JPH04506703A - グリコシル化ヘモグロビンのアッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 グリコジル化ヘモグロビンのアッセイ 本発明は、グリコジル化ヘモグロビンを特異的に評価するためのリガンド結合ア ッセイに関する。

体液中に溶解しているタンパク質は絶えずグリコジル化過程に付される。グルコ ースは非酵素的反応によりタンパク質と反応して糖タンパク質を形成し、多くの 場合、糖タンパク質形成レベルは問題の体液中のグルコース濃度に比例する。タ ンパク質は最初に糖タンパク質としては合成されないので、グリコジル化形態で 存在するタンパク質分画は、 生体内のタンパク質の寿命、および タンパク質か暴露されたグルコース濃度の関数である。

サンプリング時のグルコース濃度についての情報のみを与える血液、血漿または 尿中のグルコース濃度の測定とは異なり、グリコジル化形態で存在するタンパク 質の量は、より長期間にわたるグルコース濃度の生体制御の指標を与える。

赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、　ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ）は約１２ ０日の平均寿命を有し、大量のヘモグロビンを含有している。したがって、グリ コジル化形態の赤血球ヘモグロビン分画は、真正糖尿病患者の病気を制御する良 好な基準てあり、採血の数週間前の患者の血中グルコース濃度の関数である。臨 床診療において、真正糖尿病患者の血中グルコースの長期制御を定量的に評価す るために、グリコジル化ヘモグロビン分画を測定するのに多くの異なる方法が用 いられている。

臨床上用いられている主な方法は次の方法である。

１、イオン交換クロマトグラフィーによるグリコジル化および非グリコジル化ヘ モグロビンの分離。これは提案された最初の方法であり、今でも最も普通に用い られている臨床方法である。この方法の欠点は、コストが高く、作製方法に時間 かかかると共に、分離の実施に時間がかかることであり、わずかな温度変化によ って結果が影響を受ける。

２、グリコジル化ヘモグロビン分画を特異的に単離するためのボロン酸誘導体の 使用。ボロン酸部分かシス−ジオール基を有する炭水化物部分に結合することは 久しい以前から知られており（Ｂｏｅｓｅｋｅｎ　Ｊ、、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　 ｉｎ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４．１８９−２１０゜ １９４９、Ｓｏｌｍｓ　Ｊ、およびＤｅｕｅｌ　Ｈ，、Ｃｈｉｍｊｃａ　ＩＬ　 ３１２．１９５７）　、この性質はアフィニティクロマトグラフィー分離のため の基礎として用いることができる。したかって例えば、ボロン酸基は、糖タンパ ク質、炭水化物およびヌクレオチドを分離するために、例えば寒天なとの固相上 に化学的に固定化されてきた（Ｈａｇｅｍａｎ、　Ｊ、およびＫｕｅｈｎ、Ｇ、 、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８０：　５４７．１９７７、）。このような 材料のカラムは、ヘモグロビンのグリコジル化分画の定量にも用いられた（Ｄｅ ａｎ　Ｐ、Ｄ、Ｇ、　＆　ａｌ、英国特許出願ＧＢ−Ａ−２０２４８２９β−細 書）。このようなカラムは作製に時間と費用かかかり、実行するのに時間かかか る。すなわち、溶血物をカラムに通過させねばならず、異なる分画を集めねばな らず、そして分画の容積を補正せねばならない。

その後で異なる分画のヘモグロビン含量を測定することかでき、グリコジル化形 態のヘモグロビン分画を計算することができる。

３、電気泳動。ヘモグロビンのグリコジル化はタンパク質の電荷を変化させる。

これはグリコジル化および非グリコジル化分画の分離に用いることかでき、これ に続いて異なる分画を例えば反射率測定により定量することかできる。この方法 も時間と費用がかかる。

真正糖尿病患者においては、赤血球内ヘモグロビンのグリコジル化に加えて血清 中のタンパク質のグリコジル化も高い割合で起こる。しかし、種々の血清タンパ ク質は生体内で異なる半減期を有し、これら半減期の大部分はヘモグロビンの半 減期よりも短いので、グリコジル化血清タンパク質の測定は、病気の調節を短期 間から中間的な期間、遡及して透視するためにしか用いられない。グリコジル化 血清タンパク質を定量するための種々の測定方法が、糖尿病制御の指数として広 く用いられている（Ｊｏｈｎｓｅｎ、　Ｍｅｔｃａｌｆ　＆　Ｂａｋｅｒ。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　１２７　（１９８２）　８７− ９５）。しかしグリコジル化血清タンパク質の定量は、臨床的価値を制限してき た。なぜならば大部分の血清タンパク質の寿命が短いからであり、このことはグ リコジル化形態についても同様に真実である。さらに技術的観点から、血清タン パク質に結合した炭水化物の定量は、毛細血管血のマイクロサンプリングによっ てのみ行うことのできる糖尿病患者の血中グルコース定量と比較して、実施する のに時間がかかり、やっかいな血清の回収と調製が必要である（静脈穿刺、２時 間の凝集、遠心分離および傾しゃ）。

グリコジル化ヘモグロビンを定量するためのいずれの従来方法も、絶対的な標準 方法として確立されるに至っていない。第１には、異なる公知方法で単離された 分画は正確には対応しない（”Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｓｙ ｌａｔｅｄ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏ ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ″Ｂ　ｏｕｒｉｏｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｏ ｌｏｇｉａ　２１：　５７９−５８０゜１９８１）。イオン交換法において、Ｈ ｂＡｌｃと命名された分画はしばしば「グリコジル化ヘモグロビン」と呼ばれる が、この分画は非グリコジル化ヘモグロビンをも含有することかあり、幾つかの グリコジル化ヘモグロビンは異なる分画に溶出される。

固定化ボロン酸基を用いるアフィニティクロマトグラフィーによれば、β−鎖の アミノ末端においてグリコジル化されたもっと一般的な分画に加えて、異なる基 においてグリコジル化されたヘモグロビン（例えばリジン基においてグリコジル 化されたヘモグロビンを含む）が単離される。しかし非グリコジル化ヘモグロビ ンはこの方法に用いられる固相と非特異的に結合するようになることもあり、そ してグリコジル部分が分子内に位置し、固相との結合に利用できないならば、す べてのグリコジル化ヘモグロビンが結合できるわけではない。したがって、グリ コジル化ヘモグロビンの定量に用いられる種々の方法は、異なる基準範囲値を有 する。

もう一つの問題は、幾つかの方法においては高濃度のグルコースかグリコジル化 分画の定量を妨害することである。

ヘモグロビンの前記グリコジル化分画（グルコースがヘモグロビンに共有結合し ている）に加えて、別のグリコジル化分画（グルコースかもっとゆるく結合して いる）かある。これらのグリコジル化へモク七ビンは、赤血球の洗浄または炭水 化物を含まない溶液中での赤血球のインキュベーションにより、あるいはグリコ ジル化ヘモグロビンをｐＨ５に曝すことにより、その形態が逆転しうるので、し ばしは「不安定な」グリコヘモグロビンと呼ばれる（Ｂｉｓｓｅ。

Ｂｅｒｇｅｒ　＆　Ｆｌｕｃｋｉｎｇｅｒ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３１：　６３ ０−６３３．１９８２）。しかしグリコジル化ヘモグロビンとて形成されたボロ ン酸エステルの幾何学的構造は、不安定な予備グリコジル化形態ではなく、非可 逆的にグリコジル化された形態で主に得られる。

アッセイの別の態様に関しては、固相上への抗体の固定化が、タンパク質および 細胞のイムノアッセイ技術およびイムノ精製に一般に用いられる。抗体はホモジ ニアスイムノアッセイに用いることもできる。すなわちこの場合は抗原と抗体の 両者が溶液中に存在しており、抗原／抗体反応を直接に（例えばネフェロメトリ ック法または比濁法により）、あるいは間接的に（蛍光または酵素の活性化もし くは阻害により）測定することができる。グリコジル化ヘモグロビンに対して特 異的なモノクロナールおよびポリクロナール抗体を用いる多くの試みがなされた が、限られた成功しか得られていない。これは主として、グリコジル化ヘモグロ ビンの炭水化物基の大部分かモノクロナール抗体との結合に容易に利用できない 化学的形態で存在するという事実のためである。したがって、このような結合を 得るために、例えばポリスチレン表面への吸着（Ｅｎｇｂａｅｃｋ　Ｐ、　＆ａ ｌ：　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：　９３−９７．１９８９ ）　、または化学的変性（Ｋｎｏｗｌｅｓ　＆　ａｌ：米国特許第４．６５８． ０２２　号明細書、１９８７）によるグリコジル化ヘモグロビンの変性がしばし ば必要である。

