DE69104491T2

DE69104491T2 - Bestimmung von glycosilierten blutproteinen.

Info

Publication number: DE69104491T2
Application number: DE69104491T
Authority: DE
Inventors: Frank N-8050 Tverlandet Frantzen; Erling N-0551 Oslo 5 Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals AS
Current assignee: Axis Biochemicals AS
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1991-11-13
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2011-11-14
Also published as: NO931747L; DE69104491D1; WO1992008984A1; JPH06502244A; NO311385B1; JP2643027B2; CA2096250C; US5506144A; FI104519B; ATE112635T1; EP0557350A1; GB9024771D0; ES2061273T3; AU8866291A; FI932150A0; US5919708A; NO931747D0; EP0557350B1; DK0557350T3; CA2096250A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Liganden-Bindungs-Assay zur Bestimmung von glykosylierten (glycated) Blutproteinen (GBPs).
Es ist seit langem bekannt, daß viele Glykoproteine in Körpergeweben und -flüssigkeiten als Folge von nicht-enzymatischen Reaktionen von Körperproteinen mit Zuckern vorkommen. Diese nicht-enzymatisch glykosylierten Proteine werden hier als glykosylierte Proteine bezeichnet.
Da Gewebe von Säugern anscheinend kein Enzym enthalten, das zur Umkehrung der Glykosylierungs- ("glycation")Reaktion befähigt ist, ist der Umfang, zu dem ein gegebenes Protein glykosyliert wird, im wesentlichen abhängig von
- der eigenen Fähigkeit des Proteins, glykosyliert zu werden,
- der Lebensdauer des Proteins innerhalb des Körpers, und
- den Glukosekonzentrationen, denen das Protein ausgesetzt worden ist.
Anders als direkte Messungen der Glukosekonzentration von Körpergewebe- oder Körperflüssigkeitsproben (z.B. Blut, Plasma oder Urin), was eine Information über die Glukosekonzentration nur zum Zeitpunkt der Probenentnahme gibt, liefert somit der Glykosylierungsgrad eines Proteins einen Hinweis über die Kontrolle der Glukosekonzentration durch den Körper gemittelt über einen längeren Zeitraum.
Bei Patienten mit nicht-stabilisierter Diabetes mellitus ist der Grad der Proteinglykosylierung häufig mehrfach höher als bei normalglykämischen Patienten, und folglich sind mehrere GBP-Assays als Screeningverfahren für Diabetes mellitus oder als Mittel, mit denen der mittlere Blutglukosespiegel eines Patienten über einen langen kontrollierten Zeitraum bewertet werden kann, vorgeschlagen worden.
Solche Assays sind insbesondere für glykosyliertes Hämoglobin (GH) und glykosyliertes Serumalbumin (GSA) vorgeschlagen worden, da die relativ lange Lebensdauer dieser Proteine einen Hinweis auf die langfristige und mittelfristige Kontrolle der Blutglukose liefert und da diese Proteine sowohl vermehrt vorkommen und relativ stark zu einer Glykosylierung neigen.
Somit spiegeln die GSA- und GH-Spiegel die Kontrolle des Körpers über die Blutglukose während der vorangegangenen 1 bis 3 Wochen bzw. 1 bis 3 Monate wieder.
GBP-Assays beruhen im allgemeinen auf der Abtrennung der GBP von einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe, auf der Bindung einer detektierbaren Markierung, z.B. einem Chromophor, einem Fluorphor oder einer Radiomarkierung, an das GBP in solch einer Probe, oder auf dem chemischen Abbau des GBP in solch einer Probe, z.B. der Oxidation der Fruktosamineinheit unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart eines Redoxindikators. Über solche Assays und deren Vorteile und Nachteile wurde von Schleicher et al in J. Clin. Chem. Cli. Biochem. 27: 577-587 (1989) berichtet.
Es sind Verfahren des Standes der Technik bekannt, welche die Abtrennung der glykosylierten Proteine von den nicht-glykosylierten Proteinen durch Ionenaustauschchromatographie beinhalten. Dies war das erste Verfahren, das für GH-Assays vorgeschlagen wurde, und stellt das am meisten verwendete klinische Verfahren dar. Es ist jedoch teuer und zeitaufwendig, und die Ergebnisse werden durch kleine Temperaturänderungen beeinflußt.
Mehrere weitere Assays beinhalteten die Verwendung von Boronsäurederivaten, um die glykosylierten Proteine in einer Probe zu isolieren oder zu markieren. Es ist seit langem bekannt, daß Boronsäuren Ester mit Kohlenhydrateinheiten bilden, die cis-Diol-Reste besitzen, wie bei glykosylierten Proteinen, während enzymatisch gebildete Glykoproteine solche Ester nicht bilden. Somit sind chemisch immobilisierte Boronsäuren zur Verwendung bei der Isolierung von glykosylierten Proteinen durch Affinitäts-Chromatogrpahie vorgeschlagen worden, und die Verwendung solcher Substanzen ist z.B. von Dean et al in der GB-A-2 024 829 zur Quantifizierung der glykosylierten Fraktion von Hämoglobin vorgeschlagen worden.
Die Verwendung solcher Säulen ist jedoch teuer und zeitaufwendig, und für andere GBPs als GH weist Schleicher (siehe oben) darauf hin, daß der Grad der Bindung des glykosylierten Proteins sehr empfindlich gegenüber den Bedingungen ist, unter denen die Chromatographie durchgeführt wird.
Die Reaktion der glykosylierten Proteine in flüssiger Phase mit Boronsäuren, die mit einem Chromophor oder Fluorophor markiert worden sind, ist außerdem als Grundlage für einen Assay für glykosylierte Proteine, insbesondere für GH vorgeschlagen worden. So schlug Schleicher in der DE-A-37 20 736 einen Assay vor, der auf einem der folgenden drei Prinzipien zur Messung des gesamten, in einer Probe vorhandenen glykosylierten Proteins beruhte:
1. eine Verschiebung des Absorptionsmaximums einer Boronsäure-Chromophor-Markierung bei Bindung an ein glykosyliertes Protein,
2. eine Polarisierungsänderung der Fluoreszenz einer Boronsäure-Fluorophor-Markierung bei Bindung an ein glykosyliertes Protein, oder
3. die Messung der Menge der mit einem Chromophor oder Fluorphor markierten Boronsäure, die an ein glykosyliertes Protein gebunden ist, nach Entfernung der überschüssigen, ungebundenen markierten Boronsäure, z.B. unter Verwendung von Aktivkohle.
Keines dieser Verfahren kann jedoch zur Quantifizierung eines spezifischen GBP verwendet werden. Weiterhin besitzen die von Schleicher vorgeschlagenen Reagenzien ziemlich niedrige Absorptionskoeffizienten, und ihre Absorptionsmaxima liegen ziemlich nahe an dem von Hämoglobin, was es schwierig oder unmöglich macht, GH zu detektieren.
Wagner schlägt in der US-A-4 861 728 einen GH- Assay vor, wobei man GH abtrennt, indem man eine Hämolysatprobe mit einem festen Träger in Kontakt bringt, an den ein Antikörper gebunden ist, der Spezifität für Gesamthämoglobin besitzt, und GH mit einer mit einem Fluorophor markierten Boronsäure reagieren läßt. Das gesamte gebundene Hämoglobin kann dann reflektometrisch gemessen werden, während gebundenes GH fluoroskopisch abgeschätzt werden kann.
Dieses Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, daß die Assoziationskonstanten zwischen dem glykosylierten Hämoglobin und den Boronsäuremarkierungen ziemlich niedrig sind (z.B. 10³ bis 10&sup5; Mol&supmin;¹ l), und da die effektive Konzentration von GH nach der Immobilisierung ziemlich niedrig ist, wird die Bindung der Markierung auch entsprechend reduziert.
Es besteht somit nach wie vor ein Bedarf an GBP- Assays, die schnell, einfach und billig sind, und die leicht für eine Verwendung durch klinische Laboratorien oder Diagnostiker angepaßt werden können.
Ein solcher Assay für GH ist in unserer Patentanmeldung WO-A-90/13818 beschrieben, und wir haben nun festgestellt, daß dieses Verfahren leicht an eine Verwendung als Assay für andere GBP, insbesondere GA, anzupassen ist.
Somit wird gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Blutproteins in einer Probe bereitgestellt, wobei man bei diesem Verfahren:
a) gegebenenfalls die Probe hämolysiert, um zellgebundenes glykosyliertes Protein freizusetzen;
b) das glykosylierte Blutprotein und das entsprechende nicht-glykosylierte Blutprotein aus der Probe mit Hilfe eines Flüssigphasen-Fällungsreagens abtrennt;
c) die Probe vor oder während der Abtrennung des glykosylierten und des nicht-glykosylierten Proteins oder die abgetrennten Proteine mit einem ersten signalgebenden Agens in Kontakt bringt, das zur Bindung an das glykosylierte Protein mit wesentlich höherer Bindungsaffinität als gegenüber dem entsprechenden nicht-glykosylierten Protein befähigt ist;
d) gegebenenfalls die Probe vor oder während der Abtrennung des glykosylierten und des nicht-glykosylierten Proteins oder die abgetrennten Proteine mit einem zweiten signalgebenden Agens in Kontakt bringt, daß zur Bindung an das glykosylierte Protein und das entsprechende nicht-glykosylierte Protein befähigt ist; und
e) die signalgebenden Agenzien bestimmt, welche an die abgetrennten Proteine gebunden sind und/oder welche nicht an das glykosylierte Protein oder an das entsprechende nicht-glykosylierte Protein gebunden sind;
mit der Maßgabe, daß dann, wenn das glykosylierte Protein glykosyliertes Hämoglobin umfaßt, das erste signalgebende Agens eine mit einem Chromophor markierte Boronsäure oder ein Salz davon ist und ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm aufweist.
Bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren kann das glykosylierte Protein, das mit dem ersten signalgebenden Agens markiert ist, irgendein oder auch irgendeine Gruppe von Blutproteinen sein. Damit das Verfahren jedoch ein Maß zur Kontrolle der Blutglukose über einen bestimmten Zeitraum liefert, wird es vorzugsweise so ausgelegt, daß im wesentlichen nur ein spezifisches glykosyliertes Protein, insbesondere Hämoglobin, Albumin, Komplement C3, Fibrinogen oder Transferrin, bestimmt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden wenigstens zwei erste signalgebende Agenzien verwendet, wobei jedes im wesentlichen spezifisch für ein anderes GBP ist, und wobei sich jedes Signal von anderen ausreichend unterscheidet, um ohne signifikante gegenseitige Störung gemessen zu werden. So kann z.B. das erste signalgebende Agens zweckmäßigerweise einen Chromophor-markierten Antikörper oder einen Chromophor-markiertes, antigenbindendes Antikörperfragment, spezifisch für ein GBP, und einen Fluorophor-markierten oder radio-markierten Antikörper oder ein Fragment davon, spezifisch für ein anderes GBP, umfassen. Zur Erleichterung der Messung wird jedoch vorzugsweise die Markierung mit unterscheidbaren Markern des gleichen Typs durchgeführt; z.B. sind beide (oder alle) Chromophore. Diese Ausführungsform kann mehr als ein zu verwendendes Agens erfordern, um eine Trennung von zwei oder mehreren untersuchten Proteinen zu bewirken - in vielen Fällen ist jedoch ein einziges Agens oder Trennungsmittel ausreichend. Um bei dieser Ausführungsform ein Maß für die relative Häufigkeit der glykosylierten Formen der untersuchten Proteine zu erhalten, ist es weiterhin wünschenswert, zwei oder mehr proteinspezifische, zweite signalgebende Agenzien zu verwenden. Aufgrund einer geeigneten Auswahl der untersuchten Proteine, z.B. Hämoglobin und Albumin, und gegebenenfalls auch Komplement C3 oder Fibrinogen, läßt diese erfindungsgemäße Ausführungsform zu, daß ein einziger Assay einen Hinweis auf die zurückliegende Blutglukosekontrolle des Patienten über einen kurzen, mittleren und langen (bis zu drei Monaten) Zeitraum liefert.
Wenn das zu bestimmende, glykosylierte Protein mit einem Chromophor markiert ist, besitzt das jeweils verwendete Agens vorzugsweise ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm, so daß das Verfahren mit Erythrozyten- oder Hämoglobinhaltigen Proben, z.B. Gesamtblut, durchgeführt werden kann, ohne daß es erforderlich ist, Hämoglobin wegzuwaschen. Wenn entsprechend ein zweites signalgebendes Agens verwendet wird, um sowohl die glykosylierten als auch die nicht-glykosylierten Formen der untersuchten Proteine zu markieren, was für den Fall wünschenswert ist, daß das Protein nicht Hämoglobin ist, dann wird dieses Agens, wenn es einen Chromophor enthält, vorzugsweise auch ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm besitzen.
