによって形成し、補体受容体をもつ
特異結合対錯体を形成し、その場合受容体は、ひき続い
ての錯体におけるリガンドもしくは受容体として作用す
る。

リガンドは、補体受容体があるために特に興味のある化
合物である。大部分、興味あるリガンドは、生理学的活
性をもち、自然に存在するか、またかは合成化合物であ
る。化合物の１グループは、分子量約１２５−２，００
０の範囲内にあり、更に一般的には約１２５−１，００
０および、薬剤、小さいペプチド、ビタミン、酵素基質
、補酵素、殺虫剤、ホルモン、脂質など広範囲な種類を
含む。

これらの化合物の大部分は少なくても１つのへテロ原子
、通常はカルコダン（酸素またはイオウ）または９素、
をもち、脂肪族、脂環式、芳香族、または複素環式、ま
たはそれらの組み合わせである。図示した化合物には、
エビネフェリン、プロスタグラシン、チロキシン、エス
トロゲン、コルチコステロン、ジギトキシン、アスピリ
ン、ペニシリン、ヒドロクロロチアジブ、キニジン、オ
キシトシン、ソマトスタチン、ジフェニルヒダントイン
、レチノール、ビタミンに１コパルアミン、ピオチンお
よびホラートが含まれる。

より大きな分子量の化合物、一般的には５，０００もし
くはそれ以上の分子ｆをもつ化合物には、ポリ（アミノ
酸）−Ｉリペプチドおよびタンパク−多糖類、核酸、お
よびその組み合わせ（例、グリコサミノグリカン、グリ
コタンパク、りがシーム）が含オれる。図示した化合物
には、アルブミン、グロブリン、ヘモグロビン、Ｔおよ
びＢ細胞のよ・うな細胞上の表面タンノ４り（例、Ｌｅ
ｕ、Ｔｈｙ＋Ｉａ＋）、１１頁膓％−３％抗原、α−フ
ェトタンノ等り、レチノール結合タンノぐり、Ｃ−反応
性タンパク、酵素、コレラ毒、ジフテリア毒、？ツリン
毒、蛇毒、テトロドトキシン、サックストキシのような
毒素、コンカナバリン、麦芽アグルチニン、および大豆
アグルチニンのようなレクチン、イムノグロブリン、補
助因子、リンパ液、ムコタンノ平り、ポリシャル酸、キ
チン、コラーゲン、ケラチンなどを含む。

標識化された分子に依存して、広い範囲にわたっての連
結基は、ビリタンパクの他分子への結合に用いられる。

小さい分子量をもつ大部＠２．０００分子量以下）は、
連結のために興味ある官能基は、カルブニル基（還元的
アミン化するためのアルデヒド）、またはカルブキシル
基、〔カルボジイミドと結合させるかもしくは活性化エ
ステルとして（例、Ｎ−ヒドロキシ、スクシニミド）〕
であり、ビリタンノ譬りに存在するアミン基と共有結合
を形成（チオエーテルまたはジスルフィド）シ、その場
合、ビリタンパクは、活性化オレフィンおよび加えられ
たメルカプト基または会合したメルカプト基（例、エル
マン試薬：インチオシアネート、ジアゾニウムニトレン
またはカルベン）で変性されうる。ビリタンパクりがタ
ンノ母りと接合する場合、種々の二官能性試薬、たとえ
ば、ジアルデヒド、テトラゾニウム塩、二価酸または類
似物が用いられ、または任意に、含まれているタン／４
’りの一方もしくは両方が、他のタンノ４りに結合（複
合）のため変性されうる〔例、メルカプト基が存在する
かまたは１つのタンパクに導入し、または活性化したオ
レフィン（例、マレイミド）ヲ他のタンノククに導入す
る〕。

広範囲の種類の化合物をタン・ｌりに接合させることに
関する参考文献があり、例としては、タン／ぐり、１１
人巻、３版、Ｎ、ノイラスおよびＲ，Ｌ。

ヒル編集、アカデミツク　プレス社、ページ。

１−１０３　（１９７６）：Ａ、Ｎ、グレゼルら、“タ
ンパクの化学変性″生化学および分子生物学における実
験テクニック、４巻、ノヤート１、Ｔ、Ｓ、ワークおよ
びＥ、ワーク編集、ノース、ホーランド、パブリッジユ
ング　Ｃｏ、（１９７５）：およびに２　　ベーターら
１、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　４６巻
、４２３−５１頁（１９７７）が挙げられる。実施例で
の市販用交叉一連結試薬は、ビーアメ１９８１−８２ハ
ンドブツクおよびピーアスカタログページ１６１−１６
６（ピーアスケミカルＣｏ−ｒ　　ロックフォード、イ
リノイ）に示されている。

前記載の既知の連結方法を用いることができる。

たとえばフィコビリタンパクをイミノチオランと反応さ
せ、それによって入りやすいスルフヒドリル基を導入す
る。接合体の他の成分は、スクシニミジルビリノルチオ
ゾロビオネートとの反応によりて、活性化されうる。二
つの製造された接合体の成分の混合物は、ジスルフィド
結合を通じて会合する。任意に、スクシニミジルピリノ
ルチオゾロビオネートを用いるかわりに、タンＩ？りを
無水マレインｉと反応させ、マレイミドを生成（形成）
させ、得られたマレイミドをチオエーテルを形成するた
めにスルフヒドリル、変性タンノ９りと結合させる。

前記載のように、興味ある特異結合対メンバーとビリタ
ン・！りとの共有結合のかわりに、非−共有結合を用い
ることができる。たとえば、所望ならば、ビリタンパク
とアビノンを結合させる場合、ビオチンを、共有的にカ
ルブニル基を通じて結合させ、得られたビオチニル化ビ
リタンツクをアビジンと結合させ、その際標識化したア
ビノンビリタンパクが得られる。

すでに述べたように、ビリタンノやりは、天然に存在す
る化合物であり広範囲な源（橿）に発見され、各々の源
（種）は、一つ以上のビリタンノＪ？りを含む。

本発明に係る有用なフィコピリタンノやりの例は、アロ
フィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリスリン、
アロフィコシアニンＢ、Ｂ−フィコエリスリン、フイコ
エリスロシアニンおよびｂ−フィコエリスリンである。

