NO311385B1

NO311385B1 - Fremgangsmåte ved undersökelse av glykerte blodproteiner samt anordning for utförelse av fremgangsmåten

Info

Publication number: NO311385B1
Application number: NO19931747A
Authority: NO
Inventors: Frank Frantzen; Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Shield Asa
Priority date: 1990-11-14
Filing date: 1993-05-13
Publication date: 2001-11-19
Also published as: DE69104491T2; EP0557350B1; NO931747L; CA2096250C; AU8866291A; US5919708A; ATE112635T1; WO1992008984A1; EP0557350A1; GB9024771D0; NO931747D0; FI104519B; JP2643027B2; DK0557350T3; FI932150A; ES2061273T3; DE69104491D1; JPH06502244A; US5506144A; FI932150A0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et ligandbindende assay for påvisning av glykerte blodproteiner (GBPs) som angitt i krav 1, samt en anordning for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 18 og 19.

Det har lenge vært kjent at mange glukoprot einer i kroppsvev og væsker opptrer som et resultat av ikke-enzymatiske reaksjoner av kroppsproteiner med sukkeret. Disse ikke-enzymatisk glykosylerte proteiner blir heri referert til som glykerte proteiner.

Ettersom pattedyrvev ikke synes å inneholde noe enzym som er i stand til å reversere glykeringsreaksjonen, er ut-strekningen, hvorved ethvert gitt protein blir glykert, i hovedsak avhengig av

den iboende egenskap hos proteinet til å undergå glykering

levetiden av proteinet i kroppen, og

glukosekonsentrasjonene til hvilke proteinet har blitt

eksponert.

Følgelig, ulik direkte målinger av glukosekonsentrasjonen i kroppsvev eller kroppsvæskeprøver (f .eks. blod, plasma eller urin) , som gir informasjon kun om glukosekonsentrasjonen ved prøvetakningstiden, gir graden av glykering hos et protein en indikasjon på kroppens kontroll av glukosekon-sentrasj onen i gjennomsnitt over en lengre tidsperiode.

I pasienter med ustabilisert diabetes mellitus er graden av proteinglykering ofte flere ganger høyere enn hos normo-glykemiske pasienter, og som et resultat har flere GBP-assay blitt foreslått som utvelgelser for diabetes mellitus eller som muligheter hvorved en pasients medium til lang-tidskontroll av blodglukosenivåer kan bli beregnet.

Slike forsøk har blitt foreslått for glykert haemoglobin (GH) og glykert serumalbumin (GSA) , spesielt ettersom de relativt lange levetider hos disse proteiner gir en indikasjon på langtids- og middeltidskontroll av blodglukose, og ettersom disse proteiner begge foreligger i store mengder og er relativt utsatt for glykering. Således reflekterer GSA- og GH-nivå kroppens kontroll i forhold til blodglukose i løpet av henholdsvis de foregående 1-3 uker og 1-3 måne-der.

GBP-undersøkelser baserer seg generelt på utskillelse av GBP fra en kroppsvæske eller vevsprøve på bindingen til GBP i en slik prøve av en påvisbar markør, såsom en kromofor, en fluorfor eller en radiomarkør, eller på kjemisk nedbry-ting av GBP i en slik prøve, f.eks. oksydering av fruktos-aminenheten under alkaliske betingelser i nærvær av en re-dox indikator. Slike forsøk og deres fordeler og ulemper ble oppsummert av Schleicher et al i J. Clin Chem. Clin. Biochem 27: 577-587 (1989).

Metoder ifølge tidligere teknikk er kjent og innbefatter separasjon av det glykerte protein fra det ikke-glykerte protein ved hjelp av ionebyttekromatografi. Dette var en metode som først ble foreslått for GH-forsøk og er den kliniske metode som mest vanlig blir brukt. Imidlertid er den dyr og tidskrevende og resultater blir påvirket av små tem-peraturvariasj oner.

Flere ytterligere forsøk har involvert bruken av borsyrederivater for å isolere eller merke de glykerte proteiner i en prøve. Det har lenge vært kjent at mens borsyre danner estere med karbohydratenheter med cis-diolresiduer, såsom glykerte proteiner, danner enzymatisk dannede glukoprotei-ner ikke slike estere. Således har kjemisk immobiliserte borsyrer blitt foreslått for bruk ved isolering av glykerte proteiner ved affinitetskromatografi, og bruken av slike materialer til å mengdebestemme den glykerte fraksjon av hemoglobin ble forslått f.eks. av Dean et al. i GB A-2024829.

Bruken av slike kolonner er imidlertid dyr og tidskrevende, og for GBPs andre enn GH advarer Schleicher (supra) at bin-dingsgraden av det glykerte protein er meget følsom overfor betingelsene hvorunder kromatograferingen blir utført.

Reaksjonen i den flytende fase av glykerte proteiner med kromofor- eller fluorofor-merkede borsyrer har også blitt foreslått som basis for assay for glykerte proteiner, spesielt GH. Således foreslo Schleicher i DE-A-3720736 et assay som baserer seg på et av de følgende tre prinsipper for måling av det totale glykerte proteininnhold som er tilstede i en prøve: 1. et skift i absorpsjonsmaksimum av en borsyrekromofor-markør når den bundet til et glykert protein, 2. en polarisasjonsendring av fluorescens i en borsyre fluoroformarkør når den er bundet til et glykert protein, eller 3. måling av mengden av kromofor- eller fluoroformerket borsyre bundet til glykert protein etter fjerning av overskudd av ubundet, merket borsyre, f.eks. ved å bruke aktivt trekull.

Ingen av disse metoder kan imidlertid bli brukt for mengde-bestemmelsen av en spesiell GBP. I tillegg har reagensene foreslått av Schleicher hatt heller små absorpsjonskoeffi-sienter, og deres absorpsjonsmaksima ligger relativt nær det til hemoglobin, noe som gjør det vanskelig eller umulig å påvise GH.

Wagner, US-A-4851728, foreslo et assay for GH som innbefatter å skille ut GH ved å sette en hemolysatprøve i kontakt med et fast bærermateriale på hvilket det er bundet et antistoff som er spesifikt for totalt hemoglobin, og om-sette GH med en fluoroformerket borsyre. Totalt bundet hemoglobin kan så bli målt reflektometrisk, mens bundede GH-nivå kan bli beregnet fluoroskopisk.

Imidlertid lider denne teknikk av den ulempe at assosiasjonskonstantene mellom det glykerte hemoglobin og borsyre-markørene er relativt små (dvs IO<3> - 10s mol"1) , og siden den effektive konsentrasjonen av GH er relativt liten når den er immobilisert blir binding av markøren også tilsvarende redusert.

Det er således et fortsatt behov for GBP-assays som er raske, enkle, billige og lett tilpasningsdyktige for bruk i kliniske laboratorier eller for diagnostiske formål.

Et slikt assay for GH er beskrevet i søkers søknad W0-A90/13818 og søker har nå funnet at denne teknikk lett kan tilpasses for bruk som et assay for andre GBP, mest spesielt GA.

Således betraktet gir fra et aspekt foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å påvise et glykert blodprotein i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene; a) valgfritt å hemolysere nevnte prøve for å frigjøre cellebundet glykert protein; b) adskille nevnte glykerte blodprotein og det tilsvarende ikke-glykerte blodprotein fra nevnte prøve ved å

bruke et væskefase utfellingsreagens;

c) kontakte nevnte prøve før eller under separasjonen av nevnte glykerte og ikke-glykerte proteiner fra denne, eller

kontakte nevnte separerte proteiner med et første signaldannende middel som er i stand til å binde til nevnte glykerte protein med i hovedsak større bindingsaffinitet enn for det tilsvarende ikke-glykerte protein;

d) valgfritt å kontakte nevnte prøve før eller under separasjonen av nevnte glykerte og ikke-glykerte proteiner

fra denne, eller kontakte nevnte separerte proteiner med et andre signaldannende middel som er i stand til å binde til

nevnte glykerte protein og til nevnte tilsvarende ikkegly-kerte protein; og

e) påvise de signaldannende midler som har bundet til nevnte separerte protein og/eller som ikke har bundet til

nevnte glykerte protein eller nevnte tilsvarende ikkegly-kerte protein; med det forbehold at nevnte glykerte protein omfatter glykert hemoglobin er nevnte første signaldannende middel en kromoformerket borsyre eller salt derav med et absorpsjonsmaksimum ved eller over 600 nm.

I påvisningsmetoden ifølge oppfinnelsen kan det glykerte protein, som er merket med det første signaldannende middel, være ethvert eller faktisk ethvert sett av blodprotei-nene. Imidlertid, for at metoden skal gi en indikasjon med hensyn til blodglukosekontrollen over en spesiell tidsperiode, blir den fortrinnsvis utført slik at påvisning foregår i hovedsak kun av et spesielt glykert protein, spesielt hemoglobin, albumin, komplement C3, firbrinogen eller trans-ferrin.

I en spesiell foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir minst to første signaldannende midler brukt, hvorav hvert i hovedsak er spesifikt for en forskjellig GBP, idet signalet for hvert er tilstrekkelig forskjellig for at de kan bli målt uten signifikant interferens med hverandre. Således kan f.eks. det første signaldannende middel passende omfatte et kromoformerket antistoff eller antigenbindende antistoff-fragment, som er spesifikt for et GBP og et fluoroformerket eller radiomerket antistoff eller fragment som er spesifikt for et annet GBP. Foretrukket for må-lingsletthetens skyld vil imidlertid merking bli foretatt med adskillbare markører av samme type, f.eks. hvor begge (eller alle) er kromoforer. Denne utførelsesform kan kreve at mer enn et middel blir brukt for å fremskaffe adskillelse av de to eller flere proteiner under assayet - imidlertid i mange tilfeller vil et enkelt middel eller separasjonsmetode være tilstrekkelig. I denne utførelsesform vil det for å erholde en indikasjon av den relative mengde av de glykerte former av proteinene under undersøkelse, også være ønskelig å anvende to eller flere proteinspesifikke andre signaldannende midler. Ved passende seleksjon av proteinene i forsøket, f.eks. hemoglobin og albumin og eventuelt også komplement C3 eller fibrinogen tillater denne utførelsesform av oppfinnelsen et enkelt assay å gi en indikasjon på historien hos pasientens blodglukosekontroll over kort, middels og lang (opptil 3 mnd) tid. Hvor de glykerte proteiner som ble undersøkt er merket med en kromofor, vil det spesielle brukte middel fortrinnsvis ha et absorbsjonsmaximum over 600 nm, slik at metoden kan bli ut-ført på erytrocytt eller hemoglobininneholdende prøver, f.eks. fullblod uten å være avhengig av hemoglobinet, er vasket bort. Likeledes dersom det andre signaldannende middel blir brukt for å merke de glykerte og ikke-glykerte former av proteinet som blir undersøkt slik som fortrinnsvis vil være tilfelle hvor proteinet er forskjellig fra hemoglobin da vil det også, dersom midlet innbefatter en kromofor, fortrinnsvis ha et absorpsjonsmaksium over 600 nm.