Eine Reihe von Chromophor-Markern und diese enthaltende Verbindungen, die zur Verwendung als das erste oder das zweite signalgebende Agens bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, ist in unserer gleichzeitig anhängigen englischen Patentanmeldung Nr. 9024775.0, eingereicht am 14.11.1990 mit dem Titel "Chemical Compounds" und in der zugehörigen internationalen Patentanmeldung (offengelegt als "WO-A- 92/08722") offenbart. Diese Verbindungen enthalten Chromophore, die Absorptionsmaxima oberhalb von 600 nm besitzen, z.B. Phenoxazin- und Phenothiazin-Derivate, die sekundäre oder tertiäre Amino- und Iminogruppen in den Positionen 3 und 7 tragen. Diese Chromophore dienen zweckmäßigerweise als erstes signalgebendes Agens, wenn sie auf eine Weise mit Boronsäureeinheiten verbunden sind, die im folgenden genauer diskutiert wird, z.B. durch Substitution der Aminoeinheit durch eine 3-(N- Ethyl-piperidin-4-yl-carbonylamino)phenylboronsäuregruppe (gebunden an das β-Kohlenstoffatom der N-Ethyleinheit). Zu solchen besonders bevorzugten Chromophoren zählen Chloraluminium-phthalocyanin, wie diejenigen, die in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung definiert und offenbart sind.
Zusätzlich zur Bestimmung des Spiegels eines glykosylierten Proteins in einer Probe kann es auch wünschenswert sein, unter Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Bestimmung des Spiegels der vorhandenen glykosylierten und nicht-glykosylierten Proteine zu erhalten und das Verhältnis von glykosylierten zu Gesamtprotein zu berechnen.
Es kann weiterhin besonders wünschenswert sein, ein Maß für die Gesamtproteinkonzentration im Blut von dem bestimmten, untersuchten Protein zu erhalten, da der Glykosylierungsgrad in Abhängigkeit von der Gesamtproteinkonzentration bei Patienten, die an Zuständen leiden, die zu ungewöhnlich niedrigen Konzentrationen des untersuchten Proteins führen, variieren kann.
Der Proteintrennungsschritt erfordert nicht die Abtrennung der Gesamtmenge des in der Probe vorhandenen glykosylierten Proteins und nicht-glykosylierten Proteins. Es reicht aus, nur einen Teil sowohl der glykosylierten als auch der nicht-glykosylierten Fraktion abzutrennen, solange das Verfahren entsprechend kalibriert wird. Solche Kalibrierungen zählen bei Assays in klinischen Laboratorien zur Routine.
Der hier verwendete Ausdruck "Bestimmung" ("assessing") soll sowohl eine Quantifizierung in dem Sinne bedeuten, daß man einen absoluten Wert für die Menge an glykosylierten oder Gesamtprotein in einer Probe erhält, als auch einen Index, ein Verhältnis, einen Prozentwert oder ein ähnliches Maß des Spiegels eines glykosylierten Proteins beinhalten, z.B. relativ zur Gesamtproteinkonzentration der Probe.
Es ist ersichtlich, daß das neue, erfindungsgemäße Verfahren die Trennung der glykosylierten von der nichtglykosylierten Proteinfraktion umgeht, und stattdessen auf der Abtrennung sowohl der glykosylierten als auch der nicht-glykosylierten Proteine aus einer Probe beruht. Infolgedessen besteht kein Bedarf, das erste signalgebende Agens zu immobilisieren, da es nicht als Teil eines Trennungssystems verwendet werden braucht, und es ist in der Tat bevorzugt, es nicht zu immobilisieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um die Menge an glykosyliertem Protein in Blut-, Bluthämolysat- oder Blutextrakt-Proben sowohl bei gesunden Individuen als auch bei Patienten, die an Diabetes mellitus leiden, oder von denen man annimmt, daß sie daran leiden, zu bestimmen. Die Proben können in trockener, flüssiger oder gefrorener Form vor der Analyse vorliegen. Hämolysate, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden sollen, können z.B. hergestellt werden, indem man verschiedene Arten von Reagenzien verwendet, um die Hämolyse zu bewirken und um die Kohlenhydrateinheiten der glykosylierten Proteine der Bindungsreaktion auszusetzen. Diese Behandlung kann vor oder in Kombination mit der Verwendung der anderen Reagenzien durchgeführt werden, die zur Durchführung dieses Verfahrens notwendig sind. Um Störungen zu reduzieren, können die Proben gegebenenfalls z.B. unter Verwendung von Glukoseoxidase oder einer Pufferlösung mit einem pH-Wert unterhalb von 6 behandelt werden, um den Gehalt an freier oder schwachgebundener Glukose zu reduzieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Reaktion der signalgebenden Agenzien mit dem Protein vor, während oder nach der Proteinabtrennung von der Probe stattfinden. Die gewählte Reihenfolge ist abhängig von der chemischen Ausstattung oder von Geräten, die bei der Durchführung des Verfahrens verwendet werden, und davon, was als praktischer empfunden wird.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform findet die Bindung des signalgebenden Agens und die Proteinisolierung gleichzeitig in einer homogenen Lösung statt, aus der das Protein präzipitiert und durch Zentrifugation oder Filtration isoliert wird. Die Reaktions- und Trennungsbedingungen müssen jedoch innerhalb der durch die Glykosylrest-Borsäure-Assoziationskonstanten vorgegebenen Grenzen gewählt werden, die ziemlich niedrig sind (10³-10&sup5; Mol&supmin;&sup4;).
Aus der Stärke des von den signalgebenden Agenzien erhaltenen Signals kann die Konzentration der signalgebenden Moleküle, die an die Proteine gebunden sind oder mit diesen abgetrennt werden, bestimmt werden. Es gibt noch keinen "absoluten" Standard zur Quantifizierung von glykosylierten Proteinen; falls gewünscht, kann man jedoch eine Kalibrierung oder Korrelation dieses neuen Verfahrens gegenüber Verfahren des Standes der Technik erhalten, indem man Standardproteinlösungen verwendet, die bekannte Konzentrationen der glykosylierten Form des Proteins, wie sie durch das (die) Verfahren des Standes der Technik bestimmt wurden, enthalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können das erste und das zweite signalgebende Agens spezifisch an das zu untersuchende Protein binden oder Agenzien sein, die zur Markierung anderer Proteine dienen. In dem letztgenannten Fall sollte die Abtrennung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt sein, daß das zu untersuchende Protein in einer oder mehreren Stufen im wesentlichen frei von anderen Proteinen, die durch die signalgebenden Agenzien markiert worden sind, von der Probe abgetrennt wird.
Wenn das zu untersuchende Protein von der Probe durch eine Präzipitation oder durch ein immobilisierendes Agens, das für das Protein spezifisch ist, abgetrennt wird, kann das erste signalgebende Agens geeigneterweise Vinylboronsäure umfassen, die entweder direkt, durch eine Amin- oder Amidbindung, durch einen Spacer oder durch irgendeine bekannte chemische Bindung, welche die Dihydroxyborylreste zur Reaktion mit dem cis-Diol-Resten der Glykosyleinheiten der glykosylierten Proteine freiläßt, mit einer signalgebenden Markierung verbunden werden. In Abhängigkeit davon, welcher pKa-Wert der Boronsäurereste gewünscht wird, kann der Phenylring weiter substituiert sein, z.B. mit Nitro-, Formyl- oder Alkoxygruppen oder mit anderen Substituenten, die den pKa-Wert beeinflussen, aber nicht die Bindung an die cis-Diol-Reste der glykosylierten Proteine sterisch behindern.
Die Boronsäurereste, die zur Synthese des ersten signalgebenden Agens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeigneterweise aus Aminophenyl-, z.B. m- Aminophenyl-, Boronsäureresten synthetisiert, und die Bindung an die Markierung oder den signalgebenden Teil der signalgebenden Moleküle oder Konjugate wird typischerweise erreicht durch Diazoniumionbildung, Silanisierung, durch die Verwendung von Kopplungsagenzien, wie Glutardialdehyde, Carbodiimide, Cyanogenhalogenide, Succinimide oder durch andere Kopplungsagenzien, die in der allgemeinen chemischen Literatur beschrieben sind. Die signalgebende Markierung wird so angebracht, daß der Boronsäurerest frei zur Reaktion mit den cis- Diolen des glykosylierten Proteinanalyten bleibt, und kann vorher "aktiviert" werden, um ihn reaktiv mit Amin- oder anderen reaktiven Einheiten auf den Dihydroxyborylresten, z.B. Dimethylaminoazobenzolisothiocyanat und Dimethylaminonaphthalin-sulfonylchlorid, zu machen. Das erste signalgebende Agens kann auch weiter modifiziert werden, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden, signalgebenden Dihydroxyborylagenzien liegen vorzugsweise in einer nicht-immobilisierten Form vor und können Boronsäure oder andere spezifische oder nicht-spezifische Bindungsreste umfassen, die direkt oder indirekt mit chemischen Strukturen (Markierungen) verbunden sind, welche in der Lage sind, direkt oder indirekt Signale zu ergeben, die für eine chemische oder physikalische Quantifizierung verwendet werden können.
Die signalgebenden Markierungen können ein Enzym oder Enzyme umfassen, wobei Enzyme bevorzugt sind, die keine Kohlenhydrat-cis-diol-Einheiten tragen oder denen man diejenigen Teile entfernt hat, die cis-Diol-Reste tragen. Alternativ kann die signalgebende Markierung ganz oder teilweise aus farbigen oder fluoreszierenden Einheiten bestehen (Chromophore oder Fluorphore). Eine große Zahl farbiger, fluoreszierender oder pigmentierter Verbindungen, die zur Verwendung als Markierungen geeignet sind, gehören zum Stand der Technik und können verwendet werden. Zu geeigneten Beispielen zählen Anthrachinone, Azofarbstoffe, Azinfarbstoffe, wie Oxazine und Thiazine, Triazine, natürlich vorkommende Pigmente, wie Porphyrine, Phycobiliproteine, einschließlich Phycoerythrine und Phycocyanine, Chlorophylle und deren Analoga und Derivate, Karotinoide, Acrinidine, Xanthene, einschließlich Fluoreszeine und Rhodamine, Indigo-Farbstoffe, Thioxanthene, Cumarine, Polymethine, einschließlich Di- und Triarylmethine und Derivate davon, und Phthalocyanine und Metallphthalocyanine, die gegebenenfalls mit Spacern verbunden sind, die zwischen der signalgebenden Markierung und den Boronsäureresten eingeschoben sind, welche freigelassen werden, um mit den cis-Diolen der untersuchten glykosylierten Proteine reagieren zu können.
Entsprechend kann eine große Zahl radioaktiver Verbindungen als signalgebender Markierungsteil der erfindungsgemäß verwendeten Agenzien verwendet werden, wozu ¹²&sup5;I- markierte Verbindungen zählen. Solche markierten Verbindungen können geeigneterweise erhalten werden, indem man den Kohlenstoffring der Phenylboronsäuren mit ¹²&sup5;I markiert, oder indem man Aminophenylboronsäure mit ¹²&sup5;I-markierten Reagenzien konjugiert, z.B. mit dem bekannten Bolton-Hunter-Reagens. Eine Übersicht solcher Radiomarkierungsverfahren wird von Bolton in Biochem. J. 133: 529-539 (1973) gegeben. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind ziemlich hohe Konzentrationen an Reaktionspartnern notwendig, so daß bei vielen erfindungsgemäßen Ausführungsformen die ¹²&sup5;I-markierten Konjugate mit nicht-radioaktiver Borsäure oder nicht-radioaktiven Boronsäuren mit gleicher oder unterschiedlicher Struktur vermischt werden können, um einen geeigneten Gehalt an Radioaktivität in den Assay-Reagenzien zu erhalten.
Alternativ kann ein Boronsäurerest mit natürlichen oder synthetischen Verbindungen konjugiert werden, die ein chemilumineszentes Signal erzeugen können, das auf bekannte Weise untersucht werden kann (siehe Cormier, J.M. et al, "Chemiluminescence and Bioluminescence", Plenum Press, New York 1973). Zu geeigneten chemilumineszenten Verbindungen zählen Luciferin, Oxalsäureester, 1,2-Dioxethan, Luminol oder Derivate davon, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Wenn es möglich ist, können Wasserstoffperoxid, Enzyme, wie z.B. Luciferase oder andere Chemikalien verwendet werden, um das Chemilumineszenz-Signal der verwendeten signalgebenden Agenzien zu produzieren.