フィコビリタンパクの構造は研究されており、それらの
螢光スペクトル特性は、知られている。Ａ、Ｎ、グレー
デー、１ピリン補欠分子族を有する光合成補助タン・母
り”植物生化学、８巻、Ｍ、ＤハツチおよびＮ、に、　
＆−ドマン編集、アカデミツク　プレス社、５１−９６
　　頁（１９８１）、およびＡ、Ｎ、グレーデー、“フ
ィコビリタンパクに特別に関連のある光合成補助色素系
の構成および進展“、６タンノタク構造と機能の進展’
　Ｂ、Ｓ、ジグマンおよびＭ、Ａ、シラジェル、輪集、
アカデミツク　プレス社、ページ２２１−２４４（１９
８０）に記載されている。螢光発光最大値を含む分光特
性を、いくつかのありふれたフィコビリタンパクについ
て表１に示めす。

以下余白 特別に興味のあるのは、少なくても約４５０ｎｍの最大
吸収値をもつビリタンノ４りであり、好ましくは少なく
ても約５００　ｎｍで、少なくても１５ｎｍのストーク
、シフトをもち、好ましくは２５ｎｍであり、および少
なくても約５００　ｎｍの最大螢光発光値をもち、好ま
しくは少なくても約５５０　ｎｍである。実験材料であ
る接合体は、広範囲にわたる方法で用いられ、各々の分
子として、またはウィルス、細胞、組織、小器官（例、
成形原質、核など）のような複雑な有機体のなかに存在
している抗原の検出、診断、測定および研究のための既
知の方法論を進歩させる。実験材料としての接合体の使
用の一つは、細胞の螢光染色である。細胞は、顕微鍵下
に、特別な決定要素位置の存在の診断基準となる螢光体
の存在を観察することができ、または細胞は、螢光活性
化選別（ＦＡＣ８）においても用いられる。１つもしく
はそれ以上のビリタンパクを用いる場合は、ビリタン）
Ｊ？りの最大螢光発光が少なくても１５ｎｍ好ましくは
約２５、−れていることが良い。任意に、ビリタンパク
をビリタンパク以外のもの、たとえばフルオレセイン、
ダンジル、アンペリフェロン、ペンツオキサジアゾール
、ピレン、ローズベンガルなどのような螢光体と接合さ
せて用いることもでき、その場合、最大発光値が少なく
ても約１５　ｎｍ、好ましくは約２５ｎｍＭれているの
が良い。

螢光体の組み合わせを使用することによって、一つは、
特別な細胞型、生物体の系（種）、ウィルス株、天然の
複合体、または異なるタン・母り本しくは抗原との相互
作用などのような部分性凝集（サプセ、トーアグレｒ−
シ、ン）の検出ができる。特に興味のある組み合わせは
、同じレーデ−光源をもつ活性化されうるピリタンノ臂
りとフルオレセインとの組み合わせである。すなわち最
大吸収約４５０−５００ｎｍの範囲内（例、フィコエリ
スリン）にあるビリタンノやりである。

実験材料としてのビリタン・母りの他の使用は、免疫検
査もしくは拮抗タンパク結合検査においてであシ、その
場合実験材料としてのビリタ／ノやりは、螢光体標識化
物として作用する。ピリタンノ９りは、リガンドもしく
は受容体、特に抗体と結合する。一方、抗体の大部分に
ｘｇａ、であり、ＩｇＡ。

ＩｇＤ　、　ＩｇＥおよびＩｇＭのような他の抗体を使
用することができる。更に種々、天然に存在する受容体
を用いることもでき、特にアビジンのような高結合特異
性をもつ受容体が好ましい。受容体、ビリタンノ４りま
たは両方にビオチニル化することによって、アビジンを
経て、いろいろの分子に連結できる。広範囲の螢光分析
については知られている。それらの２，３は、米国特許
番号３，９９８．９４３　：３．９８５．８６７：３．
９９６，３４５：　４．０３６，９４６：４．０６７．
９５９：４，１６０，０１６および４，１６６．１０５
、開示されており、関連した部分は、参照として、明細
書にとりこまれている。

ビリタンパクは、多くの好ましい特性を持つ：（１）可
視領域の長波長側に、非常に高い吸収効率をもつ。

（２）高い螢光量子収率をもつ。

（３）非常に安定なタンパクりであシ、保管の安定性が
良い。

（４）水溶液における溶解性が高い。

（５）ビリタンパクユニットは、広範囲の生物学的特異
分子と容易にカップリングする。

（６）細胞と非特異的に結合しない。

ビリタンパク−生物分子接合体の螢光は、分子レベルで
、フルオレセイン接合体の強度の３０倍以上である。本
発明に係る長波長−発光−螢光接合体は短波長発光体よ
シも付加的な有利な点である。

細胞および体液におけるたいていの生物分子は、可視ス
ペクトルの赤端において吸収、および発光しない。結果
としてビリタンパク接合体は、より短波長で発光する接
合体より内因性生物分子による妨害を受けにくい。更に
、紫外領域よりもむしろスペクトルの歩測において容易
に測定でき、その理由としてはグラスチック物質は、吸
収しないし、黄→赤のスペクトル領域において、吸収、
発光しないことが挙げられる。

次に実施例は、図面の方法によ−て説明される　　　　
　　□“が、方法の限界を示めすものではない。

実施例１ 本発明の螢光接合体の例として、フィコエＩＪ　）リン
−イムノグロブリン接合体を調製した。フィコエリトリ
ンに２−イミノチロランを添加して、チオラート化フイ
コエリトリン（ＰＥ−８Ｈ）　　を調製した。２−ピリ
ジルジスルフィド基を含有する活性化イムノグロブリン
（、ＩｇＧ−８−８−Ｐｙｒ）　’ｋ、Ｎ−スクシニミ
ジル３−（２−ビリゾルジチオ）−ノロピオネ−）　（
ＳＰＤＰ）を添加して調製した＠次いでＰＥ−８ＨをＩ
ｇＧ−８−８−Ｐｙｒと混合することによシ、螢光接合
体（ＰＥ−８８−ＩｇＧ）を得た。パリアンＧ３０００
８Ｗカラムを用いた關圧液体クロマトグラフ　４−　（
ＨＰＬＣ”）により、生成物を分析した。このｒルＶ過
カラムは、主に、分子の流体力学的半径に従って、該分
子を分離する。ＰＥ−８Ｈは注入後１２分に溶出し、そ
してＩｇＧ−８−８−Ｐｙｒは約１３分に浴出する。Ｈ
ＰＬＣｆ−夕を示す第１図を参照されたい。反応生成物
ＰＥＰＥ−８−８−Ｉは８，５分にカラムから流出し、
接合体がいずれの成分よりもより大であるのでいずれの
反応体よりもよシすみやかに流出する。この接合体の試
料Ｑ、５１１の螢光発光は　１０１０Ｍ未満のフィコエ
リトリン接合体で容易に検出できた。