Ｂｕｒｎｅｔｔ　Ｊ、Ｂ、　＆　ａｌ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂ ｉｏｌ）ｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　ｖ ａｔ、　９６．　ｐ、　１５７−１６２．１９８０）は、蛍光性ボロン酸分子で あるＮ−（５−ジメチルアミノ−１−ナフタリンスルホニル）−３−アミノベン ゼンボロン酸を合成し、細胞の蛍光顕微鏡法によって、この化合物か細胞膜に結 合することを示した。

５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　はドイツ特許出願ＤＥ　３７２０７３６号明細書、１９ ８９年１月５日公告に、サンプル中に存在する総グリコジル化タンパク質を定量 するための、ホロン酸との蛍光性および着色したジアゾ接合体を記載している。

５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　法は、サンプル中に存在する総量タンパク質を測定する だめの下記の三つの原理の一つに基ついている１、存在する糖タンパク質のグリ コジル化部分に結合したときの、ポロン酸接合体の吸収極大の移動、あるいは２ 、蛍光性ボロン酸接合体か存在する総量タンパク質のグリコジル化部分に結合し たときの蛍光の極性変化、あるいは３、例えば活性炭を用いて過剰の未結合ボロ ン酸接合体を除去した後の、着色したまたは蛍光性ボロン酸接合体量の測定。

しかし、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　（同上）によって記載されたどの方法も、他の 糖タンパク質の混合物中における特定糖タンパク質の定量に用いることができず 、特に患者からの溶血サンプル中のグリコジル化ヘモグロビンの特異的測定には 用いることができない。さらに５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒにより記載された試薬は比 較的低い吸収係数を有し、それらの吸収極大はヘモグロビンの吸収極大と接近し ており、たとえ純粋な形態で存在していたとしても、グリコジル化ヘモグロビン の検出を困難または不可能にする。実際、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　は彼の方法を グリコジル化ヘモグロビンの分析に使用することについては言及しておらず、そ の代わりにヒト血清から抽出された総グリコジル化タンパク質およびグリコジル 化アルブミンの分析について述べている。

糖タンパク質と反応するレクチンも研究されてきたが、グリコジル化ヘモグロビ ンと特異的に反応し、かつグリコジル化ヘモグロビンの定量に有用であるレクチ ンは、これまで同定されていない。

したがって、使用するのに特異的で迅速で簡単であり、がっ臨床検査室での使用 に容易に適合されるグリコジル化へモグロビンアッセイの改良法に対する要求が ある。

本発明者らは、サンプルからのグリコジル化および非グリコジル化ヘモグロビン 分画を分離することと、グリコジル化分画だけを検出するボロン酸誘導体の特異 的な炭水化物認識特性とを組合わせることにより、有効かつ特異的なアッセイを 達成できることを見出した。

したかって、一つの態様からみて、本発明によれば、（ａ）　所望によりサンプ ルを溶血していずれかの細胞結合ヘモグロビンを遊離させる工程、 （ｂ）　該サンプルまたは下記工程（Ｃ）による該サンプルから回収されたヘモ グロビンを、シグナル形成ラベルに結合した１個または数個のジヒドロキシボル ニル基またはその塩の接合体からなるシグナル形成分子と接触させる工程、 （Ｃ）　グリコジル化および非グリコジル化ヘモグロビンおよびそれに結合した いずれかの分子を、サンプルまたは前記工程（ｂ）の反応混合物から分離する工 程、および （ｄ）　分離されたヘモグロビンに結合したシグナル形成分子、および／または いずれかの非−ヘモグロビン結合シグナル形成分子を評価する工程 を包含することを特徴とする、サンプル中のグリコジル化ヘモグロビンの評価方 法か提供される。

本発明の方法を実施するに際しては、サンプル中のグリコジル化ヘモグロビン濃 度を測定するほかに、存在するグリコジル化および非グリコジル化ヘモグロビン 濃度の評価を得ること、およびグリコジル化ヘモグロビンと総ヘモグロビンとの 比率を計算することか望ましいこともある。

ヘモグロビン分離工程では、サンプル中に存在するヘモグロビン（グリコジル化 および非グリコジル化）の総量の分離を必要としない。本方法を適切に較正する 限り、分離すべきグリコジル化および非グリコジル化分画の両者の割合たけて充 分である。このような較正は、臨床検査室アッセイにおいて日常的である。

本明細書において用いられるように、「評価（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」の用語は 、サンプル中のグリコジル化ヘモグロビン量または総ヘモグロビン量についての 絶対値を得る意味で、また、例えば総ヘモグロビン濃度に対するグリコジル化ヘ モグロビン濃度の指数、比率、パーセントまたは同様の指標を得る意味での両方 の定量を含むことを意図している。

本発明の新規方法では、非グリコジル化ヘモグロビン分画からのグリコジル化分 画の分離か回避され、その代わりに、サンプルからグリコジル化および非グリコ ジル化ヘモグロビンの両者を分離することに基づいていることか認められる。し たかって、シグナル形成体は分離システムの一部として用いられるのではないか らであり、実際、固定化しないことか好ましい。

本発明の方法は、健康な個体または真正糖尿病患者もしくは真正糖尿病擬似患者 の双方からの血液、血液溶血物または血液抽出物のサンプル中のグリコジル化ヘ モグロビン量を評価するために用いることかできる。本方法は、血液もしくは溶 血物、または他のグリコジル化タンパク質および／または糖タンパク質および／ または炭水化物を含有する他の混合物中のヘモグロビンと、グリコジル化へモク 七ビンとを評価するために特に有用である。サンプルは、分析の前は乾燥、液状 または凍結の形態にあってよい。本発明方法により分析するための溶血物は、例 えば種々の試薬を用いて溶血し、グリコジル化ヘモグロビンの炭水化物部分に結 合反応を受けさせることにより調製することがてきる。この処理は、本方法の実 施に必要な他の試薬を使用する前またはこの使用と組合せて行うことができる。

所望により、妨害を減少させるために、例えばグルコースオキシダーゼまたは６ より低いｐＨを有する緩衝液を用いてサンプルを処理し、存在する遊離グルコー スおよび／または不安定な糖タンパク質の量を減少させることかできる。

本発明の方法において、シグナル形成分子または接合体とヘモグロビンとの反応 は、ヘモグロビンをサンプルから分離する前でも後でも行うことかできる。選ば れる順序は、本方法の実施に用いるべき化学的装置または器具、およびさらに実 際的であると認められるものによる。

本発明の好ましい一態様においては、シグナル形成分子の結合およびヘモグロビ ンの単離は、均質溶液中で同時に行われ、この溶液からヘモグロビンか沈澱し、 遠心分離またはろ過により単離される。しかし反応および分離の条件は、グリコ ジル基−ボロン酸の会合定数の範囲内で選ぶ必要かあり、これは比較的低い（１ ０３−１０５ｍｏｌ”、ｌ）。

該シグナル形成分子から得られるシグナルの強度から、ヘモグロビンに結合した シグナル形成分子またはヘモグロビンから分離されたシグナル形成分子の濃度を 測定することができる。先に述べたように、グリコジル化ヘモグロビンの定量に ついてのＵ絶対的Ｊ基準はまだない。しかし所望により、従来技術の方法により 測定された既知濃度のグリコジル化ヘモグロビンを含有する標準溶液を用いて、 この新規方法を従来技術の方法に対して較正または補正することかできる。

シグナル形成分子または接合体は、有利には、シグナル形成ラベルに直接に結合 しているか、アミンまたはアミド結合、スペース部分、あるいはこの技術分野で 公知の任意の種類の化学結合により結合しているフェニルボロン酸基を含有し、 これらの結合または部分は、ジヒドロキシボルニル基をヘモグロビンのグリコジ ル部分のシス−ジオール基と自由に反応するようにしておくものである。ボロン 酸基のどのようなｐＫａ値か望ましいかに応じて、フェニル環は、例えばニトロ 基、ホルミル基、アルコキシ基により、あるいはｐＫａ値に影響を及はすかグリ コジル化ヘモグロビンのシス−ジオール基との結合を立体的に妨害しない他の置 換基によりさらに置換されていてもよい。