Ein besonders geeignetes Beispiel dafür, welche markierte Boronsäure als das erste signalgebende Agens verwendet werden kann, stellt das Konjugat dar, daß man durch die Reaktion von Fluoreszein-isothiocyanat mit Aminophenyboronsäure erhält, was zu einem Konjugat mit einer freien Carboxyleinheit führt. Zu weiteren geeigneten Konjugaten zählen Aminophenylboronsäure, die mit Chloraluminium-phthalocyanin oder Fluoreszin konjugiert ist, z.B. unter Verwendung von 1-Ethyl- 3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), und Fluoreszeinisothiocyanat, dessen Carboxylgruppen blockiert sind, oder dessen Carbonsäureeinheit entfernt worden ist, konjugiert mit Aminophenylboronsäure. Weiterhin kann Rhodamin B, das, z.B. unter Verwendung eines Carbodiimids, mit einer Aminophenylboronsäure konjugiert ist, verwendet werden, wobei jedoch dieses Konjugat eine ziemlich schlechte Löslichkeit in den meisten Lösungen besitzt, die für einen Assay nach dem erfindungsgemäßen Verfahren von Interesse sind. N-(Resorufin-4- carbonyl)-piperidin-4-carbonsäure-N'-hydroxysuccinimidester) (im folgenden als RESOS abgekürzt, eine Substanz, die von Boehringer Mannheim, Deutschland erhältlich ist) stellt ein signalgebendes Molekül dar, das erfindungsgemäß mit Aminophenylboronsäure konjugiert worden ist, und für das ausgezeichnete Löslichkeitseigenschaften gezeigt werden konnten.
Boronsäurereste,
-B(OH)&sub2;
werden in ihrer elektrischneutralen Form häufig als Dihydroxyborylreste bezeichnet, und bilden Anionen durch die Bindung von Hydroxylionen
-B(OH)&sub3;&supmin;
und können als solche Salze bilden. Das erste signalgebende Agens, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kann Reste umfassen, die in einer oder mehrerer dieser Boronsäureformen in Abhängigkeit von dem pH-Wert und dem Elektrolytgehalt der Reagenszusammensetzung vorliegen. Es ist die anionische Form, in der Boronsäuren an die cis-Diol-Reste der glykosylierten Proteine binden.
Die Verwendung von signalgebenden Boronsäure- Konjugaten mit hohem Molekulargewicht wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise vermieden, wenn das glykosylierten Protein Hämoglobin ist, weil die glykosylierten Einheiten der meisten glykosylierten Hämoglobine eine begrenzte Zugänglichkeit besitzen; ein wesentlicher Teil des glykosylierten Hämoglobins im Blut ist an der N-terminalen Aminosäure Valin der β-Kette glykosyliert, die für wasserlösliche Moleküle mit hohem Molekulargewicht nicht leicht zugängig ist, was in der US-A-4 658 022 beschrieben wurde. Diese Patentschrift lehrt; eine sehr signifikante Denaturierung durchzuführen, um die glykosylierten Reste Antikörer-Bindungsreaktionen auszusetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird besonders bevorzugt zur Bestimmung von glykosyliertem Albumin (GA) ausgelegt. Albumin besitzt Affinität zu einer großen Zahl von Substanzen, und dies hat Forscher dazu veranlaßt, die biologische Rolle von Albumin als Vehikel für biologisch wichtige Liganden zu beschreiben. Albumin besitzt mehrere Bindungsstellen mit unterschiedlichen Affinitäten für Liganden, z.B. für anorganische Kationen, organische Anionen, nicht-ionische Verbindungen und spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente.
Zahlreiche synthetische und exogene Anionen binden an Albumin, wozu viele organische Farbstoffe und PH-Indikatorsubstanzen zählen. Diese besitzen einen nicht-ionischen, hydrophoben Teil und einen ionischen, hydrophilen Teil, was die Bindung an Albumin stark beeinflußt. Sowohl die Affinität als auch die Anzahl der Bindungsstellen erhöht sich in der Reihenfolge: Alkohol, Carboxylat, Sulfonat, Sulfat.
Zu bekannten Beispielen zählen die Fettsäuren, aber die Bindung von Bilirubin und Tryptophan besitzt ebenfalls eine große biologische Bedeutung.
Zu nicht-ionischen Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie an Albumin binden, zählen Steroidhormone, wie Testosteron und Cortisol.
Die Bindung von anorganischem Kupfer (II) an Albumin ist in der Literatur beschrieben, und für die Affinitätskonstanten sind Werte von 10&sup7; Mol&supmin;¹ l oder größer geschätzt worden. Sowohl von Kupfer als auch von anderen Metallen ist bekannt, daß sie an Albumin binden, und, wie z.B. Nickel, farbige Komplexe bilden. Somit können Salze von Kupfer und anderen Metallen als das zweite signalgebende Agens in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Fluoreszierende, Seltenerd- Ionen (z.B. Lanthanide, insbesondere Europium und Terbium) und deren Chelate sind aufgrund ihrer einzigartigen Fluoreszenzeigenschaften, ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit und ihrer Anwendbarkeit bei einer zeitabhängigen Fluorometrie zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders interessant. Eu- Chelate werden z.B. in dem DELFIA-System von Pharmacia, Schweden, verwendet. Solche Chelate können daher auch als signalgebende Agenzien bei Albumin-Assays dienen.
Zu Beispielen für anioniche Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie an Albumin binden, zählen neben mehreren anderen:
- Tryptophan/Tryptophan-Derivate (z . B. N-Acetyltryptophan) (Assoziationskonstante Ka : etwa 2 x 10&sup4; Mol&supmin;¹ l)
- Thyroxin (Assoziationskonstante Ka: etwa 10&sup6; Mol&supmin;¹ l)
- Fettsäureanionen
- Detergentien, z.B. Dodecylsulfat (Assoziationskonstante Ka : etwa 1,2 x 10&sup6; Mol&supmin;¹ l)
- Gallensalze
- Hämatin (Vorläufer des Bilirubins)
- Sulfonamide
- Acetamide
- Salicylate und
- Azofarbstoffe.
Im allgemeinen ist die Bindung an Albumin schwächer als die von Bilirubin (ein offenkettiges Tetrapyrrol mit einer Assoziationskonstante Ka von etwa 10&sup7; Mol&supmin;¹ l) und C&sub1;&sub6;&submin;&sub1;&sub8; Fettsäureanionen (Assoziationskonstante Ka: etwa 10&sup7; Mol&supmin;¹ l). Dies gilt auch für organische Farbstoffe, wobei jedoch sowohl die Affinität als auch die Anzahl der Farbstoffbindenden Stellen von der Natur des Farbstoffs abhängt. Zu Beispielen zählen:
- Sulfonaphthaleine (Assoziationskonstante Ka: etwa 10&sup6; Mol&supmin;¹ l)
- Tetrabromderivate (z.B. Bromcresolgrün, Bromcresolblau, Bromsulfophthalein)
- Naphthalinsulfonat-Verbindungen (Assoziationskonstante Ka wahrscheinlich etwa 10&sup6; Mol&supmin;¹ l)
- Evans Blau
- Trypanblau
- Kongorot
- Azobenzoate und deren Derivate (Assoziationskonstante Ka: > 10&sup6; Mol&supmin;¹ l) und
- Methylrot.
Die Bindung von Porphyrinen an Albumin ist von großer biologischer Bedeutung. Die Bindungsaffinität ist hoch, variiert jedoch zwischen unterschiedlichen Derivaten. So bindet Deuterohäm stärker als Protoporphyrin, und die Bindungsaffinität hängt von dem Metall im Zentrum des Porphyrinringes ab.
Das synthetische Derivat Tetracarboxyphenylporphyrin (TCPP) und die entsprechenden Metalloporphyrine Cu- TCPP und Co-TCPP weisen die folgenden Affinitäten auf: Co-TCPP (Assoziationskonstante Ka: etwa 10&sup7; Mol&supmin;¹ l) > Cu-TCPP > TCPP und können somit als signalgebende Agenzien verwendet werden.
Zu weiteren organischen Anionen, die in dieser Hinsicht erwähnt werden können, zählen:
- Methylorange
- Dinitrophenol
- Fluoreszierende Liganden, wie 1-Anilinonaphthalin-8- sulfonat (ANS), Napthalinsulfonat,
- Aflatoxine, und
- Acridine (z.B. Rivanol).
Zu weiteren Farbstoffen, die als das zweite signalgebende Agens, insbesondere in Albumin-Assays, verwendet werden können, zählen Ponceau S., Coomassie Brilliant Blau und Bicinchoninsäure (geeigneterweise kombiniert mit Kupfer (II) in einem alkalischen Medium). Zur Verwendung als das zweite signalgebende Agens in Assays für glykosylierte Blutproteine, wie Albumin, ist besonders Bromphenolblau zu erwähnen (Absorptionsmaximum 590 nm). Für Albumin-Assays ist das Metalloporphyrin-Cr(III)-tetracarboxyphenylporphyrin (erhältlich von Porphyrin Products, USA) besonders geeignet, insbesondere, wenn es in einer auf einen pH-Wert von 9,0 gepufferten Lösung, z.B. unter Verwendung von 0,25 M Ammoniumacetat- Puffer, vorliegt. Die Verbindung besitzt ein Absorptionsmaximum von 440-450 nm, eine signifikante Absorption bis 600 nm und bindet stark an Albumin.
Das in den nachfolgenden Beispielen erwähnte RESOS-Aminophenylboronsäure-Konjugat und die Phthalocyanin-, Phenoxazin- und Phenothiazin-boronsäure-Konjugate unserer oben erwähnten, gleichzeitig anhängigen britischen und internationalen Patentanmeldungen sind besonders zur Verwendung als das erste signalgebende Agens geeignet, wiederum insbesondere in Assays für glykosyliertes Albumin.
Die Abtrennung des untersuchten glykosylierten und nicht-glykosylierten Proteins wird durch die Wirkung eines Fällungsagens bewirkt, einem Agens, das gewünschtenfalls auch als signalgebendes Agens wirken kann.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Abtrennung des untersuchten Proteins (und des daran gebundenen signalgebenden Moleküls) durch eine selektive Fällung des Gesamtproteins aus homogenen Lösungen erreicht, z.B. durch die Verwendung von geeigneten Fällungsreagenzien, gegebenenfalls in Kombination mit einem Chromatographie-, Zentrifugations- oder einem Filtrationssystem.
Erfindungsgemäß kann somit die Abtrennung des untersuchten Proteins mit Hilfe von nicht-immobilisierten, spezifischen Bindungsproteinen, wie spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, oder irgendeinem anderen Agens, das das untersuchte Protein aus der Lösung präzipitiert, bewirkt werden. Monoklonale Antikörper, die mit verschiedenen Epitopen reagieren, oder polyklonale Antikörper können verwendet werden, um ein Präzipitat mit dem Protein zu bilden. Eine Fällung kann auch mit Hilfe von sekundären Antikörpern erfolgen. Vorzugsweise können Antikörper ohne cis-Diol-Einheiten oder solche, denen die cis-Diol-haltigen Einheiten fehlen, oder immunoreaktive Fragmente davon verwendet werden.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß ziemlich hohe Konzentrationen der Reaktionspartner notwendig sind, was zu einem ziemlich hohen Verbrauch an Antikörpern pro Versuch führt, weil die Assoziationskonstante der Boronsäurehaltigen signalgebenden Moleküle und der glykosylierten Reste der glykosylierten Hämoglobine nur in der Größenordnung von 10³ bis 10&sup5; Mol&supmin;¹ l liegt.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird eine Proteinfällung aus der flüssigen Phase durch die Verwendung von Metallkationen oder organischen Lösungsmitteln erreicht. Die Präzipitate können z.B. durch Zentrifugation oder Filtration leicht abgetrennt werden, und die Reagenzien sind billig und wirksam.
Bei einer solchen Ausführungsform ist eine spezische oder nahezu spezifische Fällung von Hämoglobin aus einer Lösung unter Verwendung von bestimmten organischen Lösungsmitteln erreicht worden, z.B. von Alkoholen, wie Ethanol und/oder Butanol,- Ketonen, wie Aceton, Ethern, z.B. cyclische Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, Amid-Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid oder Diethylformamid, Sulfoxid-Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid, Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln, wie Toluol, und halogenierten Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln, wie Chloroform. Wenn man eine Gesamtblut-Probe fällt, die so verdünnt ist, daß sich Werte von ungefähr 6,5 mg Hämoglobin und 1,5 mg HSA/ml ergeben, indem man 50% Butanol (v/v) in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 9 % Butanol (v/v) zusetzt, werden 94 % des Hämoglobins und nur 1 % des HSA gefällt. Eine solche Fällung wurde ohne Verlust der an die cis-Diol-Einheiten gebundenen Boronsäure-Reste erreicht.
Eine spezifische Fällung des Hämoglobins kann weiterhin unter Verwendung von Metallkationen erreicht werden, die an die Proteine binden und diese aggregieren. Zu geeigneten Kationen zählen Zink, Kupfer, und weniger bevorzugt Nickel, Kobalt und Cadmium. Dies besitzt den bedeutenden Vorteil, daß gefälltes Hämoglobin auf diese Weise leicht durch Zugabe eines solubilisierenden, komplexierenden Agens wieder aufgelöst werden kann. Bei Verwendung von Zinkionen kann eine im wesentlichen spezifische Fällung des Hämoglobins aus einem Gesamtbluthämolysat erreicht werden, was eine unerwartete Beobachtung darstellt. Beispielsweise erhält man unter Anwendung einer Zinkionen-Konzentration von 2,5 - 4 mM in Gegenwart von 6,5 mg Hämoglobin und 1,5 mg HSA/ml eine spezifische oder nahezu spezifische Hämoglobinpräzipitation. Oberhalb einer Konzentration von 4 mM Zinkionen erfolgt jedoch eine substantielle Copräzipitation des HSA. Dies wird durch die im folgenden dargestellten Ergebnisse erläutert: Zn-Konzentration (mM) % präzipitiertes Hb % präzipitiertes HSA