実施例２ フィコエリトリンーアビノン接合体の合成により、他の
生体分子へのフィコビリタン・ｅりの結合の第二の例を
示す。ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシ
ニミドエステル（ＭＢＳ）’ｒ：　添加することによシ
、アビジンを活性化し九〇ＭＢＳのエステル基を、アビ
ジン上の求核体と反応させた。次いで、チオラート化フ
ィコエリトリンのスルフヒドリル基を、活性化アビジン
分子上のマレイミド基と反応させた。未結合アビジンを
、カル−キシメチルセフアゾ、クスを用いたカラムクロ
マトグラフィーにより反応混合物から除去した。

実施例３ フィコエリトリンーアビジン接合体の合成に対する別に
方法により、他の生体分子に対するフィコビリ蛋白質の
結合の第三の例を示す。ビオチニレート化フィコエリト
リンを、フィコエリトリンとビオチンのＮ−ヒドロキシ
スクシニミドエステルとを反志せしめて得た。ビオチニ
レート化フィコエリトリンにアビジンを添加してフィコ
エリトリンービオチンーアビノン接合体（ｐｇ−ｎ−＊
）を得た・過剰のアビジンを、グル濾過によシ除去した
。

ビオチニレート化分子に強固に結合したＰＫ−Ｂ−Ａを
、次いでフルオロセンス−活性化分類実験における螢光
染色として用いた。イムノグロピリンＤ（ＩｇＤ）に対
し特異的親和性を有するビオチニレート化単りローン性
抗体を、牌臓細胞の混合物Ｋｔｆ＆加した０この単クロ
ーン性抗体は、約４０％の肺臓細胞の表面に存在する、
ＩｇＧ分子と結合する。

過剰の抗体を、洗浄して除去する。次いで、この細胞混
合物に、ＰＥ−Ｂ−人を添加する。この高螢光接合体の
アビジン単位は、抗−ＩｇＧイムノグロピリンを有する
細胞表面上のビオチン基と結合する。

この細胞個体群の螢光−活性化細胞分類分析は第２図に
示される。フイコエリトリン接合体によってラベルされ
た細胞の螢光強度を、平行して実験した螢光接合体で得
られたものと比較した。得られ友知見は、フィコビリタ
ンパクが、細胞の螢光分析に対して有効な長波長の螢光
標識であることを実証している。

実施例４ 上述のフィコエリトリンービオチンーアビノ／接合体を
、抗原を保有する螢光−染色ビーズに対しても使用した
。標的イムノグログリンに対し特異的親和性を有するビ
オチニｖ−）化率−クーロン性抗体を、共役的に結合し
た標的抗原を保有するアガロースビーズ（不浴性物質）
に添加した。

これらのビーズを洗浄し、次いでＰＥ−Ｂ−Ａを添加し
た。この螢光フィコビリタンパクり接合体で標識したビ
ーズを、螢光顕微鏡で検査した。螢光放出に対して企図
された標準のフィル−ター組合わせを用いて観察すると
、標識ビーズが黄色で出現した。より長波長のフィルタ
ーを用いると、標識ビーズはオレンジ−赤色で出現した
。螢光−アビジン標識ビーズおよびＰＥ−Ｂ−Ａ標識ビ
ーズの混合物も又＼螢光顕微鏡で検査した。ＰＥ−Ｂ−
Ａ標識ビー　　　　　１′１ズは、螢光標識ビーズから
容易に区別で舞た。何故なら、それらは螢光光学を用い
、緑色（第３１図）よりもむしろ黄色であったからであ
る。より長波長のフィルターウニ）（ｗｅｔ）′４を用
いると、ＰＩ−Ｂ−Ａビーズのみがわずかに染色され、
この場合オレンジ−赤色である（、第３ｂ図）。これら
の実験は、フィコビリタンパク−生体分子接合体が、螢
光顕微鏡に対する有効な螢光スティンである。

実施例５ フィコビリ蛋白質の１１製 Ｒ−フィコエリトリンを、紅色植物、ガストロクロニウ
ムコウルテリ（Ｇｉａｔｒｏｃｌｏｎ％ｕｍｃｏｕｌｔ
ｅｒｌ）（Ｒｈｏｄｙｍｅｎｉａｌｅｓ）（これは、Ｓ
目１１ｗａｔ＠ｒＣｏｖｅ＋　Ｍｏｎｔａｒｅｙ　Ｐｅ
ｎ１ｎｓｕｌａ＋ＣＡから採取された）から精製した。

新たにＦＡ製した植物組織を、蒸留水で洗浄し、…７．
０の燐酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ中に懸濁させ、次い
でオステライザー（Ｏｓｔｅｒｉｚｏｒ）プレンダーを
高速度に設定して３分間ブレンドした。ホモジュナイデ
ーを、数層のチーズ状布を通して濾過し次いで、残留し
た特定の物質を低速遠心分離で除いた。上澄み液を、固
形（ｘ４）２８０４　を用いて飽和の６（ｌにした。全
ての上記工程を４℃で行なった。沈殿物を遠心分離によ
り集め、ｐＨ７，０の燐酸ナトリウム５０ｍＭの（ＮＨ
４）２Ｓ０４ノロ０ｔｓ飽和液に再懸濁させ、次いでＤ
ＥＡＦ−セルロース（微少粒体；　Ｗｈａｔｍ・ａｎ　
＋Ｉｎｅ−＊　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ　Ｄｉｖ、、　Ｃ１１ｆｔｏｎ＋ＮＪ）を用いてスラ
リーにした。スラリーをカラムに充填した。ｐＨ７，０
の燐酸ナトリウム５０ｍＭ中の（ＮＨ４）２Ｓｏ４濃度
を減少させてカラムを段階的に展開し、飽和の１０％に
低下させた。この点において、ｐ）１７．０の燐酸ナト
リウム２００ｍＭで溶出は完了した。フィコエリトリン
は、ＰＩＮ７．０の１０チ飽和（ＮＨ４）２Ｓ０４−燐
酸ナトリウム５０ｍＭおよび−７，０の燐酸ナトリウム
２００　ｍＭの間で溶出した。

