JP2643027B2 - グリカン化血中タンパク質のアッセイ - Google Patents

グリカン化血中タンパク質のアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グリカン化血中タンパク質（GBPs）を評価
するためのリガンド結合アッセイに関する。
体組織および体液中の多くの糖タンパクは、体中タン
パク質（body proteins）と糖との非−酵素的反応の結
果生成することが長い間知られていた。ここで、これら
の非−酵素的グリコシル化タンパク質は、グリカン化タ
ンパク質（glycated proteins）と記す。
哺乳類組織は、グリカン化反応を逆転し得る酵素を含
んでいないと思われるので、特定のタンパク質がグリカ
ン化される程度は、基本的には、 タンパク質のグリカン化を受ける内在的能力、 タンパク質の体内での寿命、および タンパク質が暴露されるグルコースの濃度に依存す
る。
従って、体組織または体液サンプル（血液、プラズマ
または尿等）におけるグルコース濃度の直接測定（この
測定は、サンプリング時のグルコース濃度についてのみ
情報を与える）とは異なり、タンパク質のグリカン化度
は、より長期間に亘り平均化されたグルコース濃度の生
体制御の指標を与える。
不安定化な真正糖尿病患者では、タンパク質グリカン
化の程度は、正常血糖値の患者におけるよりも何倍も高
いことが多く、その結果、いくつかのGBPアッセイが、
真正糖尿病の鑑別法として、あるいは血中グルコースレ
ベルにおける中期間から長期間の患者の制御を評価でき
る手段として、提案されてきた。
このようなアッセイは、グリカン化ヘモグロビン（G
H）およびグリカン化血清アルブミン（GSA）に対して提
案されてきた。これは、特にこれらタンパク質の比較的
長い寿命が、血中グルコースの長期間および中期間の指
標を提供するからであり、かつこれらのタンパク質が豊
富で比較的グリカン化し易いからである。このように、
GASおよびGHレベルは、各々測定前１〜３週間および１
〜３ヶ月間の血中グルコース体内制御を反映している。
GBPアッセイは、通常、体液サンプルあるいは体組織
サンプルからGBPを分離すること、発色団、蛍光団ある
いは放射線ラベル等の検出可能な標識がこのようなサン
プル中のGBPに結合すること、あるいはたとえばこのよ
うなサンプル中のGBPを化学的に分解すること、酸化還
元指示薬存在下、かつアルカリ条件下でのフルクト−ス
アミン部分の酸化等によっている。このようなアッセ
イ、その利益および不利益は、Schleicher et alによっ
てJ.Clin.Chem.Clin.Biochem.27:577−587（1989）で再
検討されている。
イオン交換クロマトグラフィーによる非グリカン化タ
ンパク質からのグリカン化タンパク質の分離を含む従来
方法は公知である。これはGHアッセイに対して最初に提
案された方法であり、最も一般的に用いられる臨床方法
である。しかしながら、これは高価で時間を要し、かつ
その結果が小さな温度変化によっても影響される。
幾つかの他のアッセイでは、サンプル中のグリカン化
タンパク質を単離あるいは標識するためのボロン酸誘導
体の使用を含んでいる。ボロン酸は、グリカン化タンパ
ク質等のシス−ジオール残基を有する炭水化物部分とエ
ステルを形成する一方、酵素的に形成された糖タンパク
質は、このようなエステルを形成しないことは長い間知
られていた。そこで、化学的に固定化されたボロン酸
が、アフィニティクロマトグラフィーによるグリカン化
タンパク質の単離に用いるために提案され、ヘモグロビ
ンのグリカン化画分を定量するためのこのような材料の
使用は、たとえばGB−Ａ−2024829に、Dean et alによ
って提案されている。
しかしながら、このようなカラムの使用は、高価で時
間を要し、また、GH以外のGBPについてSchleicher（上
述）は、グリカン化タンパク質の結合程度が、クロマト
グラフィーを行う条件に非常に敏感であることを警告し
ている。
液相でのグリカン化タンパク質と発色団あるいは蛍光
団で標識したボロン酸との反応も、グリカン化タンパク
質、特にGHのアッセイの基本技術として提案されてい
る。そして、Schleicherは、DE−Ａ−3720736におい
て、サンプル中に存在する全グリカン化タンパク質の測
定のための以下の三つの法則の１つによるアッセイを提
案している。
1. グリカン化タンパク質に結合した場合の、ボロン酸
発色団標識の吸収最大値におけるシフト、 2. グリカン化タンパク質に結合した場合の、ボロン酸
蛍光団標識における蛍光の偏光変化、あるいは 3. 活性炭等を用いて過剰の不結合標識ボロン酸を除去
した後における、グリカン化タンパク質に結合した発色
団あるいは蛍光団標識ボロン酸の量の測定。
しかしながら、これら方法のいずれにあっても、特定
のGBPの定量には用いることができなかった。加えて、S
chleicherによって提案された試薬は、吸光度が比較的
低く、その吸光極大値がどちらかといえばヘモグロビン
のそれと近接しており、このことがGHの検出を困難ある
いは不可能にしている。
Wagnerは、US−Ａ−4861728において、ヘモグロビン
全体に対して特異的な抗体が表面に結合された固体状担
体と溶血サンプルとの接触によるGHの分離、およびGHと
蛍光団標識ボロン酸との反応を含むGHのアッセイを提案
している。全結合ヘモグロビンは、反射率測定法で測定
できる一方、結合GHレベルは蛍光法によって評価するこ
とができる。
しかしながら、この技術では、グリカン化ヘモグロビ
ンとボロン酸標識との会合定数が比較的低く（すなわ
ち、103〜105mol-1リットル）、かつ固定化した場合GH
の有効な濃度が比較的低いために、標識の結合もそれに
対応して低減されているという問題があった。
したがって、迅速、簡単かつ安価であり、臨床実験室
において、あるいは診断医によって容易に適用されるGB
Pアッセイに対する要請がある。
このようなGHの８アッセイは、本発明者らの出願WO−
Ａ−90/13818に記載されている。本発明者らは、この技
術が、他のGBP、特にGAのアッセイとして用いるのに容
易に適用できることを見出した。
すなわち、１つの観点から見て、本発明はサンプル中
のグリカン化血中タンパク質をアッセイする方法を提供
する。この方法は、下記の工程 ａ）所望により、血液サンプルを溶血して細胞結合グリ
カン化血中タンパク質を遊離させる工程； ｂ）液相沈澱剤を用いて、該サンプルから該グリカン化
タンパク質および対応する非グリカン化血中タンパク質
を分離する工程； ｃ）該グリカン化および非グリカン化タンパク質を該サ
ンプルから分離する前またはその間に、該サンプルを、
対応する非グリカン化タンパク質に対するよりも実質的
に高い結合親和性で該グリカン化タンパク質と結合する
ことのできる第一シグナル形成剤と接触させるか、ある
いは該分離させた両タンパク質を該第一シグナル形成剤
と接触させる工程； ｄ）所望により、該グリカン化および非グリカン化タン
パク質を該サンプルから分離する前またはその間に、該
サンプルを、該グリカン化タンパク質および該対応する
非グリカン化タンパク質と結合することのできる第二シ
グナル形成剤と接触させるか、あるいは該分離させた両
タンパク質を該第二シグナル形成剤と接触させる工程；
および ｅ）該分離されたタンパク質と結合したシグナル形成剤
および／または該グリカン化タンパク質または該対応す
る非グリカン化タンパク質と結合したシグナル形成剤を
評価する工程； を包含し、 ただし、該グリカン化タンパク質がグリカン化ヘモグ
ロビンであるときは、該第一シグナル形成剤が600nm以
上に吸収極大を有する発色団で標識されたボロン酸また
はその塩であることを特徴とする。
本発明のアッセイ方法において、第一シグナル形成剤
によって標識されるグリカン化タンパク質は、どの血中
タンパク質であってもよく、また、これらのどのような
組み合わせであってもよい。しかしながら、特定期間に
亘る血中グルコースに関する指標を提供するための方法
は、評価が実質的にたった１つの特定グリカン化タンパ
ク質、特にヘモグロビン、アルブミン、補体C3、フィブ
リノーゲンあるいはトランスフェリン等のものであるよ
うに構成することが好ましい。
本発明の１つの特に好ましい態様は、少なくとも２つ
の第一シグナル形成剤が用いられる。これら第一シグナ
ル形成剤の各々は異なるGBPに対して実質的に特異的で
あり、各々のシグナルは、互いに重大な影響がなく測定
するのに充分なほど異なっている。したがって、たとえ
ば、第一シグナル形成剤は、有利には、１つのGBPに特
異的な発色団標識抗体、あるいは抗原−結合抗体フラグ
メントと、他のGBPに特異的な、蛍光標識あるいは同位
体標識抗体またはフラグメントからなる。しかしなが
ら、測定を容易にするためには、標識操作は、同一タイ
プの分別可能な標識、たとえば両方（または全て）発色
団を用いて行うことが好ましい。この態様は、アッセイ
する２種以上のタンパク質の分離を行うために用いられ
る一つ以上の剤を必要とするかもしれない。しかしなが
ら、多くの場合、１つの試薬または分離手段で充分であ
ろう。この態様では、グリカン化形態のアッセイに付さ
れるタンパク質の相対的量についての指標を得るため
に、２種以上のタンパク質に特異的な第二ジクナル形成
剤を用いることが好ましい。アッセイに付されるタンパ
ク質、たとえばヘモグロビンとアルブミン、および所望
によって補体C3またはフィブリノーゲンの適切な選択を
行うことにより、本発明のこの態様は、単一のアッセイ
で、短期間、中期間および長期間（３ヶ月まで）に亘る
患者の血中グルコース制御の経歴についての指標を提供
することを可能にする。
評価されるグリカン化タンパク質が発色団で標識され
る場合、エリスロサイトあるいはヘモグロビンを含むサ
ンプル、たとえばヘモグロビンを洗浄除去する必要なし
に、全血液を用いてこの方法を実施できるように、その
用いられる特定の試薬は600nm以上に吸収極大を有する
ことが好ましい。同様に、タンパク質がヘモグロビン以
外である場合に好ましいという理由で、第二シグナル形
成剤が、グリカン化および非グリカン化形態の両方のア
ッセイタンパク質を標識するために用いられ、かつ試薬