本発明のシグナル形成分子の合成に用いられるボロン酸基は、有利には、アミノ フェニル基例えばｍ−アミノフェニル基とボロン酸基から合成され、該シグナル 形成分子または接合体のラベルまたはシグナル形成部分との結合は、典型的には 、ジアゾニウムイオン形成、シラン化により、あるいはカップリング剤例えばグ ルタルジアルデヒド類、カルボジイミド類、ハロゲン化シアン、スクシンイミド 類または一般の化学文献に教示された他のカップリング剤を用いて得ることかで きる。シグナル形成ラベルは、ボロン酸基がグリコジル化ヘモグロビン分析物の シス−ジオールと自由に反応するようにしておく方法で結合され、そしてアミン またはジヒドロキシボルニル基土の他の反応性部分、例えばジメチルアミノアゾ −ベンゼンイソチオシアネートおよびジメチルアミノ−ナフタリンスルホニルク ロリドと反応性にさせるために、予め「活性化」することかできる。本発明のシ グナル形成分子は、水溶性を増大するためにさらに変性されていてもよい。

本発明により用いられるシグナル形成ジヒドロキシボルニル試薬は、好ましくは 固定化されていない形態で存在しており、そして化学的または物理的定量の目的 に使用できるシグナルを直接または間接的に形成しつる化学構造（ラベル）に直 接または間接的に結合したボロン酸基からなる。シグナル形成ラベルは、酵素、 好ましくは炭水化物のシス−ジオール部分を有しないか、またはシス−ジオール 基を有する分画を取り除いた酵素からなっていてよい。あるいはシグナル形成ラ ベルは、一部または全体が着色部分または蛍光性部分により構成されていてもよ い。ラベルとしての使用に好適な広範囲の着色化合物、蛍光性化合物または色素 化合物かこの技術分野で知られており、使用できる。好適な例には次のものか含 まれる。アントラキノン類、アゾ染料、アジン染料例えばオキサジン類およびチ アジン類、トリアジン類、天然に存在する色素例えばポルフィリン類、フィコエ リスリン類およびフィコシアニン類を含むフィコビリタンパク質、クロロフィル 類、およびこれらの類似化合物または誘導体、カロチノイド類、アクリニシン類 、フルオレセン類およびローダミン類を含むキサンチン類、インジゴ染料、チオ キサンチン類、クマリン類、ジーおよびトリーアリールメチン類を含むポリメチ ン類、およびこれらの誘導体、およびフタロシアニン類および金属フタロシアニ ン類。これらの化合物は、所望により、シグナル形成ラベルとボロン酸基との間 に介在するスペース部分により結合され、分析すべき糖タンパク質のシス−ジオ ールと自由に反応するようにしておく。

同様に、本発明に用いられる試薬のシグナル形成ラベル部分としては、広範囲の 放射性化合物を使用することができ、中でも特に沃素−１２５て標識された化合 物か挙げられる。これらの標識化合物は、有利には、フェニルボロン酸の炭素環 をｌ−１２５で標識することにより、またはアミノフェニルボロン酸を１−１２ ５標識用試薬、例えばよく知られたＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬に接合させ ることにより得ることかできる。このような放射性標識技術は、Ｂｏｌｔｏｎに よりＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１３３：　５２９−５３９．１９７３で概説され ている。本発明の方法を実施するに際しては、比較的高い試薬濃度が必要であり 、したかって本発明の多くの態様においては、！−１２５標識接合体を非放射性 ホウ酸または同一または異なる構造のボロン酸類と混合し、アッセイ用試薬の適 切な放射性レベルを得ることができる。

あるいは、公知方法でアッセイてきる化学ルミネッセンス性シグナルを生成しう る天然または合成化合物にボロン酸基を接合体させることができる（Ｃｏｒｍｉ ｅｒ、　Ｍ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎ ｄＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ　１９７３）　ｏ好適な化学ルミネッセンス性化合物には、蓚酸エステ ル、１．２−ジオキシエタン、ルミノールまたはこれらの誘導体が含まれるが、 これらに限定されるものではない。もし適当であるならば、過酸化水素、酵素、 例えばルシフェラーゼまたは他の化学物質を、用いられるシグナル生成分子から 化学ルミネッセンス性シグナルを生成させるのに使用することができる。

強アニオン性のシグナル形成接合体は、サンプル中に存在することのあるヒト血 清アルブミン（Ｈ３Ａ）のような血清タンパク質と結合する傾向を有するので、 本発明方法への使用には好ましくない。使用できる特に好適な例は、フルオレセ ンインチオシアネートとアミノフェニルボロン酸との反応により得られる接合体 であり、この反応の結果、遊離カルボン酸部分を有する接合体が生じる。他の好 適な接合体には次のものが含まれる。例えばｌ−エチル−３−（３−ジメチルア ミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）によりフルオレセンに接合されたア ミノフェニルボロン酸、ブロックされたカルボキシル基を有するフルオレセンイ ソチオシアネート、またはカルボン酸部分が除去されている場合にはアミノフェ ニルボロン酸に接合されたフルオレセンイソチオシアネート。例えばカルボジイ ミドによりアミノフェニルボロン酸に接合されたローダミンＢも使用できるか、 この接合体は、本発明方法によるアッセイにとって重要な大部分の溶液に対して 比較的劣った溶解度を有する。特に好ましいシグナル形成分子は、Ｎ−（レゾル フィン）−４−カルボニルピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステル（以下、ｒｅｓｏｓと略記する）であり、本発明者はこれをア ミノフェニルボロン酸に接合させ、そしてこれは優れた溶解特性およびタンパク 質との低い非特異的結合を提示することを示した。

この低いタンパク質結合は、アニオン性基の数か、接合体例えばＦＩＴＣ−アミ ノフェニルポロン酸接合体と較べて少ないためかもしボロン酸基 −Ｂ−（ＯＨ）２ は、その電気的中性の形ではしばしばジヒドロキシホルニル基と呼ばれ、ヒドロ キシルイオンの結合によりアニオン−Ｂ−（ＯＨ）、＝ を形成し、それ自体で塩を形成できる。本発明方法に用いられ、また本発明によ り提供される試薬は、試薬組成物のｐＨおよび電解質含有量に応じて、ボロン酸 のこれらの形態の１種または数種を有することかできる。ボロン酸かグリコジル 化ヘモグロビンのシス−ジオール基と結合するのは、アニオン形である。しかし ボロン酸基のアニオン強度は充分に低いので、タンパク質例えばＨ３Ａとの結合 の際に問題を起こすことがない。

本発明方法においては、ボロン酸との高分子量シグナル形成接合体の使用は、大 部分のグリコジル化ヘモグロビンのグリコジル化部分の利用性か制限されるので 、避けることか好ましい。すなわち、血液中のグリコジル化ヘモグロビンの実質 的分画は、ベータ鎖のＮ−末端バリンアミノ酸においてグリコジル化されており 、前記の米国特許第４６５８０２２号明細書に記載されているように、水溶性高 分子量分子には容易に利用されない。この特許は、グリコジル化基に抗体結合反 応を受けさせる極めて重要な変性の使用を教えている。

本発明方法の一態様によれば、ヘモグロビンに対して特異的な固定化結合タンパ ク質、例えばフィルター、膜、ビーズ、ゲル、マイクロタイターストリップ、チ ューブまたはプレートのような表面に、疏水性相互作用によるか、あるいは直接 の化学結合または第二抗体による化学的結合のいずれかにより結合させた、抗体 またはハプトグロビンなどを用いてサンプルから総ヘモグロビンを分離すること ができる。しかしこれは、ボロン酸と炭水化物のシス−ジオール基との間の会合 定数が、１０’−１０’ｍｏｌ−’、１の範囲にあるので（Ｅｖａｎｓ　＆　ａ ｌ：　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｖｈｅｍ、　９５：３８３．１９７９．　２ｉｔｔｌ ｅ　Ｃ。

Ａｄｖａｎ、　Ｅｎｚｙｍ、　１２：４９３．１９５１）　、それゆえ結合タン パク質の有効濃度は固定化されたときに比較的低く、ボロン酸とシス−ジオール 基との結合も対応して減少されるのて、好ましくない。したかって、補償のため に高結合能が必要であり、これを達成するのは技術上の観点から困難である。こ れはまた、結合能の低い固相、例えばポリスチレン表面の使用を制限する。しか し固相結合能は、ゲル、マイクロビーズまたは単位体積当り大きな表面積を有す る他のよく知られた固相の使用により増大させることかできるか、このような固 相は日常的な臨床使用にはあまり実際的でない。固定化されたヘモグロビン特異 的結合タンパク質をヘモグロビンの分離に使用する場合には、シグナル形成分子 をアルカリ性ホスファターゼ酵素ラベル以外のもので標識することか好ましい。