溶出液を、（ＮＨ４）２８０４　沈殿により濃縮し、−
７，０の燐酸ナトリウム５０ｍＭに再溶解し次いで（Ｎ
Ｈ４）２Ｓ０４　を４℃の飽和液に加えた。蛋白質は、
これらの条件のもとて４℃で放置することにより晶出し
た。

Ｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ　（Ｇｌａｚ＠ｒおよびＦ
ｒａｎｇ　＊Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、（１９７３年）２
４８：６５〜６６２）アナバエナ　パリアビリス（Ａｎ
ａｂａｅｎａ　ｖａｒｉａｂ…８）アロフィアシアニン
（Ｂｒｙａｎｔ等、Ａｒ　ｃ　ｈ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。

（１９７６年）１１０：６１〜７５）およびＢ−フィコ
エリトリン（Ｇｌａｚ＠ｒおよびＨｅｘｓｏｎ＋Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ　−Ｃｈｅｍ、（１９７７年）２５２：　３２〜
４２）を、上述の如く調製した。

実施例６ フイコエリトリンーアビジンの調製 ジメチルスルホキシドに溶解した１　ｈ；／　／　ａ／
のＮ−ヒドロキシルスクシニミドビオチン（Ｓｌｇｍａ
Ｃｈａｍｉｅａｌ　Ｃｏ−＋　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉａ＋　
ＭＯ又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ＋Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ＋
　ＣＡ）の５０ｔｔｅアリコートを、−７，５の燐酸ナ
トリウム５０ｍＭに溶解した２、７１１９７１のＲ−フ
ィコエリトリン（又ｄＢ−フィコエリトリン）ｌ紅に添
加し、試剤／フィコエリトリフモル比１３を得た。アビ
ノンおよびビオチンｔ−ｍ繊の研究に用いることば、す
でに開示されている（Ｇｒ＠ｅｎ＋　Ａｄｖ、Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、　（１９７５年）２９　：　８５〜
１３３　：　Ｈｅ　ｉ　ｔｚｍａｎｎおよびＲｉｃｈａ
ｒｄ＊＋ＰＮＡＳ　ＵＳＡ（１９７４年）７１　：　３
５３７〜３５４１）。

室温で３０分後、ｐＨ７，５の１００　ｒｎＭのグリシ
ル−グリシン１０μノを添加して反応を抑え、次いでビ
オチニレート化フィコエリトリン（Ｂ　ｉ　ｏ　ｔ　−
ＰＥ　）のこの混合物１ｍ／を−６，８の燐酸ナトリウ
ム５０ｍＭに対し４℃で３日間透析し次いで未変性フィ
コチリトリンを同じ緩衝液に溶解した５ダ／肩ｌのアビ
ジン１１に、攪拌しながらゆっくり加えた・フィコエリ
トリンに対する四量体のアビジンのモル比は２０であっ
た。フィコエリトリンーアビジン接合体（ＰＥ−アビジ
ン）、フィコエリトリノおよびアビジンの混合物を、高
圧液体クロマトグラフィーで分画した。

実施例７ １２５ｍＭの燐酸ナトリウム、１Ｊ（６，８に溶解した
３、６〜／　ｒａｌのＲ−フィコエリトリン１．２　Ｗ
Ｌｌに、　　　　　　　　Ｉ＋１５．５１１９／Ｒ１（
７）イミ／　ｆオー）　７塩酸塩（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、）（Ｊｕｅ＄％Ｂｉｏｃｈ＠ｍ１ｓｔ
ｒｙ（１９７８年）１７：５３９９〜５４０６）６００
ｄを添加して、チオラート化フィコエリトリンを調製し
た。

室温で９０分後、反応混合物を、ｐＨ６，８の燐酸ナト
リウム５０ｍＭに対し４℃で一昼夜透析し次いでｐ）１
７．５の緩衝液に対して２日間透析１．た。５．５’−
ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の少量の滴定によ
り、フィコヒリトリンに対するスルヒドリル基の平均含
量が８であることが判明した。

エタノールに溶解した１、１ｍｇ／ｍｌのＮ−スクシニ
ミジル３−（２−ピリジルチオ）−プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）（Ｐｈａｍｒｍａｃｉｉ　Ｆｉｎｓ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ　　＋Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ＋　Ｎ　Ｊ　）
（Ｃａｒｉｅｓｓ等、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。

（Ｔｏｋｙｏ）（１９７８年）　１７３　：　７２３〜
７３７　）３０μｊを、ｐＨ７，，５の燐酸ナトリウム
５０ｍＭに溶解した４、２■／ＩＬｌのイムノグロブリ
ンＧ７００μｌにｆＡ加した。イムノグロブリンは、　
　２ｍサブクラスのマウスの見アロタイプに対し特異性
を有する単クローン性の、１マウス抗−アロタイプ抗体
でありた。ＩｇＧに対する５ＰＤＰのモル比は５．３で
あった。

反応を室温で２．５時間行った。チオラート化フイコエ
リトリン（同じ緩衝液中の１．７１Ｒ９／ＩＩ／の４０
０μｌ）を、この反応混合物５００μｌに添加した。チ
オラート化フィコエリトリンに対する活性化ＩｇＧのモ
ル比は４．７であった。室温で１２時間後、８０ｍＭの
ヨード酢酸ナトリウム１００μｌを、残存するスルヒド
リル基をブロックするため添加し７た。

実施例８ フィコエリトリンー蛋白質入の製造 ０．１Ｍ燐酸ナトリウム−０，１Ｍ塩化ナトリウム（ｐ
Ｈ７，４）に溶解したＢ−フィコエリトリン（４，０８
〜／ＩＬｌ）０．５肩ｌに、無水メタノールに溶解した
５ＰＤＰ　（２，６５ｖｙ　５ＰＤＰ／ｍｉ　）　１０
　ｐｌを添加し、８ＰＤＰ／蛋白質モル比１０を得た。