が発色団を含む場合、やはりこの試薬は600nm以上の吸
収極大を有することが好ましい。
本発明の方法において、第一または第二シグナル形成
剤として用いるのに適した発色団ラベル、あるいはそれ
らを有する化合物の範囲は、「Chemical Compounds」と
題された1990年11月14日出願の同時継続中の英国特許出
願題9024775.0号と、その対応国際特許出願（WO−Ａ−9
2/08722として公開された）に開示されており、そのテ
キストのコピーはここに添付して提出され、その開示は
参考として本明細書に組み込まれる。これらの化合物
は、第３および７位に２級または３級アミノ基とイミノ
基とを有するフェノキサジンおよびフェノチアジン誘導
体等の、600nm以上に吸収極大を有する発色団を含んで
いる。これらの発色団は、有利には、第一シグナル形成
剤として機能し、この場合、これらは以下により詳細に
議論される方法、たとえば（Ｎ−エチル部分のβ炭素に
結合した）３−（Ｎ−エチル−ピペリジン−４−イル−
カルボニルアミノ）フェンニルボロン酸の基または原子
団（grouping）によるアミノ部分の置換によって、ボロ
ン酸部分と結合している。特に好ましいこのような発色
団としては、対応出願で定義かつ開示されているよう
な、クロロアルミニウムフタロシアニンを挙げることが
できる。
サンプル中のグリカン化タンパク質のレベルを決定す
るのに加え、本発明の方法を行うに際しては、グリカン
化および非グリカン化タンパク質のレベルを評価し、グ
リカン化タンパク質と全タンパク質との比を算出するこ
とが好ましい。グリカン化の程度は、アッセイに付され
るタンパク質が異常に低濃度となる結果を来す条件にお
かされた患者にとって、全タンパク質濃度とともに変化
するため、アッセイに付される特定タンパク質に対する
血中の全タンパク質濃度の指標を得ることもまた、特に
好ましい。
タンパク質分離工程は、サンプル中のグリカン化およ
び非グリカン化タンパク質の全量の分離を必要としな
い。本方法が適切に検量されているかぎり、両グリカン
化および非グリカン化タンパク質の一部を分離するだけ
で充分である。このような検量は、臨床実験室アッセイ
において通常行われるものである。
ここで用いられる用語「評価（assessing）」は、サ
ンプル中のグリカン化タンパク質または全タンパク質の
量に対する絶対値を得るという意味、かつたとえばサン
プルの全タンパク質濃度に対する相対比のような、グリ
カン化タンパク質の指標、比、パーセントあるいは同様
の表示を得るという意味での両方の定量を含んでいる。
本発明の新規方法は、非グリカン化タンパク質画分から
グリカン化タンパク質を分離する必要はないが、そのか
わりサンプルからグリカン化および非グリカン化タンパ
ク質の両者を分離することによるということを認識する
べきである。従って、第一シグナル形成剤は分離システ
ムの一部として用いる必要がないのであるから、固定化
する必要はなく、実際に固定化されない方が好ましい。
本発明の方法は、健康な個体と、真正糖尿病に罹患し
ている患者または罹患したと考えられる患者との両方か
らの、血液、血液溶血物または血液抽出物のサンプル中
に含まれたグリカン化タンパク質の量の評価に用いるこ
とができる。サンプルは、分析前は乾燥物状、液体状あ
るいは凍結物状であってもよい。本発明の方法で分析さ
れる溶血物は、たとえば溶血して、グリカン化タンパク
質の炭水化物部分を結合反応にさらすための異なった種
類の試薬を用いて調製することができる。この処理は、
本方法を実施するために必要な他の試薬を用いる前、あ
るいはこれと組み合わせて行うことができる。所望によ
り妨害を低減するために、たとえばグリコースオキシダ
ーゼあるいはpH6以下の緩衝溶液を用いて、結合してい
ないグルコース、あるいは弱く結合しているグルコース
のレベルを低減させる処理をサンプルに施してもよい。
本発明の方法において、タンパク質と、シグナル形成
剤との反応は、サンプルからのタンパク質分離操作の
前、その間あるいは後のいずれで行っても良い。選択さ
れる順序は、方法の実施に用いられる化学装置または器
具、およびより現実的であると認められることに依存し
ている。
本発明の好ましい一つの方法において、シグナル形成
剤の結合とタンパク質の分離とは、均質溶液中で同時に
行われ、この溶液からタンパク質を沈澱させ、遠心分離
あるいは濾過によって単離される。しかしながら、反応
および分離条件は、グリコシル残基−ボロン酸会合定数
の限界内で選択しなければならない場合があり、これは
比較的低い（103−105mol-1リットル）。
シグナル形成剤から得られるシグナルの強度から、タ
ンパク質に結合した、あるいはタンパク質から分離した
シグナル形成分子の濃度を決定することができる。グリ
カン化タンパク質の「絶対的」基準はまだ存在していな
いが、もし所望であるならば、本新規方法と従来方法と
の検量あるいは相互関係は、従来方法で決定されたよう
に、既知濃度のグリカン化形態タンパク質を含む標準タ
ンパク質溶液を用いて得ることができる。
本発明の方法において、第一および第二シグナル形成
剤は、アッセイに付されるタンパク質に特異的に結合し
ても良く、また他のタンパク質を標識するのに役立つ試
薬であっても良い。後者の場合、本発明の方法における
この分離は、１回以上の工程で、シグナル形成剤によっ
て標識された他のタンパク質を実質的に含まないサンプ
ルから、アッセイに付されるタンパク質を分離するよう
な分離であるべきである。
アッセイに付されるタンパク質が、沈澱によるか、あ
るいはそのタンパク質に特異的な固定化試薬によってサ
ンプルから分離される場合、第一シグナル形成剤は、有
利には直接、あるいはアミン結合、アミド結合、介在部
分、または当該分野で公知の化学結合のいずれか（これ
らの結合は、ジヒドロキシボリル残基がグリカン化タン
パク質のグリコシル部分におけるシス−ジオール残基と
自由に反応できるようにしておくものである）によっ
て、シグナル形成標識に結合したフェニルボロン酸を含
んでいてもよい。ボロン酸残基のどのpKa値が所望され
るかによって、フェニル環は、たとえばニトロ基、ホル
ミル基、アルコキシ基によって、あるいはpKa値に影響
を与えるがグリカン化タンパク質のシス−ジオール残基
との結合にとって立体障害とならない他の置換基によっ
てさらに置換されていても良い。
本発明の第一シグナル形成剤の合成に用いることがで
きるボロン酸残基は、便利には、アミノフェニル（たと
えばｍ−アミノフェニル）ボロン酸残基から合成され、
上記シグナル形成分子または複合体の標識あるいはシグ
ナル形成部分への結合（linkage）は、、典型的には、
ジアゾニウムイオン形成またはシラン化により、あるい
はグルタルジアルデヒド、カルボジイミド、ハロゲン化
シアノゲン、コハク酸イミドなどのカップリング剤、あ
るいは一般的化学文献に教示された他のカップリング剤
の使用によって達成される。シグナル形成ラベルは、ボ
ロン酸残基がグリカン化タンパク質アナライトのシス−
ジオールと自由に反応できるように結合され、アミンあ
るいはジメチルアミノアゾベンゼンイソチオシアネート
およびジメチルアミノ−ナフタレンスルホニルクロライ
ド等のジヒドロキシボリル残基上の反応性の残基に対し
て反応性とするために前もって「活性化」することがで
きる。第一シグナル形成剤はまた、水溶性を増加させる
ためにさらに変性されていてもよい。
本発明に従って用いられるシグナル形成ジヒドロキシ
ボリル剤は、好ましくは非固定化状態で存在し、またボ
ロン酸、あるいは直接的または間接的にシグナルを形成
し得る化学構造（ラベル）（これは化学的あるいは物理
的定量に用い得る）に、直接あるいは間接に結合した他
の特異性あるいは非特異的結合残基からなっていてもよ
い。
シグナル形成ラベルは、酵素、好ましくは炭水化物の
シス−ジオール部分を有しないか、またはシス−ジオー
ル基を有する分画を取り除いた酵素からなっていてよ
い。あるいはシグナル形成ラベルは、一部または全体が
着色部分または蛍光性部分（発色団または蛍光団）によ
り構成されていてもよい。ラベルとしての使用に好適な
広範囲の着色化合物、蛍光性化合物または色素化合物が
この技術分野で知られており、使用できる。好適な例に
は次のものが含まれる。アントラキノン類、アゾ染料、
アジン染料たとえばオキサジン類およびチアジン類、ト
リアジン類、天然に存在する色素たとえばポルフィリン
類、フィコエリスリン類およびフィコシアニン類を含む
フィコビリタンパク質、クロロフィル類、およびこれら
の類似化合物または誘導体、カロチノイド類、アクリニ
ジン類、フルオレセン類およびローダミン類を含むキサ
ンチン類、インジゴ染料、チオキサンチン類、クマリン
類、ジ−およびトリ−アリールメチン類を含むポリメチ
ン類、およびこれらの誘導体、およびフアロシアニン類
および金属フタロシアニン類。これらの化合物は、所望
により、シグナル形成ラベルとボロン酸基との間に介在
するスペース部分により結合され、分析すべき糖タンパ
ク質のシス−ジオールと自由に反応するようにしてお
く。
同様に、本発明に用いられる試薬のシグナル形成ラベ
ル部分としては、広範囲の放射性化合物を使用すること
ができ、中でも特に沃素−125で標識された化合物が挙
げられる。これらの標識化合物は、有利には、フェニル
ボロン酸の炭素環をＩ−125で標識することにより、ま
たはアミノフェニルボロン酸をＩ−125標識用試薬、た
とえばよく知られたBolton−Hunter試薬に複合させるこ
とにより得ることができる。このような放射性標識技術
は、BoltonによりBiochem.J.133:529−539,1973で概説
されている。本発明の方法を実施するに際しては、比較
的高い試薬濃度が必要であり、したがって本発明の多く
の態様においては、Ｉ−125標識複合体を非放射性ホウ
酸または同一または異なる構造のボロン酸類と混合し、
アッセイ用試薬の適切な放射性レベルを得ることができ
る。
あるいは、公知方法でアッセイできる化学ルミネッセ
ンス性シグナルを生成しうる天然または合成化合物にボ
ロン酸基を複合させることができる（Cormier,M.J.et a
l;Chemiluminescence and Bioluminescence,Plenum Pre
ss,New York 1973）。好適な化学ルミネッセンス性化合