Die Ionenkonzentration muß jedoch sorgfältig eingestellt werden, so daß keine Störung der verwendeten signalgebenden Boronsäurederivate auftritt. Falls gewünscht, kann das gefällte Protein gegebenenfalls gewaschen oder filtriert werden, um überschüssige Kationen vor der Reaktion mit signalgebenden Boronsäurekonjugaten zu entfernen. Diese Reaktionsfolge ist besonders bevorzugt, wenn eher anionische signalgebende Boronsäurekonjugate verwendet werden, da eine direkte Bindung zwischen überschüssigen Zinkionen und den anionischen Konjugaten zu einer unerwünschten Störung führen kann. Zusätzlich zu Zink können andere Metallkationen verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie nicht selbst in der für die Fällungsreaktion verwendeten Pufferlösung präzipitieren.
Wegen der Möglichkeit, daß die Metallionen an einer Hydrolyse oder anderen Reaktionen mit den anderen Reagenzien in der Testlösung beteiligt sind, müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um zu garantieren, daß die Metallkationen löslich bleiben und für die Fällung des Hämoglobins zur Verfügung stehen.
Einige der in dieser Beschreibung aufgeführten signalgebenden Boronsäurekonjugate enthalten Gruppen, die ein Elektronenpaar an die Metallkationen abgeben können und dadurch als Komplexmittel wirken. Diese Fähigkeit, Ligand-Metallkomplexe zu bilden, kann verwendet werden, um die Reaktionen zu kontrollieren, die Metallionen in Lösung zu halten, die Bildung von Komplexen zwischen dem Metall und den signalgebenden Boronsäure-Derivaten zu verhindern und eine Verfügbarkeit und Konzentrationen der Metallionen zu garantieren, die hoch genug sind, um die gewünschte Proteinfällung zu erreichen.
Da sowohl die Liganden-Konzentration und die Stabilitätskonstanten von verschiedenen Metallkomplexen in Betracht gezogen werden müssen, können geeignete Puffersalze verwendet werden, um die Bildung von unlöslichen Metallkomplexen (im folgenden als Me-Komplexe bezeichnet) zu verhindern.
Puffersalze, die schwache, einzähnige Me-Komplexe bilden, sind daher bevorzugt, und ein Beispiel für einen solchen Puffer ist Ammoniumacetat in Kombination mit Zink, wodurch lösliche Zn(Ac)- und Zn(NH&sub4;)-Komplexe gebildet werden.
Durch Zugabe stärkerer Komplexierungsmittel, wie vielzähnigen chelatisierenden Liganden, zu dem Puffer, können alle genannten Reaktionen in der Testlösung kontrolliert werden. Das Komplexierungsmittel wird in geeigneter molarer Konzentration zugesetzt, um die notwendigen Molverhältnisse bei den verschiedenen Komplexen zu erhalten, und um einen Ausgleich mit anderen Zusätzen herzustellen, wodurch garantiert wird, daß alle Reaktionen optimal durchgeführt werden. Weiterhin sollte das Komplexierungsmittel unter Berücksichtigung des zu verwendenden, jeweiligen Hetallkations ausgewählt werden, um sicherzustellen, daß möglicherweise unerwünschte Nebeneffekte, wie eine zu starke Komplexierung des Metallions vermieden werden.
Die Stabilitätskonstante des Chelat-Me-Komplexes muß groß genug sein, um mit weiteren möglichen Komplexierungsmitteln in der Testlösung zu konkurrieren, z.B. mit dem signalgebenden Boronsäurekonjugat, aber sie muß nicht so groß sein, daß die Verfügbarkeit des Metallkations als Fällungsagens reduziert oder unterbunden wird.
Viele chelatbildende Liganden können verwendet werden, einschließlich Ethylen-, Propylen- oder Butylendiamin oder Analoga davon, Glycin, Aspartat, Nitriloacetat, Histidin und Picolinat. Mehrere weitere natürliche oder synthetische Chelatbildner, wie Kohlenhydrate, organische Säuren mit mehr als einer Koordinierungsgruppe, Aminosäuren, Peptide, Phenole und ähnliches, können auch verwendet werden, wobei jedoch einige von diesen aufgrund ihrer Fähigkeit, Komplexe mit Boronsäure zu bilden, nicht bevorzugt sind, z.B. Salicylate, Oxalate, Kohlenhydrate, wie Sorbitol und Tartrat, da sie mit dem glykosylierten Protein um die Bindung an das signalgebende Boronsäurekonjugat konkurrieren.
Vielzähnige chelatbildende Liganden wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), CDTA (trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure), EGTA (Ethylenglykol-o,o'- bis(2-amino-ethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), DTPA (Diethylentriamin-pentaessigsäure) und dergleichen können ebenfalls verwendet werden, sind jedoch in bestimmten Situationen weniger bevorzugt aufgrund ihres sehr starken Komplexierungsvermögens von Metallionen, was zu einer sehr eingeschränkten Proteinfällung führt. Ein Ammoniumacetatpuffer, der Zinkionen und Glycin enthält, stellt ein Beispiel für eine bevorzugte Kombination dar.
Verschiedene Komplexierungsmittel sind bei verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen bevorzugt. Komplexierungsmittel, wie EDTA und DTPA, werden geeigneterweise verwendet, wobei jedoch ihre Konzentration sorgfältig eingestellt werden muß, wenn sie mit Metallkationen, die zur Proteinfällung verwendet werden, kombiniert werden. Zitronensäure und Oxalsäure sind weniger bevorzugt aufgrund ihrer Wechselwirkung mit Boronsäure-Resten. Heparin und Fluoridionen stellen weitere Beispiele dar, die verwendet werden können.
Präzipitate, die man durch Fällung aus homogenen Lösungen erhält, wie durch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Metallkationen, können vollständig oder teilweise durch Zentrifugation oder Filtration oder andere Verfahren des Standes der Technik abgetrennt werden.
Filtermembranen oder TLC-Systeme können ebenfalls zur Abtrennung des Hämoglobins verwendet werden, gegebenenfalls mit Haptoglobinen, Antikörpern oder immunoreaktiven Fragmenten davon, die daran immobilisiert sind, um das untersuchte Protein zu binden, wie bei einem Meßstäbchen oder einem Mehrschicht- Film.
Eine Abtrennung des untersuchten Proteins durch Zentrifugation, gefolgt von einer Abtrennung des Präzipitates vom Überstand, stellt eine der bevorzugten Verfahren dar. Alternativ kann eine Filtration praktischerweise verwendet werden, wobei dies entweder vertikal zur Filteroberfläche durch den Filter, oder tangential oder radial innerhalb des Filters in einem eindimensionalen oder zweidimensionalen Abtrennungsverfahren durchgeführt werden kann.
Dunnschicht-Chromatographieverfahren können ebenfalls verwendet werden, indem man beispielsweise die Probe auf ein geeignetes Chromatographiemedium appliziert, z.B. einen Teststreifen oder ein Gel, und man die Reagenzien und Waschlösungen z.B. direkt auf die Auftragungsstelle der Probe, appliziert oder durch Elution.
Gemäß weiteren Ausführungsformen kann das Protein aus einer Lösung direkt auf oder in einen Filter oder ein anderes Festphasen-Chromatographiemedium gefällt werden, wobei sich das Präzipitat nach der oder gleichzeitig mit der Bildung des Präzipitates auf oder in der Festphase ablagert. Die Reagenzien können auf ein poröses Festphasenmedium vor, gleichzeitig mit oder nach dem Fällungsschritt aufgetragen werden. So können z.B. Reagenzien, wie die Fällungsagenzien, die signalgebenden Agenzien, z.B. das Boronsäurereagens, hämolysierende Agenzien, Komplexiermungsmittel oder andere Reagenzien in jeder bevorzugten Kombination in oder auf dem Festphasenmedium, vorzugsweise in trockener Form, mitgeführt werden. Solche Reagens-tragenden Festphasenmedien bilden weitere erfindungsgemäße Gegenstände. Die Festphasenmedien können gegebenenfalls gewaschen werden, oder eine Elutionslösung kann durch die Präzipitationsfläche eluiert werden.
Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Albumin-Assays können geeigneterweise Liganden verwendet werden, die an einem festen Träger immobilisiert sind (z.B. Perlen aus quervernetzter Agarose, Dextran oder Polyacrylamid). Solche immobilisierten Liganden, z.B. Octlyamin, Benzylamin, Bromsulfophthalein-glutathion, N-(3-Carboxypropionyl)aminodecan, Cibacron Blau F3GA, Deoxycholsäure, Glycocholsäure, Procion Rot HE3B und N-Pyromellitylaminodecan, sind kommerziell erhältlich. Die Abtrennung von Albumin kann weiterhin unter Verwendung von Fällungsagenzien, wie Caprylsäure, Caprinsalze, Rivanol (2- Ethoxy-6,7-diaminoacridinlactat) und basisches Dextran, bewirkt werden. Albumin und andere Blutproteine können weiterhin unter Verwendung verschiedener Metallionen (z.B. Hg, Cd, Cn, Zn usw. gefällt werden, obwohl einige von diesen relativ spezifisch sein können. Weiterhin können organische Lösungsmittel, im Fall des Albumin Lösungsmittel mit niedriger Polarität wie Chloroform oder Alkohole (wie Butanol oder höhere Alkanole), verwendet werden. Zur Fällung von Blutproteinen können im allgemeinen Agenzien, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Polyethylenglykol, verwendet werden.
Wenn das zu untersuchende Protein von Zellen im Blut getragen wird, sollte ein Lysierungsagens verwendet werden, um einen guten chemischen Kontakt zwischen dem glykosylierten Protein und dem ersten signalgebenden Agens sicherzustellen; eine Anzahl von Reagenzien und Verfahren zählen allgemein zum Stand der Technik und können verwendet werden, wozu eine hypotonische Hämolyse, die Verwendung von Detergentien, wie nicht-ionischen Polyethylenglykolester- oder Polyoxyethylensorbitolester-Derivaten, z.B. die "Tween" -Serie, und Polyoxyalkylphenol-Derivaten, z.B. die "Triton "-Serie, Cholaten, Natriumdodecylsulfaten, Guanidin, Erhitzung, Ultraschallbehandlung oder irgendeine Kombination davon zählen.
Das erste signalgebende Agens kann mit gegebenenfalls hämolysierten Blut-, Plasma- oder Serumproben oder mit Proteinen, die aus solchen Proben isoliert worden sind, z.B. in einer Assay-Pufferlösung, nach dem oder gleichzeitig mit dem optionalen Hämolysebehandlungsschritt in Kontakt gebracht werden oder damit vermischt werden.
Es kann eine Anzahl von Assay-Puffern verwendet werden, zu denen Phosphatpuffer und andere Pufferlösungen zählen, die in der Lage sind, den pH-Wert des Reaktionsgemisches bei einem geeigneten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Der bevorzugte pH-Bereich des Assays liegt bei 7,5 bis 10,0, wobei jedoch der gewünschte pH-Wert abhängig ist von den Additiven, den verwendeten Puffersalzen und dem pKa-Wert des signalgebenden Agens, wobei dies ein Reagenz darstellt, das, wie die Boronsäure-Derivate, reversibel mit dem glykosylierten Protein konjugiert. Es gibt einige Hinweise darauf, daß Aminhaltige Puffer dazu dienen können, die Dihydroxyboryl-cis-Diol- Wechselwirkung zu verstärken oder den scheinbaren pKa-Wert des Borates zu erniedrigen. Aufgrund dieser Tatsache sind Puffer, wie Serin, Glycin, Hepes(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure), Ammoniumacetat, Morpholin und Taurin bevorzugt. Um die Wechselwirkung zwischen den Dihydroxyboryl- und den cis- Diol-Resten weiter zu fördern, können Additive, wie divalente Kationen, Detergenzien und chaotrophe Agenzien, verwendet werden, um die Ladungsabstoßung zu reduzieren, die Zielmoleküle zu solubilisieren, die hydrophoben Wechselwirkungen einzuschränken und die Zugänglichkeit der Diole in den glykosylierten Proteinen zu erhöhen. Es sollten jedoch bestimmte Puffer, wie Tris und Ethanolamine, aufgrund der Tatsache, daß diese Pufferverbindungen Borat komplexieren und eine Bindung der Diole blockieren können, vermieden werden. Bestimmte Puffer-/Additiv-Kombinationen, wie Phosphat-Zink sind wegen der möglichen Bildung von unlöslichen Verbindungen, wie Zn3 (PO&sub4;)&sub2;, ebenfalls ungünstig.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das untersuchte Protein Hämoglobin ist, wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß es vorteilhaft ist, ein Stabilisierungsreagens zu verwenden, z.B. ein Salz, das ein stabilisierendes Anion besitzt, Liganden, von denen bekannt ist, daß sie sich mit Ferrihämoglobin verbinden, Agenzien, die die Absorptionseigenschaften von Hämoglobin modifizieren (z.B. deoxygenierende Agenzien wie Dithionit), Redoxmediatoren (wie Methylenblau) usw., um die Farbe von Hämoglobin zu stabilisieren. So können in dieser Hinsicht z.B. Nitratsalze verwendet werden; zu weiteren oder gegebenenfalls zusätzlichen Beispielen zählen Azide, Cyanoferrate, Cyanide, Fluoride, Formiate, Thiocyanate, Acetate, EDTA, Ammoniak, Imidazole, Stickoxid, Picolin, Hydrosulfid, Dithionit und Methylenblau.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht bei bevorzugten Ausführungsformen auf der Bindung zwischen einem Boronsäure-Derivat und cis-Diol-Einheiten in GBPs - diese Bindung wird im allgemeinen nur zu einem geringen Ausmaß von Temperaturänderungen, insbesondere innerhalb des Bereichs der Umgebungstemperatur, beeinflußt.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Bestimmung (assessment) oder Quantifizierung des signalgebenden Agens (d.h. einen Signalleseschritt) und gegebenenfalls auch des Gesamtgehalts des untersuchten Proteins sowohl in der glykosylierten als auch der nicht-glykosylierten Form.