本発明のさらに好ましい態様において、ヘモグロビン（およびそれに結合したシ グナル形成分子）の分離は、例えば適切な沈澱剤を所望によりクロマトグラフィ ー、遠心分離またはろ通糸と組合せて用いることにより、均質溶液から総ヘモグ ロビンを選択的に沈澱させることにより達成される。したがってヘモグロビンの 分離は、固定化されていない特異的ヘモグロビン結合タンパク質、例えば特異的 モノクローナルまたはポリクローナル抗体、ヒトヘモグロビンに結合する任意の 種からのハプトグロビン、またはヘモグロビンに結合して沈澱を形成するかまた は溶液からヘモグロビンを除去する任意の他のタンパク質を用いて行うことかで きる。したかって、異なるエピトープと反応するモノクローナル抗体またはポリ クローナル抗体を用いて、ヘモグロビンとの沈澱を形成することかできる。第二 抗体を用いて、またはハプトグロビンと反応する抗体と組合せたハプトグロビン を用いて、沈澱を行うこともてきる。シス−ジオール部分を存しない抗体、シス −ジオール含有部分に関して枯渇された抗体、またはそれらの免疫反応性フラグ メントを好ましく用いることかできる。

しかしこの方法の欠点は、シグナル形成部分を含有するボロン酸とグリコジル化 ヘモグロビンのグリコジル化基との会合定数が、１０３−１０’　ｍｏ　１−’ 、１のオーダーでしかないので、比較的高い濃度の反応関与体か必要であり、そ の結果、試験当りの抗体またはハプトグロビンの消費か比較的多くなることであ る。

本発明の好ましい態様において、均質溶液からの特異的ヘモグロビン沈澱は、金 属カチオンまたは有機溶剤を用いて達成される。これは、極めて高濃度のヘモグ ロビンを使用でき、例えば遠心分離またはろ過により沈澱を容易に分離でき、そ して試薬か安価で有効であるという利点を有する。

このような−態様は、ヘモグロビンが極めて水溶性のタンパク質であるという事 実を使用するものであり、本発明者は、ある種の有機溶剤、例えば下記の溶剤の 使用により、ヘモグロビンを特異的またはほぼ特異的に沈澱させることができた 。この溶剤の例は、アルコール類例えばエタノールおよび／またはブタノール、 ケトン類例えばアセトン、エーテル類例えばジオキサンおよびテトラヒドロフラ ン等の環状エーテル類、アミド溶剤例えばジメチルホルムアミド、スルホキシド 溶剤例えばジメチルスルホキシド炭化水素溶剤例えばクロロホルムである。約６ ．５ｍｇヘモグロビンおよび１．５ｍｇ　ＨＳＡ／ｍｌとなるように希釈した全 血液（エタノール中の５０％ブタノール（Ｖ　／　Ｖ　）の添加によりブタノー ルの最終濃度を９％（Ｖ／Ｖ）にする）を沈澱させたときに、ヘモグロビンの９ ４％か沈澱したか、Ｈ３Ａは１％しか沈澱しなかった。このような沈澱は、シス −ジオール基に結合したボロン酸の損失なしに得られた。

ヘモグロビンの特異的沈澱は、タンパク質に結合して凝集させる金属カチオンを 使用して行うこともてきる。好適なカチオンには、亜鉛、あまり好ましくないか ニッケル、コバルトおよびカドミウムか含まれる。この手段で沈澱されたどのヘ モグロビンも、可溶化錯生成剤の添加により容易に再溶解できるという重要な利 点を有する。亜鉛イオンを用いると、全匍溶血物からヘモグロビンを実質的に特 異的に沈澱させることかできる。これは予期できなかった観察である。−例とし て、約６．５ｍｇヘモグロビンおよび１．　５ｍｇｌ５Ａ／ｍｌの存在下に２． ５−４ｍＭの亜鉛イオン濃度を用いることにより、特異的またはほぼ特異的なヘ モグロビン沈澱か得られる。しかし４ｍＭより高い亜鉛イオン濃度は、Ｈ３Ａの 実質的な共沈を引き起こす。これは下記に示す結果により説明される。

Ｚｎ濃度（Ｍｍ）　沈澱したＨｂ％　沈澱したＨ３Ａ％しかしイオン濃度は、用 いられるシグナル形成ボロン酸誘導体を妨害しないように注意深く調整すべきで ある。望ましい場合には、シグナル形成ボロン酸接合体と反応させる前に過剰の カチオンを除去するために、沈澱したヘモグロビンを所望により洗浄またはろ過 することができる。この反応順序は、比較的アニオン性のシグナル形成ボロン酸 接合体を用いる場合に特に好ましい。なぜならば過剰の亜鉛イオンとアニオン性 接合体との直接の結合が望まれない妨害を生じることかあるからである。亜鉛の ほかに、沈澱反応に用いられる緩衝液中で他の金属カチオンがそれ自体で沈澱せ ず、亜鉛イオンと同じ特異的ヘモグロビン沈澱能を有するならば、これら他の金 属カチオンを使用することもできる。

金属イオンか加水分解または試験溶液中の他の試薬との他の反応に関与する可能 性かあるため、金属カチオンが可溶性のままであり、ヘモグロビンの沈澱に利用 できることを保証するように沈澱を行う必要がある。

本明細書に記載したシグナル形成接合体の幾つかは、金属カチオンに電子対を供 与でき、それゆえに錯生成剤として作用する基を含有する。リガンド−金属錯体 を形成するこの能力は、反応を制御するために使用することができ、金属イオン を溶液中に保持し、金属とボロン酸シグナル形成誘導体との錯体の形成を防ぎ、 そして金属イオンの利用可能性および充分高い濃度を保証し、試験溶液中のヘモ グロビンの望ましい沈澱を与える。

リガンド濃度および種々の金属錯体の安定定数の両者を考慮する必要かあるので 、不溶性金属錯体（以下、Ｍｅ−錯体という）の形成を防止するために適切な緩 衝塩を用いることができる。

したかって弱い単座配位Ｍｅ−錯体を形成する緩衝塩が好ましく、こうのような 緩衝塩の例は、亜鉛と組合せた酢酸アンモニウムてあり、可溶性のＺｎ　（Ａｃ ）およびＺｎ　（ＮＨ，）錯体を形成する。

より強い錯生成剤、例えば多座キレート化配位子を緩衝液に添加することにより 、前記の全ての反応を試験溶液中で制御することかできる。錯生成剤は、種々の 錯体において必要なモル比が得られるように、そしてすべての反応関与体か最適 に働くことを保証するために他の添加物と調和するように添加される。さらに、 錯生成剤は、使用すべき特別の金属カチオンを考慮して、もしかして望ましくな い全ての副反応、例えば金属イオンの強すぎる錯生成を防止することを保証よう に選択すべきである。

キレート−Ｍｅ−錯体の安定定数は、試験溶液中のシグナル−ボロン酸接合体な どの他の可能性のある錯生成剤と競争するために充分高くなければならないか、 沈澱剤としての金属カチオンの利用可能性か減少し、あるいは阻害されるほど強 くてはいけない。

多くのキレート化剤を使用することができ、これにはエチレン−、プロピレン− またはブチレン−ジアミンまたはこれらの類似化合物、グリシン、アスパルテー ト、ニトリロアセテートヒスチジンおよびピコリネートか含まれる。幾つかの他 の天然または合成キレート化剤、例えば炭水化物、２個以上の配位基を有する有 機酸、アミノ酸ペプチド、フェノール性化合物等も使用できるが、これらのある もの、すなわちサリチレート、オギザレート、炭水化物例えばソルビトールおよ びタルタレートは、ボロン酸と錯体を形成することかでき、したがってシグナル −ボロン酸接合体との結合に関しグリコジル化ヘモグロビンと競合するため、好 ましくない。

多座キレート化配位子、例えばＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）、Ｃ ＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、　Ｎ、Ｎ’、Ｎ’− テトラ酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ｏ、ｏ’　−ビス（２−アミノ −エチル）　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、Ｎ’　−テトラ酢酸）、ＤＴＰＡ（ジメチレ ントリアミン−ペンタ酢酸）等も使用できるか、金属イオンとの錯生成能か強く 、ヘモグロビンの沈澱を著しく減少させるのて、事情によってはあまり好ましく ない。亜鉛イオンおよびグリシンを含有する酢酸アンモニウム緩衝液は、好まし い組合せの一例である。