物には、ルシフェリン、蓚酸エステル、1,2−ジオキセ
タン、ルミノールまたはこれらの誘導体が含まれるが、
これらに限定されるものではない。もし適当であるなら
ば、過酸化水素、酵素、たとえばルシフェラーゼまたは
他の化学物質を、用いられるシグナル生成分子から化学
ルミネッセンス性シグナルを生成させるのに使用するこ
とができる。
第一シグナル形成剤として使用できる標識ボロン酸試
薬の特に好適な例は、フルオレセンイソチオシアネート
とアミノフェニルボロン酸との反応により得られる複合
体であり、この反応の結果、遊離カルボン酸部分を有す
る複合体が生じる。他の好適な複合体には次のものが含
まれる。たとえば１−エチル−３（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド（EDC）によりクロロアル
ミニウムフタロシアニン、またはフルオレセンに複合さ
れたアミノフェニルボロン酸、ブロックされたカルボキ
シル基を有するフルオレセンイソチオシアネート、また
はカルボン酸部分が除去されている場合には、アミノフ
ェニルボロン酸に複合されたフルオレセンイソチオシア
ネート。たとえばカルボジイミドによりアミノフェニル
ボロン酸に複合されたローダミンＢも使用できるが、こ
の複合体は、本発明方法によるアッセイにとって重要な
大部分の溶液に対して比較的劣った溶解度を有する。Ｎ
−（レゾルフィン−４−カルボニル）ピペリジン−４−
カルボン酸−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミド−エステ
ル（以下、RESOSと略記する：ドイツ国;Boehringer Man
nheimより入手可能）は、本発明者がアミノフェニルボ
ロン酸に複合させたシグナル形成分子であり、これは優
れた溶解特性を示した。
ボロン酸基 −Ｂ−（OH）２ は、その電気的中性の形でしばしばジヒドロキシボリル
基と呼ばれ、ヒドロキシルイオンの結合によりアニオン −Ｂ−（OH）3 - を形成し、それ自体で塩を形成できる。本発明方法に用
いられる第一シグナル形成剤は、試薬組成物のpHおよび
電解質含有量に応じて、ボロン酸のこれらの形態の１種
または数種を有することができる。ボロン酸がグリカン
化ヘモグロビンのシス−ジオール基と結合するのは、ア
ニオン形である。
本発明方法においては、ボロン酸との高分子量シグナ
ル形成複合体の使用は、大部分のグリコシル化ヘモグロ
ビンのグリコシル化部分の利用性が制限されるので、避
けることが好ましい。すなわち、血液中のグリコシル化
ヘモグロビンの実質的分画は、ベータ鎖のＮ−末端バリ
ンアミノ酸においてグリコシル化されており、前記の米
国特許第4658022号明細書に記載されているように、水
溶性高分子量分子には容易に利用されない。この特許
は、グリコシル化基に抗体結合反応を受けさせる極めて
重要な変性の使用を教えている。
本発明の方法は、グリカン化アルブミン（GA）のアッ
セイに特に好ましく構成される。アルブミンは広い範囲
の物質に親和性を有しており、これは研究者が生物学的
に重要なリガンドのビヒクルとしてのアルブミンの役割
を説明することを促した。アルブミンは無機カチオン、
有機カチオン、有機アニオン、非イオン性化合物、特異
的抗体あるいは抗体フラグメントなどの配位子に対して
異なる親和性を有するいくつかの結合部位を有してい
る。
多くの有機色素およびpH指示薬物質を含む多数の合成
陰イオンンおよび外因性陰イオンは、アルブミンに結合
する。これらのものは、非イオン性の疎水性部分と、ア
ルブミンへの結合に強く影響を及ぼすイオン性の親水性
部分とを有している。親和性および結合サイト数の両方
は、アルコール、カルボン酸塩、スルホン酸塩および硫
酸塩の順序で増加する。
一般的な例としては脂肪酸などが挙げられるが、ビリ
ルビンおよびトリプトファンの結合もまた生物学的に極
めて重要である。
アルブミンに結合することが知られている非イオン性
物質としては、ステロイドホルモン類、たとえばテスト
ステロンおよびコーチゾルなどが挙げられる。
無機銅（II）がアルブミンと結合することは刊行物に
記載されており、親和力定数は107mol-1リットルまたは
それ以上と推定されている。銅および他の金属、たとえ
ばニッケルの両者は、アルブミンと結合し、着色錯化合
物を生成することが知られている。したがって、銅およ
び他の金属の塩を、本発明方法において第二シグナル形
成剤として使用することができる。蛍光性希土類イオン
類（たとえばランタニド類、特にユーロピウムおよびテ
ルビウム）およびこれらのキレート類は、その独特の蛍
光特性、高探知感度、および時間分解蛍光測定法への適
応性のために、本発明方法に用いるのに特に重要であ
る。Eu−キレート類は、たとえばPharmacia（スウェー
デン）のDELFIA−システムに用いられている。したがっ
て、このようなキレート類は、アルブミンアッセイのた
めのシグナル形成剤としても利用できる。
アルブミンと結合することが知られている多くの陰イ
オン性化合物のうち、幾つかの例としては下記のものが
挙げられる。
トリプトファン／トリプトファン誘導体（たとえばＮ
−アセチルトリプトファン）（会合定数Ka＝約２×104m
ol-1リットル）、 チロキシ（会合定数Ka＝約106mol-1リットル）、 脂肪酸陰イオン類、 界面活性剤、たとえばドデシル硫酸（会合定数Ka＝約
1.2×106mol-1リットル）、 胆汁酸塩、 ヘマチン（ビリルビンの前駆体）、 スルホンアミド類、 アセトアミド類、 サリチレート類および アゾ色素。
一般に、アルブミンへの結合は、ビリルビンとの結合
（約107mol-1リットルの会合定数を有する閉鎖テトラピ
ロール）およびC16-18の脂肪酸陰イオン類（約107mol-7
リットルの会合定数）との結合よりも弱い。このことは
有機色素に対しても真実であるが、親和性および色素−
結合サイトの数は色素の性質に依存する。これらの例と
しては、下記のものが挙げられる。
スルホナフタレン類（会合定数Ka＝約106mol-1リット
ル）、 テトラブロモ誘導体（たとえばブロモクレゾールグリ
ーン、ブロモクレゾールブルー、ブロモスルホフタレイ
ン）、 ナフタレンスルホネート化合物類（会合定数Ka＝おそ
らく約106mol-1リットル）、 エパンスブルー、 トリパンブルー、 コンゴーレッド、 アゾベンゾエート類およびこれらの誘導体（会合定数
Ka＞106mol-1リットル）および メチルレッド。
ポリフィリンのアルブミンへの結合は生物学的に極め
て重要である。その結合親和性は高いが、異なる誘導体
間で若干の変動が見られる。したがって、ジュウテロヘ
ムはプロトポルフィリンよりも強く結合し、結合親和性
はポリフィリン環の中心における金属に依存する。
合成誘導体であるテトラカルボキシフェニルポルフィ
リン（TCPP）、および対応する金属ポルフィリンである
Cu−TCPPおよびCo−TCPP（会合定数Ka＝約107mol-1リッ
トル）＞Cu−TCPP＞TCPP、したがってシグナル形成剤と
して用いることもできる。
これに関して挙げられる他の有機陰イオンとしては、
次のものがある。
メチルオレンジ、 ジニトロフェノール、 蛍光性配位子、たとえば１−アニリノナフタレン−８
−スルホネート（ANS）、ナフタレンスルホネート、 アフラトキシン類および アクリジン類（たとえばリバノール）。
特にアルブミンのアッセイにおける第二シグナル形成
剤として使用できる他の色素としては、ポンソ−Ｓ（Po
nceauus）、クーマシーブリリアントブルー（Coomasie
brilliant blue）およびビシンコニン酸（好適にはアル
カリ媒体中でCu（II）と結合している）が挙げられる。
アルブミンのようなグリカン化血中タンパク質のアッセ
イにおける第二シグナル形成剤として使用するために
は、特にブロモフェノールブルー（吸収極大590nm）を
挙げることができる。アルブミンアッセイのためには、
金属ポルフィリンであるCr（III）−テトラカルボキシ
フェニルポルフィリン（Porphyrin Products,USAから入
手可能）もまた特に好適であり、これがたとえば0.25M
の酢酸アンモニウム緩衝液を用いてpH9.0に緩衝された
溶液中に存在する場合には殊にそうである。この化合物
は、440−450nmの吸収極大（600nmまで有意な吸収）を
有し、アルブミンに強く結合する。
下記実施例で述べるRESOS−アミノフェニルボロン酸
複合体、ならびに上述した本出願人の同時係属中の英国
および国際特許出願のフタロシアニン、フェノキサジン
およびフェノチアジンボロン酸複合体は、第一シグナル
形成剤として、殊にグリカン化アルブミンのアッセイに
用いるのに特に適している。
アッセイされるグリカン化および非グリカン化タンパ
ク質の分離は、沈澱剤であって、所望によりシグナル形
成剤としても機能しうる試薬の作用によって行うことが
できる。
本発明の好ましい態様においては、アッセイされるタ
ンパク質（およびこれに結合したシグナル形成剤）の分
離は、たとえば適切な沈澱試薬を所望によりクロマトグ
ラフィー、遠心分離または濾過システムと共に用いるこ
とによって、均質溶液から総タンパク質を選択的に沈澱
させることによって達成される。
したがって、本発明によれば、アッセイされるタンパ
ク質の分離を、固定化されていない特異的タンパク質、
たとえば特異的モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体、あるいは溶液からアッセイされるタンパク質を
沈澱させる他の任意の剤を用いて行ってもよい。異なる
エピトープと反応性のモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体は、タンパク質との沈澱を形成するために
使用できる。沈澱は、二次抗体を用いても得ることがで
きる。好ましくは、シス−ジオール部分を有しない抗
体、またはシス−ジオール含有部分が除去された抗体、
あるいは免疫反応性のこれらの抗体のフラグメントを使
用できる。
しかしながら、この方法の点は、シグナル形成分子を
含むボロン酸とグリコシル化ヘモグロビンのグリコシル
化残基との会合定数が、わずかに103〜105mol-1リット
ル程度であるから、かなり高濃度の反応関与体が必要で