Et område for kromoformarkører og forbindelser som bærer disse som er egnet for bruk som første eller andre signaldannende midler ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er beskrevet i søkers samtidige GB nr 9024775.0, innlevert 14. november 1990 og med tittel "Chemical Compounds", samt i den tilsvarende internasjonale patentsøknad, hvorav en kopi av teksten som ble innlevert med denne, samt beskrivelsen derav er innbefattet heri pr. referanse. Disse forbindelser inneholder kromof orer med absorpsjonsmaksima over 600 nm, f.eks. fenoksasin- og fenotiasinderivater som bærer sekundære eller tertiære amino- og iminogrupper ved 3 og 7 posi-sjonene. Disse kromoforer virker passende som første signaldannende midler, hvor de blir bundet til borsyreenheter på den måte som er beskrevet i større detalj nedenfor, f.eks. ved substitusjon av aminoenheten med en 3-(N-etyl-piperidin-4-ylkarbonylamino) fenylborsyregruppe (festet ved P-karbonet av N-etylenheten). Spesielt foretrukket innbefatter slike kromoforer kloraluminiumftalocyanider, såsom de som er definert og beskrevet i den samtidige ansøkning.

I tillegg til å bestemme nivået av et glykert protein i en prøve ved å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det også være ønskelig å erholde en bestemmelse av nivået av glykert og ikke-glykert protein som er tilstede, samt å regne ut et forhold mellom glykert og totalt protein. Det kan også være spesielt ønskelig å erholde en indikasjon på total proteinkonsentrasjon i blodet for det spesielle proteinet som er under undersøkelse, ettersom graden av glykering kan variere med total proteinkonsentrason for pasienter som lider av sykdommer som resulterer i abnormalt lave konsentrasjoner av det aktuelle protein.

Proteinadskillelsestrinnet krever ikke adskillelse av den totale mengde glykert protein og ikke-glykert protein som er tilstede i prøven. Det er tilstrekkelig for kun endel av både de glykerte og ikke-glykerte fraksjoner å bli adskilt så lenge metoden er passende kalibrert. Slike kalibreringer er rutinemessige i kliniske laboratorieforsøk.

Som brukt heri er uttrykket "påvisning" tenkt å innbefatte både mengdebestemmelse i betydningen å erholde en absolutt verdi for mengden av glykert eller totalt protein i en prø-ve, og også å erholde en indeks, et forhold, en prosentdel eller lignende indikasjon på nivået av glykert protein, f.eks. relativt til den totale proteinkonsentrasjonen i prøven.

Det vil bli forstått at den nye fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen unngår adskillelse av den glykerte fra den ikke-glykerte proteinfraksjon, men baserer seg i stedet på en separasjon av både glykert og ikke-glykert protein fra en prøve. Følgelig er det intet behov for det første signaldannende middel å bli immobilisert, siden det ikke er nød-vendig å bli brukt som del av et separasjonssystem, og faktisk er det foretrukket at det ikke er immobilisert. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli brukt for å påvise mengden av glykert protein i blodprøver, blodhemoly-sater eller blodekstrakter, både fra friske individer og fra pasienter som lider av eller er mistenkt for å lide av diabetes mellitus. Prøvene kan være i tørr, flytende eller frossen form før analyse. Hemolysator for analyse ved frem gangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt f.eks. ved å bruke forskjellige typer reagenser for å hemolysere og blottlegge karbohydratenhetene av de glykerte proteiner til vinningsreaksjonene. Denne behandling kan bli utført i kombinasjon med bruken av andre materialer som er nødvendige for å utføre den fremgangsmåte. Eventuelt for å redusere interferensen kan prøvene bli behandlet for å redusere nivået av fritt eller svakt bundet glukose, f.eks. ved å bruke glukoseoksydase eller en bufret oppløsning med pH under 6.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan reaksjonen av de signaldannende midler med proteiner finne sted før, under eller etter proteinadskillelsen fra prøven. Den valgte fremgangsmåte avhenger av det kjemiske utstyr eller instru-mentene som skal bli brukt for utførelse av fremgangsmåten og hva som er funnet å være mest praktisk.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen finner vin-ningen av det signaldannende middel og proteinisolasjonen sted samtidig i en homogen oppløsning, hvorfra proteinet blir utfelt og isolert ved sentrifugering eller filtrering. Imidlertid kan reaksjons- og separasjonsbetingelsene måtte bli valgt innenfor begrensningene av glukosylresiduet - borsyreassosiasjonskonstanter som er relativt lave (IO<3> - 10s mol<-1> 1) .

Fra styrken av signalet som erholdes fra de signaldannende midler kan konsentrasjonen av de signaldannende molekyler bundet til eller separert med proteinene bli bestemt. En "absolutt" standard for mengdebestemmelse av glykerte proteiner eksisterer enda ikke, men om ønsket kan en kalibre-ring eller korrelering av denne nye fremgangsmåte i forhold til metoder fra tidligere teknikk bli erholdt ved å bruke standard proteinoppløsninger inneholdende kjente konsentrasjoner av den glykerte form av proteinene som bestemt ved metoden(e) ifølge tidligere teknikk.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan de første og andre signaldannende midler bindes spesifikt til det aktuelle protein, eller kan være midler som virker til å merke andre proteiner. I sistnevnte tilfelle bør separasjonen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen være slik at den i én eller flere trinn separerer det aktuelle protein fra prøven i hovedsak, fritt for andre proteiner, merket med de signaldannende midler.

Hvor det aktuelle protein blir adskilt fra prøven med en utfellelse eller med et immobiliserende middel som er spesifikt for dette protein, da kan det første signaldannende middel passende omfatte fenylborsyre bundet til en signaldannende markør, enten direkte eller via en amin eller amidbinding, med en avstandsgivende enhet eller med enhver type kjemisk binding som er kjent i faget og som etterlater dihydroksyborylresiduer fri til å reagere med cis-diolresiduene av glykosylenhetene av det glykerte protein. Avhengig av hvilken pKa-verdi av borsyreresiduene som er ønsket kan fenylringen være ytterligere substituert, f.eks. med nitro, formyl eller alkoksygrupper, eller med andre substituenter som innvirker på pKa-verdien, men som ikke sterisk innvirker på bindingen til cis-diolresiduene av det glykerte protein.

Borsyreresiduene som kan bli brukt for syntesen av det før-ste signaldannende middel ifølge foreliggende oppfinnelse blir passende syntetisert fra aminofenyl, f.eks. m-aminofenyl, borsyreresiduer og bindingen til markøren eller den signaldannende del av nevnte signaldannende molekyler eller konjugater, blir typisk oppnådd ved hjelp av diasoniumion-dannelse, silanisering ved bruk av koblingsmidler, såsom glutardialdehyder, karbodiimider, cyanogenhalider, succin-imider eller andre koblingsmidler som er nevnt i den gene-relle kjemiske litteratur. Den signaldannende markør festes på en måte som etterlater borsyreresiduet fritt til å reagere med cis-diolene av den glykerte proteinanalytt, og kan være "aktivert" på forhånd for å gjøre den reaktiv med amin eller andre reaktive enheter på dihydroksyborylresiduene, f.eks. dimetylaminoazobenzen-isotiocyanat og dimetylamino-naftalensulfonylklorid. Det første signaldannende middel kan også ytterligere være modifisert for å øke vannoppløse-ligheten.

De signaldannende dihydroksyborylmidler for bruk i henhold til oppfinnelsen er foretrukket tilstede i ikke-immobilisert form, og kan omfatte borsyre eller andre spesifikke eller ikke-spesifikke bindingsresiduer bundet direkte eller indirekte til kjemiske strukturer (markører), som er i stand til direkte eller indirekte å danne signaler som kan bli brukt for kjemiske eller fysiske mengdebestemmelsesfor-mål .

Den signaldannende markør kan omfatte enzym(er), fortrinnsvis enzymer som ikke bærer karbohydratcis-diolenheter eller som mangler fraksjoner som bærer cis-diolresiduer. Alternativt kan den signaldannende markør, delvis eller fullstendig bestå av fargede eller fluorescente enheter (kromoforer eller fluoroforer). En mengde fargede, fluorescente eller pigmenterte forbindelser som er egnet for bruk som markører er kjent i faget og kan bli brukt. Passende eksempler innbefatter antrakvinoner, azofargemidler, azinfargemidler såsom oksasiner og tiaziner, traziner, naturlig forekommende pigmenter såsom porfyriner, fykobiliproteiner innbefattende fykoerytriner og fykocyaniner, klorofyll, samt deres analoger og derivater, karotenoider, acrinidiner, xantener innbefattende fluoresciner og rodaminer, indigofargemidler, tioksantener, coumariner, polymetiner innbefattende di- og triarylmetiner og derivater derav, samt ftalocyaniner og metall-ftalocyaniner, eventuelt bundet med avstandsgivende enheter som ligger mellom den signaldannende markør og borsyreresiduene som er etterlatt frie til å reagere med cis-diolene av det aktuelle glykerte protein.

På lignende måte kan en mengde radioaktive forbindelser bli brukt som den signaldannende markørdel av midlene brukt ved foreliggende oppfinnelse, blant annet 125I-merkede forbindelser. Slike merkede forbindelser kan passende bli erholdt ved <125>I-merking av karbonringen av fenylborsyrene eller ved å konjugere aminofenylborsyre til 12<5>I-merkede reagenser, f.eks. det velkjente Bolton-Hunter reagens. En oversikt over slike radiomerkende teknikker er gitt av Bolton i Biochem. J. 133: 529-539 (1973). Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er relativt høye konsentrasjoner av reaktanter nødvendig, og således kan i mange utførelses former av foreliggende oppfinnelse de <1>25I-merkede konjugater bli blandet med ikke-radioaktiv borsyre eller borsyrer med identiske eller forskjellige strukturer for å erholde en radioaktivitet av forsøksreagensene ved et passende nivå.

Alternativt kan et borsyreresiduum bli konjugert til naturlige eller syntetiske forbindelser som kan danne et kjemi-luminescent signals om kan bli påvist på kjent måte (se M.J. Cormier et al, "Chemiluminescence and Biolumine-scence", Plenum Press, New York 1973). Passende kjemilumie-scente forbindelser innbefatter luciferin, oksalestere, 1,2-dioksetan, luminol eller derivater derav, men er ikke begrenset til disse. Dersom det er passende kan hydrogen-paroksyd, enzymer, f.eks. luciferase, eller andre kjemika-lier bli brukt for å danne det kjemiluminescente signal fra de anvendte signaldannende midler.