Die Bestimmung des signalgebenden Agens, das an das Protein gebunden ist oder mit diesem abgetrennt worden ist, kann mit Hilfe einer geeigneten chemischen Ausrüstung, die üblicherweise zur Messung der enzymatischen Aktivität, Fluoreszenz, radioaktiven Strahlung oder optischen Dichte (Extinktion), in Abhängigkeit von der chemischen Beschaffenheit der signalgebenden Markierung erreicht werden. Eine Färbung oder Fluoreszenz auf einer Festphasenoberfläche kann leicht mit Hilfe der Reflektometrie gemessen werden, was in der klinischen Chemie allgemein verwendet wird. Auf einem Meßstäbchen oder Filter oder einem anderen praktischen Festphasenformat können Hämoglobine und/oder fluoreszierende oder farbige, signalgebende Agens:Protein-Konjugate direkt auf der Oberfläche bestimmt werden. Alternativ können das gefällte oder immobilisierte Protein und/oder die signalgebenden Agens:Protein-Konjugate wieder aufgelöst und in Lösung gemessen werden.
Entsprechend können signalgebende Konjugate, die enzymatische Aktivtät besitzen, in immobilisierter oder gelöster oder wiederaufgelöster Form mit Mitteln der enzymometrischen Technologie, die zum Stand der Technik gehört, bestimmt werden. So können auch radioaktive Konjugate unter Verwendung der bekannten radiometrischen Verfahren bestimmt werden.
Wenn das untersuchte Protein, wie Hämoglobin, ein deutliches Absorptionsmaximum in seinem UV-Vis-IR-Spektrum besitzt, kann die Gesamtkonzentration seiner glykosylierten und nicht-glykosylierten Formen durch Messung der Absorption bei der geeigneten Wellenlänge bestimmt werden. Wenn andere Bestandteile der Probe ebenfalls eine signifikante Absorption bei dieser Wellenlänge aufweisen, dann wird man natürlich eine solche Messung an dem Protein nach dessen Abtrennung von solchen Bestandteilen vornehmen müssen, z.B. nach einer Abtrennung unter Verwendung von Reagenzien, die effektiv nicht partizipieren oder die Bestandteile immobilisieren, was eine solche Absorptionsmessung stören würde. Alternativ und vorzugsweise für andere Proteine als Hämoglobin kann ein zweites signalgebendes Agens bei dem Assay-Verfahren verwendet werden, wobei dieses zweite Agens an das untersuchte Protein sowohl in dessen glykosylierten als auch nicht-glykosylierten Formen bindet oder in anderer Weise konjugieren wird, und das ein Signal gibt, das von dem des ersten signalgebenden Agens unterscheidbar ist. Die signalgebende Einheit kann irgendeine der oben beschriebenen sein, z.B. eine Radiomarkierung, ein Chromophor, ein Fluorophor oder eine enzymatisch aktive Einheit. Um das Assay-Verfahren leicht durchführen zu können, sollte die signalgebende Einheit vorzugsweise die gleiche Beschaffenheit wie das erste signalgebende Agens besitzen, so daß die Signale, die den Gehalt an gesamten und glykosylierten Protein anzeigen, unter Verwendung der gleichen Gerätschaften gelesen werden können. Besonders bevorzugt ist ein zweites signalgebendes Agens, das das Protein mit einem Chromphor markiert, der ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm besitzt, da auf diese Weise das Signal für andere Proteine als Hämoglobin gelesen werden kann, ohne Hämoglobin, das mit dem untersuchten Protein abgetrennt worden ist, entfernen zu müssen. Es ist anzumerken, daß es, wenn ein zweites signalgebendes Agens verwendet wird, nicht nötig ist, daß dessen Bindungseigenschaften spezifisch für das untersuchte Protein sein müssen; wenn es jedoch an andere Blutproteine bindet, die in nicht vernachlässigbarem Anteil relativ zu dem untersuchten Protein vorhanden sind, dann sollte der Abtrennungsschritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so beschaffen sein, daß das untersuchte Protein von solchen anderen Proteinen abgetrennt wird. Wenn es gewünscht wird, daß das zweite signalgebende Agens spezifisch an das untersuchte Protein binden soll, können geeigneterweise markierte monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon, die spezifisch für das untersuchte Protein sowohl in dessen glykosylierten als auch nicht-glykosylierten Formen sind, verwendet werden.
Wenn somit das Gesamtprotein und das glykosylierte Protein mit spektrometrisch unterscheidbaren Chromophoren markiert sind oder wenn, wie es beim Hämoglobin der Fall ist, das Gesamtprotein und das mit dem ersten Agens markiert glykosylierte Protein spektroskopisch unterscheidbare Chromophoren besitzen, kann die Konzentration sowohl des glykosylierten als auch des nicht-glykosylierten untersuchten Proteins mit Hilfe der Absorption bei den relevanten Wellenlängen im Reaktionsgemisch vor oder nach dem Abtrennungsschritt bestimmt werden. Wenn Fluorphore in Gegenwart von Hämoglobin quantifiziert werden sollen, sind Exzitations- und Emissionswellenlängen außerhalb der Absorptionswellenlängen des Hämoglobin bevorzugt. Wenn ein Chromophor verwendet wird, wird entsprechend eine Absorptionswellenlänge außerhalb der des Hämoglobin bevorzugt. Falls notwendig, kann jedoch eine teilweise Hämoglobin-Interferenz akzeptiert werden und durch Berechnungen, die auf Messungen bei mehr als einer Wellenlänge basieren, korrigiert werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das abgetrennte Protein auf Mikrokügelchen und/oder einem Filter oder anderen Festphasen isoliert, gefolgt von einer reflektometrischen Quantifizierung des mit einer ersten Markierung markierten glykosylierten Proteins und des gegebenenfalls markierten Gesamtproteins, z.B. durch Lichtabsorptionsmessungen oder durch Fluoreszenzmessungen.
Bei weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Proben oder Aliquots von Bluthämolysaten, Plasma oder Serum, die im Hinblick auf mehrere oder die meisten oder alle anderen Proteine verwendet, die mit Boronsäureresten oder Salzen davon reaktiv sind, abgereichert sind; z.B. können Erythrocyten vor der Hämolyse gewaschen werden, um Plasma- Proteine vor der Analyse der glykosylierten Hämoglobine zu entfernen, oder eine Zentrifugation oder Filtration kann mit Gesamtblutproben durchgeführt werden, um die Zellen vor der Analyse zu entfernen. Alternativ kann gegebenenfalls hämolysiertes Blut einer Ionenaustausch-Festphasentrennung ausgesetzt werden, um alle Proteine zu entfernen, die isoelektrische Punkte unterhalb und/oder oberhalb derjenigen des untersuchten Proteins besitzen. Diese Reinigung kann gegebenenfalls einen Teil der Vorrichtung oder des Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen.
In einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Menge des ersten signalgebenden Agens, das an das untersuchte Protein gebunden ist, in Gegenwart und Abwesenheit einer konkurrierenden Verbindung gemessen. Die konkurrierende Verbindung kann irgendein cis-Diol-haltiges Molekül sein, z.B. Sorbitol oder Mannitol, oder eine Boronsäure, die Moleküle ohne signalgebende Aktivität enthält.
In einer weiteren, besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Menge des vor und nach der Abtrennung des untersuchten Proteins entweder in dem Reaktionsgemisch und/oder in der abgetrennten Fraktion vorhandenen ersten signalgebenden Agens gemessen, was es ermöglicht, den Teil des durch Bindung an das Protein entfernten signalgebenden Agens zu berechnen.
Da diese Erfindung auf einer ziemlich niedrigen Bindungstärke (wegen der Assoziationskonstante von 10³ bis 10&sup5; Mol&supmin;¹ zwischen den cis-Diol-Einheiten und den Boronsäureresten) beruht, wird eine direkte stöchiometrische Bindung zwischen dem glykosylierten Protein und solchen signalgebenden Boronsäure- Derivaten nicht stattfinden.
In einem geringen Ausmaß können freie Kohlenhydrate im Blut mit den Boronsäure-Derivaten konkurrieren. Diese Effekte können durch die Verwendung eines Überschusses der signalgebenden Boronsäure-Derivate verringert werden. Ein 20-facher molarer Überschuß (relativ zu den Proteinen, die mit dem Boronsäure-Derivat konjugierbar sind) ist geeignet, aber es können auch in Abhängigkeit von der verwendeten erfindungsgemäßen Ausführungsform höhere und niedrigere Verhältnisse verwendet werden. In Abhängigkeit von der Wirksamkeit der verwendeten Abtrennungsverfahren wird es natürlich ein Hintergrundsignal geben. Wenn ein sehr wirksames Abtrennungssystem verwendet wird, kann ein größerer Überschuß verwendet werden. Wenn sehr hohe Reaktionkonzentrationen nicht verwendet werden können, sollte die Konzentration des glykosylierten Proteins unter Bezugnahme auf Messungen, die bei Standardzusammensetzungen mit bekannten Konzentrationen an glykosyliertem Protein durchgeführt worden sind, berechnet werden. Die Verwendung solcher Standards ist in der klinischen Laboratoriumsmedizin sehr gebräuchlich.
Diese Erfindung stellt weiterhin eine Reagenszusammensetzung oder einen Kit zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens bereit, wobei das Reagens umfaßt ein erstes signalgebendes Agens, das zur Markierung eines glykosylierten Blutproteins befähigt ist; ein Flüssigphasen-Trennmittel, das zur Ausfällung des Proteins in dessen glykosylierter und nichtglykosylierten Form befähigt ist; gegebenenfalls ein zweites signalgebendes Agens, welches zur Markierung des Proteins in dessen glykosylierter und nicht-glykosylierter Form befähigt ist; und gegebenenfalls Puffer- und/oder Stabilisator- und/oder Lysierungsreagenzien, wobei von dem ersten Agens und dem Trennagens wenigstens eines im wesentlichen spezifisch für das Protein ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereit, wobei die Vorrichtung umfaßt: Mittel zur Entnahme einer Blutprobe; Mittel, um die Blutprobe mit den folgenden Agenzien:
(i) gegebenenfalls einem hämolysierenden Agens,
(ii) einem ersten signalgebenden Agens (wie oben definiert),
(iii) einem Flüssigphasen-Trennagens, das zur Fällung eines Blutproteins in dessen glykosylierter und nicht-glykosylierter Form befähigt ist,
(iv) gegebenenfalls einem zweiten signalgebenden Agens (wie oben definiert),
(v) gegebenenfalls einem Stabilisator (wie oben definiert),
(vi) gegebenenfalls einem Puffer,
einzeln oder in einer oder mehreren Kombinationen davon in Kontakt zu bringen; und
Mittel, z.B. spektrometrische Mittel, zur Bestimmung der signalgebenden Agenzien, die an die mit Hilfe des Trennagens abgetrennten Blutproteine gebunden sind und gegebenenfalls zur spektroskopischen Bestimmung eines oder mehrerer Blutproteine (z.B. Hämoglobin), die mit Hilfe des Trennagens abgetrennt wurden, an welchen jedoch im wesentlichen kein signalgebendes Agens gebunden ist. Besonders bevorzugt umfaßt die Vorrichtung ein Blutentnahmegerät, Mittel zur Überführung einer Blutprobe in einer Reaktionskammer, welche eine Festphase zur Aufnahme des abgetrennten Proteins enthält, Mittel zur Einführung von Reagenzien in die Kammer und ein Spektrometer zum Nachweis der Photonenemission von oder -absorption durch die auf der Festphase abgetrennten Proteine bei wenigens einer und vorzugsweise wenigstens zwei vorgegebenen Wellenlängen.
Die folgenden Beispiele und Präparate werden nur zum Zwecke einer nicht-beschränkenden Erläuterung der Erfindung angegeben:

BEISPIELE

Präparate

Präparationsbeispiel 1

1. N-(RESORUFIN-4-CARBONYL)-PIPERIDIN-4-CARBONSÄUREKONJUGAT MIT M-AMINOPHENYLBORONSÄURE

Lösung A: 2 mg RESOS (N-Resorufin-4-carbonyl)-piperidin-4- carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester) wurde in 0,5 ml Dimethylsulfoxid gelöst.
Lösung B: Das Hemisulfatsalz der m-Aminophenylboronsäure wurde zu 15 mg/ml in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 8,0, gelöst. Der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt.
0,5 ml der Lösung A wurde zu 2 ml der Lösung B gegeben. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 12 h inkubiert. Die Reinigung wurde mittels HPLC durchgeführt.

Präparationsbeispiel 2

2. FLUORESZEIN-ISOTHIOCYANAT(FITC)-KONJUGAT MIT AMINOPHENYLBORONSÄURE

Lösung A: 3,9 mg FITC wurde in 1 ml Dimethylsulfoxid gelöst.
Lösung B: Das Hemisulfatsalz der m-Aminophenylboronsäure wurde zu 1,86 mg/ml in 0,2 M Carbonatpuffer, pH 9,5 gelöst.
1 ml der Lösung A wurde langsam zu 10 ml der Lösung B unter stetigem Rühren zugegeben. Man ließ das Gemisch mindestens 2 h bei Umgebungstemperatur reagieren und das FITC- Aminophenylboronsäure-Konjugat wurde mittels HPLC gereinigt.

Präparationsbeispiel 3

3. IOD-125-MARKIERTES BORONSÄURE-KONJUGAT

A: Aminophenylboronsäure (APBA), 10 mg/ml in 50 mM Na- Phosphat, pH 7,5, wurde mit 14,2 mg/ml des Bolton-Hunter-(BH)- Reagens in DMSO umgesetzt. BH wurde langsam zum APBA bis zum gleichen Volumenanteil zugegeben. Die Lösung wurde 1 h bei Umgebungstemperatur inkubiert.
B. Das Reaktionsprodukt wurde auf einer Reversed-Phase- Säule mit einem Gradienten aus Methanol in Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) abgetrennt.
C: Das isolierte BH-APBA-Reaktionsprodukt wurde mit ¹²&sup5;I- NaI mit dem Chloramin-T-Verfahren markiert. 0,5 ml der BH-APBA- Fraktion wurden zu 0,1 ml 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,5 gegeben, und der pH-Wert wurde auf 7,5 eingestellt. 10 ul ¹²&sup5;I- NaI, 100 uCi, wurden zusätzlich zur frisch hergestellten 0,3 ml Chloramin-T (10 mg/ml) in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,5, gegeben, und das Gemisch wurde 1 min inkubiert.
D: Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,3 ml Na-Bisulfit (24 mg/ml) in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,5, abgestoppt.
E: Markiertes BH-APBA wurde mittels Reversed-Phase-Chromatographie mit einem Methanolgradienten in Wasser mit 0,1 % TFA isoliert.

Präparationsbeispiel 4

4. BORONSÄURE-KONJUGAT MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE

10 mg Alkalische Phosphatase, die im Hinblick auf Boronsäurereaktive Enzymmoleküle abgereichert war, indem sie über eine Agarosesäule mit immobilisierten Phenylboronsäureresten gegebenen wurde, wird mit einem 30-fachen molaren Überschuß an Bis-(sulfonsuccinimidyl)-suberat in Carbonatpuffer, pH = 8,5, vermischt, und zur Reaktion 120 min bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf die Zugabe eines 100-fachen molaren Überschusses an Monoethanolamin folgte. Nach 4 h wurden die Enzymkonjugate mittels Gelchromatographie gereinigt.

BEISPIELE, DIE EINE NAHEZU SPEZIFISCHE PRÄPARATION VON HÄMOGLOBIN AUS GESAMTBLUTHÄMOLYSATEN DEMONSTRIEREN.

Metallkationen:
Lösung A: Gesamtbluthämolysat, gelöst in 50 mM Ammoniumacetat, pH 8,0, bis zu einer Endkonzentration von 6,4 mg Hämoglobin/ml.
Lösung B: CuSO&sub4;, gelöst in Wasser in einer Konzentration von 10 mM Cu²&spplus;.
Lösung C: Zn Cl&sub2;, gelöst in Wasser in einer Konzentration von 10 mM Zn²&spplus;.

Präparationsbeispiel 5

40 ul der Lösung B wurden zu 200 ul der Lösung A gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert und das Hämoglobin-Präzipitat durch Zentrifugation abgetrennt.

Präparationsbeispiel 6

40 ul der Lösung C wurden zu 200 ul der Lösung A gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert und das Hämoglobin-Präzipitat durch Zentrifugation abgetrennt.

BEISPIELE FÜR WEITERE REAGENZIEN ZUR VERWENDUNG BEI DEN ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERFAHREN.

Reagensbeispiel 1

Phenoxazin:Boronsäure-Konjugat zur Verwendung als erstes signalgebendes Agens

Die Synthese dieses Agens, das ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm besitzt, ist in unserer gleichzeitig anhängigen britischen Patentanmeldung beschrieben.

Reagensbeispiel 2

Cr(III)-Tetracarboxyphenylporphyrin

Dies stellt ein zweites signalgebendes Agens für Albumin-Assays dar und ist von Porphyrin Products, USA, erhältlich, und wird in einer wäßrigen Lösung, die mit 0,25 M Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von 9 gepuffert ist, formuliert.

Reagensbeispiel 3

Bromphenolblau

Dies ist kommerziell leicht erhältlich und wird zur Verwendung als zweites signalgebendes Agens bei Albumin-Assays mit 50 mM Natriumphosphat gepuffert auf pH 7,5 formuliert.

Reagensbeispiel 4

Fällungsagens für Albumin-Assays

5 % (w/v) Rivanol in Assay-Puffer (0,25 M Ammoniumacetat, 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). (Dies kann etwa 5 bis 20 % (v/v) der gesamten Assay-Reagenszusammensetzung bilden, die den Assay- Puffer mit darin gelösten signalgebenden Agenzien umfaßt). Eine Pufferung kann auch bis zu pH 9,0 erfolgen.

Reagensbeispiel 5

Albumin-Immobilisierungsmittel

Polystyrol-Latex-Partikel mit einer durchschnittlichen Größe im Bereich von 0,05 bis 1 um werden zur Herstellung von Antikörper-Latex-Konjugaten verwendet. Zu 2 ml der Latex-Suspension in 0,16 M NaCl (50 mg/ml) werden 2,6 mg E Amino-capronsäure und 5 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl (EDC) zugegeben. Man läßt die Reaktion 3 h bei 4ºC ablaufen, und die Lösung wird danach über Nacht in 0,15 M NaCl dialysiert, und die aktivierten Partikel werden abzentrifugiert. 20 mg Antikörper, abgereichert an Boronsäure-reaktiven Stellen, und 5 mg EDC in 2,5 ml 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, werden zu den gefällten Partikeln gegeben. Das Reaktionsgemisch läßt man dann 12 h rotieren, und blockiert nicht-umgesetzte aktive Stellen mit geeigneten Reagenzien. Abschließend werden die Partikel gewaschen und durch Zentrifugation gesammelt.

Reagensbeispiel 6

Albumin-Immobilisierungsmittel

Filtermaterialien, die durch übliche Verfahren aktiviert worden sind, zu denen Cyanogenbromid, Carbodiimid, N-Hydroxysuccinimid, bis-Oxirane und Hydrazine, die alle zum Stand der Technik gehören, zählen, werden als feste Träger zur Immobilisierung eines Anti-Albumin-Antikörpers verwendet, nachdem man zuvor Boronsäure-reaktive Stellen abgereichtert hatte.
Diese aktivierte Membran wird in einem geeigneten Filterhalter befestigt, und 100 ul der Antikörperlösung mit 200 bis 300 ug Protein pro ml des Immobilisierungspuffers, 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PH 7,3, wird sodann über den Filter bei kontrollierter Flußrate gegeben. Eine Blockierung der verbleibenden aktiven Stellen auf dem Filter wird durchgeführt, indem man Blockierungslösungen, wie 0,5 M Tris-Puffer, pH 8,5, oder 1 M Ethanolamin, pH 9,5, über die Filtermembran gibt.

Reagensbeispiel 7

Albumin-Immobilisierungsmittel

Epoxy-aktivierte Filtersubstanzen, die durch Reaktion mit dem Bis-oxiran, 1,4-Bis-(2,3-epoxypropoxy)butan, gebildet werden, werden als fester Träger verwendet, der direkt vor der Verwendung gemäß Verfahren des Standes der Technik präpariert wird. Der Filter wird in eine Lösung von Benzylamin in 50 mM Natriumphosphat-Puffer, 7,5, getaucht und 12 h bei 40ºC unter stetigem Schütteln inkubiert. Die Benzylamin-Konzentration kann variiert werden, aber man hat festgestellt, daß 50 mM zur Immobilisierung und Blockierung der aktiven Gruppen auf den meisten Filtern geeignet sind.