あり、結果として試験当たりの抗体の消費がかなり多く
なることである。
本発明の好ましい態様では、液相からのタンパク質の
沈澱は、金属陽イオンまたは有機溶剤の使用によって達
成される。この沈澱は、たとえば遠心分離または濾過に
よって容易に分離することができ、また試薬は安価で効
率がよい。
このような一態様の場合、溶液からのヘモグロビンの
特異な、またはほとんど特異的な沈澱が、ある種の有機
溶剤、たとえばエタノールおよび／またはブタノールな
どのアルコール類、アセトンなどのケトン類、エーテル
類、たとえばジオキサンおよびテトラヒドロフランなど
の環状エーテル、ジメチルホルムアミド、ジエチルホル
ムアミドなどのアミド溶剤、ジメチルスルホキシドなど
のスルホキシド溶剤、トルエンなどの炭化水素溶剤、お
よびクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素溶剤を用い
ることによって達成された。エタノール中の50％ブタノ
ール（v/v）をブタノールの最終濃度が９％（v/v）とな
るように加えて、約6.5mgのヘモグロビンおよび1.5mg H
SA/mlに希釈された全血液サンプル沈澱させると、94％
のヘモグロビンおよびわずか１％のHSAが沈澱した。こ
の沈澱は、シス−ジオール成分に結合したボロン酸残基
を失うことなく得られた。
ヘモグロビンの特異的沈澱は、タンパク質と結合して
これを凝集させる金属陽イオンを用いて達成してもよ
い。好適な陽イオンとしては、亜鉛、銅、あまり好まし
くないが、ニッケル、コバルトおよびカドミウムのイオ
ンが挙げられる。このことは、こうして沈澱させたどの
ヘモグロビンも、可溶化錯形成剤の添加により簡単に再
溶解できるという重要な利点を有する。亜鉛イオンを用
いることにより、全血液溶血物から実質的に特異的なヘ
モグロビンの沈澱を得ることができ、これは予期しなか
った観察である。たとえば、2.5〜4mM濃度の亜鉛イオン
を、ヘモグロビン6.5mgおよび1.5mg HSA/mlの存在下で
用いると、特異的またはほとんど特異的なヘモグロビン
沈澱が得られる。しかしながら亜鉛イオンの濃度が4mM
を越えると、HSAの実質的な共沈が起こる。このことは
下記に示す結果によって説明される。
亜鉛濃度（mM） 亜鉛濃度 亜鉛濃度 2.6 87 6 3.9 87 15 6.5 91 92 しかしながらイオン濃度は、用いたどのシグナル形成
ボロン酸誘導体をも妨害しないように、注意深く調整す
べきである。所望により、シグナル形成ボロン酸複合体
との反応の前に、沈澱したタンパク質を任意に洗浄また
は濾過して、過剰の陽イオンを除去することができる。
この反応の順序は、過剰の亜鉛イオンと陰イオン性複合
体とが直接結合して望ましくない妨害が生じるおそれが
あるので、アニオン性シグナル形成ボロン酸複合体を用
いる場合に特に好ましい。亜鉛に加えて、他の金属陽イ
オンは、沈澱反応に用いた緩衝液中で、それ自体が沈澱
しないならば、用いることができる。
金属イオンは試験溶液中で加水分解に関与するか、あ
るいは他の反応関与体とは別に反応する可能性があるの
で、金属陽イオンが依然として溶解性を示し、ヘモグロ
ビンの沈澱に利用できることが保証されるように用心す
ることが必要である。本明細書に記載した幾つかのシグ
ナル形成ボオン酸複合体は、金属陽イオンに一対の電子
を供与することができ、これにより錯形成剤として作用
する基を含んでいる。配位子−金属錯化合物を形成する
この能力は、反応を制御するために、すなわち溶液中に
金属イオンを保持し、金属とボロン酸シグナル形成誘導
体とで錯化合物を形成するのを防止し、そして金属イオ
ンの利用性および充分に高い濃度を保証して、所望のタ
ンパク質沈澱を生じさせるために用いることができる。
配位子濃度と異なる金属錯化合物の安定度定数との両
者を考慮する必要があるので、不溶性の金属錯化合物
（以下、Me−錯体という）の形成を防止するために、適
切な緩衝塩を用いてもよい。
したがって、弱い単座配位のMe−錯体を形成する緩衝
塩が好ましく、このような緩衝剤の例としては、溶解性
のZn（Ac）およびZn（NH4）錯体を形成する酢酸アンモ
ニウムと亜鉛との組合せが挙げられる。
多座キレート化配位子のようなより強い錯形成剤を緩
衝剤に加えることにより、試験溶液中の前記反応の全て
を制御することができる。この錯形成剤を適当なモル濃
度で加えると、異なる錯体間の必要モル比が得られると
ともに、他の添加剤とのバランスが保たれ、全ての反応
が最適に行われるよう保証される。さらに、使用すべき
特定の金属陽イオンを考慮して、金属イオンの強すぎる
錯形成などの潜在的に好ましくない副作用が確実に避け
られるように、錯形成剤を選択すべきである。
キレート−Me−錯体の安定度定数は、試験溶液中に存
在しうる他の錯形成剤、たとえばシグナル形成ボロン酸
複合体と競合するほど充分に高くあるべきであるが、沈
澱剤としての金属陽イオンの有効性が減少または妨げら
れるほど強くてはならない。
エチレン−、プロピレン−またはブチレン−ジアミ
ン、またはその類似物、グリシン、アスパルテート、ニ
トリロアセテート、ヒスチジンおよびピコリネートなど
の多くのキレート化配位子を用いることができる。他の
天然または合成キレート化剤、たとえば炭水化物、２以
上の配位基を有する有機酸、アミノ酸、ペプチド、フェ
ノール性化合物なども使用できるが、これらの幾つか
は、ボロン酸との錯化合物、すなわちサリチレート、オ
キサレート、ソルビトールおよびタルタレートのような
炭水化物を形成する能力を有するため、シグナル形成ボ
ロン酸複合体との結合に対してグリカン化タンパク質と
競合するので、好ましくない、 EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、CDTA（トランス−
1,2−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N′,N′−四酢
酸）、EGTA（エチレングリコール−0,0′−ビス（２−
アミノ−エチル）−N,N,N′,N′−四酢酸）、DTPA（ジ
エチレントリアミン五酢酸）などのような多座キレート
化配位子も使用しうるが、ある場合には金属イオンとの
非常に強い錯形成能のため、タンパク質の沈澱が著しく
減少する結果となるので、あまり好ましくない。亜鉛イ
オンおよびグリシンを含む酢酸アンモニウム緩衝剤は、
好ましい組合せの一例である。
本発明の異なる態様においては、異なる錯形成剤が好
ましいことがある。EDTAおよびDTPAのような錯形成剤は
好都合に用いられるが、タンパク質沈澱に用いられる金
属イオンと組合せる際には、その濃度を注意深く調整す
る必要がある。クエン酸および蓚酸はボロン酸残基と相
互作用するので、あまり好ましくない。ヘパリンおよび
フッ化物のイオンは使用できる他の例である。
均質溶液からの沈澱、たとえば有機溶剤または金属陽
イオンの使用によって得られた沈殿物は、遠心分離また
は濾過によって、あるいは公知の他の手段によって、全
部または一部を分離することができる。
濾過膜またはTLC−系もまた、所望によりアッセイさ
れるタンパク質を結合するためにその膜上に固定化され
たハプトグロビン、抗体またはそのフラグメントと共
に、たとえばディップスティックまたは多層フィルムホ
ーマットとして、ヘモグロビンの分離のために使用でき
る。
遠心によってアッセイされるタンパク質を分離し、次
いで上澄液から沈澱の分離を行うことは、好ましい方法
の一つである。また、濾過を好都合に用いることがで
き、これは濾材表面に垂直に濾材を通して、あるいは濾
材内の接線方向または半径方向に一次元分離方法または
二次元分離方法で実施できる。
薄層クロマトグラフィー法も用いることができ、たと
えばサンプルを好適なクロマトグラフィー媒体、たとえ
ばテストストリップまたはゲルに付け、そして試薬およ
び洗浄溶液を、たとえばサンプルの付いている部位に直
接に付けるか、または溶出することにより用いられる。
さらなる態様では、タンパク質を溶液から直接に濾材
または他の固相クロマトグラフィー媒体上、またはその
中に沈澱させてもよい。この場合、沈澱物はその生成に
続いて、またはそれと同時に、固相の上またはその中に
付着する。試薬は、沈澱段階の前に、それと同時に、ま
たはその後で、多孔質固相媒体に付着させてもよい。し
たがって、たとえば沈澱剤、ボロン酸試薬などのシグナ
ル形成剤、溶血化剤、錯形成剤などの試薬または他の試
薬を、任意の好ましい組合せで固相媒体の中または固相
媒体上に乾燥形態で担持させることができる。このよう
な試薬を担持している固相媒体は、本発明の他の態様を
形成している。この固相媒体を必要に応じて洗浄するこ
とができ、あるいはこの沈澱領域を通して溶離剤を溶離
させることができる。
本発明に従ってアルブミンアッセイを実施するために
は、固体支持体（たとえば架橋されたアガロース、デキ
ストランまたはポリアクリルアミドのビーズ）上に固定
化された配位子を、有利に使用できる。このような固定
化された配位子、たとえばオクチルアミン、ベンジルア
ミン、ブロモスルホフタレイン−グルタチオン、Ｎ−
（３−カルボキシプロピオニル）アミノデカン、チバク
ロン（Cibacron）ブル−F3GA、デオキシコリン酸、グリ
ココリン酸、プロシオン（Procion）レツドHE3Bおよび
Ｎ−ピロメリチルアミノデカンは商業的に入手できる。
アルブミンの分離も有利に実施することができ、カプリ
ル酸、カプリン酸塩、リバノール（２−エトキシ−6,7
−ジアミノアクリジン乳酸塩）および塩基性デキストラ
ンなどの沈澱剤を用いて実施できる。様々な金属イオン
（たとえばHg、Cd、Cu、Zn等）の幾つかは比較的特異的
であるかもしれないが、これらの様々な金属イオンを用
いてアルブミンおよび他の血液タンパク質を沈澱させる
こともできる。さらに有機溶剤、アルブミンの場合はク
ロロホルムまたはアルコール（ブタノールまたはより高
級のアルカノールなど）のような極性の低い溶剤を用い
てもよい。血液タンパク質の沈澱のためには、一般的に
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよびポリエチレン
グリコールなどの剤を用いてもよい。
アッセイされるタンパク質が血液中の細胞によって担