Et spesielt passende eksempel som med en merket borsyre kan bli brukt som det første signaldannende middel er konjuga-tet erholdt ved reaksjon av fluorescin-isotiocyanat med aminofenylborsyre, noe som resulterer i et konjugat med en fri karboksylsyreenhet. Andre egnede konjugater innbefatter aminofenylborsyre konjugert til kloraluminium, ftalocyanin eller fluorescin, f.eks. ved hjelp av l-etyl-3(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid (EDC), og fluorescin-isotiocyanat med blokkerte karboksylgrupper eller hvor karboksylsyre-enheten er blitt fjernet konjugert til aminofenylborsyre. Rhodamin B, konjugert f.eks. ved hjelp av et karbodiimid til en aminofenylborsyre kan også bli brukt, men dette konjugat har en relativt dårlig oppløselighet i de fleste opp-løsninger avUm interesse for forsøk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. N-(resorufin-4-karbonyl)-piperidin-4-karboksylsyre-N'hydroksysuccinimidester) (heretter forkor-tet til RESOS, et materiale som er tilgjengelig fra Boe-hringer Mannheim, Tyskland) er et signaldannende molekyl som oppfinneren har konjugert til aminof enylborsyre og som har blitt vist å oppvise utmerkede oppløselighetsegenska-per.

Borsyreresiduer,

blir ofte betegnet dihydroksyborylresiduer i sin elektrisk nøytrale form, og danner anioner ved binding av hydroksyl-ioner

og kan som sådan danne salter. Det første signaldannende middel som er brukt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte residuer med én eller flere av disse former av borsyre, avhengig av pH og elektrolyttinn-holdet av reagensblandingen. Det er i den anioniske form at borsyre binder til cis-diolresiduene av glykerte proteiner.

Bruken av høymolekylvektsignaldannende konjugater med borsyrer ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, blir helst unngått hvor det glykerte protein er hemoglobin på grunn av den begrensede tilgjengelighet av den glykerte enhet hos de fleste glykerte hemoglobiner, idet en vesentlig fraksjon av det glykerte hemoglobin i blod er glykert ved den N-terminale valinaminosyre av beta-kjeden, og som ikke lett er tilgjengelig for vannoppløselige molekyler med høy molekylvekt som beskrevet i US-A-4658022. Dette patent beskriver bruken av en meget signifikant denaturering for å eksponere det glykerte residuum til antistoff bindingsreak-sj oner.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse blir spesielt innrettet til å bestemme glykert albumin (GA). Albumin har en affinitet for et bredt område substanser, og dette har gitt støtet til forskere å beskrive den biologiske rolle til albumin som et middel for biologisk viktige ligander. Albumin har flere bindingssteder med forskjellige affiniteter for ligander, f.eks. uorganiske kationer, organiske anioner, ikke-ioniske forbindelser og spesifikke antistoff eller antistoff-fragmenter.

Mange syntetiske og eksogene anioner binder til albumin, innbefattende mange organiske fargemidler og pH-indikator-substanser. Disse har en ikke-ionisk hydrofobdel og en ionisk hydrofildel som sterkt innvirker på bindingen til albumin. Både affiniteten og antallet bindingssteder øker i rekkefølge: alkohol, karboksylat, sulfonat, sulfat.

Vanlige eksempler innbefatter fettsyrer, men bindingen av bilirubin og tryptofan er også av stor biologisk viktighet.

Ikke-ioniske substanser som er kjent for å binde til albumin innbefatter steroidhormoner, såsom testosteron og kor-tisol .

Binding av uorganisk kobber(II) til albumin er bitt beskrevet i litteraturen, og affinitetskonstanter har blitt beregnet som IO<7> mol"<1>! eller høyere. Både kobber og andre metaller er kjent for å binde til albumin, f.eks. nikkel, og danner fargede komplekser. Således kan salter av kobber og andre metaller bli brukt som de andre signaldannende midler ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fluorescente sjeldne jordmetallioner (f.eks. lantanider, spesielt Euro-pium og Terbium) , samt deres chelater er spesielt interes-sante for bruk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på grunn av sine unike fluorescente egenskaper, høye påvis-ningssensitivitet og anvendelighet ved tidsbegrenset flu-orometri. Eu-chelater blir brukt f.eks. i DELFIA-systemet til Pharmacia, Sverige. Slike chelater kan følgelig også virke som signaldannende midler for albuminforsøk.

Eksempler på anioniske forbindelser som er kjent for å binde til albumin innbefatter blant mange andre: tryptofan/tryptofanderivater (f.eks. N-acetyl-trypto fan) (assosiasjonskonstant Ka ca 2 x IO<4> mol"<1>!) tyroksin (assosiasjonskonstant Ka ca IO<6> mol"<1> 1) fettsyreanioner

detergenter, f.eks. dodecylsulfat (assosiasjonskonstant Ka ca 1,2 x IO<6> mol"<1> 1)

gallesalter

hematin (precursor for bilirubin)

sulfonamider

acetamider

salicylater og

azofargemidler.

Generelt er bindingen til albumin svakere enn den for bilirubin (en åpen-kjedet tetrapyrrol med en assosiasjonskonstant Ka på ca. IO<7> mol"<1> 1) og C16.18 f ettsyreanioner (assosiasjonskonstant Ka ca. IO<7> mol"1 1) . Dette gjelder også for organiske fargemidler, men både affiniteten og antallet fargemiddelbindende seter er avhengig av naturen til farge-midlet. Eksempler innbefatter: sulfonaftaleiner (assosiasjonskonstant Ka ca IO<6>

mol"<1>!)

tetrabromderivater (f.eks. bromkresolgrønt, bromkre-solblått, bromsulfoftalein)

naftalensulfonatforbindelser (assosiasjonskonstant Ka

sannsynligvis ca. IO<6> mol"<1> 1)

Evansblått

Trypanblått

Kongorødt

azobenzoater, samt deres derivater (assosiasjonskonstant Ka > IO<6> mol'<1> 1) og

metylrødt.

Bindingen av porfyriner til albumin er av stor biologisk viktighet. Bindingsaffiniteten er høy, men enkelte varia-sjoner observeres mellom forskjellige derivater. Således binder deuteroheme sterkere enn protoporfyrin og bindings-af f initeten avhenger av metallet i sentrum av porfyrinrin-gen.

Det syntetiske derivat tetrakarboksyfenylporfyrin (TCPP) og de tilsvarende metallporfyriner Cu-TCPP og Co-TCPP viser den følgende affinitet: Co-TCPP (assosiasjonskonstant Ka ca. IO<7> mol"<1> 1) > Cu-TCPP > TCPP og kan således også bli brukt som signaldannende midler.

Andre organiske anioner som kan bli nevnt i dette henseende innbefatter:

metylorange

dinitrofenol

fluorescente ligander, såsom

1-anilinonaftalen-8-sulfonat (ANS), naftalensul-f onat

aflatoksiner, og

acridiner (f.eks. Rivanol)

Andre fargemidler som kan bli brukt som det andre signaldannende middel, spesielt ved forsøk for albumin, innbefatter Ponceau S, Coomasie brilliant blue og bicinkoninsyre

(passende kombinert med kobber(II) i et alkalisk medium). Spesielt nevnt for bruk som det andre signaldannende middel i forsøk for glykerte blodproteiner, såsom albumin, kan også bli foretatt for bromfenolblått (absorpsjonsmaksimum 590 nm). For albuminforsøk er metallporfyrinet Cr(III)-tetrakarboksyfenylporfyrin (tilgjengelig fra Porphyrin Products, USA) også spesielt egnet, spesielt om det er tilstede i en oppløsning bufret til pH 9,0, f.eks. ved å bruke 0,25 M ammoniumacetatbuffer. Forbindelsen har absorpsjonsmaksium på 440-450 nm, signifikant absorpsjon opp til 600 nm og binder sterkt til albumin.

RESOS-aminofenylborsyre-konjugatet nevnt i eksemplene nedenfor og ftalocyaninfenoksazin og fenotiazinborsyre-konju-gatene ifølge søkers samtidige britiske og internasjonale patentsøknader nevnt ovenfor, er spesielt egnet for bruk som det første signaldannende middel, igjen spesielt i for-søk for glykert albumin.

Utskillelse av det glykerte og ikke-glykerte protein i for-søket kan bli utført på et antall måter, men for letthet av utførelsen ved oppfinnelsen vil dette fortrinnsvis være ved virkning av et utfellende eller immobiliserende middel, et middel som om ønsket også kan virke som et signaldannende middel.

Således, i henhold til en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan protein av interesse, glykert eller ikke, bli adskilt fra prøven ved hjelp av immobiliserte bindende proteiner som er spesifikke for dette, såsom antistoff eller haptoglobin, f.eks. koblet til overflater såsom filtere, membraner, kuler, geler, mikrotiterstrimler, rør eller plater, enten ved hydrofobisk interaksjon eller ved kjemisk binding, enten direkte eller ved hjelp av sekundære antistoffer. Dette er imidlertid ikke foretrukket generelt, spesielt hvor borsyrederivater blir brukt som signaldannende midler siden assosiasjonskonstantene mellom borsyre og cisdiolresiduene av karbohydratene er i området IO<3> - 10s mol"<1> 1 (se Evans et al, Anal. Biochem, 95:383 (1979) og Zittle, Advan. Enzym. 12:493 (1951)), og følgelig, siden den effektive konsentrasjonen av bindende protein er relativt lav når det er immobilisert, blir bindingen av bor-sy-ren til cisdiolgruppene også tilsvarende redusert. Høye bindingskapasiteter er følgelig nødvendig for å kompensere og disse er vanskelig å oppnå fra et teknisk synspunkt. Dette begrenser også bruken av fastfaser med lav bindingskapasitet såsom polystyrenoverflater. Fastfase-bindings-kapasiteten kan imidlertid bli øket ved bruken av geler, mikrokuler eller andre velkjente faste faser som har et stort overflateområde pr. enhetsvolum, men slike faste faser kan være mindre praktiske for rutinemessig klinisk bruk. Når de er immobilisert blir spesifikke bindingsprote-iner brukt til å skille ut proteinet som skal bli under-søkt, idet de signaldannende molekyler passende kan være merket med noe annet enn en alkalisk fotfatase-enzymmarkør.

I mer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen blir separasjonen av proteinet som blir undersøkt (og de signaldannende molekyler bundet til dette) oppnådd ved selektiv utfelling av det totale protein fra homogene oppløsninger, f.eks. ved bruk av passende utfellingsreagenser, eventuelt kombinert med et kromatografisk, sentrifugering eller fil-treringsystem.