本発明の種々の態様においては異なる錯生成剤が好ましいことかある。錯生成剤 、例えばＥＤＴＡおよびＤＴＰＡは好都合に使用できるが、ヘモグロビンの沈澱 に用いられる金属カチオンと組合せる場合には、その濃度を注意深く調整すべき である。クエン酸および蓚酸は、ボロン酸基と相互作用するためあまり好ましく ない。ヘパリンおよびフルオリトイオンは、使用できる他の例である。

有機溶剤または金属カチオンの前記の使用により、均質溶液から沈澱反応により 得られる沈澱は、遠心分離またはろ過あるいはこの技術分野でよく知られた他の 技術により、全体としてまたは部分的に分離することかできる。

ヘモグロビンを分離するためには、フィルター膜またはＴＬＣ−系も、例えばデ ィツプスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）または多層フィルムホーマットとして、 所望によりヘモグロビンを結合するためにその上に固定化された抗体もしくはそ の免疫反応性フラグメントまたはハプトグロビンとともに用いることができる。

一つの好ましい方法は、遠心分離によりヘモグロビンを分離し、次いで上澄液か ら沈澱を分離することである。その代わりに、ろ過を好都合に使用することかで き、これはフィルターを通してフィルター表面に対し垂直に、あるいはフィルタ ー内で接線方向にまたは半径方向に一次元的または二次元的分離法で行うことが できる。

薄層クロマトグラフィー法も使用てきる。この場合には例えば次のように操作す る。サンプルを好適なりロマトグラフィー用媒体、例えばテストトリップまたは ゲルに塗布し、そして試薬および洗浄液を例えばサンプルを塗布したと同じ場所 に塗布するかまたは溶離する。

さらに他の態様においては、フィルターまたは他の固相クロマトグラフィー用媒 体の上またはその中で、ヘモグロビンを溶液から直接に沈澱させることかでき、 この場合、沈澱の形成に続いてまたはこれと同時に、固相の上またはその中で沈 澱が析出しつる。沈澱工程の前、同時または後に、試薬を多孔性固相媒体に塗布 することができる。したがって例えば、試薬、例えば沈澱剤、シグナル形成ボロ ン酸試薬、溶血剤または錯生成剤を、任意の好ましい組合せにおいて、固相媒体 の中または上に、好ましくは乾燥状態で担持させることができる。このような試 薬を担持した固相クロマトグラフィー用媒体は、本発明の他の態様を形成する。

同相媒体を所望により洗浄することかでき、あるいは沈澱領域を通して溶離液を 溶離させることかできる。

全血液サンプル中の赤血球を溶血し、そしてグリコジル化へモグロビンとシグナ ル形成ポロン酸接合体との良好な化学的接触を保証するために、この技術分野で 多くの試薬および方法か知られており、使用できる。これには、低張性溶血、界 面活性剤、例えば非イオン性ポリエチレングリコールエステルまたはポリオキシ エチレンソルビトールエステル誘導体、例えば”Ｔｒｉｔｏｎ”および”Ｔｗｅ ｅｎ“、コール酸塩（エステル）もしくはドデシル硫酸ナトリウム、グアニジン 、加熱、超音波処理の使用、あるいはこれらの任意の組合せか含まれる。

シグナル形成ボロン酸接合体は、溶血処理工程の後でまたはこれと同時に、血液 溶血サンプルまたはこのようなサンプルから単離されたヘモグロビンと、アッセ イ用緩衝液中て接触または混合することができる。

多くのアッセイ用緩衝液、中でも特に反応混合物のｐＨを好適なｐＨに保持しう るリン酸塩緩衝液および他の緩衝液を用いることかできる。アッセイの好ましい ｐＨ範囲は７．５−１０．０であるか、望ましいｐＨは用いられる添加物、緩衝 塩および用いられるボロン酸誘導体のｐＫａ値に左右される。アミンを含有する 緩衝剤がジヒドロキシボルニル−シスジオール相互作用を強めるか、またはホウ 酸塩の見掛けｐＫａ値を低下させるのに役立ちうるという証拠がある。この事実 により、セリン、グリシン、Ｈｅｐｅｓ　（４−（２−ヒドロキシエチル）−１ −ピペラジン−エタンスルホン酸）、酢酸アンモニウム、モルホリンおよびタウ リンのような緩衝剤か好ましい。ジヒドロキシボルニル基−シス−ジオール基間 の相互作用をさらに促進するために、２価のカチオン、界面活性剤および力オト ロフィク剤のような添加物を用いて、電荷反発作用を減少させ、標的分子を安定 化し、疎水性相互作用を制限し、そしてグリコジル化ヘモグロビン中のジオール の利用性を高めることかできる。しかしトリスおよびエタノールアミンのような ある種の緩衝剤は、これらの緩衝化合物かホウ酸塩を錯化させ、ジオールか結合 するのを妨げるという事実があるために避けるへきである。リン酸塩−亜鉛のよ うなある種の緩衝剤／添加物の組合せもＺｎ３　（ＰＯ４）２のような不溶性化 合物を形成する可能性かあるため好ましくない。

本発明の方法は、４−３７°Ｃの温度範囲内で、得られる結果に有意な変化を生 じることなしに実施することができる。

本発明の方法は、該シグナル形成分子を評価または定量すること（すなはちシグ ナル読取り工程）、および所望によりグリコジル化ヘモグロビンおよび非グリコ ジル化ヘモグロビンの両形態で存在する総ヘモグロビンをも評価または定量する ことを伴う。本発明方法のどの態様を用いるかに応じて、ヘモグロビン結合シグ ナル形成分子または残った非ヘモグロビン結合シグナル形成分子からシグナルを 読取ることかできる。予め単離されたヘモグロビンに結合したシグナル形成分子 を評価することか最も実際的である。

ヘモグロビンに結合しているかまたはこれから分離されたシグナル形成分子の評 価は、シグナル形成ラベルの化学的性質に応じて、酵素活性、蛍光、放射線また は光学的濃度（吸光度）を測定するために普通に用いられる従来の化学装置によ り達成される。固相表面上の色または蛍光は、臨床化学において一般に用いられ る反射率測定法により容易に測定することかできる。ディツプスティックもしく はフィルターフォーマットまたは他の実用的な固相フォーマットにおいて、ヘモ グロビンおよび／または蛍光性または着色したシグナル形成接合体をその表面上 で直接に評価することかできる。あるいは沈澱または固定化したヘモグロビンお よび／またはシグナル形成ボロン酸接合体を再溶解し、溶液中で測定することも できる。

同様に、酵素活性を有するシグナル形成ボロン酸接合体は、固定化あるいは溶解 または再溶解された形態で、この技術分野でよく知られた酵素分析技術により評 価することができる。したかって、よく知られた放射分析法を用いて評価できる 放射性ボロン酸接合体についても同様である。

分離されたグリコジル化ヘモグロビンおよび非グリコジル化ヘモグロビンの両者 の濃度は、分離工程の前または後の反応混合物中の関連する波長における吸収に より測定することかでき、あるいは分離した分画中のヘモグロビン含量を測定す ることかできる。後者は、ヘモグロビンを再溶解したのち吸光度を測定すること により、あるいは分離した分画を必要に応じて固相上で反射率測定することによ り得ることかできる。ヘモグロビンの存在下に蛍光性シグナル形成分子を定量し ようとするならば、消光および発光波長はヘモグロビンの吸収波長の外側にある ことが好ましい。同様に、着色シグナル形成分子を用いる場合には、第１図〔ヘ モグロビン（１）およびＲＥＳＯＳ−アミノフェニルボロン酸接合体とヘモグロ ビンとの混合物（２）の吸収スペクトルを示す〕に示されるように、ヘモグロビ ンの吸収波長の外側の波長が好ましい。しかしヘモグロビンからの部分的干渉は 容認でき、２種以上の波長における測定値に基づく計算によって補正できる。

本発明の一つの態様において、ヘモグロビンおよび結合したシグナル形成ボロン 酸接合体は、マイクロビーズおよび／またはフィルターまたは他の固相上で単離 され、次いてヘモグロビンおよびシグナル形成ポロン酸接合体は、吸光測定また は蛍光測定のいずれかによって、反射率測定定量される。