持されている場合、グリカン化タンパク質と第一シグナ
ル形成剤との良好な化学的接触を保証するために、溶菌
剤（lyping agent）を用いるべきである。数多くの試薬
および方法が当業者に一般的に知られており、また使用
できる。その例としては、次のものが挙げられる。低張
溶血法、界面活性剤、たとえば非イオン性ポリエチレン
グリコールエステルまたはポリオキシエチレンソルビト
ール誘導体たとえばトウィーン（Tween）系列およびポ
リオキシアルキルフェノール誘導体たとえばトリトン
（Triton）系列、コレート、ドデシルスルホン酸ナトリ
ウム、グアニジン、加熱、超音波処理の使用、またはこ
れらの任意の組合せ。
第一シグナル形成剤は、必要に応じて溶血した血液、
血漿または血清サンプルと接触または混合することがで
き、あるいはたとえばアッセイ緩衝溶液中のこれらのサ
ンプルから任意の溶血処理段階の前にまたはこれと同時
に単離されたタンパク質と接触または混合してもよい。
数多くのアッセイ緩衝剤、中でもホスフェート緩衝剤
および反応混合物のpHを好適なpHに保持することができ
る他の緩衝溶液を用いることができる。アッセイの好ま
しいpHの範囲は7.5〜10.0であるが、所望のpHは、添加
剤、用いられる緩衝塩およびこのシグナル剤（これがボ
ロン酸誘導体のように、グリカン化タンパク質と可逆的
に複合する試薬である場合）のpKa値に依存する。アミ
ンを含む緩衝剤がジヒドロキシボリル−シスジオール相
互作用を強めるか、ボレートの見掛pKaを低めるのに役
立つという幾つかの証拠がある。この事実のために、セ
リン、グリシン、Hepes（４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、酢酸アン
モニウム、モリホリンおよびタウリンなどの緩衝剤が好
ましい。ジヒドロキシボリルとシス−ジオール残基との
相互作用をさらに促進するため、２価の陽イオン、界面
活性剤およびカオトロピック剤などの試薬を、荷電柝力
を低下させ、ターゲット分子を可溶化し、疎水性相互作
用を制限し、グリカン化タンパク質中のジオールのアク
セシビリティを増加するために用いてもよい。しかしな
がら、トリスおよびエタノールアミンのようなある種の
緩衝剤は、これらの緩衝剤化合物がボレートを錯化し、
ジオールが結合するのを阻止しうるので、避けるべきで
ある。ホスフェート／亜鉛のようなある種の緩衝剤／添
加剤の組合せは、Zn3（PO4）２のような不溶性化合物が
形成する可能性があるので、好ましくない。
本発明の方法でアッセイに付されるタンパク質がヘモ
グロビンである場合、安定化剤試薬、たとえば安定化陰
イオンを有する塩、フェリヘモグロビンと結合すること
が知られている配位子、ヘモグロビンの吸収特性を変え
る試薬（たとえばジチオナイトのような脱酸素剤）、レ
ドックス媒介物質（たとえばメチレンブルー）などを、
ヘモグロビンの色を安定化するために用いるのが有利で
あることを本発明者らは見出した。したがってこの点か
ら、たとえば硝酸塩を用いることができる。さらにある
いは必要に応じて追加される例としては、アジド類、シ
アノフェレート類、シアナイド類、フルオライド類、ホ
ルメート類、チオシアネート類、アセテート類、EDTA、
アンモニア、インダゾール、酸化窒素、ピコリン、ハイ
ドロサルファイド、ジチオナイトおよびメチレンブルー
が挙げられる。
本発明の方法は、好ましい態様においてボロン酸誘導
体とGBP中のシス−ジオール部分との結合に信頼を置い
ており、この結合は、一般的に温度の変動、特に周囲温
度範囲内での変動によって、一般的にごくわずかしか影
響されない。
本発明の方法は、シグナル形成剤の評価または定量
（すなわち、シグナル−リーディング段階）、および必
要に応じてグリカン化形態および非グリカン化形態の両
方でアッセイに付されるタンパク質の総含量の評価また
は定量も包含している。
タンパク質と結合しているか、あるいは分離している
シグナル形成剤の評価は、シグナル形成ラベルの化学的
性質に応じて、酵素活性、蛍光、放射線または光学濃度
（吸収）の測定に一般的に用いられている公知の化学装
置を用いて達成することができる。固相表面の色または
蛍光は、臨床化学において一般的に用いられている反射
測定の手段により容易に測定できる。ディップスティッ
ク、フィルターホーマットまたは他の実用的な固相ホー
マットの上で、ヘモグロビンおよび／または蛍光性また
は着色したシグナル形成剤：タンパク質複合体は、その
表面上で直接に評価できる。あるいは沈澱または固定化
されたタンパク質および／またはシグナル形成剤：タン
パク質複合体を再溶解し、溶液中で測定することもでき
る。
同様に、酵素活性を有するシグナル形成複合体は、固
定化形態、溶解形態、あるいは再溶解形態で、公知の酵
素測定技術を用いて評価できる。放射活性複合体につい
ても、公知の放射線測定方法を用いて評価できる。
ヘモグロビンのようなアッセイされるタンパク質が、
そのUV−可視−IRスペクトルにおいて明確な吸収極大を
有する場合には、そのグリカン化形態および非グリカン
化形態の総濃度は、適切な波長での吸収を測定すること
により決定できる。サンプルの他の成分もこの波長で有
意な吸収を示す場合には、勿論、このような成分からタ
ンパク質を分離した後、たとえば吸収測定を妨害する成
分を有効に沈澱または固定化しない試薬を用いて分離し
た後に、このような測定をタンパク質について行わなけ
ればならない。その代わりに、またヘモグロビン以外の
タンパク質の場合は、好ましくは、アッセイ方法に第二
シグナル形成剤を使用することができる。この第二シグ
ナル形成剤は、タンパク質のグリカン化形態および非グ
リカン化形態の両者において、アッセイされるタンパク
質と結合するかあるいは複合し、また、第一シグナル形
成剤のシグナルと区別できるシグナルを形成するもので
ある。シグナル形成部分は、上記のいずれであってもよ
く、たとえばラジオラベル、発色団、発蛍光団または酵
素的に活性な部分であってよい。アッセイ方法の操作を
容易にするために、シグナル形成部分は、第一シグナル
形成剤の性質と同じ性質のものが好ましく、したがって
総タンパク質量およびグリカン化タンパク質量を示すシ
グナルは、同じ手法の装置で読み出すことができる。第
二シグナル形成剤は、600nm以上に吸収極大を有する発
色団でタンパク質を標識するものが特に好ましい。なぜ
ならば、このようにして、アッセイされるタンパク質か
ら分離されたヘモグロビンを除去する必要なしに、ヘモ
グロビン以外のタンパク質についてのシグナルを読み出
すことができるからである。第二シグナル形成剤を用い
る場合には、その結合特性は、アッセイされるタンパク
質に対して特異的である必要がないことに注目すべきで
ある。しかしながら、第二シグナル形成剤が、アッセイ
されるタンパク質に関して無視できない割合で存在して
いる他の血中タンパク質と結合するならば、本発明の方
法における分離工程は、アッセイされるタンパク質を他
のタンパク質から分離するような工程であるべきであ
る。第二シグナル形成剤が、アッセイされるタンパク質
と特異的に結合することが望ましい場合には、アッセイ
されるタンパク質（そのグリカン化形態および非グリカ
ン化形態の両方において）に対して特異的な、標識され
たモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、また
はその抗原結合フラグメントを、好都合に用いることが
できる。
したがって、総タンパク質およびグリカン化タンパク
質が、分光測定的に識別可能な発色団で標識されるなら
ば、あるいはヘモグロビンの場合のように、総タンパク
質および第一剤で標識されたグリカン化タンパク質が、
分光分析的に識別可能な発色剤を有するならば、アッセ
イされるグリカン化および非グリカン化タンパク質の両
方の濃度は、分離工程の前または後の反応混合物におい
て、適切な波長での吸収を用いて測定することができ
る。ヘモグロビンの存在下に発蛍光団を定量しようとす
るときは、ヘモグロビンの吸収波長以外の消光波長およ
び発光波長が好ましい。同様に、発色団を用いるとき
は、ヘモグロビンの吸収波長以外の吸収波長が好まし
い。しかしながら、必要に応じ、ヘモグロビンからの部
分的干渉は容認することができ、二つ以上の波長での測
定に基づく計算により補正することができる。
本発明の一つの態様においては、分離したタンパク質
は、マイクロビーズおよび／またはフィルターまたは他
の固体相上で単離され、次いで、第一ラベルで標識され
たグリカン化タンパク質は反射率定量され、および所望
により、標識された総タンパク質は、たとえば光吸収測
定または蛍光測定により定量される。
本発明の他の態様においては、ボロン酸残基またはそ
の塩と反応する幾つかの、または大部分の、または全て
の他のタンパク質を除去した溶血物、血漿または血清の
サンプルまたはアリコートが用いられ、たとえば、グリ
カン化ヘモグロビンを分析する前に血清タンパク質を除
去するために、溶血前に赤血球を除去することができ、
あるいは分析前に細胞を除去するために、全血液サンプ
ルについて遠心または濾過を行ってもよい。その代わり
に、所望により、溶血物をイオン交換固体相分離器にさ
らして、アッセイされるタンパク質よりも高い等電点お
よび／または低い等電点を有する全てのタンパク質を除
去することもできる。この精製は、所望により、本発明
の方法を実施するため装置またはキットの一部であって
よい。
本発明の特別の態様においては、競合化合物の存在お
よび不在において、アッセイされるタンパク質と結合し
た第一シグナル結合剤の量が測定される。この競合化合
物は、任意とシス−ジオール含有分子、たとえばソルビ
トールまたはマンニトール、あるいはシグナル形成活性
を有しないボロン酸含有分子であってよい。
本発明のもう一つの特別の態様においては、アッセイ
されるタンパク質を分離する前またはその後に、反応混
合物中および／または分離フラクション中に存在する第
一シグナル形成剤の量が測定され、このことによって、
そのタンパク質との結合により除去されたシグナル形成
剤の部分を算出することが可能になる。
本発明は、むしろ低い結合力（シス−ジオール部分と
ボロン酸残基との間の会合定数103〜105mol-1参照）に
頼ることができるので、グリカン化タンパク質とこのよ