Således kan separasjonen av proteinet som undersøkes bli utført ved hjelp av ikke-immobiliserte spesifikke bindende proteiner, såsom spesifikke monoklonale eller polyklonale antistoff, eller ethvert annet middel som feller ut eller på annen måte fjerner proteinet som blir undersøkt fra opp-løsningen. Monoklonale antistoff som er reaktive mot forskjellige epitoper eller polyklonale antistoff kan bli brukt for å danne en utfelling med proteinet. Utfelling kan også bli erholdt ved hjelp av sekundære antistoff. Foretrukket kan antistoff uten cis-diolenheter eller som mangler cis-diolinneholdende enheter eller immunoreaktive fragmenter derav bli brukt.

Imidlertid er en ulempe ved denne metode at siden assosiasjonskonstanten av de borsyreinneholdende signaldannende molekyler, og de glykosylerte residuer av glykosylerte hemoglobiner kun er i størrelsesorden IO<3> - IO5 mol"<1> 1, er relativt høye konsentrasjoner av reaktanter nødvendig, noe som resulterer i et relativt stort forbruk av antistoff pr. undersøkelse.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen blir proteinutfelling fra væskefasen oppnådd ved bruk av metalliske kationer eller organiske oppløsningsmidler. Utfellingene kan lett bli fraskilt, f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, og reagensene er billige og effektive.

For en slik utførelsesform har en spesifikk eller nære på spesifikk utfelling av hemoglobin fra oppløsning blitt oppnådd ved bruk av visse organiske oppløsningsmidler, f.eks. alkoholer såsom etanol og/eller butanol, ketoner såsom ace-ton, etere, f.eks. cykliske etere såsom dioksan og tetra-hydrofuran, amidoppløsningsmidler såsom dimetylformamid eller dietylformamid, sul f oksyloppløsningsmidler såsom dimetylsulfoksyd, hydrokarbonoppløsningsmidler såsom toluen og halogenerte hydrokarbonoppløsningsmidler såsom kloroform. Ved utfelling av en fullblodprøve, fortynnet til å gi ca. 6,5 mg hemoglobin og 1,5 mg HSA/ml, ved å tilsette 50% butanol (v/v) i etanol til endelig konsentrasjon på 9% butanol (v/v), ble 94% av hemoglobinet utfelt og kun 1% av HSA. Slik utfelling ble erholdt uten tap av borsyreresiduer bundet til cis-diolenhetene.

Spesifikk utfelling av hemoglobin kan også bli oppnådd ved å bruke metalliske kationer som binder seg til og aggrege-rer med proteiner. Passende kationer innbefatter sink, kobber og mindre foretrukket nikkel, kobolt og kadium. Dette har den viktige fordel at ethvert hemoglobin som utfelles på denne måte lett kan oppløses på nytt ved å tilsette et oppløsende kompleksdannende middel. Ved å bruke sinkioner kan en i hovedsak spesifikk utfelling av hemoglobin fra fullblodhemolysater bli erholdt, noe som er en uventet ob-servasjon. Som eksempel ved å bruke en sinkionkonsentrasjon på 2,5 - 4 mM i nærvær av 6,5 mg hemoglobin og 1,5 mg HSA/ml, blir en spesifikk eller nære på spesifikk hemoglo-binutfelling oppnådd. Imidlertid ved en konsentrasjon over 4 mM sinkioner, opptrådte i hovedsak ko-utfelling av HSA. Dette er illustrert ved resultatene angitt nedenfor:

Ionekonsentrasjonen må imidlertid bli nøyaktig justert for ikke å interferere med noen signaldannende borsyrederivater som anvendes. Om ønsket kan det utfelte protein eventuelt bli vasket eller filtrert for å fjerne overskytende kationer før omsetning med signaldannende borsyrekonjugater. Denne reaksjons sekvens er spesielt foretrukket når relativt anioniske signaldannende borsyrekonjugater blir brukt, siden direkte binding mellom overskytende sinkioner og de anioniske konjugater kan resultere i uønsket interferens. I tillegg til sink kan andre metalliske kationer bli brukt, forutsatt at de ikke utfelles på egen hånd i den bufrende oppløsning som brukes for utfellingsreaksjonen.

Grunnet muligheten for at metallionene utfelles i hydrolyse eller andre reaksjoner med andre reagenser i forsøksoppløs-ningen, er det nødvendig at det blir gjort tiltak for å sikre at metallkationene forblir oppløselige og tilgjengelige for utfellingen av hemoglobinet.

Noe av de signaldannende borsyrekonjugater beskrevet i foreliggende beskrivelse, inneholder grupper som kan donere et par elektroner til metallkat ionene og derved virke som kompleksdannende midler. Denne egenskap å danne ligand metallkomplekser kan bli brukt til å kontrollere reaksjonene, holde metall ionet i oppløsning, forhindre dannelse av komplekser mellom metallet og de borsyresignaldannende derivater, og å sikre tilgjengelighet og tilstrekkelig høye konsentrasjoner av metallionet til å gi den ønskede proteinutfelling.

Siden både ligandkonsentrasjon og stabilitetskonstanter av forskjellige metallkomplekser må bli tatt i betraktning, kan passende buffersalter bli brukt for å forhindre dannelse av uløselige metallkomplekser (heretter referert til som Me-komplekser).

Buffersalter som danner svake monodenate Me-komplekser er følgelig foretrukket og et eksempel på en slik buffer er ammoniumacetat i kombinasjon med sink som danner oppløselig Zn (Ac) og Zn(NH4) komplekser.

Ved å tilsette sterkere kompleksdannende midler, såsom mul-tidenate chelaterende ligander til bufferen, kan alle de nevnte reaksjoner bli kontrollert i forsøksoppløsning. Det kompleksdannende middel tilsettes i passende molar konsentrasjon for å erholde de nødvendige molare forhold i de forskjellige komplekser, og å balansere med additiver for å sikre at alle reaksjonene blir utført optimalt. Videre bør det kompleksdannende middel bli valgt med det spesielle metalliske kation som skal brukes i tankene, for å sikre at alle potensielt uønskede sideeffekter, såsom for sterk kom-pleksdanning av metallionet blir unngått.

Stabilitetskonstanten av chelat-Me-komplekset må være høyt nok til å konkurrere med andre mulige kompleksdannende midler i forsøksoppløsningen, f.eks. det signaldannende borsyrekonjugat, men ikke så sterkt at tilgjengeligheten av metallkationet som utfellende middel reduseres eller for-hindres .

Mange chelaterende lignader kan bli brukt, innbefattende etylen-, propylen- eller butylendiamin eller analoger derav, glycin, aspartat, nitriloacetat, histidin og pico-linat. Flere andre naturlige eller syntetiske chelatorer, såsom karbohydrater, organiske syrer med mer enn én koordi-neringsgruppe, aminosyrer, peptider, fenoler og lignende kan også bli brukt, men enkelte av disse er ikke foretrukket grunnet deres egneskap å danne komplekser med borsyre, dvs salicylater, oksalater, karbohydrater såsom sorbitol og tartrat, for å derved å konkurrere med glykert protein for bindingen til det signaldannende borsyrekonjugat.

Multidenatet chelaterende lignader, såsom EDTA (etylendia-mintetraeddiksyre) , CDTA (trans-1,2-diamincykloheksan-N,N,N',N'-tetraeddiksyre), EGTA (etylenglykol-o,o'-bis(2amino-etyl)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre) DTPA (dietylen-aminpentaeddiksyre) osv. kan også bli brukt, men kan i enkelte situasjoner være mindre foretrukket grunnet deres meget sterke kompleksdannende evne med metallioner, noe som resulterer i sterkt redusert proteinutfelling. Ammoniumacetatbuffer innholdende sinkioner og glycin er et eksempel på en foretrukket kombinasjon. Forskjellige kompleksdannende midler kan være foretrukket i forskjellige utførel-sesf ormer av foreliggende oppfinnelse. Kompleksdannende midler, såsom EDTA og DTPA blir passende brukt, men deres konsentrasjon må nøye bli justert nå de kombineres med metalliske kationer brukt for proteinutfelling. Sitronsyre og oksalsyre er mindre foretrukket, grunnet interaksjonen med borsyreresiduer. Heparin og fluoridioner er andre eksempler som kan bli brukt.

Utfellinger erholdt ved utfelling fra homogene oppløsnin-ger, såsom ved bruk av organiske oppløsningsmidler eller metalliske kationer, kan bli fullstendig eller delvis separert ved hjelp av sentrifugering eller filtrering, eller ved andre teknikker velkjent i faget.

Filtermembraner eller TLC-systemer kan også bli brukt for separasjonen av hemoglobinet, eventuelt med haptoglobiner, antistoff eller immunoreaktive fragmenter derav immobilisert på dette for å binde proteinet som blir undersøkt, såsom i en dyppepinne eller multilagsfilmutforming.

Separasjon av proteinet som blir undersøkt ved hjelp av sentrifugering fulgt av separasjon av utfellingen fra supernatanten er en av de foretrukne metoder. Alternativt kan filtrering passende bli brukt, og dette kan bli utført enten vertikalt til filteroverflaten gjennom filteret tan-gensielt, eller radielt inni filteret i en én-dimensjonal eller to-dimensjonal separasjonsmetode.

Tynnsjiktskromatografimetoder kan også bli brukt, f.eks. ved påføring av prøven til et egnet kromatografisk medium, f.eks. en forsøksstrimmel eller gel, og påføring av reagenser og vaskeoppløsninger, f.eks. direkte til påførings-stedet av prøven eller ved eluering.

I ytterligere utførelsesformer kan proteinet bli utfelt fra oppløsning direkte i eller inn i et filter eller annet fastfasekromatografisk medium, i hvilket tilfelle utfellingen kan bli avleiret på eller inn i den faste fase, et-terfølgende eller samtidig med dannelsen av utfellingen. Reagensene kan bli påført til et porøst fastfasemedium før, samtidig med eller etter utfellingstrinnet. F.eks. kan reagenser, såsom utfellende midler, de signaldannende midler, f.eks. borsyrereagens, hemolyserende midler, kompleksdannende midler eller andre reagenser i enhver foretrukket kombinasjon blir båret i eller på fastfasemediet, fortrinnsvis i tørrform. Slike reagensbærende fastfasemedier danner ytterligere aspekter av oppfinnelsen. Fastfasemedi-ene kan eventuelt bli vasket eller en elueringsmiddelopp-løsning kan bli eluert gjennom utfellingsområdet.