本発明の他の態様においては、ボロン酸基またはその塩と反応する他の幾つかの 、大部分のまたはすべてのタンパク質を除去した溶血物のサンプルまたはアリコ ートか用いられる。例えば、サンプル中のグリコジル化ヘモグロビンを分析する 前に血漿タンパク質を除去するために、溶血前に血赤球を洗浄することかできる 。あるいは、全血液の溶血物をイオン交換固相セパレーターに曝して、ヘモグロ ビンより低い等電点および／または高い等電点を有するすべてのタンパク質を除 去することもできる。この精製は、所望により本発明方法を実施するための装置 またはキットの一部であってよい。

本発明の特別の態様におては、競合化合物の存在または不在においてヘモグロビ ンと結合しているシグナル形成分子または接合体の量か測定される。競合化合物 は任意のシス−ジオール含有分子、例えばソルビトールもしくはマンニトール、 またはシグナル形成活性を有しないボロン酸含有分子であってよい。

本発明の他の特別の態様においては、ヘモグロビンを分離する前および後の反応 混合物および／または分離された分画中に存在するシグナル形成分子の量が測定 され、ヘモグロビンとの結合により除去されたシグナル形成分子の分画を計算す ることが可能になる。

本発明は、比較的低い結合力（シス−ジオール部分とボロン酸基との間の会合定 数１０３−１０５ｍｏ　ｌ−１，１）に基づいているので、グリコジル化ヘモグ ロビンとシグナル形成ボロン酸接合体との間の化学量論的結合は起こらない。さ らに、本発明によれば、ヘモグロビンのすべてのグリコジル部分が、結合反応に より容易に評価される方法が提供され、したがって、従来法により通常得られる グリコジル化ヘモグロビンの分画二総ヘモグロビンの比率よりも高い結合したポ ロン酸接合体・ヘモグロビンの比率か得られる。

わずかな程度てはあるか、血液中の遊離炭化水素はボロン酸基に対して競合する ことかある。これらの効果は過剰のシグナル形成ボロン酸接合体の使用により減 少される。２０倍モル過剰が有利であるか、本発明のどの態様を用いるかに応じ て、より高い割合およびより低い割合も使用できる。もちろん、用いられる分離 技術の有効性に応じてバックグラウンドシグナルがあるだろう。極めて有効な分 離系を用いる場合には、より高い過剰を使用できる。極めて高い反応量与体濃度 を使用できない場合には、既知濃度のグリコジル化ヘモグロビンを有する標準を 用いて、および／または会合定数について正確な知識を用いて測定することによ り、グリコジル化ヘモグロビン濃度を計算すべきである。このような標準の使用 は、臨床検査室医学においては極めて一般的である。

また、本発明によれば、前記の方法を実施するための試薬組成物か提供される。

この試薬は、グリコジル化ヘモグロビンのグリコジル基と自由に反応する１個ま たは数個のボロン酸基を有し、かつシグナル形成ラベルと結合した分子を含有し 、このラベルは、前記のように酵素活性を有するか、着色しているか、蛍光性で あるか、化学ルミネッセンス性であるか、または放射性であることかできる。

本発明の他の態様によれば、 （ａ）　シグナル形成ラベルに結合した１個または数個のジヒドロキシボルニル 基またはその塩の接合体からなるシグナル形成分子を含有する試薬と、 （ｂ）　サンプルからヘモグロビンを分離するための手段とを、所望により緩衝 塩または緩衝液と組合せてなることを特徴とする分析試験用キットか提供される 。

（以下余白） 下記実施例および調製例は、本発明を限定することなく説明するためにのみ提供 される。

１、アミノフェニルボロン酸とのＮ−（レゾルフィン）−４−カルボニルピペリ ジン−４−カルボキシ環状酸−Ｎ−ヒドロキシスサクシンイミドエステル（ＲＥ ＳＯ３）の接合体溶液Ａ：　２ｍｇのＲＥＳＯ３を、０．５ｍｌのジメチルスル ホキシドに溶解した。

溶液Ｂ：　ｍ−アミノフェニルボロン酸の半硫酸塩を、ｐＨ８゜０の０．１Ｍ炭 酸Ｎａ緩衝液に１５ｍｇ／ｍｌ溶解した。ｐＨを８．０に調整した。

０．５ｍｌの溶液Ａを、２ｍｌの溶液Ｂに加えた。この混合物を室温で１２時間 インキュベートした。精製は、ＨＰＬＣて行った。

この接合体の構造を第２図に示す。

調製例２ ２、　アミノフェニルボロン酸とのフルオレセンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ ）との接合体 溶液Ａ：３゜９ｍｇのＦＩＴＣを、１ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解した。

溶液Ｂ：　ｍ−アミノフェニルボロン酸の半硫酸塩を、ｐＨ９゜５の０．２Ｍ炭 酸塩緩衝液に１．８６ｍｇ／ｍｌ溶解した。

１ｍｌの溶液Ａを、絶えず攪拌しながら１０ｍ１の溶液已に徐々に加えた。この 混合物を室温て最低２時間反応させ、Ｆ　ＩＴＣ−アミノフェニルボロン酸接合 体をＨＰＬＣて精製した。この接合体の構造を第３図に示す。

調製例３ ３、　沃素−１２５て標識されたポロン酸接合体Ａ：ｐ８７．５の５０ｍＭリン 酸Ｎａ中のアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）１０ｍｇ／ｍｌを、ＤＭＳＯ中 のＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ　（Ｂ　Ｈ）試薬１４．２ｍｇ／ｍｌと反応させ た。ＨＢをＡＰＢＡに同容量部になるまで徐々に加えた。この溶液を室温て１２ 時間インキュベートした。

Ｂ：　反応生成物を、逆層カラム上で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水 溶液中のメタノール勾配により分離した。

Ｃ：　単離されたＢＨ−ＡＰＢＡ反応生成物を、クロラミン−Ｔ法により１２’ 　Ｉ　−Ｎａ　Ｉで標識した。０．５ｍｌのＢＨ−ＡＰＢＡ分画を、ｐＨ７，５ の０．２５Ｍリン酸Ｎａ　Ｏ。

１ｍｌに加え、ｐＨを７．５に調整した。新たに調製したｐＨ７，５の０．２５ Ｍ　リン酸Ｎａ中のクロラミン−Ｔ（１０ｍｇ／ｍ１）０．３ｍｌのほかに、１ ０μｍの１２５１−Ｎａｌ　（１００μｃｉ）を加え、この混合物を１分間イン キュベートした。

Ｄ：ｐＨ７，５の０．２５Ｍ　リン酸Ｎａ中のジ亜硫酸Ｎａ（２４ｍｇ／ｍ１） ０．３ｍｌを加えて反応を停止した。

Ｅ　標識されたＢＨ−ＡＰＢＡを、０．１％ＴＦＡを含む水溶液中のメタノール 勾配により逆層クロマトグラフィーにて単離した。

調製例４ ４、　アルカリ性ホスファターゼとのボロン酸の接合体フェニルボロン酸か固定 化された寒天カラムを通過させることにより、ボロン酸と反応する酵素分子を除 去したアルカリ性ホスファターゼ１０ｍｇを、ｐＨ８，５の炭酸塩緩衝液中の３ ０倍モル過剰のビス−（スルホスクシンイミド）スベレートと混合し、室温で１ ２０分間反応させ、次いて１００倍モル過剰のモノエタノールアミンを加えた。

その４時間後、酵素接合体をゲルクロマトグラフィーにより精製した。

全血液溶血物からのほぼ特異的な ヘモグロビン沈澱を説明する例： 金属カチオン： 溶液Ａ：　最終濃度か６．４ｍｇヘモグロビン／ｍｌになるようにｐＨ８，０の ５０ｍ、Ｍ　酢酸アンモニウムに希釈した全血液溶血物。

溶液Ｂ：　１０ｍＭ　Ｃｕ”　の濃度になるように水に溶解したＣｕ　（ＳＯ２ ）。

溶液Ｃ：　ｌｏｍＭ　Ｃｕ２＋　の濃度になるように水に溶解したＺｎ（ＣＩ□ ）。

調製例５ ４０μｍの溶液Ｂを、２００μＩの溶液Ａに加えた。この混合物を室温で５分間 インキュベートし、ヘモグロビン沈澱を遠心分離により分離した。

調製例６ ４０μｍの溶液Ｃを、２００μｍの溶液Ａに加えた。この混合物を室温で５分間 インキュベー１−Ｌ、ヘモグロビン沈澱を遠心分離により分離した。

下記の本方法のすべての実施例において、本方法を、Ｊｅｐｐｓｏｎ。

Ｊ、０．　＆　ａｌ、　：　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ　３２／ １０．１８６７−１８７２．１９８８による古典的なイオン交換クロマトグラフ ィー（以下、「イオン交換」法と略記する）と比較した。