うなシグナル形成ボロン酸誘導体との直接の化学量論的
結合は、起こらないであろう。
血液中の遊離炭水化物は、わずかな程度でボロン酸誘
導体に対して競合することがある。これらの作用は、過
剰のシグナル形成ボロン酸誘導体を用いることにより減
少される。20倍モル過剰（ボロン酸誘導体と複合しうる
タンパク質に対し）が有利であるが、本発明のどの態様
を用いるかに応じて、より高い割合もより低い割合も使
用できる。勿論、用いられる分離技術の効率に応じて、
バックグラウンドシグナルがある。極めて有効な分離系
を用いる場合は、より高い過剰を使用できる。極めて高
い試薬濃度を使用できない場合には、既知濃度のグリカ
ン化タンパク質を含む標準組成物について行った測定値
を参照して、グリカン化タンパク質の濃度を計算すべき
である。このような標準物の使用は、臨床実験医学にお
いて極めて一般的である。
また、本発明によれば、前記の方法を実施するための
試薬組成物またはキットが提供される。この試薬組成物
は、グリカン化した血中タンパク質を標識することので
きる第一シグナル形成剤；該タンパク質をそのグリカン
化形態または非グリカン化形態で沈澱させることのでき
る液相沈澱剤；所望により、該タンパク質をそのグリカ
ン化形態または非グリカン化形態で標識することのでき
る第二シグナル形成剤；および所望により、緩衝剤およ
び／または安定化剤および／または溶解剤（lysing age
nt）を包含し、該第一シグナル形成剤および該分離剤の
少なくとも一方が、該タンパク質に対して実質的に特異
的である。
もう一つの観点からみると、本発明によれば、本発明
の方法を実施するための装置が提供される。この装置
は、血液サンプルを抽出するための手段；該血液サンプ
ルを下記の試薬 （ｉ） 所望により、溶血剤、 （ii） 第一シグナル形成剤（上記定義のとおり）、 （iii） 血中タンパク質を、そのグリカン化形態およ
び非グリカン化形態で沈澱させることのできる液相沈澱
剤、 （iv） 所望により、第二シグナル形成剤（上記定義の
とおり）、 （ｖ） 所望により、安定化剤（上記定義のとおり）、
および （vi） 所望により、緩衝剤と 個々に、またはこれらの一つまたは二つ以上の組み合わ
せで接触させる手段；および該分離剤により分離された
血中タンパク質と結合したシグナル形成剤を評価し、そ
して所望により、該分離剤により分離されたが、該シグ
ナル形成剤と結合していない１種または数種の血中タン
パク質（たとえばヘモグロビン）を分光測定的に評価す
るための手段、たとえば分光計手段を包含する。特に好
ましい装置は、血液サンプリングデバイス、分離された
タンパク質を収容するように配置された固体相を含有す
る反応室に血液サンプルを通すための手段、該室に試薬
を導入するための手段、および該固体相上で分離された
タンパク質からの光子の放出またはこの分離されたタン
パク質による吸収を、少なくとも一つの、好ましくは少
なくとも二つのプリセット波長において検出するように
配置された分光計からなる。
下記実施例および調製剤は、本発明を限定することな
く説明するためにのみ提供される。
実施例 調製例 調製例１ 1.N−アミノフェニルボロン酸とのＮ−（レゾルフィン
−４−カルボニル）−ピペリジン−４−カルボン酸複合
体 溶液A:2mgのRESOS（Ｎ−レゾルフィン−４−カルボニ
ル）−ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ′−ヒドロキシ
サクシンイミドエステル）を、0.5mlのジメチルスルホ
キシドに溶解した。
溶液B:m−アミノフェニルボロン酸の半硫酸塩を、pH8.0
の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液に15mg/ml溶解した。pHを
8.0に調整した。
0.5mlの溶液Ａを、2mlの溶液Ｂに加えた。この混合物
を常温で12時間インキュベートした。精製は、HPLCで行
った。
調製例２ 2.アミノフェニルボロン酸とのフルオレセンイソチオシ
アネート（FITC）複合体 溶液A:3.9mlのFITCを、1mlのジメチルスルホキシドに溶
解した。
溶液B:m−アミノフェニルボロン酸の硫酸塩を、pH9.5の
0.2M炭酸塩緩衝液に1.86mg/ml溶解した。
1mlの溶液Ａを、絶えず撹拌しながら10mlの溶液Ｂに
徐々に加えた。この混合物を常温で最低２時間反応さ
せ、FITC−アミノフェニルボロン酸複合体をHPLCで精製
した。
調製例３ 3.沃素−125で標識されたボロン酸複合体 A:pH7.5の50mMリン酸Na中のアミノフェニルボロン酸（A
PBA）10mg/mlを、DMSO中のBolton−Hunter（BH）試薬1
4.2mg/mlと反応させた。BHをAPBAに同容量部になるまで
徐々に加えた。この溶液を常温で１時間インキュベート
した。
B:反応生成物を、逆層カラム上で、0.1％トリフルオロ
酢酸（TFA）水溶液中のメタノール勾配により分離し
た。
C:単離されたBH−APBA反応生成物を、クロラミン−Ｔ法
により125I−NaIで標識した。0.5mlのBH−APBA画分を、
0.1mlのpH7.5の0.25Mリン酸Naに加え、pHを7.5に調整し
た。新たに調製したpH7.5の0.25Mリン酸Na中のクロラミ
ン−Ｔ（10mg/ml）0.3mlのほかに、100μCiの125I−NaI
10μｌを加え、この混合物を１分間インキュベートし
た。
D:pH7.5の0.25Mリン酸Na中の亜硫酸水素Na（24mg/ml）
0.3mlを加えて反応を停止した。
E:標識されたBH−APBAを、0.1％TFAを含む水溶液中のメ
タノール勾配により逆層クロマトグラフィーで単離し
た。
調製例４ 4.アルカリ性ホスファターゼとのボロン酸複合体 フェニルボロン酸残基が固定化された寒天カラムを通
過させることにより、ボロン酸と反応する酵素分子を除
去したアルカリ性ホスファターゼ10mgを、pH8.5の炭酸
塩緩衝液中の30倍モル過剰のビス−（スルホサクシンイ
ミジル）スベレートと混合し、室温で120分間反応さ
せ、次いで100倍モル過剰のモノエタノールアミンを加
えた。その４時間後、酵素複合体をゲルクロマトグラフ
ィーにより精製した。
全血液溶血物からのほぼ特異的な ヘモグロビン沈澱を説明する例： 金属カチオン： 溶液A:最終濃度が6.4mgヘモグロビン/mlになるようにpH
8.0の50mM酢酸アンモニウムに希釈した全血液溶血物 溶液B:10mM Cu2+の濃度になるように水に溶解したCu
（SO4） 溶液C:10mM Zn2+の濃度になるように水に溶解したZn
（Cl）２ 調製例５ 40μｌの溶液Ｂを、200μｌの溶液Ａに加えた。混合
物を常温で５分間インキュベートし、ヘモグロビン沈澱
を遠心分離により分離した。
本発明の方法に用いられるその他の試薬の例。
調製例６ 40μｌの溶液Ｃを、200μｌの溶液Ａに加えた。この
混合物を常温で５分間インキュベートし、ヘモグロビン
沈澱を遠心分離により分離した。
本発明の方法に用いられるその他の試薬例 試薬例１ 第一シグナル形成剤として用いられるフェノキザジン：
ボロン酸複合体 この試薬は600nm以上の吸収極大を有し、その合成は
本出願人の同時継続中の英国特許出願に記載されてい
る。
試薬例２ Cr（III）−テトラカルボキシフェニルポルフィリン この試薬は、アルブミン用アッセイに用いられる第二
シグナル形成剤であり、USAのPorphyrin Productsから
入手でき、0.25M酢酸アンモニウムでpH9に緩衝された水
溶液に配合される。
試薬例３ ブロモフェノールブルー この試薬は広く市販されており、50mMのリン酸ナトリ
ウムでpH7.5に緩衝されたアルブミン用アッセイに用い
られる第二シグナル形成剤として使用する。
試薬例４ アルブミンアッセイに用いられる沈澱剤 アッセイ用緩衝液（0.25M酢酸アンモニウム、0.05％
Triton X−100、pH8.0）中の５％のリバノール（Riva
nol）（w/v）。（これは、シグナル形成剤を溶解してい
るアッセイ用緩衝液からなるアッセイ用試薬組成物の全
量の約５−20％（v/v）とすることができる。）緩衝も
またpH9.0とすることができる。
試薬例５ アルブミン固定化剤 平均粒径0.05から１μｍのポリスチレンラテックス粒
子を抗体−ラテックス複合体の調製に用いる。0.15M N
aCl（50ml/ml）中の2mlのラテックス懸濁液に、2.6ml
ε−アミノカプロン酸と5mgの１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−HCl（EDC）
とを加える。４℃で３時間反応を進行させ、次いでこの
溶液を0.15M NaCl中で一晩透析して、活性化した粒子
を遠心分離により回収する。ボロン酸反応性部位を除去
した20mgの抗体とpH7.0の20mMリン酸ナトリウム緩衝液
2.5ml中の5mg EDCとを沈降した粒子に加える。次いで
反応混合物を12時間回転し、未反応の反応性部位を適切
な試薬でブロックする。最後に、粒子を洗浄し、遠心分
離により回収する。
試薬例６ アルブミン固定化剤 従来の方法によって活性化された濾過材、たとえば公
知のブロムシアン、カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミド、ビス−オキシランおよびヒドラジン等で
活性化された濾過材は、予めボロン酸反応性部位を除去
させたアンチ−アルブミン抗体の固定化に固体支持体と
して用いられる。
この活性化膜を適切なフィルターホルダー内に取り付
け、次いで1mlの固定化用緩衝液当たり２〜300μｇのタ
ンパク質と、pH7.3の50mMリン酸ナトリウムで緩衝した
塩水とからなる100μｌの抗体溶液を制御した流量でフ
ィルターを介して通過させる。フィルター上に残ってい
る活性化部位のブロッキングは、pH8.5の0.5Mトリス緩
衝液またはpH9.5の1Mエタノールアミンのようなブロッ
キング溶液を、フィルター膜を介して通過させて行われ
る。
試薬例７ アルブミン固定化剤 ビス−オキシランと1,4−ビス−（2,3−エポキシプロ
ポキシ）ブタンとを反応して形成されるエポキシ−活性
化濾過材を、使用する直前に公知の従来方法に従って調
製し、固体支持体として用いる。このフィルターをpH7.