For å utføre et albuminforsøk i henhold til oppfinnelsen kan lignader immobilisert på et fast støttemateriale (f.eks. kuler av fornettet agarose, dextran eller polyakry-lamid) passende bli brukt. Slike immobiliserte ligander, f.eks. oktylamin, benzylamin, bromsulfoftalein-glutasjon, N-(3-karboksypropionyl)aminodekan, Cibacron blue F3GA, de-oksycholinsyre, glykocholsyre, Procion Red HE3B og N-pyro-mellitylaminodekan er tilgjengelige kommersielt. Separasjonen av albumin kan også bli utført ved å buke utfellingsmidler, såsom kaprylsyre, kaprilsalter, Rivanol (2-etoksy-6,7-diaminoacridinlactat) og basisk ekstran. Albumin og andre blodproteiner kan også bli utfelt ved å bruke forskjellige metallioner (f.eks. Hg, Cd, Cn, Zn, osv) selv om enkelte av disse kan være relativt spesifikke. Videre kan organiske oppløsningsmidler, i tilfelle med albumin lavpola-ritets-oppløsningsmidler, såsom kloroform eller alkoholer (f.eks. butanol eller høyere alkoholer) bli brukt. For utfelling av blodproteiner generelt kan midler, såsom ammoni-umsulfat, natriumsulfat og polyetylenglykol, bli brukt.

Hvor proteinet som blir undersøkt blir båret av celler i blodet, bør et lyserende middel bli brukt for å sikre en god kjemisk kontakt mellom det glykerte protein og det før-ste signaldannende middel, idet et antall reagenser og metoder er generelt kjent i faget og kan bli brukt, innbefattende hypoton hemolyse, bruken av detergenter såsom ikke-ionisk polyetylenglykolester eller polyoksyetylen-sor-bitolesterderivater, f .eks. 11 Tween"-serien og polyoksyal-kyl-fenolderivater, f.eks. "Triton"-serier, cholater, na-triumdodecylsulfater, guanidin, oppvarming, ultralydbehand-ling eller enhver kombinasjon derav.

Det første signaldannende middel kan settes i kontakt med eller blandes med eventuelt hemolysert blod, plasma eller serumsprøver eller med proteiner isolert fra slike prøver, f.eks. i en prøvebufferoppløsning, etterfølgende med eller samtidig med det valgfrie hemolysebehandlingstrinn.

Et antall prøvebuffere kan bli brukt blant disse fosfatbuf-fere og andre bufferoppløsninger som er i stand til å opp-rettholde pH av reaksjonsblandingen ved en passende pH. Det foretrukne pH-omåde av forsøket er 7,5 - 10, men den ønskede pH er avhengig av additivene, buffersaltene som brukes og pKa-verdien av det signaldannende middel, hvor dette er en reagens som lik borsyrederivatene konjugerer reversibelt med glykerte protein. Det er enkelte bevis på at buffere inneholdende amin kan virke til å styrke dihydroksyboryl-cisdiolinteraksjonen eller å senke den observerte pKa-verdi av boratet. Grunnet dette er buffere, såsom serin, glycin, Hepes (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre), ammoniumacetat, morfolin og taurin foretrukket. For ytterligere å fremme interaksjonen mellom hydroksyboryl og cis-diolresiduene kan additiver, såsom divalente kationer, detergenter og kaotropiske midler bli brukt for å redusere ladningsfrastøtninger, oppløseliggjøre målmolekylene, be-grense hydrofobiske interaksjoner og øke tilgjengeligheten av diolene i de glykerte proteiner. Imidlertid bør visse buffere som tris- og etanolaminer bli unngått, grunnet det faktum at disse bufferforbindelser kan kompleksbinde borat og blokkere dioler fra binding. Visse buffer/additivkombinasjoner, lik fosfat-sink er også ugunstige pga. den mulige dannelse av uløselige forbindelser som Zn3(P04)2. Dersom proteinet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som skal undersøkes er hemoglobin, har søker funnet at det er fordelaktig å bruke et stabiliseringsreagens, f.eks. et salt med et stabiliserende anion, ligander som er kjent for å kombinere med ferrihemoglobin, midler som modi-fiserer absorpsjonskarakteristikaene til hemoglobin (f.eks. deoksygenerende midler såsom ditionitt), redoxmediatorer

(såsom metylenblått), osv., for å stabilisere fargen av hemoglobinet. Således kan f.eks. nitratsalter bli brukt i denne forbindelse; ytterligere eller eventuelt tilleggs-eksempler innbefatter azider, cyanoferrater, cyanider, fluorider, formater, tiocyanater, acetater, EDTA, ammoni-akk, imidazol, nitrogenoksyd, picolin, hydrosulfid, ditionitt og metylenblått.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen baserer seg i foretrukne utførelsesformer på binding mellom et borsyrederivat og cisdiolenheter i GBPer - denne binding blir generelt påvirket kun i meget liten grad av temperaturvariasjoner, spesi-

elt ved romtemperatur.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter påvisning eller mengdebestemmelse av nevnte signaldannende midler (dvs. et signalavlesende trinn) og eventuelt også av det totale innhold av proteinet som skal undersøkes i både de glykerte og ikke-glykerte former.

Påvisning av de signaldannende midler, bundet til eller separert med proteinet, kan bli oppnådd ved hjelp av konven-sjonelt kjemisk utstyr som vanlig brukes for å måle en sym-matrisk aktivitet, fluorescens, radioaktiv bestråling eller optisk tetthet (absorbans), avhengig av den kjemiske natur til den signaldannende markør. Farge eller fluorescens på en fastfaseoverflate kan bli målt ved hjelp av reflektome-tri som er i generell bruk i klinisk kjemi. På en dyppepinne eller et filter eller annet praktisk fastfase kan hemoglobiner og/eller fluorescente eller farget signaldannende middel:proteinkonjugater bli undersøkt direkte på overflaten. Alternativt kan de utfelte eller immobiliserte protein og/eller det signaldannende middel:proteinkonju-gater bli gjenoppløst og målt i oppløsningen.

På lignende måte kan signaldannende konjugater med en enzymatisk aktivitet bli påvist i immobilisert eller oppløst eller gjenoppløst form ved hjelp av enzymometrisk teknologi velkjent i faget. Slik også med radioaktive konjugater som kan bli beregnet ved å bruke velkjente radiometriske metoder.

Hvor proteinet som undersøkes, lik hemoglobin, har et ut-preget absorpsjonsmaksimum i sitt UV- eller IR-spektrum, kan den totale konsentrasjon av dets glykerte og ikke-glykerte former bli bestemt ved å måle absorpsjon ved den passende bølgelengde. Dersom andre komponenter av prøven også viser noen signifikant absorpsjon ved denne bølgelengde vil slik måling selvfølgelig måtte bli utført på proteinet etter dets separasjon fra slike komponenter, f.eks. etter se-paras jon ved å bruke reagenser som effektivt ikke virker på eller immobiliserer komponenter som ville innvirke på slike absorpsjonsmålinger. Alternativt og foretrukket for proteiner som er forskjellige fra hemoglobin, kan et andre signaldannende middel bli brukt ved forsøksmetoden, idet dette andre middel er et som vil binde eller konjugere til proteinet i forsøket på både dets glykerte og ikke-glykerte former, og som danner et signal som kan adskilles fra det til det første signaldannende middel. Den signaldannende enhet kan være enhver av dem beskrevet ovenfor, f .eks. en radio-markør, en kromofor, en fluorofor eller en enzymatisk aktiv enhet. For enkelhet ved utførelse av denne forsøksmetode bør den signaldannende enhet fortrinnsvis være av samme natur som den til det første signaldannende middel, slik at signalene som indikerer totalt og glykert proteininnhold kan bli utlest ved å bruke samme type utstyr. Spesielt foretrukket er det andre signaldannende middel et som mer-ker proteinet med en kromofor med absorpsjonsmaksimum ved over 600 nm for på denne måte kan signalet bli lest ut for proteiner som er forskjellig fra hemoglobin, uten behov for å fjerne ethvert hemoglobin adskilt med proteinet som un-dersøkes. Det bør bemerkes at hvor et andre signaldannende middel blir brukt, er det ikke nødvendig at dets bindings-egenskaper bør være spesifikke for proteinet under behandling, men dersom det faktisk binder til andre blodproteiner som er tilstede i ikke-neglisjerbare mengder, relativt til proteinet under behandling, bør separasjonstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen være slik at den adskiller proteinet til behandling fra slike andre proteiner. Hvor det er ønsket at det andre signaldannende middel skal bindes spesifikt til proteinet som undersøkes, kan merkede monoklonale eller polyklonale antistoff eller antigenbindende fragmenter derav, som er spesifikke for proteinet som er under behandling, både i sine glykerte og ikke-glykerte former passende bli brukt.

Således, dersom totalt protein og glykert protein er merket med delbare kromoforer, eller slik det er tilfelle hvor hemoglobin totalt protein og første middelmerket glykert protein har spektroskopisk delbare kromoforer, kan konsentrasjonen av både glykert og ikke-glykert protein vinder behandling bli bestemt ved hjelp av absorpsjon ved den rele-vante bølgelengde i reaksjonsblandingen, før eller etter separasjonstrinnet. Dersom fluoroforer skal mengdebestemmes i nærvær av hemoglobin, er eksitasjon og emisjonsbølgeleng-der utenfor absorpsjonsbølgelengden til hemoglobin foretrukket. På lignende måte, dersom en kromofor blir brukt, er en absorpsjonsbølgelengde utenfor den til hemoglobin foretrukket, men om nødvendig kan en partiell interferens fra hemoglobin bli godtatt og korrigert for ved utregninger basert på målinger ved mer enn en bølgelengde.

I en utførelseform av foreliggende oppfinnelse blir det separerte protein isolert på mikrokuler og/eller et filter eller annen fast fase, fulgt av reflektometrisk mengdebestemmelse av det glykerte protein merket med en første mar-kør, og av det eventuelt merkede totale protein, f .eks. ved lysabsorpsjonsmålinger eller ved målinger av fluorescens.

I ytterligere utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse blir prøver eller porsjoner av blodhemolysat, plasma eller serum som er fjernet med hensyn til flere, mesteparten av eller alle andre proteiner som er reaktive mot borsyreresiduer eller salter derav brukt, f.eks. kan erytrocytter bli vasket før hemolyse for å fjerne plasmaproteiner før analyse av glykerte hemoglobiner, sentrifugering eller filtrering kan bli utført på fullblodprøver for å fjerne celler før analyse. Alternativt kan eventuelt hemolysert blod bli eksponert til en ionebytter fastfaseseparator for å fjerne alle proteiner med isoelektriske punkter under, og/eller over det til proteinet som undersøkes. Denne opp-renskning kan eventuelt være en del av apparaturen eller settet for å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse .

I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir mengden av første signaldannende middel som er bundet til proteinet som skal undersøkes i nærvær og fravær av en konkurrerende forbindelse, målt. Den konkurrerende forbindelse kan være ethvert cis-diolinneholdende molekyl, f.eks. sorbitol eller mannitol, eller borsyreinneholdende molekyler uten signaldannende aktivitet.

I en annen spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir mengden av det første signaldannende middel, som er tilstede enten i reaksjonsblåndingen og/eller den adskilte fraksjon før og etter separasjonen av proteinet som skal undersøkes, målt, noe som gjør det mulig å regne ut fraksjonen av det signaldannende middel, fjernet ved binding til dette protein.