２２℃で５０分間反応を行ない、そして１００ｍＭ燐酸
ナトリウム−０，１Ｍ　Ｎ＊Ｃ！、　（％１７−４　）
　テ平衡化しタセファデエクスＧ−２５（１，ＯＸｌ　
７ｃＩｎ）カラムに、反応混合物を適用することによシ
該反応を終了させた。同じ緩衝液を用いて溶出させたフ
ィコエリトリンピークを集めそして４℃で保存した。

１００ｍＭ燐酸ナトリウム−１００ｍＭ塩化ナトリラム
（ｐＨ７，４）に６％したスタフィロコ、ツヵスアウレ
ウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ　ａｕｒ＠ｕｉ　
）産生の蛋白質２■／ｄの０．５１に、上記メタノール
性５ＰＤＰ溶液２．６ｔｔｌ’ｋｔｆｋ加し、５ＰＤＰ
／３［１質モル比９．５を得た。２２℃で４０分後、Ｐ
Ｈ７，４（７）緩衝１１ＫｌｌＩ解した１　ｍＭ　＋７
）　）　ｆａｔ　）　Ｌ”ｆ　）　−ｋ　２５１１１を
添加した。２２℃で２５分後、反応混合物を上述の如く
ｒルｐ過に委ねそして蛋白質Ａのピークを採取した。

適尚量のフィコエリトリノー８−８−ピリジル誘導体お
よびチオラート化蛋白質入を混合し、蛋白質Ａに対する
フイコエリトリンのモル比に２を得た・反応混合物は０
．７７　ｑのフィコエリトリン／１および０．２７■の
蛋白質Ａ／Ｉｌｌを含有していた０２２℃で６時間後、
反応混合物を４℃で保゛　　存し次いでこのようにして
生じたフイコエリトリンー蛋白質Ａ接合体を爽に精製す
ることなく使用した。

実施例９ ＣＮＢ　ｒ−活性化セファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍ
ａｅｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｍ）のスラリー２
ゴに、５．２Ｑ／ｄのＩｇＧ　１．２　ｙｎｌを添加し
てＩｇＧ−セファロースビーズを調製した。免疫グロブ
リンは、見アロタイゾのマウスｒ　２　ｍ骨髄腫抗体で
あった。室温で２時間転倒混合後、１Ｍのグリシン（ｐ
Ｈ７，５）２鳳ｌを添加して反応を抑制した。次いでビ
ーズを徹底的ニ洗浄シた。オバルブミンーセ７アロース
ピーズおよびアビジン−セファロースビーズを同様にし
て１ｌｉｌｌｌした。オバルブミンーセファロースピー
ズをＮ−ヒドロキシスクシニミドピオチンと反応させて
、ピオチン−セファロースビーズを調製した。

分光測定 ぺ、ラマン２５型分光光度計（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ＋　Ｉｎｅ−＋　Ｆｕｌｌｓｒｔｏｎ＋
　ＣＡ　）で吸収スペクトルを測定した。ＤＣ８ＣＵ−
２補正発光スペクトルユニットを備Ｌｆｃ＝−キンーエ
ルマー４４Ｂ型螢光計、又はスペックフルオロローブ（
Ｓｐ＠ｘＦｌｕｏｒｏｌｏｇ）機器を用いて螢光スペク
トルを得た・エビ−イルミネーション光学を備えたツア
イスユニパーサール（ｚＩ量ａｍ　Ｕｎｉｖ＠ｒｓａｌ
）顕微鏡を用いて螢光鏡検法を行なった。

高圧液体クロマトグラフィー 分子の流体力学的半径に従って、主として分子を分離す
るパリアンＧ３０００８Ｗグル濾過カラムを備えたウォ
ーター（Ｗａｔｅｒｓ）機器を用い、高圧液体クロマト
グラフィー法によりカップリング反応を追跡した。分析
に対して２０μｇの蛋白質を１０〜２０μ！の容量で適
用した。調製用実験において、試料７５０μｌを適用し
そして４００μ！分画を集めた。溶離緩衝液は２００　
ｍＭの燐酸す）　ＩＪウム（ｐＨ６，８）であシ、そし
て流速はＩＷＬｌ／分であった。

リンパ球の螢光染色 ヒトの末梢系血液リン・９球を、Ｆｌｃｏｌｌ−Ｈｙｐ
ａｑｕｅ傾斜法を用いて調製した。回収した細胞の生存
数の計測は、細胞をアクリジンオレンジおよびエチジウ
ムプロミドで染色し次いで標準の螢光光学を用いて螢光
顕微鏡により螢光細胞を数えることによって行なった。

この染料組み合わせは、生存細胞を緑に死亡細胞をオレ
ンジ−赤色に染色する。細胞の個数は常に９５チ以上生
存に適していた。

この研究において用いた抗−ロイ（Ｌｓｕ）抗体は、全
ての単クローン由来のハイブリドマ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ
。

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　　＆　　Ｃｏ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　　Ｃｅｎｔｅｒ＋Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉ＠ｗ＋
　ＣＡ　）であった。緑色の螢光シグナルは、螢光化さ
れた抗体から直接由来した。

赤色の螢光シグナルは、フィコエリトリンーアピジンで
カラター染色されたビオチニレート化抗体から由来した
。螢光抗体の染色は一工程又は二工程で行なわれた。直
接に螢光化された抗体を、５％　（ｖｏＬ／ｖｏｔ）馬
牛清および０．２　ｆｂ　（ｗｔ／ｖｏｔ）アジドを含
有する、ＨＥＰＥＳ−緩衝化（１０ｍＭ）ＲＰＭＩ　−
１６４０媒地（フェノールレッドおよび一ビオチン不足
）の５０μｌ中１０６個の細胞と共に氷上２０分間イン
キュベートした。添加された抗体の量は、該細胞数を染
色するために最適であるように、予じめ決定された。二
色の染色に対し、直接に螢光化された抗体およびビオチ
ニレート化抗体の双方が、媒地５０μｊ中の１０６個の
細胞と共に氷上で２０分間インキュベートされた。課電
で細胞を２回洗浄後、フィコエリトリンーアビジン接合
体を、媒地５０μｌ中の細胞に添加した。最終的に細胞
を課電中３回洗浄する前に、該混合物を氷上で更に２０
分間インキュベートした。螢光−活性化細胞ソーターを
用い、細胞を螢光分析用媒触０．５ｗＬｌ中に再懸濁さ
せた。