5の50mMリン酸ナトリウム緩衝液中のベンジルアミンの
溶液に浸漬し、絶えず撹拌しながら40℃で12時間インキ
ュベートする。ベンジルアミンの濃度は変化するが、50
mMが大部分のフィルター上の活性基の固定化およびブロ
ッキングに適切であることがわかった。
試薬例８ アルブミン固定化剤 ビス−オキシランと1,4−ビス−（2,3−エポキシプロ
ポキシ）ブタンとを反応して形成されるエポキシ−活性
化濾過材を調製する。イミノ二酢酸の二ナトリウム塩
を、2M炭酸ナトリウム溶液に溶解し、最終濃度を1ml緩
衝液当たり0.2mgのキレートであるようにし、次いでこ
の容液を予め活性化した濾過材に加る。65℃で24時間反
応させ、次いでフィルターを過剰の蒸留水で洗浄する。
“活性”金属キレートを調製するために、所望のアッセ
イタンパク質に応じて1mg/mlの塩化亜鉛または硫酸銅を
含有する金属塩溶液に、フィルターを浸漬する。最後
に、フィルターを過剰の蒸留水中で洗浄してキレート化
されていない遊離金属イオンを除去する。
試薬例９ グリカン化タンパク質の分離に用いるボロン酸フィルタ
ー 試験用サンプルからのグリカン化タンパク質の分離
は、アミノ−フェニル−ボロン酸または任意に他のボロ
ン酸含有成分で変性したフィルターを備えている分離装
置を用いて達成される。この分離において、ボロン酸含
有残基は、通過している試験用サンプルにボロン酸基を
さらしているフィルター表面に共有的に結合される。本
発明に用いられるフィルターは、アミノ基に最初に結合
するように予め活性化される（イムノダイン（Immunody
ne）（PALL）、イモビロン（Immobilon）（Millipor
e））。アミノフェニルボロン酸を、pH7.5−８の0.2Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、その中に膜を浸漬す
る。フィルター上の未反応基を、pH9の10％モノエタノ
ールアミン溶液を添加してブロックする。あるいは、ボ
ロン親和性ゲルを含むカラム（Glyco−Gel B,Pierce）
に通過させてグリカン化タンパク質を除去したカゼイン
溶液で、フィルターをブロックしてもよい。このように
して非特異性タンパク質結合の低いフィルターが得られ
る。分離は、タンパク質のグリカン化された部位にボロ
ン酸を結合させるのに適した緩衝液中で塩基性pH（pH8
−９）で行われる。分離用装置は、吸収パットと接触し
ている活性フィルターからなり、この吸収パッドは活性
フィルターを通して試験用サンプルを排出し、このフィ
ルターからグリカン化タンパク質の他はすべて除去され
る。
試薬例10 アルブミンのグリカン化セグメントと反応する抗体の形
成 Cohen et al,J.Immunol.Meth.117:121−129（1989）
の方法によるグリカン化アルブミン抗体を用いて、グリ
カン化アルブミンと反応するモノクロナール抗体を得
る。もっと特異的な免疫化を行うための免疫化用セグメ
ントは、グルコース−Lys 525−Gln−Thr−Ala−Leu 52
9であり、これはグリカン化アルブミン中で最も多くグ
リカン化された残基である。
試薬例11 グリカン化アルブミンに特異的な固定化剤（抗体） 試験用サンプルからのグリカン化アルブミンの分離
は、アルブミンをグリカン化するための主部位がグリカ
ン化されている場合に、この主部位と特異的に反応する
ような抗体または抗体フラグメントで変性されたフィル
ターを備えている分離装置で達成される（試薬例10参
照）。本発明で用いられるフィルターは、おもにアミノ
基と結合させるために予め活性化される（イムノダイン
（immunodyne）（PALL）、イモビロン（Immobilon）（M
illipore））。この抗体または抗体フラグメントを、pH
7.5−８の0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、この
膜を浸漬する。フィルター上の未反応基は、10％モノエ
タノールアミン溶液をpH9で加えてブロックする。ある
いは、このフィルターをボロン酸親和性ゲル（Glyco−G
el B,Pierce）を含むカラムを通過させることによって
グリカン化タンパク質を除去したカゼイン溶液でブロッ
クしてもよい。このようにして、非特異性タンパク質結
合の低いフィルターが得られる。抗体の反応性部位を、
通過するサンプルにさらすと、グリカン化アルブミンは
固定化される。
試薬例12 約645nmの吸収極大を有する活性化フェノキサジンと複
合したグリカン化アルブミンに反応するモノクロナール
抗体 試薬例10により得られたモノクロナール抗体20mgをpH
8.5の0.1Mリン酸緩衝液1mlに溶解する。この溶液に、10
モル過剰の または NHS＝Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル基 （本出願人の同時係属中の英国特許出願に記載されてい
るようにして合成）を加え、この混合物を常温で１時間
回転して、最後に適切な緩衝液に接触させて透析する。
試薬例13 グリカン化または未グリカン化全血清タンパク質の沈澱
剤 （Ａ）500mlの水に125gのTCAを溶解し、１リットル容量
に希釈して、0.76Mトリクロロ酢酸（TCA）を調製する。
タンパク質の沈澱は、0.25gのTCA−試薬と５−10mg/m
lの総タンパク質濃度の全血液サンプル1mlとを完全に混
合して行われる。この混合物を10分間放置して、沈澱物
を分離する。
（Ｂ）総タンパク質濃度約0.5mg/mlのサンプルに対して
は、水に15.0gのスルホサリチル酸（×2H2O）と35.0gの
硫酸ナトリウム塩（無水）とを溶解し、最終容量500ml
に希釈して調製する。
0.5mlのサンプルに、2mlのサリチル酸試薬を加えて充
分に混合し、10分間放置して、沈殿物を分離する。
試薬例14 補体C3（グリカン化または非グリカン化）の固定化剤 ヒト補体因子C3に反応する市販のモノクロナール抗体
（多くの販売元から入手可能）を、試薬例６および試薬
例11に記載しているようにして固定化する。
試薬例15 カルボニックアンヒドラーゼ（グリカン化または非グリ
カン化）の固定化剤 ヒトカルボニックアンヒドラーゼに反応する市販のモ
ノクローナル抗体（多くの販売元から入手可能）を、試
薬例６および試薬例11に記載しているようにして固定化
する。
試薬例16 第一シグナル形成剤として用いられるフタロシアニン：
ボロン酸複合体 2mlペンゼン中のクロロアルミニウムフタロシアンテ
トラスルホネート（60mg、6.7×10-5モル）の懸濁液
に、10倍モル過剰の塩化オキサリルを絶えず撹拌しなが
ら徐々に滴下して、この溶液を湿分排除下に25℃で撹拌
した。この温度で12時間後に、溶媒を減圧で湿分排除下
に蒸発させた。その直後に、得られた塩化スルホニル
に、1.5mlの0.25M炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム
緩衝液（pH9.0）中の３−アミノフェニルボロン酸一無
水物（20mg、1.35×10-4モル）を加えて、この溶液を室
温で３−12時間撹拌した。ボロン酸複合体をおもにモノ
フェニルボロン酸で機能化した色素の形で逆層クロマト
グラフィーにより単離した。
本発明方法の実施例 実施例１ １種類の色素を用いた全血液中のグリカン化ヘモグロビ
ンおよび溶媒沈澱 全血液サンプルを溶血し、溶血アッセイ用緩衝液、す
なわち0.05％Triton X−100とともに100mM Hepesを含む
pH9.0の溶液にて、ヘモグロビン約8mg/mlとなるように
希釈した。エタノール中の50％ブタノール（v/v）と試
薬例１に記述のフェノキサジンアミノフェニルボロン酸
複合体との混合物を加え、最終ブタノール濃度を９％
（v/v）に、複合体濃度を1.6×10-4Mにした。沈澱が形
成され、これを遠心分離により上澄液から分離した。こ
の沈澱を、５％のジメチルスルホキシドを含有する0.05
M塩酸に再溶解し、ヘモグロビン濃度およびヘモグロビ
ン結合ボロン酸フェノキサジン複合体の濃度を吸光光度
法により測定した。既知濃度のヘモグロビンおよびグリ
カン化ヘモグロビンの標準溶液を用いて得られた較正曲
線において内挿することにより濃度を計算し、そして総
ヘモグロビンに対するグリコシル化ヘモグロビンのパー
セントを計算した。
実施例２ ２種類の色素を用いた全血液中のグリカン化アルブミン
およびリバノール沈澱（Ｉ） 0.05％Triton X−100を加えた0.25M酢酸アンモニウム
（pH9.0）を含み、さらに100nmolの試薬例１の化合物と
20nmolのCr（III）−テトラカルボキシフェニルとを含
む溶血アッセイ用緩衝液150μｌに、全血液10μｌを混
合する。
アッセイ用緩衝液中のリバノール（２−エトキシ−6,
9−ジアミノアクリジン乳酸塩）５％（w/v）溶液18μｌ
を加える。アルブミン沈澱物を濾過して分離し、１度洗
浄し、Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner
CS 9000を用いて645と450nmにおける反射率を測定し
た。645と450nmでの反射率比を測定した。
アッセイは、従来の比色法、アフィニティクロマトグ
ラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって
定量化された既知のグリコン化アルブミン画分を含む標
準血液サンプルを用いて較正される。
実施例３ ２種類の色素を用いた全血液中のグリカン化アルブミン
およびリバノール沈澱（II） 試薬例１の化合物の代わりに試薬例16の化合物を用
い、また反射率を645nmではなく685nmで読み取る他は実
施例２の方法を繰り返す。
実施例４ 固定化した固体とブロモフェノールブルーを用いたグリ
カン化アルブミンの定量化 グリカン化アルブミンに特異的に反応する固定化した
モノクロナール抗体を用いた濾過装置を使用する（試薬
例11参照）。
130mM NaCl 500μｌと、溶血剤として0.05％Triton
X−100を加えた20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）
と、50nMブロモフェノールブルーとに、全血液10μｌを
混合する。濾過装置の結合容量に応じて、この混合物の
適量を濾過装置に接触させる。実施例２と同様にして、
リフレクトメーターを用いて590nmでの反射率を測定す
る。照射の強さは、固定化された抗体に反応するアルブ
ミンの量に依存する。
グリカン化アルブミン画分は、従来技術によって別個
に得られた血液アルブミンを参照して測定する。
実施例５ グリカン化血清タンパク質の定量化 ５μｌの血清（約0.4mgのタンパク質を含有）を、試
薬例13Bのスルホサリチル酸／硫酸ナトリウム溶液0.75m
lと混合する。混合および10分間のインキュベートの後
に、沈澱物をフィルターに通過させてトラップする。次
いで緩衝液2ml、すなわち0.25M酢酸アンモニウムと0.05
％Triton X−100とからなるpH9.0の溶液と調製例１の化
合物100nmとを、フィルターに通す。Shimadzu Dual Wav
elength Flying Spot Scanner CS 9000を用いて、575nm
での反射率を測定する。この反射率シグナルは、試験用
サンプル中のグリカン化タンパク質濃度の関数である。
実施例６ グリカン化補体因子C3の定量化（Ｉ） 0.25％Triton X−100を加えた0.25M酢酸アンモニウム
（pH9.0）を含み、さらに100nmolの試薬例１の化合物を
含む溶血アッセイ用緩衝液150μｌに、全血液10μｌを
混合する。
この混合物のアリコートを試薬例14のフィルターに移
す。（アリコートの容量は、フィルターの総結合容量を
越えないように調整しなければならない）。このフィル
ターを一度洗浄し、Shimadzu Dual Wavelength Flying
Spot Scanner CS 9000を用いて、645nmでの反射率を測
定する。この反射率シグナルは、グリカン化補体C3の濃
度に依存する。
実施例７ グリカン化補体因子C3の定量化（II） 試薬例１の化合物の代わりに試薬例16の化合物を用
い、また645nmではなく685nmでの反射率を読み取る他は
実施例６の方法を繰り返す。
実施例８ グリカン化カルボニックアンヒドラーゼの定量化 0.05％Triton X−100を加えた0.25M酢酸アンモニウム
（pH8.0）を含み、さらに100nmolの試薬例１の化合物を
含む溶血アッセイ用緩衝液150μｌに、全血液10μｌを
混合する。
この混合物のアリコートを試薬例15のフィルターに移
す。（アリコートの容量は、フィルターの総結合容量を
越えないように調整しなければならない）。このフィル
ターを一度洗浄し、Shimadzu Dual Wavelength Flying