Siden foreliggende oppfinnelse kan være avhengig av en relativt liten bindingsstyrke (se assosiasjonskonstanten på IO<3> - IO<5> mol"<1> 1 mellom cis-diolenheter og borsyreresiduer) behøver en direkte støkiometrisk binding mellom glykert protein og slike signaldannende borsyrederivater ikke finne sted.

I liten grad kan frie karbohydrater i blod konkurrere med borsyrederivater. Disse effekter blir minsket ved bruk av et overskudd av de signaldannende borsyrederivater. Et tyve gangers molart overskudd (i forhold til proteinene som kan konjugeres med borsyrederivatet) er passende, men høyere og lavere forhold kan også bli brukt, avhengig av hvilken ut-førelsesform av foreliggende oppfinnelse som blir brukt. Selvfølgelig vil det være et bakgrunns signal avhengig av effektiviteten av de anvendte separasjonsteknikker. Dersom et meget effektivt separasjonssystem blir brukt, kan et høyere overskudd bli brukt. Dersom meget høye reaktantkon-sentrasjoner ikke kan bli brukt, bør konsentrasjonen av glykert protein bli regnet ut under referanse til målinger foretatt på standardblandinger med kjente konsentrasjoner av glykert protein. Bruken av slike standarder er meget vanlig i klinisk laboratoriemedisin.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en reagensblan-ding eller et sett for å utføre den ønskede fremgangsmåte, hvilken reagens omfatter: et første signaldannende middel som er i stand til å merke et glykert blodprotein; et adskillende middel som er i stand til å utfelle eller immobilisere nevnte protein i sine glykerte og ikke-glykerte former; eventuelt et andre signaldannende middel som er i stand til å merke nevnte protein i sine glykerte og ikke-glykerte former og eventuelt buffer og/eller stabilisator og/eller lyseringsreagenser, hvorav minst én av nevnte før-ste middel og nevnte adskillende middel i hovedsak er spesifikk for nevnte protein.

Sett fra et annet aspekt fremskaffer oppfinnelsen også anordninger for å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, hvilke anordninger omfatter: innretninger for å trekke ut en blodprøve; innretninger for å sette nevnte blodprøve i kontakt med de følgende midler -

(i) eventuelt et hemolyserende middel,

(ii) et første signaldannende middel (som tidligere definert og angitt i krav 1), (iii) et separerende middel i flytende fase som er i stand til å felle ut et blodprotein i sine glykerte og ikke-glykerte former, (iv) eventuelt et andre signaldannende middel (som ovenfor definert og angitt i krav 1), (v) eventuelt en stabilisator (som ovenfor definert og angitt i krav 1),

(vi) eventuelt en buffer,

enkeltvis eller i én eller fler kombinasjoner derav, samt innretninger, såsom spektrometerinnretninger, for å påvise de signaldannende midler bundet til blodproteiner adskilt av nevnte adskillende middel, og eventuelt eksempelvis for spektrometrisk å påvise én eller fler blodproteiner (f.eks. hemoglobin), adskilt med nevnte adskillende middel, men i hovedsak ubundet av nevnte signaldannende midler. Spesielt

foretrukket omfatter apparaturen en blodoppsamlende innretning, anordninger for å passere en blodprøve til et reaksjonskammer inneholdende en fast fase anbragt for å motta adskilt protein, anordninger for å innføre reagenser i nevnte kammer og et spektrometer anbragt for å påvise foto-nemmisjon fra, eller absorpsjon av, proteiner separert på nevnte faste fase ved minst én og fortrinnsvis ved minst to på forhånd bestemte bølgelengder.

I et ytterligere aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å bestemme et glykert blodprotein (som er forskjellig hemoglobin) i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene: -

a) eventuelt å hemolysere nevnte prøve for å frigjøre cellebundne glykerte proteiner; b) adskille nevnte glykerte proteiner fra nevnte prøve, f.eks. ved å sette det glykerte protein i kontakt med

et immobilisert borsyrederivat eller et antistoff som

er spesifikt for det glykerte protein;

c) før, under eller etter trinn b) , å sette nevnte glykerte protein i kontakt med et signaldannende middel

som er i stand til å binde seg til dette; og

d) påvise det signaldannende middel bundet til nevnte adskilte glykerte protein.

I denne fremgangsmåte kan det signaldannende middel være spesifikt for det glykerte protein som skal undersøkes, f.eks. et merket antistoff, men dersom det ikke er spesifikt bør det heller ikke være slik at det binder seg og ut-feller de ikke-glykerte former av proteinet som skal under-søkes .

De følgende eksempler og preparater er fremskaffet kun som ikke-begrensende illustrasjon av oppfinnelsen:U

EKSEMPLER

PREPARATER

Fremstillingseksempel 1

1. N-(RESORDFIN-4-KARBONYL)-PIPERIDIN-4-KARBOKSYLSYRE-KONJUGAT MED M-AMINOFENYL-BORSYRE

Oppløsning A: 2 mg RESOS (N-RESORUFIN-4-KARBONYL)-PIPERIDIN-4-KARBOKSYLSYRE-N'-HYDROKSYSUCCINIMIDESTER) ble oppløst i 0,5 ml dimetylsulfoksyd.

Oppløsning B: Hemisulfatsaltet av m-aminofenylborsyre ble oppløst ved 15 mg/ml i 0,1 M natri-umkarbonatbuffer, pH 8,0. pH ble justert til 8,0.

0,5 ml oppløsning A ble tilsatt til 2 ml oppløsning B. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 12 timer. Opp-renskning ble utført med HPLC.

Fremstillingseksempel 2

2. FLUORESCEN ISOTIOCYANAT (FITC) KONJUGAT MED AMINOFENYLBORSYRE

Oppløsning A: 3,9 mg FITC ble oppløst i 1 ml dimetylsulfoksyd.

Oppløsning B: Hemisulfatsaltet av m-aminofenyl borsyre ble oppløst ved 1,86 mg/ml i 0,2 M karbonatbuffer, pH 9,5.

1 ml oppløsning A ble tilsatt sakte til 10 ml oppløsning B med konstant omrøring. Blandingen ble tillatt å reagere i minimum 2 timer ved romtemperatur, og FITC-aminofenylbor-

syrekonjugatet ble renset med HPLC.

Fremstillingseksempel 3

3. IOD-125-MERKET BORSYREKONJUGAT

A: Aminof enylborsyre (APBA) 10 mg/ml i 50 mM Na-fosfat,

pH 7,5 ble omsatt med Bolton-Hunter (BH) reagens 14,2 mg/ml i DMSO. BH ble sakte tilsatt til APBA opp til en lik volumdel. Oppløsningen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur.

B: Reaksjonsproduktet ble adskilt på en revers faseko-lonne med en gradient av metanol i vann med 0,1% tri-fluoreddiksyre (TFA).

C: Det isolerte BH-APBA-reaksjonsprodukt ble merket med <125>I-NaI med kloramin-T-metoden.

0,5 ml av BH-APBA-fraksjonen ble tilsatt til 0,1 ml 0,25 M Na-fosfat pH 7,5 og pH ble justert til 7,5. 10 ul <125>I-NaI, 100 uCi ble tilsatt i tillegg til ferskt fremstilt 0,3 ml kloramin-T (10 mg/ml) i 0,25 M Nafos-fat pH 7,5, og blandingen ble inkubert i 1 minutt. D. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,3 ml Na-bisulfitt (24 mg/ml) i 0,25 M Na-fosfat pH 7,5.

E. Merket BH-APBA ble isolert med revers fasekromatografi

med metanolgradient i vann med 0,1% TFA.

Fremstillingseksempel 4

4. BORSYREKONJUGAT MED AL KAL INS K FOSFATASE

10 mg alkalisk fosfatase, fjernet med hensyn til borsyrereaktive enzymmolekyler ved å passere den gjennom en kolonne av agarose med immobiliserte fenylborsyreresiduer, blandes med 30 ganger molart overskudd av bis-(sulfosuc-cinimidyl) suberat i karbonatbuffer pH = 8,5 og etterlates for å reagere i 120 min ved romtemperatur, fulgt av tilsetning av 100 ganger molart overskudd av monoetanolamin. 4 timer etter renses enzymkonjugatene med gelkromatografi.

EKSEMPLER SOM VISER NÆR SPESIFIKK UTFELLING AV HEMOGLOBIN FRA FULLBLODHEMOLYSATER

Metallkationer:

Oppløsning A: Fullblodhemolysat fortynnet i 50 mM am moniumacetat pH 8,0 til endelig konsentrasjon på 6,4 mg hemoglobin/ml

Oppløsning B: Cu(S04) oppløst i vann til en konsentrasjon på 10 mM Cu<2+>

Oppløsning C: Zn (Cl) 2 oppløst i vann til en konsentrasjon på 10 mM Zn<2+>.

Fremstillingseksempel 5

40 ul oppløsning B ble tilsatt til 200 ul oppløsning A. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 5 min og hemo-globinutfellingen ble adskilt ved sentrifugering.

Eksempler eller ytterligere reagenser for bruk ved frem-gangsmåtene ifølge oppfinnelsen.

Fremstillingseksempel 6

40 ul oppløsning C ble tilsatt til 200 ul oppløsning A. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 5 min og hemo-globinutfellingen ble adskilt ved sentrifugering.

EKSEMPLER PA YTTERLIGERE REAGENSER FOR BRUK VED FREMGANGSMÅTEN IFØLGE OPPFINNELSEN

Reagenseksempel 1

Fenoksazintborsyrekonjugat for bruk som et første signaldannende middel

Syntesen av dette middel som har et absorpsjonsmaksimum over 600 nm er beskrevet i søkers samtidige britiske pa-tentsøknad.

Reagenseksempel 2

Cr( III) - tetrakarboksyfenylporfyrin

Dette som er et andre signaldannende middel for albuminpåvisning er tilgjengelig fra Porphyrin Products, USA, og blir formulert i vandig oppløsning bufret til pH 9 med 0,25 M ammoniumacetat.

Reagenseksempel 3

Bromfenolblått

Dette er generelt tilgjengelig kommersielt og blir formulert for bruk som et andre signaldannende middel for albuminpåvisning bufret til pH 7,5 med 50 mM natriumfosfat.

Reagenseksempel 4

Utfellingsmiddel for albuminpåvisning

5% (w/v) Rivanol i assaybuffer (0,25 M ammoniumacetat, 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). (Dette kan utgjøre omkring 5-20%

(v/v) av en total forsøksreagensblanding omfattende assay-

buffer med signaldannende midler oppløst deri.) Bufring kan også være til pH 9,0.