全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０゜０５％　Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００とともに１００ｍＭＨｅ　ｐ　ｅ　ｓｎを含むｐＨ９，０ の溶液にて、ヘモグロビン約８ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。エタノール中 の５０％ブタノール（Ｖ／Ｖ）と前記のＦＩＴＣ−アミノフェニルボロン酸接合 体との混合物を加え、最終ブタノール濃度を９％（Ｖ　／　Ｖ　）に、接合体濃 度を１．６ｘｌＯ−４Ｍにした。沈澱が形成され、これを遠心分離により上澄液 から分離した。この沈澱を、５％のジメチルスルホキシドを含有する０゜０５Ｍ 塩酸に再溶解し、ヘモグロビン濃度を吸光光度法により測定し、そしてＦＩＴＣ −アミノフェニルボロン酸接合体濃度を蛍光測定により検出した。既知濃度のヘ モグロビンおよびグリコジル化ヘモグロビンの標準溶液を用いて得られた較正曲 線において内挿することにより、ヘモグロビンおよびＦＩＴＣ−アミノフェニル ボロン酸接合体の濃度を計算し、そして総ベモグロビンに対するグリコジル化ヘ モグロビンのパーセントを計算した。

前記の方法を実施することにより得られた結果を下記に示す。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン４、　８　０．　２８４ １１、　７　０．　４３１ 実施例２ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液中に、ヘモグロビン約８ｍｇ ／ｍｌになるように希釈し、ＦＩＴＣ−アミノフェニルボロン酸接合体を加えて ２ｘｌＯ−’Ｍの最終濃度にした。サンプルを３０分間インキュベートし、エタ ノール中の５０％ブタノール（Ｖ　／　Ｖ　）を加え、最終ブタノール濃度を９ ％（Ｖ　／　Ｖ　）にした。

沈澱が形成され、これを遠心分離により上澄液から分離した。この沈澱を、５％ のジメチルスルホキシドを含有する０、０５Ｍ　塩酸に再溶解し、ヘモグロビン および接合体の濃度を実施例５に記載のようにして測定した。

ＦＩＴＣ−アミノフェニルボロン酸接合体の特異性を証明するために、実施例２ に記載のようにして本方法を実施し、ただし、競合する０、ＩＭ濃度のソルビト ールを加えた。これは、接合体のヘモグロビンに対する低くくて非特異的な結合 を生じ、これらの結果は、下記のように、グリコジル化ヘモグロビン含有量の高 いサンプルと低いサンプルとの間て差異を示さなかった。

ソルビトールを添加せずに得られた結果：グリコシル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビンソルビトールを添加して得られた結果 ：グリコシル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン１１、　４　０．　０８３ 実施例３ 実施例１に記載のようにして本方法を実施し、ただし、沈澱を遠心分離により分 離する代わりに、沈澱したサンプルをろ過により分離した。全血液のサンプルを 溶血し溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と １００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓとを含有するｐＨ９，０の溶液中に、ヘモグロビン約８ ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。エタノール中の５０％ブタノール（Ｖ／■） とＦＩＴＣ−アミノフェニルポロン酸接合体との混合物を加え、最終ブタノール 濃度を９％（Ｖ／Ｖ）に、接合体濃度を１．　６ｘｌＯ−４Ｍにした。沈澱か形 成され、これをろ過により単離した後、単離されたヘモグロビンおよびＦＩＴＣ −アミノフェニルボロン酸接合体を定量した　下記の結果が得られた。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン１１、　７　０．　２２６ 実施例４ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０゜０５％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００と１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓとを含有するｐＨ９，０の溶液中 に、ヘモグロビン約８ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。エタノール中の５０％ ブタノール（Ｖ／Ｖ）と前記のＲＥＳＯ３−アミノフェニルボロン酸接合体との 混合物を加え、最終ブタノール濃度を９％（ｖ　／　ｖ　）に、接合体濃度を１ ．　６ｘｌＯ−４Ｍにした。沈澱が形成され、これを遠心分離により上澄液から 分離した。この沈澱を、５％のジメチルスルホキシドを含有する０゜０５Ｍ　塩 酸に再溶解し、ヘモグロビンおよびＲＥＳＯ３−アミノフェニルボロン酸接合体 の濃度を吸収測定法により測定した。既知濃度のヘモグロビンおよびグリコジル 化ヘモグロビンの標準溶液を用いて得られた較正曲線において内挿することによ り、ヘモグロビンおよびＲＥＳＯ３−アミノフェニルボロン酸接合体の濃度を計 算し、そしてグリコジル化ヘモグロビンのパーセントを計算した　本方法を前記 のように実施したときに、下記の結果が得られた。

グリコジル化ヘモグロビン９６　モル比（イオン交換法）　接合体／ヘモグロビ ン１１、　２　０．　２９４ 実施例５ 実施例４に記載のようにして本方法を実施し、ただし、沈澱を遠心分離により分 離する代わりに、沈澱したサンプルをろ過により単離した。全血液のサンプルを 溶血し溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と ｌｏｏｍＭ　Ｈｅｐｅｓとを含有するｐＨ９，０の溶液中に、ヘモグロビン約８ ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。エタノール中の５０％ブタノール（Ｖ／Ｖ） とＲＥＳＯ８−アミノフェニルボロン酸との混合物を加え、最終ブタノール濃度 を９％（Ｖ／Ｖ）に、接合体濃度を１．６ｘｌＯ−’Ｍにした。沈澱か形成され 、これをろ過により単離した後、単離されたヘモグロビンおよびＲＥＳＯ３−ア ミノフェニルボロン酸接合体を定量した。

下記の結果か得られた。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン１３．０　１３６７ 実施例６ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０゜０５％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００と０．２５Ｍ酢酸アンモニウムとを含有するｐＨ９，０の溶 液中に、ヘモグロビン約８ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。この溶血ヘモグロ ビン溶液に、３０ｍＭＺｎｃ１□および５０ｍＭ　グリシンの溶液中のＲＥＳＯ ３−アミノフェニルボロン酸接合体１．６ｘｌＯ−’Ｍを加え、沈澱を形成させ た。この沈澱を遠心分離により上澄液から分離した後、ｐＨ９゜０の３０ｍＭ　 ＥＤＴＡを含有する０、２５Ｍ　酢酸アンモニウム緩衝液に再溶解した。ヘモグ ロビンおよびＲＥＳＯ３−アミノフェニルボロン酸接合体の濃度を、吸収分光光 度法により測定した。

結果は下記のとおりであった。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン４、　９　０．　３８４ １３、　０　０．　４４９ 実施例７ 実施例６に記載のようにして本方法を実施し、ただし、沈澱したヘモグロビンを ろ過により分離した後、ヘモグロビンおよびＲＥＳＯ８−アミノフェニルボロン 酸接合体を定量した。

実施例８ Ｈｅｐｅｓ緩衝液中で溶血した血液を、沃素−１２５で標識されたボロン酸接合 体に加えた（上記参照）。ヘモグロビン濃度は８ｍｇ／ｍｌであった。

３０分間インキュベートした後、２２μｍのエタノール：ブタノール（１：　１ ）を加え、沈澱したヘモグロビンを遠心分離により分離した。

この沈澱をＨＣ１／ＤＭＳ○／水の添加により再溶解し、ヘモグロビン含有量お よび放射能を測定した。

放射能／ヘモグロビン比とグリコジル化ヘモグロビン含存量との間に有意な相関 関係かあることか認められた。

実施例９ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０゜０５％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００と１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓを含有するｐＨ９，０の溶液中に 、ヘモグロビン約８ｍｇ／ｍｌになるように希釈した。ＲＥＳＯ３−アミノフェ ニルボロン酸接合体を加えて最終濃度を２ｘｌＯ″４Ｍとなし、ＣｕＳ○、を加 えて最終濃度を２ｍＭとなし、沈澱を形成させた。この沈澱を遠心分離により上 澄液から分離した。この沈澱を、５％のジメチルスルホキシドを含有する０、０ ５Ｍ　塩酸に再溶解し、ヘモグロビンおよびＲＥＳＯ３−アミノフェニルボロン 酸接合体の濃度を実施例１に記載のようにして測定した。