Reagensbeispiel 8

Albumin-Immobilisierungsmittel

Es werden Epoxy-aktivierte Filtersubstanzen, die durch Reaktion des Bis-oxirans, 1,4-Bis-(2,3-epoxypropoxy)butan, gebildet werden, hergestellt. Das Dinatriumsalz von Iminodiessigsäure wird in 2 M Natriumcarbonatlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg Chelat pro ml Puffer gelöst und sodann zu der voraktivierten Filtersubstanz gegeben. Die Reaktion wird 24 h bei 65ºC durchgeführt, und die Filter werden danach mit einem Überschuß an destilliertem Wasser gewaschen. Um das "aktive" Metallchelat herzustellen, wird der Filter in eine Metallsalzlösung getaucht, die 1 mg/ml Zinkchlorid oder Kupfersulfat, in Abhängigkeit von dem zu testen beabsichtigten Protein, enthält. Abschließend wird der Filter mit einem Überschuß an destilliertem Wasser gewaschen, um freie, nicht-chelierte Metallionen zu entfernen.

Reagensbeispiel 9

Boronsäurefilter zur Abtrennung von glykosylierten Proteinen

Die Abtrennung von glykosylierten Proteinen aus einer Untersuchungsprobe kann unter Verwendung einer Abtrennungsvorrichtung erreicht werden, die einen Filter umfaßt, der mit Aminophenylboronsäure oder gegebenenfalls einer anderen Boronsäure-haltigen Einheit modifiziert ist, wobei der Boronsäurehaltige Rest kovalent an die Filteroberfläche gebunden ist, auf der die Boronsäuregruppe der durchgeleiteten Untersuchungsprobe ausgesetzt ist. Der bei dieser Anwendung verwendete Filter ist voraktiviert, um vorzugsweise an Aminogruppen zu binden (Immunodyne (PALL), Immobilon (Millipore)). Aminophenylboronsäure wird in einem 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 bis 8, gelöst, worin die Membran eingetaucht wird. Unumgesetzte Gruppen auf dem Filter werden durch Zugabe einer 10% Monoethanolaminlösung bei pH 9 blockiert. Alternativ kann der Filter mit einer Casein-Lösung blockiert werden, aus der glykosylierte Proteine durch eine Passage durch eine Säule abgereichert sind, die ein Boronsäure-Affinitätsgel enthält (Gylco-Gel B , Pierce). Dies ergibt einen Filter, der eine niedrige unspezifische Proteinbindung besitzt. Die Abtrennung wird bei basischem pH-Wert (pH 8-9) in einem Puffer durchgeführt, der zur Bindung der Boronsäure an den glykosylierten Teil des Proteins geeignet ist. Die Vorrichtung zur Abtrennung besteht aus einem Aktivfilter in Kontakt mit einem Absorbens- Pad, das die Untersuchungsprobe durch den Aktivfilter zieht, wobei alle außer den glykosylierten Proteinen von dem Filter entfernt werden.

Reagensbeispiel 10

Bildung von Antikörpern, die mit den glykosylierten Segmenten des Albumin reagieren

Unter Verwendung eines glykosylierten Albumin-Antigens gemäß dem Verfahren von Cohen et al, J. Immunol. Meth. 117: 121-129 (1989) erhält man monoklonale Antikörper, die mit glykosyliertem Albumin reagieren. Für eine spezifischere Immunisierung verwendet man das Segment Glukose-Lys525-Gl-Thr-Ala-Leu529, was den am stärksten glykosylierten Rest in glykosylierten Albumin darstellt.

Reagensbeispiel 11

Immobilisierungs-Agens (Antikörper), spezifisch für glykosyliertes Albumin

Die Abtrennung von glykosyliertem Albumin aus einer Untersuchungsprobe kann mit einer Trennvorrichtung erreicht werden, die einen Filter enthält, der mit einem Antikörper oder mit Antikörperfragmenten modifiziert ist, die spezifisch mit der Haupt-Glykosylierungsstelle des Albumin reagieren, wenn diese Stelle glykosyliert ist (siehe Reagensbeispiel 10). Der für diese Anwendung verwendete Filter ist zur hauptsächlichen Bindung von Aminogruppen voraktiviert (Immunodyne (Pall), Immobilon (Millipore). Der Antikörper oder das Antikörper- Fragment wird in einem 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 bis 8, gelöst, in den die Membran getaucht wird. Nicht umgesetzte Gruppen auf dem Filter werden durch Zugabe einer 10%-igen Monoethanolaminlösung bei pH 9 blockiert. Alternativ kann der Filter mit einer Caseinlösung blockiert werden, deren glykosylierte Proteine durch Passage über eine Säule, die ein Boronat- Affinitätsgel (Glyco-Gel B, Pierre) enthält, abgereichert sind. Dies ergibt einen Filter, der eine niedrige unspezifische Proteinbindung aufweist. Der reaktive Teil des Antikörpers wir der durchlaufenden Probe ausgesetzt, wodurch das glykosylierte Albumin immobilisiert wird.

Reagensbeispiel 12

Monoklonale Antikörper, die mit glykosyliertem Albumin reagieren. welches mit einem aktivierten Phenoxazin konjugiert ist, was ein Absorptionsmaximum von etwa 645 nm aufweist.

10 mg des im Reagensbeispiel 10 erhaltenen monoklonalen Antikörpers werden in 1 ml 0,1 M Natriumphosphat- Puffer, pH 8,5, gelöst. Zu dieser Lösung gibt man einen 10- molarer Überschuß von
NHS = N-Hydroxysuccinimidestergruppe zugegeben (synthetisiert wie in unserer gleichzeitig anhängigen britischen Patentanmeldung beschrieben), und das Gemisch wird 1 h bei Umgebungstemperatur rotiert und abschließend gegen einen geeigneten Puffer dialysiert.

Reagensbeispiel 13

Fällungsagenzien für alle glykosylierten oder nicht-glykosylierten Serumproteine

(A) 0,76 M Trichloressigsäure (TCA) wird hergestellt, indem man 125 g TCA in 500 ml Wasser löst und dies auf ein Volumen von 1 l verdünnt.
Eine Proteinpräzipitation kann bewirkt werden, indem man 1 ml einer Blutprobe mit einer Gesamtproteinkonzentration von 5 bis 10 mg/ml mit 0,25 ml des TCA-Reagens gründlich vermischt. Man läßt das Gemisch 10 min stehen, und das Präzipitat wird abgetrennt.
(B) Bei Proben mit einer Gesamtproteinkonzentration von etwa 0,5 mg/ml wird ein weiteres Fällungsagens hergestellt, indem man 15 g Sulfosalicylsäure (x 2H&sub2;O) und 35,0 g Natriumsulfat (wasserfrei) in Wasser löst und volumetrisch auf ein Endvolumen von 500 ml verdünnt.
Zu einer 0,5 ml Probe gibt man 2 ml des Salicylsäurereagens, mischt gut, läßt es 10 min stehen und trennt das Präzipitat ab.

Reagensbeispiel 14

Immobilisierungsagens für Komplement C3 (glykosyliert und nicht-glykosyliert)

Kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper, die mit dem humanen Komplementfaktor C3 (erhältlich von verschiedenen kommerziellen Quellen) reagieren, werden wie in den Reagensbeispielen 6 und 11 beschrieben, immobilisiert.

Reagensbeispiel 15

Immobilisierungsagens für Carboanhydrase (glykosyliert und nicht-glykosyliert)

Kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper, die mit der humanen Carboanhydrase (erhältlich von vielen kommerziellen Quellen) reagieren, werden wie in den Reagensbeispielen 6 und 11 beschrieben immobilisiert.

Reagensbeispiel 16

Phthalocyanin: Boronsäure-Konjugat zur Verwendung als erstes signalgebendes Agens

Zu einer Suspension von Chloraluminium-phthalocyanintetrasulfonat (60 mg, 6,7 x 10&supmin;&sup5; mol) in 2 ml Benzol gab man tropfenweise und unter stetigem Rühren einen 10-fachen molaren Überschuß an Oxalylchlorid, und rührte die Lösung bei 25ºC unter Feuchtigkeitsausschluß. Nach 12 h bei dieser Temperatur wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck und Feuchtigkeitsausschluß verdampft. Sofort danach wurde 3-Aminophenylboronsäure-monohydrat (20 mg, 1,35 x 10&supmin;&sup4; mol) in 1,5 ml 0,25 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat-Puffer (pH 9,0) zu dem resultierenden Sulfonylchlorid gegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 3 bis 12 h gerührt. Die Boronsäure-Konjugate wurden mittels Reversed-Phase-Chromatographie hauptsächlich in Form eines Monophenylboronsäure-funktionalisierten Farbstoffs isoliert.

BEISPIELE DER DURCHFÜHRUNG DES VERFAHRENS

Beispiel 1

Glykosyliertes Hämoglobin in Gesamtblut unter Verwendung eines Farbstoffs und Lösungsmittelfällung

Eine Probe Gesamtblut wurde hämolysiert und in einem hämolysierenden Assay-Puffer, 100 mM Hepes mit 0,05 % Triton X-100, pH 9,0, auf ungefähr 8 mg Hämoglobin/ml verdünnt. Ein Gemisch von 50 % (v/v) Butanol in Ethanol und das oben im Reagensbeispiel 1 beschriebene Phenoxazin-aminophenylboronsäure-Konjugat werden bis zu einer endgültigen Butanolkonzentration von 9 % (v/v) und einer Konjugat-Konzentration von 1,6 x 10&supmin;&sup4; M zugegeben. Es bildet sich ein Präzipitat, das von dem Überstand durch Zentrifugation abgetrennt wird. Das Präzipitat wird in 0,05 M Chlorwasserstoffsäure mit 5 % Dimethylsulfoxid gelöst, und die Konzentrationen des Hämoglobins und des Hämoglobin-gebundenen Boronsäure-phenoxazin-Konjugates werden durch Absorptionsspektroskopie gemessen. Die Konzentrationen werden durch Interpolation von Kalibrierungskurven berechnet, die man unter Verwendung von Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen an Hämoglobin und glykosyliertem Hämoglobin erhält, und der Prozentwert des glykosylierten Hämoglobins in bezug auf das gesamte Hämoglobin wird berechnet.

Beispiel 2

Glykosyliertes Albumin in Gesamtblut unter Verwendung von zwei Farbstoffen und einer Rivanol-Fällung (I)

10 ul Gesamtblut werden mit 150 ul hämolysierendem Assay-Puffer vermischt, der 0,25 M Ammoniumacetat, 0,05 % Triton X-100, pH 9,0, umfaßt, und der zusätzlich 100 nmol der Verbindung gemäß Reagensbeispiel 1 und 20 nmol Cr(III )-Tetracarboxyphenylporphyrin umfaßt.
18 ul einer 5% (w/v)-Lösung von Rivanol (2- Ethoxy-6,9-diaminoacridinlactat) in Assay-Puffer werden zugesetzt. Das Albumin-Präzipitat wird durch Filtration abgetrennt, einmal gewaschen, und die Reflexion wird bei 645 nm und 450 nm mit Hilfe eines Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen. Es wird das Verhältnis der Reflexionen bei 645 und 450 nm gemessen.
Der Assay wird unter Verwendung von Standardblutproben kalibriert, die bekannte Anteile an glykosyliertem Albumin enthalten, was durch klassische Colorimetrie oder durch Affinitäts-Chromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie quantifiziert wurde.

Beispiel 3

Glykosyliertes Albumin in Gesamtblut unter Verwendung von zwei Farbstoffen und einer Rivanol-Fällung (II)

Das Verfahren des Beispiels 2 wird wiederholt, wobei man die Verbindung des Reagensbeispiels 16 durch die des Reagensbeispiels 1 ersetzt und die Reflexion bei 685 nm statt bei 645 nm abliest.

Beispiel 4

Quantifizierung von glykosyliertem Albumin unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern und Bromphenolblau

Es wird eine Filtrationseinheit mit immobilisierten monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit glykosyliertem Albumin reagieren, verwendet (siehe Reagensbeispiel 11).
10 ul Gesamtblut werden mit 500 ul 130 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, umfassend 0,05 % Triton X-100 als hämolysierendes Agens und 50 nm Bromphenolblau vermischt. Ein Teil dieses Gemisches wird mit der Filtereinheit in Kontakt gebracht, wobei das Volumen von der Bindungskapazität der Filtereinheit abhängt. Die Reflexion bei 590 nm wird unter Verwendung eines Reflektometers wie in Beispiel 2 gemessen, wobei die Intensität von der Menge des Albumins, das mit den immobilisierten Antikörpern reagiert hat, abhängt.
Der Anteil des glykosylierten Albumins wird unter Bezugnahme auf eine Messung von Blutalbumin, die unabhängig davon durch übliche Verfahren erhalten wurde, bestimmt.