螢光−活性化細胞分析 改良されたＢｅｃｔｏｎ＋　Ｄｌｃｋｉｎｓｏｎ社の螢
光−活性化細胞ソータ−（ＦＡＣ８ｎ）を、墜細胞の螢
光分析に対し、使用した。５６０ｎｍの二色性ミラーは
発光を短波長成分（「緑色」チャンネル）および長波成
分（「赤色」チャンネル）に分けた。３．５の１０進法
対数幅を有する対数的アングリファイヤーを両チャンネ
ルに対し使用した。電子工学的補償（Ｌｏｋｓｎ等、Ｊ
−Ｈｉｓｔｒｏｃｈ＠ｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。

（１９７７年）２５：８９９〜９ｏ７）は螢光益田を赤
色チャンネルにそしてフィコエリトリン益出を緑色チャ
ンネルに補正した。これらの補正されたシグナルは緑色
および赤色フルオロセンスとして言及されるであろう。

螢光（フルオロセンス）データは地勢図に以た等局線地
図と（７て示された・等局線は、線状スケールで細胞密
度を画いている。

マツプの領域における細胞数は、その領域における複数
の等局線によって示される一鎗に比例する。

この方法において必要としかつＦＡＣＳデータを示すコ
ンピュータープログラムハ、ウニイン　ムアー（Ｗｉｙ
ｎｅ　Ｍｏｏｒｓ）　（スタンファード大学）によりで
作成された。

ＰＥ−アビジン接合体は、フィコエリトリンをビオチニ
レート化し、次いで過剰のアビジンを添加することによ
り、調製された。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチ
ンの１３倍モル過剰を、フィコエリトリンと９０分間反
応させる場合、フイコエリトリンに対し平均１個のビオ
チンを導入した。

大過剰のアビジンを連続的に添加して得られ死灰　　　
　　旨！応混合物を、高圧液体クロマトグラフィーで分
析した。最初に、フィコエリトリンーアピジン接合体が
溶出し、続いてフィコエリトリン、そしてピオチニレー
ト化フィコエリトリン更にアビジンが、それらの流体力
学的半径を基にして予期しに如く溶出し九。反応混合物
は、実質的量のＰＥ−アビジン接合体（ピーク１および
ピーク２）、更にフイコエリトリン（ピーク３）および
アビジン（ピーク４）を含有していた。ピーク２はピオ
チニレート化フィコエリトリン１分子に結合したアビジ
ン１分子を含む接合体に対応し、一方ピーク１並びにピ
ーク１およびビーク２間の領域は、３又はそれ以上の蛋
白質分子から構成される接合体からなるように思われる
。ピーク２に対応する分画を集めそしてプールした。主
な種類は、ＰＥ−アビジンである。一部分がフィコエリ
トリンと反応せずそしてこの分画工程後、少量のアビジ
ンが残った。

ビオチンに対するこのＰＥ−アビジン調製能力を、それ
をピオナンーセ７丁ロースビーズに６加して試験した。

これらの架色ビーズはフィコエリトリンの強烈なオレン
ジ−赤色螢光特性を示した。アビジンをビオチン−セフ
ァロースビーズに先ニ添加すること、又はビオチンをＰ
Ｅ−アビジン接合体に先に添加することはこれらのビー
ズに対するＰＥ−アビジンの結合をブロックした。この
ことはそれらが螢光顕微鏡のもとて暗色に現われる事実
から明らかにされた。同様に、フィコエリトリン又はビ
オチニレート化フィコエリトリンのいずれかにより染色
されたビオチン−セフ丁ロースピードはオレンジ−赤色
スペクトル領域において螢光を発しなかった。これらの
実験、並びに手短かに論議されるべき螢光−活性化細胞
分析により、ＰＥ−アビノンがビオチンおよびビオチニ
レート化分子に特異的に結合していることが判明した。

更に、ＰＥ−アビジン接合体の定量的収量および放出ス
ペクトルは天然のフィコエリトリンのそれらと実質上同
じであった。５２０ｎｍで放出する１０１２Ｍのフィコ
エリトリン（又はフィコエリトリン接合体）の試料１　
ｒｒＵは、５７６ｎｍで螢光シグナルを与え、これは水
に対し６３１ｎｍでのラマン散乱の２倍の強さである。

かくして、標準のフルオレセンスキューペットにおいて
フィコエリトリン１６−１５モルが容易に検出できた。

フィコエリトリンの螢光強度をフルオレセインのそれと
比較することは興味あることである。色素の希溶液の螢
光強度ＦｉｃｘＱに比例し、ここでＣは励起波長でのモ
ル吸光系数であり、そしてＱは螢光定量的収量である。

４８８ｎｍ（アルゴン−イオンレーザ−光線）における
励起に対し：フィコエリトリンに対してε＝　１．２８
　Ｘ　１０６ｃｍ　’　Ｍ−’であり、そしてＱ＝０．
８２でおり：フルオレセインに対してε＝８　Ｘ、ＩＯ
’ｍ　’　Ｍ　’　であり、Ｑ＝０．９である。従って
、４８８ｎｍで励起されたフィコエリトリンの溶液はフ
ルオレセインの等モル溶液の螢光強度の１４．５倍＾い
螢光強度を有する。

観察された強度比は、また放出波長に関し検出システム
の効率にも依存する。フィコエリトリン／フルオレセイ
ン強に比ｌＯが測定され、この時これらの物質の等モル
溶液が細胞ソーターを通して流された。細胞に結合した
１０３分子のフィコエリトリンが流量血球計算の実験に
おいて検出できた。