Spot Scanner CS 9000を用いて、645nmでの反射率を測
定する。この反射率シグナルは、グリカン化カルボニッ
クアンヒドラーゼの濃度に依存する。
実施例９ 総アルブミン−結合フィルター（ベンジルアミンフィル
ター）とボロン酸色素を用いたグリカン化アルブミンの
分析（Ｉ） 0.25M酢酸アンモニウムと0.05％Triton X−100と（pH
9.0）を含み、さらに100nmolの試薬例２の化合物を含む
溶血アッセイ用緩衝液150μｌに、全血液10μｌを混合
する。（このように、フィルターから洗浄ヘモグロビン
をつくることは不要となる）。得られた混合物のアリコ
ートを試薬例７のフィルターに通過させる。Shimadzu D
ual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000を用い
て、645nmでのフィルター上の反射率を測定する。
実施例10 総アルブミン−結合フィルター（ベンジルアミンフィル
ター）とボロン酸色素を用いたグリカン化アルブミンの
分析（II） 試薬例２の化合物の代わりに試薬例16の化合物を用
い、また645nmでなく685nmでの反射率を読み取る他は実
施例９の方法を繰り返す。試薬例２および試薬例３の化
合物を第二シグナル形成剤として所望により含んでいて
もよい。
実施例11 １種類の色素を用いた全血液中のグリカン化ヘモグロビ
ン：フィルターホーマット 全血液のサンプルを、pH9.4の160mMピペラジンと0.07
％Triton X−100（pH9.4）を含み、さらに9.4％エタノ
ール（v/v）、9.4％ブタノール（v/v）と2.1×10-5M濃
度の試薬例16の化合物とを含む溶血化反応−緩衝液と混
合した。最終ヘモグロビン濃度は、約2mg/mlであった。
この全血液を溶血化すると、沈澱が形成された。沈澱し
たヘモグロビンを濾過により分離した。Shimadzu Dual
Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000を用いて、68
5と470nmでの反射率を測定した。685と470nmの反射率の
比を計算した。既知濃度のヘモグロビンおよびグリカン
化ヘモグロビンの標準溶液を用いて得られた較正曲線に
おいて内挿することによりこれらの濃度を計算し、そし
て総ヘモグロビンに対するグリカン化ヘモグロビンのパ
ーセントを計算した。
グリカン化ヒトタンパク質に定量化に用いられる全て
の試薬に対して、生物由来の試薬を任意に過ヨウ素酸ま
たはエンドグリコシダーゼで処理した固定化ボロン酸成
分を有するゲルを含有するカラムを通過させて、分析試
薬をボロン酸基と反応する成分から精製すると有利であ
る。
一方、シグナル形成成分は、ヨウ素−125のようなラ
ジオアイソトープ、蛍光成分、化学ルミネセンス成分、
または生物ルミネセンス成分で構成される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−28865（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−21167（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−101765（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−253399（ＪＰ，Ａ) 米国特許4861728（ＵＳ，Ａ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の工程 ａ） 所望により、血液サンプルを溶血して細胞結合グ
    リカン化血中タンパク質を遊離させる工程； ｂ） 液相沈澱剤を用いて、該サンプルから該グリカン
    化タンパク質および対応する非グリカン化血中タンパク
    質を分離する工程； ｃ） 該グリカン化および非グリカン化タンパク質を該
    サンプルから分離する前またはその間に、該サンプル
    を、対応する非グリカン化タンパク質に対するよりも実
    質的に高い結合親和性で該グリカン化タンパク質と結合
    することのできる第一シグナル形成剤と接触させるか、
    あるいは該分離させた両タンパク質を該第一シグナル形
    成剤と接触させる工程； ｄ） 所望により、該グリカン化および非グリカン化タ
    ンパク質を該サンプルから分離する前またはその間に、
    該サンプルを、該グリカン化タンパク質および該対応す
    る非グリカン化タンパク質と結合することのできる第二
    シグナル形成剤と接触させるか、あるいは該分離させた
    両タンパク質を該第二シグナル形成剤と接触させる工
    程；および ｅ） 該分離されたタンパク質と結合したシグナル形成
    剤および／または該グリカン化タンパク質または該対応
    する非グリカン化タンパク質と結合したシグナル形成剤
    を評価する工程 を包含し、 ただし、該グリカン化タンパク質がグリカン化ヘモグロ
    ビンであるときは、該第一シグナル形成剤が600nm以上
    に吸収極大を有する発色団で標識されたボロン酸または
    その塩であることを特徴とする、サンプル中のグリカン
    化血中タンパク質を評価する方法。
  2. 【請求項２】工程（ｃ）を、それぞれが異なるグリカン
    化血中タンパク質に対して実質的に特異的である２種の
    異なる第一シグナル形成剤を用いて行い、そして所望に
    より、工程（ｄ）を、前記２種の異なる血中タンパク質
    に対して実質的に特異的である２種の異なる第二シグナ
    ル形成剤を用いて行うことを特徴とする、特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】第一または第二シグナル形成剤が、600nm
    以上の吸収極大を有する発色団で標識されていることを
    特徴とする、特許請求の範囲第１項または第２項に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】工程（ｂ）と（ｃ）、および所望により
    （ｄ）を同時に行うことを特徴とする、特許請求の範囲
    第１〜３項のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記の第一シグナル形成剤が、シグナル形
    成標識と結合した１種または数種のヒドロキシボリル残
    基またはその塩の複合体であることを特徴とする、特許
    請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】前記の分離工程（ｂ）を、評価されるタン
    パク質に対して実質的に特異的な剤または手段を用いて
    行うことを特徴とする、特許請求の範囲第１〜５項のい
    ずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】前記の分離工程（ｂ）を、均質溶液からの
    選択的沈澱により行うことを特徴とする、特許請求の範
    囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】沈澱を金属陽イオンの添加により行うこと
    を特徴とする、特許請求の範囲第６項または第７項に記
    載の方法。
  9. 【請求項９】沈澱を、評価されるタンパク質を実質的に
    選択的に沈澱させることのできる濃度の有機溶剤または
    その混合物の添加により行うことを特徴とする、特許請
    求の範囲第６項または第７項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】沈澱を、評価されるタンパク質に対して
    実質的に特異的な結合タンパク質の添加により行うこと
    を特徴とする、特許請求の範囲第６項または第７項に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】沈澱工程を、固体相の上または内部で行
    うことを特徴とする、特許請求の範囲第６〜10項のいず
    れかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】形成された沈澱を、クロマトグラフィー
    またはろ過媒体を用いて、または遠心により分離するこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第６〜10項のいずれか
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記の分離工程（ｂ）が、評価されるタ
    ンパク質に対して特異的でないことを特徴とする、特許
    請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】第二シグナル形成剤が、前記のグリカン
    化タンパク質および対応する非グリカン化タンパク質と
    実質的に特異的に結合することを特徴とする、特許請求
    の範囲第１〜13項のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】第二シグナル形成剤が、血中タンパク質
    と非特異的に結合することを特徴とする、特許請求の範
    囲第１〜12項のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】グリカン化アルブミンおよび／またはグ
    リカン化補体C3を評価するための、特許請求の範囲第１
    〜15項のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】グリカン化アルブミンの評価に用いら
    れ、第二シグナル形成剤が、金属塩、金属キレート、陰
    イオン性色素、ポルフィリン類およびそれらの合成誘導
    体、ポンソ−Ｓ、クーマシーブリリアントブルー、ビシ
    ンコニン酸およびブロモフェノールブルーから選ばれる
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第16項に記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】グリカン化血中タンパク質を標識するこ
    とのできる第一シグナル形成剤；該タンパク質をそのグ
    リカン化形態または非グリカン化形態で沈澱させること
    のできる液相沈澱剤；所望により、該タンパク質をその
    グリカン化形態または非グリカン化形態で標識すること
    のできる第二シグナル形成剤；および所望により、緩衝
    剤および／または安定化剤および／または溶解試薬を包
    含し、該第一シグナル形成剤および該沈澱剤の少なくと
    も一方が、該タンパク質に対して実質的に特異的である
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法
    を実施するための分析用テストキット。
  19. 【請求項１９】血液サンプルを分離するための手段；該
    血液サンプルを下記の試薬 （ｉ） 所望により、溶血剤、 （ii） 特許請求の範囲第１項で定義した第一シグナル
    形成剤、 （iii） 血中タンパク質を、そのグリカン化形態およ
    び非グリカン化形態で沈澱させることのできる液相沈澱
    剤、 （iv） 所望により、特許請求の範囲第１項で定義した
    第二シグナル形成剤、 （ｖ） 所望により、安定化剤、および （vi） 所望により、緩衝剤と 個々に、またはこれらの一つまたは二つ以上の組み合わ
    せで接触させる手段；および該沈澱剤により分離された
    血中タンパク質と結合したシグナル形成剤を評価し、そ
    して所望により、該沈澱剤により分離されたが、該シグ
    ナル形成剤と結合していない１種または数種の血中タン
    パク質を評価するための手段を包含することを特徴とす
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法を実施するため
    の装置。
  20. 【請求項２０】血液サンプリングデバイス、分離された
    タンパク質を受け取るように配置された固体相を含有す
    る反応室に血液サンプルを通すための手段、該室に試薬
    を導入するための手段、および該固体相上で分離された
    タンパク室からの光子の放出またはこの分離されたタン
    パク質による吸収を、少なくとも一つの、好ましくは少
    なくとも二つのプリセット波長において検出するように
    配置された分光計を包含することを特徴とする、特許請
    求の範囲第19項に記載の装置。
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