Beispiel 5

Quantifizierung von glykosylierten Serumproteinen

5 ul Serum (enthaltend ungefähr 0,4 mg Protein) werden mit 0,75 ml der Sulfosalicylsäure-/Natriumsulfatlösung des Reagensbeispiels 13B vermischt. Nach dem Mischen und einer 10-minütigen Inkubation wird das Präzipitat mittels einer Passage durch einen Filter aufgefangen. Danach werden 2 ml eines Puffers, 0,25 M Ammoniumacetat, pH 9,0, mit 0,05 % Triton X- 100 und 100 nmol der Verbindung des Präparationsbeispiels 1 über den Filter gegeben. Danach wird die Reflexion bei 575 nm mit einem Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen. Die Reflexionsintensität ist eine Funktion der Konzentration der glykosylierten Proteine in der Untersuchungsprobe.

Beispiel 6

Quantifizierung von glykosyliertem Komplementfaktor C3 (I)

10 ul Gesamtblut werden mit 150 ul hämolysierendem Assay-Puffer vermischt, der 0,25 M Ammoniumacetat, 0,25 % Triton X-100, pH 9,0 und zusätzlich 100 nmol der Verbindung des Reagensbeispiels 1 umfaßt, vermischt.
Ein Aliquot des Gemisches wird gemäß dem Reagensbeispiel 14 auf einen Filter transferiert. (Das Volumen des Aliquots muß so eingestellt sein, daß die Gesamtbindungskapazität des Filters nicht überschritten wird). Der Filter wird einmal gewaschen, und die Reflexion wird bei 645 nm mit einem Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen. Das Reflexionssignal hängt von der Konzentration an glykosyliertem Komplement C3 ab.

Beispiel 7

Quantifizierung von glykosyliertem Komplementfaktor C3 (II)

Das Verfahren des Beispiels 6 wird wiederholt, wobei die Verbindung des Reagensbeispiels 16 durch diejenige des Reagensbeispiels 1 ersetzt wird; die Reflexion wird bei 685 nm statt bei 645 nm abgelesen.

Beispiel 8

Quantifizierung von glykosylierter Carboanhydrase

10 ul Gesamtblut werden mit 150 ul hämolysierendem Assay-Puffer vermischt, der 0,25 M Ammoniumacetat, 50,05 % Triton X-100, pH 8,0 und zusätzlich 100 nmol der Verbindung des Reagensbeispiels 1 umfaßt.
Ein Aliquot des Gemisches wird gemäß dem Reagensbeispiel 15 auf einen Filter transferiert. (Das Volumen des Aliquots muß so eingestellt sein, daß die Gesamtbindungskapazität des Filters nicht überschritten wird). Der Filter wird einmal gewaschen, und die Reflexion wird bei 645 nm mit einem Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen. Das Reflexionssignal hängt von der Blutkonzentration an glykosylierter Carboanhydrase ab.

Beispiel 9

Analyse von glykosyliertem Albumin unter Verwendung eines Filters, der das gesamte Albumin bindet (Benzylamin-Filter) und eines Boronsäurefarbstoffes (I)

10 ul Gesamtblut werden mit 150 ul hämolysierendem Assay-Puffer vermischt, der 0,25 M Ammoniumacetat, 0,05 % Triton X-100, pH 9,0, und weiterhin 100 nmol der Verbindung des Reagensbeispiels 2 umfaßt (wodurch somit ein Abwaschen des Hämoglobins vom Filter unnötig wird). Ein Aliquot des resultierenden Gemisches wird durch den Filter des Reagensbeispiels 7 gegeben. Die Reflexion auf dem Filter wird bei 645 nm mit Hilfe eines Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen.

Beispiel 10

Analyse von glykosyliertem Albumin unter Verwendung eines Filters, der das gesamte Albumin bindet (Benzylamin-Filter) und eines Boronsäurefarbstoffes (II)

Das Verfahren des Beispiels 9 wird wiederholt, wobei man die Verbindung des Reagensbeispiels 16 durch diejenige des Reagensbeispiels 2 ersetzt und die Reflexion bei 685 nm statt bei 645 nm abliest. Die Verbindungen des Reagensbeispiels 2 oder 3 können gegebenenfalls als zweites signalgebendes Agens enthalten sein.

Beispiel 11

Glykosyliertes Hämoglobin in Gesamtblut unter Verwendung eines Farbstoffes; Filterformat

Eine Gesamtblut-Probe wurde mit einem hämolysierenden Reaktions-Puffer vermischt, der 160 mM Piperazin, pH 9,4, 0,07 % Triton X-100, 9,4 % Ethanol (v/v), 9,4 % Butanol (v/v) und die Verbindung des Reagensbeispiels 16 in einer Konzentration von 2,1 x 10&supmin;&sup5; M enthielt. Die endgültige Hämoglobin-Konzentration betrug ungefähr 2 mg/ml. Das Gesamtblut wurde hämolysiert, und es bildete sich ein Präzipitat. Das präzipitierte Hämoglobin wurde durch Filtration abgetrennt. Die Reflexion wurde bei 685 und 470 nm mit Hilfe eines Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000 gemessen. Das Verhältnis der Reflexionen bei 685 und 470 nm wurde berechnet.
Die Konzentrationen wurden durch Interpolation an Kalibrierungskurven berechnet, die man unter Verwendung von Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen an Hämoglobin und glykosyliertem Hämoglobin erhielt, und der %-Wert an glykosyliertem Protein im Verhältnis zu Gesamthämoglobin wurde berechnet.
Bei allen Reagenzien, die zur Quantifizierung von glykosylierten Humanproteinen verwendet werden, ist es vorteilhaft, wenn die Reagentien, die einen biologischen Ursprung besitzen, über eine Säule gegeben werden, die ein Gel mit immobilisierten Boronsäureeinheiten enthält, welche gegebenenfalls mit Periodat oder Endoglykosidase behandelt sind; auf diese Weise werden die analytischen Reagenzien von Einheiten gereinigt, die mit Boronsäuregruppen reagieren.
Alternativ können die signalgebenden Einheiten von Radioisotopen, z.B. Iod-125, fluoreszierenden, chemolumineszierenden oder biolumineszierenden Einheiten gebildet werden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines glykosylierten Blutproteins in einer Probe, wobei man bei diesem Verfahren:

a) gegebenenfalls die Probe hämolysiert, um zellgebundenes glycosyliertes Protein freizusetzen;

b) das glycosylierte Blutprotein und das entsprechende nichtglycosylierte Blutprotein aus der Probe mit Hilfe eines Flüssigphasen-Fällungsreagens abtrennt;

c) die Probe vor oder während der Abtrennung des glycosylierten und des nicht-glycosylierten Proteins oder die abgetrennten Proteine mit einem ersten signalgebenden Agens in Kontakt bringt, das zur Bindung an das glycosylierte Protein mit wesentlich höherer Bindungsaffinität als gegenüber dem entsprechenden nicht-glycosylierten Protein befähigt ist;

d) gegebenenfalls die Probe vor oder während der Abtrennung des glycosylierten und des nicht-glycosylierten Proteins oder die abgetrennten Proteine mit einem zweiten signalgebenden Agens in Kontakt bringt, das zur Bindung an das glycosylierte Protein und an das entsprechende nicht-glycosylierte Protein befähigt ist; und

e) die signalgebenden Agenzien bestimmt, welche an die abgetrennten Proteine gebunden sind und/oder welche nicht an das glycoslierte Protein oder an das entsprechende nicht- glycosylierte Protein gebunden sind;

mit der Maßgabe, daß dann, wenn das glycosylierte Protein glycosyliertes Hämoglobin umfaßt, das erste signalgebende Agens eine mit einem Chromophor markierte Boronsäure oder ein Salz davon ist und ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man Schritt (c) unter Verwendung zweier verschiedener erster signalgebender Agenzien durchführt, wobei jedes davon im wesentlichen spezifisch für ein anderes glycosyliertes Blutprotein ist, und man gegebenenfalls Schritt (d) unter Verwendung zweier verschiedener zweiter signalgebender Agenzien durchführt, welche im wesentlichen spezifisch für die gleichen zwei verschiedenen Blutproteine ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die sersten oder die zweiten signalgebenden Agenzien mit Chromophoren markiert sind, die ein Absorptionsmaximum oberhalb von 600 nm aufweisen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Schritte (b) und (c) und gegebenenfalls (d) gleichzeitig ausgeführt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das erste signalgebende Agens ein Konjugat aus einem oder mehreren Dihydroxyborylresten oder Salzen davon, gebunden an eine signalgebende Markierung, umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Trennschritt (b) unter Verwendung eines Fällungsreagens durchgeführt wird, welches im wesentlichen spezifisch für das zu bestimmende Protein ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Trennschritt (b) durch selektive Ausfällung aus homogener Lösung erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die Fällung durch Zugabe von Metallkationen erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die Fällung durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder eines Gemisches von organischen Lösungsmitteln in einer Konzentration erfolgt, bei der im wesentlichen spezifisch das zu bestimmende Protein ausgefällt werden kann.

10. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, worin die Fällung durch Zugabe von Bindungsproteinen erfolgt, die spezifisch für das zu bestimmende Protein sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Fällungsschritt auf oder in einer Festphase erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin das auf diese Weise erhaltene Präzipitat mit Hilfe eines chromatographischen Mediums oder eines Filtrationsmediums oder durch Zentrifugation abgetrennt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Trennschritt (b) für das zu bestimmende Protein nicht spezifisch ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das zweite signalgebende Agens im wesentlichen spezifisch an das glycosylierte und an das entsprechende nicht-glycosylierte Protein bindet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das zweite signalgebende Agens unspezifisch an Blutproteine bindet.

16. Verfahren nah einem der Ansprüche 1 bis 15, zur Bestimmung von glykosyliertem Albumin und/oder glycolysiertem Komplement C3.

17. Verfahren nach Anspruch 16 zur Bestimmung von glykosyliertem Albumin, wobei das zweite signalgebende Agens ausgewählt ist unter Metallsalzen, Metallchelaten, anionischen Farbstoffen, Porphyrinen und synthetischen Derivaten davon, Ponceau S, Coomassie Brilliant Blue, Bicinchoninsäure und Bromphenolblau.

18. Analytischer Testkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1, umfassend:

ein erstes signalgebendes Agens, das zur Markierung eines glycosylierten Blutproteins befähigt ist; ein Flüssigphasen- Trennmittel, das zur Ausfällung des Proteins in dessen glycosylierter und nicht-glycosylierter Form befähigt ist; gegebenenfalls ein zweites signalgebendes Agens, welches zur Markierung des Proteins in dessen glycosylierter und nicht- glycosylierter Form befähigt ist; und gegebenenfalls Puffer- und/oder Stabilisator- und/oder Lysierungsreagenzien, wobei von dem ersten Agens und dem Trennagens wenigstens eines im wesentlichen spezifisch für das Protein ist.

19. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung umfaßt: Mittel zur Entnahme einer Blutprobe; Mittel, um die Blutprobe mit den folgenden Agenzien:

(i) gegebenenfalls einem hämolysierenden Agens,

(ii) einem ersten signalgebenden Agens gemäß Anspruch 1,

(iii) einem Flüssigphasen-Trennagens, das zur Fällung eines Blutproteins in dessen glycosylierter und nicht-glycosylierter Form befähigt ist,

(iv) gegebenenfalls einem zweiten signalgebenden Agensgemäß Anspruch 1,

(v) gegebenenfalls einem Stabilisator,

(vi) gegebenenfalls einem Puffer,

einzeln oder in einer oder mehreren Kombinationen davon in Kontakt zu bringen; und

Mittel zur Bestimmung der signalgebenden Agenzien, die an die mit Hilfe des Trennagens abgetrennten Blutproteine gebunden sind und gegebenenfalls zur Bestimmung eines oder mehrerer Blutproteine, die mit Hilfe des Trennagens abgetrennt wurden, an welchen jedoch im wesentlichen kein signalgebendes Agens gebunden ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, umfassend ein Blutentnahmegerät, Mittel zur Überführung einer Blutprobe in eine Reaktionskammer, welche eine Festphase zur Aufnahme des abgetrennten Proteins enthält, Mittel zur Einführung von Reagenzien in die Kammer und ein Spektrometer zum Nachweis der Photonen-Emission von oder -Absorption durch die auf der Festphase abgetrennten Proteine bei wenigstens einer und vorzugsweise wenigstens zwei vorgegebenen Wellenlängen.