ＩｇＧ−セファロースビーズは予期したように、フィコ
エリトリンータンノ母りＡ接合体で染色した後、明かる
いオレンジ−赤色螢光を示し友。何故なら、蛋白質入は
マウスｒ　２　ａイムノグロブリンのＦｅ部分と結合す
ることが知られている。ビーズのこの染色は溶解性Ｉｇ
Ｇ２ａの添加によって抑制された。同様に、単りローン
性抗−アロタイグの抗体とのフィコエリトリンの接合体
は、共役的に結合した標的イムノグロブリンを有するセ
ファロースビーズを染色した。これらのビーズは、屯し
も溶解性標的イムノグロブリンをフィコエリトリンー抗
体接合体に最初に添加するか、又は溶解性抗−アロタイ
グ抗体を最初にビーズに添加する場合、螢光性とはなら
なかった。かくして、蛋白質および抗−アロタイプの抗
体の特異的結合性が、フィコエリトリンとそれらの接合
体において保持された。

ＰＥ−アビジン接合体を、二色螢光−活性化細胞分析に
おいて赤色螢光スティンとして用いた・ヒ）　Ｔ　−Ｉ
Ｊンパ球の表面上のロイ（Ｌｅ　ｉ　）抗原（ＯＫＴ抗
原）の分布を調べた（ＬｅｕおよびＯＫＴ抗原の強度は
最近決定された。Ｌｓｕ−１＝ＯＫＴ　１　：　Ｌ＠ｕ
２　＝　ＯＫＴ　８　：　Ｌ＠ｕ　−３＝　ＯＫＴ　４
　：およびＬｓｕ−４＝　ＯＫＴ　３　）　Ｌ＠ｕ−１
およびＬｅｕ−２は全てのＴ−細胞に存在することが知
られておシ、一方Ｌ＠ｕ−２ｍおよびＬ＠ｕ−２ｂは、
サツルッサーおよび細胞傷害Ｔ細胞と関係している。Ｌ
・ｕ−１゜Ｌ＠ｕ　　２　＊　Ｌ＠ｕ　−３＋およびし
５ｕ−４の密度は、これらの抗原の一種に特異的である
螢光抗体を用いて細胞を染色し次いでこれらの細胞の緑
色螢光を測定することによυ決定された。Ｌ＠ｕ−３ｍ
の密度は、Ｌｅｕ”３ｍに対し特異的であるピオチニレ
ート化抗体で’ｌ’　＋　ＩＪンノや球を染色し、続い
てＰＥ−アビシンを染色し、続いて赤色螢光を測定する
ことにより確めた。対照の実験において、細胞を抗体で
はな（ＰＥ−アビジンで染色した。この点の原点近くの
ピークは、未染色の細胞が同じパターンを与える限りに
おいて、それらの細胞の自己螢光から由来する。かくし
て、ＰＥ−アビジンはこれらの細胞に対して重大な親和
性を有しない。これらの細胞を、螢光抗−Ｌｅｕ３ｂで
染色した結果は、二個めピークであ島原点近くの一方の
ピークはそれらの表面のＬｅｕ−３ｂがない細胞（〜５
０％）から由来し、そして他のピークはＬｅｕ−３ｂを
表わす細胞（〜５０９６）から由来する。

緑色シグナルは、Ｌｅｕ−３ｂネガチプ細胞の自己螢光
の５０倍の明かるさであり、一方それらの赤色シグナル
は同程度である。Ｔ−リンパ球をピオチニレート化抗−
Ｌｅｕ−３ｍで染色し、続いてＰＥ−アビジンで染色し
た場合、逆の結果が得られた。細胞表面にＬｅｕ−３ｍ
を有する？ＭＡ胞の赤色螢光はネガチプ細胞の３０倍高
いものであり、一方これらの二種の固体群の緑色シグナ
ルは同程度である。Ｌ＠ｕ３１およびＬｅｕ−３ｂに対
し同時分析の結果はいずれも抗原を表わさない細胞から
生じる原点近くのピークであり、そしてＬ＠ｕ−３ｍお
よびＬｅｕ−３ｂの双方を有する細胞から生じる他のピ
ークである。換ビすれば、Ｌｅｕ　−３ｍを表わすどの
細胞も又Ｌａｕ−３ｂを表わし、逆もそうである。３ａ
および３ｂは同じタン／＃り分子に関し非重複デテルミ
ナントであることが知られているからである。

ヒトの末梢系血液リンツク球に関するＬ＊ｕｌ＋Ｌ＠ｕ
−２ｍおよびＬｅｕ−４に関するＬｅｕ−３ｍの分布の
二色螢光−活性細胞分析も又行なりた。観察されたＬ＠
ｕｌ染色／ｌターンはこのドナーからの末梢性リンパ球
の〜６０チがＴ−細胞である＠何故ならＬｅｕ−１抗原
は、全てのヒトの末梢系Ｔ−細胞上に存在することが知
られている・Ｌｅｕ　−３ｍに対し染色することによっ
て得られる儂は全ての〒−細胞がＬｅｕ−３ｍ抗原を有
しないことを示している。約８０％のＴ−細胞はＬ＠ｕ
３ｍおよびＬｅｕ−１を有する。これらの二重ポジティ
ブ細胞はヘルツ４−および誘導物質Ｔ−細胞サす固体群
を含んでいる。Ｌｅｕ−２ｍおよびＬｅｕ−３＠の分布
に対し、別の結果が得られた。分析された全てのリンパ
球のわずか１ｏチは、Ｌｅｕ２ｍが、サブレ、サーおよ
び細胞傷害Ｔ−細胞サす固体群に関係する抗原であるこ
とを示している。Ｌｅｕ−２ｍおよびＬｅｕ３ｍに対す
る像はＴ−細胞がＬＨＩ　−２ａ又はＬ＠ｕ３ｍを宍ゎ
し、双方とも抗原でないことを実証している。この相互
の排斥は、特定のＴ−細胞がサグレッサーー細胞傷害又
はヘルツｆ−−鰐発物質細胞のいずれかで、双方ともで
ないことの事実と調和している。

Ｌｅｕ−４ａの分布は、予期される如（Ｌｅｕｌのそれ
に類似している。何故なら、Ｌ・ｕ−４は全てのヒトの
末梢系Ｔ−細胞上に存することが知られているからであ
る。Ｌｅｕ−３ａおよびＬｅｕ　−４を染色するに際し
、Ｌｅｕ−３ｍに対し陽性であることが判明した全ての
細胞は、Ｌｅｕ−４に対しても陽性であることが判明し
た。