結果は下記のとおりてあった。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン４、　６　０．　５２４ １２、　０　０．　６１７ 実施例１０ 全血液のサンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、すなわち０゜０５％Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００と１００ｍＭ酢酸アンモニウムとを含有する溶液中に希釈し た。ＦＩＴＣ−アミノフェニルボロン酸接合体を加えて最終濃度を２ｘｌＯ”Ｍ にした。イソプロパツールを加えて最終濃度を３３％（ｖ／ｖ）となし、沈澱を 形成させた。

この沈澱を遠心分離により上澄液から分離した。この沈澱を、５％のジメチルス ルホキシドを含有する０、０５Ｍ　塩酸に再溶解し、ヘモグロビンおよびＦＩＴ Ｃ−アミノフェニルボロン酸接合体の濃度を実施例１に記載のようにして測定し た。

結果は下記のとおりであった。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン４、　８　０．　２６０ １２、　５　０．　３９８ 実施例１０に記載のようにして本方法を実施し、ただし、テトラヒドロフランを 添加して最終濃度を５０％（Ｖ／Ｖ）にすることにより沈澱を形成させた。

結果は下記のとおりであった。

グリコジル化ヘモグロビン％　モル比 （イオン交換法）　接合体／ヘモグロビン４、　８　０．　２５５ １２、　５　０．　４２９ 実施例１２ 実施例１Ｏに記載のようにして本方法を実施し、ただし、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホ ルムアミドを添加して最終濃度を１５％（Ｖ／Ｖ）にすることにより沈澱を形成 させた。

結果は下記のとおりであった。

グリコジル化ヘモグロビン９６　モル比（イオン交換法）　接合体／ヘモグロビ ン４、　８　０．　１９７ １２、　５　０．　２１１ 第　１　図 （２）　ヘモグロビン／Ｒｅ５ｏｓ−アミノフェニルボロン酸接合体第２図 第　３　図 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月１１

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）所望によりサンプルを溶血していずれかの細胞結合ヘモグロビンを遊 離させる工程、 （ｂ）該サンプルまたは下記工程（ｃ）による該サンプルから回収されたヘモグ ロビンを、シグナル形成ラベルに結合した１個または数個のジヒドロキシボルニ ル基またはその塩の接合体からなるシグナル形成分子と接触させる工程、（ｃ） グリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビンおよびそれに結合したいずれか の分子を、サンプルまたは前記工程（ｂ）の反応混合物から分離する工程、およ び（ｄ）分離されたヘモグロビンに結合したシグナル形成分子、および／または いずれかの非−ヘモグロビン結合シグナル形成分子を評価する工程 を包含することを特徴とする、サンプル中のグリコシル化ヘモグロビンの評価方 法。
2. ２．上記シグナル形成分子が固定化されていないことを特徴とする特許請求の範 囲第１項に記載の方法。
3. ３．工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行うことを特徴とする特許請求の範囲第１ 項または第２項に記載の方法。
4. ４．サンプルから分離されたグリコシル化および非グリコシル化ヘモグロビンの 量を評価する工程をさらに包含することを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項 のいずれかに記載の方法。
5. ５．上記総ヘモグロビンを、均質溶液からの選択的沈澱により分離することを特 徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．形成された沈澱を、クロマトグラフィーまたはろ過媒体により分離すること を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．沈澱工程を固相クロマトグラフィーまたはろ過媒体上またはその中で行うこ とを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方法。
8. ８．上記クロマトグラフィーまたはろ過媒体が、ヘモグロビン沈澱剤、特許請求 の範囲第１項で定義したシグナル形成分子、溶血剤および錯生成剤から選ばれた １種または数種の試薬を担持していることを特徴とする特許請求の範囲第６項ま たは第７項に記載の方法。
9. ９．亜鉛イオンおよび／または銅イオンおよび／または他の特異的ヘモグロビン 沈澱金属カチオンの添加により、ヘモグロビンを沈澱させることを特徴とする特 許請求の範囲第５〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．金属一錯生成剤を添加することをさらに包含することを特徴とする特許請 求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．有機溶剤または有機溶剤混合物を、実質的に特異的にヘモグロビンを沈殿 させることのできる濃度で添加することにより、ヘモグロビンを沈澱させること を特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
12. １２．上記溶剤が、水混和性アルコール類、ケトン類、エーテル類、アミド溶剤 、スルホキシド溶剤、炭化水素溶剤、ハロゲン化溶剤またはこれらの混合物から 選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．ヘモグロビン−特異的結合タンパク質の添加により、ヘモグロビンを沈澱 させることを特徴とする特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
14. １４．抗−ヘモグロビン抗体またはハプトグロビンまたはこれらのフラグメント を用い、所望により第２の抗体または抗−ハプトグロビン抗体またはこれらのフ ラグメントの存在下に、ヘモグロビンを沈澱させることを特徴とする特許請求の 範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．固相上に固定化されたヘモグロビン−特異的結合タンパク質により、ヘモ グロビンを沈澱させることを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに 記載の方法。
16. １６．上記シグナル形成分子を、アルカリ性ホスファターゼ酵素ラベル以外のも ので標識することを特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．ジオール含有化合物またはジヒドロキシボルニル基含有化合物のような競 合剤の存在下に実施することを特徴とする特許請求の範囲第１〜１６項のいずれ かに記載の方法。
18. １８．界面活性剤またはグアニジンの添加による低張性溶解、加熱、超音波処理 またはこれらの任意の組合せにより、溶血を行うことを特徴とする特許請求の範 囲第１〜１７項のいずれかに記載の方法。
19. １９．上記シグナル形成分子が化学ルミネッセンス性、蛍光性、着色性または放 射性であるか、あるいは酵素活性を有することを特徴とする特許請求の範囲第１ 〜１４項および第１４項のいずれかに記載の方法。
20. ２０．上記シグナル形成分子を、Ｎ−（レゾルフィン）−４−カルボニルピペリ ジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＲＥＳＯＳ） または他のオキサジンで標識することを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記 載の方法。
21. ２１．試験すべきサンプル以外の、用いられる１種または数種の反応関与体が、 ジヒドロキシボルニル基と反応する分子を除去されていることを特徴とする特許 請求の範囲第１〜２０項のいずれかに記載の方法。
22. ２２．放射性または化学ルミネッセンス性シグナル形成ラベルに結合している、 １個または数個のジヒドロキシボルニル基またはその塩の接合体からなるシグナ ル形成分子を含有する試薬。
23. ２３．Ｎ−（レゾルフィン）−４−カルボニルピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＲＥＳＯＳ）または他のオキサジンに結 合している、１個または数個のジヒドロキシボルニル基またはその塩の接合体か らなるシグナル形成分子を含有する試薬。
24. ２４．亜鉛イオンまたは他のヘモグロビン沈澱金属カチオンを添加することを包 含することを特徴とする均質溶液からヘモグロビンを沈澱させる方法。
25. ２５．錯生成剤を添加することをさらに包含することを特徴とする特許請求の範 囲第２４項に記載の方法。
26. ２６．（ａ）シグナル形成ラベルに結合しているとともに、１個または数個のジ ヒドロキシボルニル基またはその塩の接合体からなるシグナル形成分子を含有す る試薬と、 （ｂ）サンプルからヘモグロビンを分離するための手段とを、所望により緩衝塩 または緩衝液と組合せてなることを特徴とする分析試験用キット。
27. ２７．上記ヘモグロビン分離手段（ｂ）が、亜鉛イオンおよび／または銅イオン および／または他のヘモグロビン特異的沈澱金属カチオン、ヘモグロビンを沈澱 させることのできる有機溶剤または有機溶剤混合物、または所望により固体支持 体上に固定化されたヘモグロビン−特異的結合タンパク質またはそのフラグメン トから選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第２６項に記載の試験用キット 。
28. ２８．ヘモグロビン−分離試薬として亜鉛または他のヘモグロビン−沈澱金属イ オンを含有し、錯生成剤をさらに包含することを特徴とする特許請求の範囲第２ ６項に記載の試験用キット。
29. ２９．上記試薬（ａ）および／または該ヘモグロビン分離手段（ｂ）が、固相ク ロマトグラフィーまたはろ過媒体中またはその上に担持されていることを特徴と する特許請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の試験用キット。
30. ３０．沈澱したヘモグロビンを分離するための固相クロマトグラフィーまたはろ 過媒体をさらに包含することを特徴とする特許請求の範囲第２６項に記載の試験 用キット。
31. ３１．特許請求の範囲第１〜２１項のいずれかに記載の方法または特許請求の範 囲第２６〜３０項のいずれかに記載の分析試験用キットを、真正糖尿病のインビ トロ診断または監視に使用すること。