Reagenseksempel 5

Albuminimmobilisator

Polystyren latexpartikler med en gjennomsnittlig størrelse i området fra 0,05 - 1 um benyttes for fremstilling av antistoff-latexkonjugater. Til 2 ml av latexsuspensjonen i 0,15 M NaCl (50 mg/ml) tilsettes 2,6 mg e-aminokapronsyre og 5 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-HCl

(EDC). Reaksjonen tillates å fortsette i 3 timer ved 4°C og oppløsningen dialyseres derpå over natten i 0,15 M NaCl, og de aktiverte partikler samles opp ved sentrifugering. 20 mg antistoff fjernes for borsyrereaktive seter, og 5 mg EDC i 25 ml 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, tilsettes til de utfelte partikler. Reaksjonsblåndingen blir så rotert i 12 timer og uomsatte aktive seter blokkert med passende reagenser. Endelig vaskes partiklene og samles opp ved sentrifugering .

Reagenseksempel 6

Albuminimmobilisator

Filtermaterialer aktivert med vanlige metoder, innbefattende cyanogenbromid, karbodiimider, N-hydroksysuccinimi-der, bisoksiraner og hydraziner, alle velkjent i faget, brukes som faste støttematerialer for immobilisering av et anti-albumin antistoff, på forhånd fjernet for borsyrereaktive seter. Denne aktiverte membran monteres i en passende filterholder og 100 ul antistoff-oppløsning med 2-300 ug protein pr. ml immobiliseringsbuf f er, 50 mM natriumfos-fatbufret saltvann, pH 7,3, blir så passert gjennom filteret ved en kontrollert strømningsgrad. Blokkering av gjenværende aktiverte seter på filteret utføres ved å plas-sere blokkeringsoppløsninger, såsom 0,5 M Tris buffer, pH 8,5, eller 1 M etanolamin, pH 9,5, gjennom filtermembranen.

Reagenseksempel 7

Albuminimmobilisator

Epoksyaktiverte filtermaterialer dannet ved reaksjon med bis-oksirane, 1,4-bis- (2,3-epoksypropoksy)butan blir brukt som et fast støttemateriale, fremstilt umiddelbart før bruk i henhold til metoder som er velkjent i faget. Filteret neddykkes i en oppløsning av benzylamin i 50 mM natrium-fosf atbuf fer, pH 7,5, og inkuberes 12 timer ved 40°C under konstant omrøring. Konsentrasjonen av benzylamin kan varie-res, men 50 mM har blitt funnet å være passende for immobilisering og blokkering av de aktive grupper på de fleste filtre.

Reagenseksempel 8

Albuminimmobilisator

Epoksyaktiverte filtermaterialer dannet ved reaksjon med bis-oksiran, 1,4-bis-(2,3-epoksypropoksy)butan fremstilles. Dinatriumsaltet av iminodieddiksyre oppløses i 2 M natrium-karbonatoppløsning til en endelig konsentrasjon på 0,2 mg chelat pr. ml buffer, og tilsettes derpå til det preakti-verte filtermateriale. Reaksjonen utføres ved 65°C i 24 timer og filtrene blir derpå vasket med et overskudd av destillert vann. For å fremstille det "aktive" metallchelat, neddykkes filteret i en metallsaltoppløsning inneholdende 1 mg/ml sinkklorid eller kobbersulfat, avhengig av det på-tenkte assayprotein. Endelig vaskes filteret i overskudd av destillert vann for å fjerne frie, uchelaterte metallioner.

Reagenseksempel 9

Borsyrefilter for separasjon av glykerte proteiner

Separasjon av glykerte proteiner fra en forsøksprøve kan bli oppnådd ved å bruke en separasjonsanordning innbefattende et filter modifisert med aminofenyl-borsyre eller eventuelt en annen borsyreinneholdende enhet, hvor det borsyre inneholdende residuum er kovalent bundet til filteroverflaten, og eksponerer borsyregruppen til forsøksprøven som passerer gjennom. Filteret som benyttes for foreliggende anvendelse er preaktivert for binding i hovedsak til aminogrupper (Immunodyne (PALL), Immobilon (Millipore)). Aminofenylborsyre oppløses i en 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 7,5-8, i hvilken membranen neddykkes. Ikke-omsatte grup-pr. på filteret blokkeres med tilsetning av en 10% mono-etanolaminoppløsning ved pH 9. Alternativt kan filteret bli blokkert med en oppløsning av kasein, hvor glykert protein er fjernet ved passasje gjennom en kolonne inneholdende en boraffinitetsgel (Glyco-Gel B, Pierce). Dette gir et filter som har en lav ikke-spesifikk proteinbinding. Separasjon utføres ved basisk pH (pH 8-9) i en buffer som er egnet for å binde borsyren til den glykerte del av proteinene. Anordningen for separasjon består av aktivt filter i kontakt med en absorberende pute, som trekker forsøksprøven gjennom det aktive filter og fjerner alt bortsett fra de glykerte proteiner fra filteret.

Reagenseksempel 10

Dannelse av antistoff som er reaktive overfor de glykerte segementer av albumin

Ved å bruke et glykert albumin-antigen i henhold til fremgangsmåte til Cohen et al, J. Immunol. Meth. 117: 121-129

(1989), blir monoklonale antistoff som er reaktive mot glykert albumin erholdt. For mer spesifikk immunisering er segmentet som brukes for immunisering glykose-Lys525-Gln-Thr-Ala-Leu529, som er det mest omfattende glykerte residuum i glykert albumin.

Reagenseksempel 11

Immobiliseringsmiddel ( antistoff) som er spesifikt for glykert albumin

Separasjon av glykert albumin fra en forsøksprøve kan bli oppnådd med en separasjonsinnretning innbefattende et filter modifisert med antistoff eller antistoff-fragmenter som reagerer spesifikt med hovedsetet for glykering av albumin når dette setet er glykert (se reagenseksempel 10). Filteret som brukes for denne anvendelse er preaktivert for binding primært til aminogrupper (immunodyne (PALL), Immobilon (Millipore)) . Antistoffet eller antistoff-fragmentet opplø-ses i en 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 7,5-8, i hvilken

membranen blir neddykket. Ikke-omsatte grupper på filteret

blokkeres ved tilsetning av en 10% monoetanolaminoppløsning ved pH 9. Alternativt kan filteret bli blokkert med en opp-løsning av kasein, hvor glykert protein er fjernet ved passasje gjennom en kolonne inneholdende en boronat affini-tetsgel (Glyco-Gel B, Pierce). Dette gir et filter som har en lav ikke-spesifikk proteinbinding. Den reaktive del av antistoffet eksponeres til prøven som passerer gjennom, for således å immobilisere det glykerte albumin.

Reagenseksempel 12

Monoklonale antistoff som er reaktive mot glykert albumin konjugert med et aktivert fenoksazin med et absorpsjonsmaksium på omkring 645 nm

10 mg monoklonalt antistoff erholdt i henhold til reagenseksempel 10 oppløses i 1 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 8,5. Til denne oppløsning blir et 10 molart overskudd av

NHS = N-hydroksysuccinimid-estergruppering

(syntetisert som beskrevet i søkers samtidige britiske pa-tentsøknad) tilsatt, og blandingen roteres i 1 time ved romtemperatur, og dialyseres til slutt mot en passende buffer.

Reagenseksempel 13

Utfellingsmidler for alle serumproteiner, glykerte eller ikke (A) Trikloreddiksyre (TCA) 0,76 M fremstilles ved å opp-løse 125 g TCA i 500 ml vann og fortynnet til 1 1 volumetrisk.

Proteinutfelling kan bli fremskaffet ved grundig å blande 1 ml av en blodprøve med en total proteinkonsentrasjon på 5-10 mg/ml med 0,25 ml av TCA-reagenset. Denne blanding tillates stå i 10 min og utfellingen adskilles.

(B) For prøver med total proteinkonsentrasjon på omkring 0,5 mg/ml blir et ytterligere utfellingsmiddel fremstilt

ved å oppløse 15,0 g av sulfosalicylsyre (x 2H20) og 35,0 g natriumsulfat (vandig) i vann, og fortynne volumetrisk til et endelig volum på 500 ml.

Til en 0,5 ml prøve, tilsettes 2 ml av salicylsyrereagen-set, blandes godt og tillates å stå i 10 min hvorpå utfellingen adskilles.

Reagenseksempel 14

Immobiliseringsmiddel for komplement C3 ( glykert og ikke-glykert )

Kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoff som er reaktive mot human komplement C3 (tilgjengelig fra flere kommersielle kilder) immobiliseres som beskrevet i reagenseksempel 6 og 11.

Reagenseksempel 15

Immobiliseringsmiddel for karbonisk anhydrase ( glykert og ikke- glykert

Kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoff som er reaktive mot human karbonisk anhydrase (tilgjengelig fra flere kommersielle kilder) immobiliseres som beskrevet i reagenseksempel 6 og 11.

Reagenseksempel 16

Ftalocyanin: borsyrekonjugat for bruk som et første signaldannende middel

Til en suspensjon av kloraluminium-ftalocyanin-tetrasulfo-nat (60 mg, 6,7 x 10"S mol) i 2 ml benzen, ble det sakte tilsatt dråpevis og under konstant omrøring et 10-ganger molart overskudd av oksalylklorid, og oppløsningen omrøres ved 25°C under fjerning av fuktighet. Etter 12 timer ved denne temperatur inndampes oppløsningsmidlet under redusert trykk, og ved fjerning av fuktighet. Umiddelbart deretter ble 3-aminofenylborsyremonohydrat (20 mg, 1,35 x 10~<4> mol)

i 1,5 ml 0,25 M natriumkarbonat/natriumbikarbonatbuf f er (pH 9,0) tilsatt til resulterende sylfonylklorid og oppløsnin-gen ble omrørt ved romtemperatur i 3 - 12 timer. Borsyre-konjugatene ble isolert med revers fasekromatografi, i hovedsak i form av monofenyl borsyre funksjonalisert fargestoff .

EKSEMPLER PA UTFØRELSE AV FREMGANGSMÅTEN

Eksempel 1

Glykert hemoglobin i fullblod ved å bruke et fargestoff og oppløsningsmiddelutfelling

En prøve av fullblod ble hemolysert og fortynnet i en hemolyserende prøvebuffer, 100 mM Hepes med 0,05% Triton X-100, pH 9,0, til omkring 8 mg hemoglobi/ml. En blanding av 50%

(v/v) butanol i etanol og fenoksazinaminofenyl-borsyrekon-

jugat beskrevet ovenfor i reagenseksempel 1, tilsettes for å gi en endelig butanolkonsentrasjon på 9% (v/v) , og en konjugatkonsentrasjon på 1,6 x IO"<4> M. En utfelling dannes, og utfellingen separeres fra supernatanten ved sentrifugering. Utfellingen oppløses på nytt i 0,05 M saltsyre med 5% dimetylsulfoksyd og konsentrasjonen av hemoglobin og av det hemoglobinbundne borsyrefenokazinkonjugat måles med absorp-sjons spekt r oskop i . Konsentrasjonene blir regnet ut ved interpolering på kalibreringskurver erholdt ved brukt av standard oppløsninger med kjente konsentrasjoner av hemoglobin og glykert hemoglobin, og prosentdelen av glykert hemoglobin til totalt hemoglobin regnes ut.