上記結果は、ビリタン・９り接合体が分子の分析用の螢
光試剤の価値ある種類のものであることを実証している
。螢光−活性細胞ソーターの例は、ビリタンパクを用い
ることのできる分析の有用性および変化の特異的な証拠
である。４８８ｎｍのアルゴン−イオンレーザ光線での
フィコエリトリンの吸光係数は、高効率で螢光およびフ
ィコエリトリンを同時に励起することを可能とする。最
高の螢光放出はそれぞれ５１５ｎｍおよび５７６ｎｍに
あね、従ってそれらの発光寄与分は、適当外フィルター
によって容易に分離できる。フィコエリトリンを用いる
利点は、単色光のレーザー光線が二色分析に対七十分で
あることである。

フィコビリタンノ母り接合体は、２個のレーザー源を用
いて３個の）ｆラメ−ター分析を行なう可能性を開いて
いる。例えば、アロフィコシアニンは第三の螢光色素と
して役立つことができた。このような三色の実験におい
て、フルオロセインおよびフィコエリトリンは４８８ｎ
ｍアルゴンーイオン光線によって励起されそしてアロフ
ィコシアニンは〆イ（ｄｙｅ）レーザの６２５ｎｍ出力
により（又はクリプトン又はへリウムーネオンレーザー
によって）励起される。フィコビリタン・ダクの吸収お
よび発光スペクトルは、もしもＣ−フィコシアニン接合
体を用いる場合、４色の分析の可能性を示している。フ
ィコビリタンパクは、蛋白イムノアッセイに対し十分適
している。フィコエリトリンの如きフィコビリタンノ９
りのフェムトモル量の螢光を容易に検知できる。更に体
液および支持媒体からの背景螢光は、スペクトルの赤色
端への移行において著るしく減少する。フィコビリタン
ノ譬りのオレンジ−赤色発光はこの点において特に有利
である。更に、フィコビリタンＡりはペアの特異的結合
において、リガンド又はレセプターの作用を防害するこ
となく、あるいはフィコビリタンノ臂りの所望のスペク
トルの特性を失うことなく、多様のりがンドおよびレセ
プターに接合できる。

以上、本発明の明確な理解を目的として、本発明の詳細
な説明および実施例により詳説したが特許請求の範囲に
記載された範囲において、一定の変更および修正は可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図はフィコエリスリン−イムノグロブリン複合体、
その反応性前駆物質、およびチオラート化フィコエリス
リンの高圧液体クロマトグラムであり、 第２図はＰＥ−Ｂ−Ａ染色した細胞の螢光強度を表わす
グラフであり、 ９４３　ａ　図ｔｄ　ＰＥ−Ｂ−Ａ染色ビーズおよびフ
ルオレセインーアビノン染色ビーズの螢光顕微鏡写真で
あり、 第３ｂ図はＰＥ−Ｂ−Ａ染色ビーズの螢光顕微鏡写真で
ある。 特許出願人 ザ　ゲードオプ　トラスティーズオプ デ　リーランド　スタンフォード　ジュニアユニノ々−
シティ 肴許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　内　１）幸　男 弁理士　山　「Ｊ　昭　之 軒 Ｆｌ６　３ゑ ｌ Ｆｌにｗ　　３ｂ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５７年　特許願　　第１７４７１９号２、発明の名
称 螢光化合物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 （外　３名） ５、補正命令Ｏ日付 １穐補正 ６、補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）　　委任状 （３）明細書 ７、補正の内容 （１）（２）別紙の通シ （３）明細書の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の
目録 （１）訂正願書　　　　１通 （２）委任状及び訳文　　　　　　　各１通（３）浄書
明細書　　　　　　１通 手続補正書（方式） 昭和５８年４１２２日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年　特許願　　第１７４７１９号２、発明の名
称 螢光化合物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和５８都３月２９日（発送日） ６、補正の対象 （１）　　明細書の「図面の簡単な説明」の欄７、補正
の内容 （１）明細書第４６頁最下行、第４７頁第１行および第
３行の「染色ビーズ」をそれぞれ「染色ビーズ（粒子）
」に補正する。 １　′！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　リガンドおよびレセプターからなる特異的結合イ
   アのメンバーに共有結合的に共役したピリタン・ぐりを
   含んでなる、螢光化合物。 ２、上記メンバーがレセプターである、特許請求の範囲
   第１項記載の螢光化合物。 ３、上記レセプターが、細胞表面、抗原に対し特異的で
   ある、特許請求の範囲第２項記載の螢光化合物。 ４、上記レセプターが抗体である、特許請求の範囲第２
   項又は第３項記載の螢光化合物。 ５、上記特異的結合メンバーが、リガンドである特許請
   求の範囲第１項記載の螢光化合物。 ６゜特異的結合ペアのメンバーに共役した螢光化合物を
   試剤として用いる螢光イムノアッセイであって、そのア
   ッセイにおいて、リガンドおよびレセプターからなる特
   異的結合ペアのメンバ′−に共有結合的に共役したビリ
   タン・ぐりを含んでなる螢光化合物を用いることを含ん
   でなる、前記アッセイ。 ７、螢光標識用として、螢光体および第一の特異的結合
   ペアのメンバーを含んでなる螢光試剤を用い、第一の特
   異的限定部位を有する細胞を検出するための螢光法であ
   って、リガンドおよびレセプターからなる特異的結合ペ
   アのメンバーに共有結合的に共役したビリタンノ＋りを
   含んでなる螢光化合物を用いることを含んでなる、前記
   螢光法・８、　リガンドおよびレセプターからなる特異
   的結合ペアのメンバーに共有結合的に共役し九ピリタン
   ・やりを含んでなる螢光化合物と異なる吸収および発光
   特性を有しかつ第二の限定部位に結合する第二の特異的
   結合ペアのメンバーに結合された、第二の螢光試剤を用
   いる、特許請求の範囲第７項記載の螢光法。 ９、特異的結合ペアのメンバーに結合した螢光体を有す
   る螢光試剤を用いることによシ、限定部位又はレセプタ
   ーの存在を検出する方法であって、リガンドおよびレセ
   プターからなる特異的結合ペアのメン／４−　Ｋ共有結
   合的に共役１〜たビリタンノヤクを含んでなる螢光化合
   物を用いることを含んでなる、前記方法。