Eksempel 2

Glykert albumin i fullblod ved å bruke to fargemidler og rivanolutfelling ( I) 10 ul av fullblod blandes med 150 ul hemolyserende assaybuffer, omfattende 0,25 M ammoniumacetat, 0,05% Triton X-100, pH 9,0, men som i tillegg omfatter 100 nmol av forbindelsen fra reagenseksempel 1 og 20 nmol Cr(III)-tetrakarboksyfenylporfyrin. 18 ul av 5% (w/v) oppløsning av Rivanol (2-etoksy-6,9- dia-minoakridinlaktat) i assaybuffer tilsettes. Utfellingen av albumin adskilles ved filtrering, vaskes én gang og reflektansen måles ved 645 og 450 nm ved hjelp av en Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000. Forholdet mellom reflektansene ved 645 og 450 nm måles.

Forsøket kalibreres ved bruk av standard blodprøver inneholdende kjente fraksjoner av glykert albumin, mengdebe-stemt med klassisk kolorimetri eller ved affinitetskromatografi eller ionebytterkromatografi.

Eksempel 3

Glykert albumin i fullblod ved å bruke to f argemidler og rivanolutfelling ( II)

Fremgangsmåten fra eksempel 2 gjentas ved å erstatte forbindelsen fra reagenseksempel 16 med den fra høy reagenseksempel 1 og ved å avlese reflektans ved 685 nm i stedet for 545.

Eksempel 4

Mengdebestemmelse av glykert albumin ved å bruke immobiliserte antistoff og bromfenolblått

En filtreringsenhet med immobiliserte monoklonale antistoff som er spesifikt uavhengige med glykert albumin blir benyt-tet (se reagenseksempel 11). 10 ul fullblod blandes med 500 ul 130 mM NaCl, 20 mM natri-umf osf atbuf fer, pH 7,5, omfattende 0,05% Triton X-100 som et hemolyserende middel og 50 mM bromfenolblått. En del av denne blandingen hvor volumet avhenger av bindingskapasi-teten til filterenheten settes i kontakt med filterenheten. Reflektansen ved 590 nm måles ved å bruke et reflektometer som i eksempel 2, hvor intensiteten er avhengig av mengden av albumin omsatt med de immobiliserte antistoff.

Delen av glykert albumin bestemmes under referanse til en måling av blodalbumin erholdt uavhengig med konvensjonelle teknikker.

Eksempel 5

Mengdebestemmelse av glykerte serumproteiner

5 ul serum (inneholdende ca 4,0 mg protein) blandes med 0,75 ml av sulfonsalicylsyren/natriumsulfatoppløsningen fra reagenseksempel 13B. Etter blanding og 10 minutters inkube-ring blir utfellingen fanget opp ved passasje gjennom et filter. Derpå blir 2 ml av en buffer, 0,25 M ammoniumacetat, pH 9,0, med 0,05% Triton X-100 og 100 nm av forbindelsen fra fremstillingseksempel 3 passert gjennom filteret. Derpå blir reflektansen ved 575 nm målt med en Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000. Reflektansin-tensiteten er en funksjon av konsentrasjonen av de glykerte proteiner i forsøksprøven.

Eksempel 6

Mengdebestemmelse av glykert komplement faktor C3 ( I)

10 ul fullblod blandes med 150 ul hemolyserende prøvebuf-fer, omfattende 0,25 M ammoniumacetat, 0,25% Triton X-100, pH 9,0, og i tillegg omfattende 100 nmol av forbindelsen fra reagenseksempel 1.

En porsjon av blandingen overføres til et filter i henhold til reagenseksempel 14. (Volumet av porsjonen må bli justert slik at den totale bindingskapasitet for filteret ikke blir oversteget.) Filteret vaskes én gang og reflektansen måles ved 645 nm med en Shimadzu Dual Wavselength Flying Spot Scanner CS 9000. Reflektanssignalet er avhengig av konsentrasjonen av glykert komplement C3.

Eksempel 7

Mengdebestemmelse av glykert komplement faktor C3 ( II)

Fremgangsmåten fra eksempel 6 blir gjentatt ved å erstatte forbindelsen fra reagenseksempel 16 med den fra reagenseksempel 1, og avlese reflektansen ved 685 nm i stedet for 645 nm.

Eksempel 8

Mengdebestemmelse av glykert karbonisk anhydrase

10 ul fullblod blandes med 150 ul hemolyserende prøvebuf-fer, omfattende 0,25 M ammoniumacetat, 0,05% Triton X-100, pH 8,0, og i tillegg omfattende 100 nmol av forbindelsen fra reagenseksempel 1.

En porsjon av blandingen overføres til et filter i henhold til reagenseksempel 15. (Volumet av porsjonen må bli justert slik at den totale bindingskapasitet til filteret ikke blir oversteget.) Filteret blir vasket én gang, og reflektansen måles ved 645 nm med en Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000. Reflektanssignalet er avhengig av blodkonsentrasjonen av glykert karbonisk anhydrase.

Eksempel 9

Analyse av glykert albumin ved å bruke et fullstendig albumin- bindende filter ( benzylaminfilter) og borsyrefargestoff

( I)

10 ul fullblod blandes med 150 ul hemolyserende prøvebuffer omfattende 0,25 M ammoniumacetat, 0,05% Triton X-100, pH 9,0, og som også inneholder 100 nmol av forbindelsen fra reagenseksempel 2 (noe som gjør vasking av hemoglobin fra filteret unødvendig). En porsjon av den resulterende blanding passeres gjennom filteret fra reagenseksempel 7. Re-fleksjonen av filteret måles ved 645 nm ved hjelp av en Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000.

Eksempel 10

Analyse av glykert albumin ved å bruke et fullstendig albu-minbindende filter ( benzylaminfilter) og borsyrefargestoff

( II)

Fremgangsmåten fra eksempel 9 gjentas ved å erstatte forbindelsen fra reagenseksempel 16 med den fra reagenseksempel 2, og avlese reflektansen ved 685 nm i stedet for 645 nm. Forbindelsene fra reagenseksemplene 2 og 3 kan eventuelt bli inkludert som et andre signaldannende middel.

Eksempel 11

Glykert hemoglobin i fullblod ved å bruke et fargestoff; filterformat

En prøve av fullblod ble blandet med en hemolyserende reak-sjonsbuffer inneholdende 160 mM piperazin, pH 9,4, 0,07% Triton X-100, 9,4% etanol (v/v), 9,4% butanol (v/v) og forbindelsen fra reagenseksempel 16 i en konsentrasjon på 2,1 x IO"<5> M. Den endelige hemoglobinkonsentrasjon var ca 2 mg/ml. Fullblodet ble hemolyzert, og en utfelling dannet. Det utfelte hemoglobin ble adskilt ved filtrering. Reflektansen ble målt ved 685 og 470 nm ved hjelp av en Shimadzu Dual Wavelength Flying Spot Scanner CS 9000. Forholdet mellom reflektansene ved 685 og 470 nm ble regnet ut.

Konsentrasjonene ble regnet ut ved interpolering på kalibreringskurver erholdt ved å bruke standard oppløsninger med kjente konsentrasjoner av hemoglobin og glykert hemoglobin, og prosentdelen av glykert hemoglobin til total hemoglobin ble regnet ut.

For alle reagenser som skal brukes ved mengdebestemmelse av glykerte humane proteiner, er det fordelaktig om reagensene av biologisk opprinnelse passeres gjennom en kolonne inneholdende en gel med immobiliserte borsyreenheter, eventuelt behandlet med periodat eller endoglykosidase; og på denne måte blir de analytiske reagenser renset for enheter som reagerer med borsyregrupper.

Som et alternativ kan de signaldannende enheter bestå av radioisotoper, f.eks. jod-125, fluorescente, kjemiluminescente eller bioluminescente enheter.

Claims

1. Fremgangsmåte ved påvisning av glykert blodprotein i en prøve, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene; a) eventuelt å hemolysere nevnte prøve for å frigjøre cellebundet glykert protein; b) adskille nevnte glykerte blodprotein og det tilsvarende ikke-glykerte blodprotein fra nevnte prøve ved å bruke et væskefase utfellingsreagens; c) kontakte nevnte prøve før eller under separasjon av nevnte glykerte og ikke-glykerte proteiner fra denne, eller kontakte nevnte separerte proteiner med et første signaldannende middel, som er i stand til å binde til nevnte glykerte protein med vesentlig høyere bindingsaffinitet enn for det tilsvarende ikke-glykerte protein; d) eventuelt kontakte nevnte prøve før eller under separasjonen av nevnte glykerte og ikke-glykerte proteiner fra denne, eller kontakte nevnte separerte proteiner med et andre signaldannende middel, som er i stand til å binde til nevnte glykerte protein og til nevnte tilsvarende ikkegly-kerte protein; og e) påvise det signaldannende middel som har bundet til nevnte separerte proteiner og/eller som ikke har bundet til nevnte glykerte proteiner eller nevnte tilsvarende ikkegly-kerte proteiner; med det forbehold at hvor nevnte glykerte protein omfatter glykert hemoglobin og nevnte første signaldannende middel er en kromofor-merket borsyre eller salt derav med et absorpsjonsmaksimum ved over 600 nm.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinn (c) blir utført ved å bruke to forskjellige signaldannende midler, hvert i hovedsak spesifikt for et forskjellig glykert blodprotein, og eventuelt hvor trinn (d) blir utført ved å bruke to forskjellige andre signaldannende midler som i hovedsak er spesifikke for de samme to forskjellige blodproteiner.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte første eller andre signaldannende middel er merket med kromoforer med et absorpsjonsmaksium over 600 nm.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at trinnene (b) og (c), og eventuelt (d) blir utført samtidig.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at nevnte første signaldannende middel omfatter et konjugat av én eller flere dihydroksyborylresiduer, eller salter derav, bundet til en signaldannende markør.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at nevnte separasjons-trinn (b) utføres ved å bruke et utfellende middel som i hovedsak er spesifikt for proteinet som blir undersøkt.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at nevnte separasjons-trinn (b) utføres ved hjelp av selektiv utfelling fra en homogen oppløsning.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at utfellingen utføres ved tilsetning av metalliske kationer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at utfellingen blir ut-ført ved tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel eller en blanding av organiske oppløsningsmidler, i en konsentrasjon som i hovedsak er i stand til spesifikt å utfelle proteinet som blir undersøkt.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at utfelling blir oppnådd ved å tilsette bindende proteiner som er spesifikke for proteinet som blir undersøkt.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 - 10, karakterisert ved at utfellingstrinnet finner sted på eller inne i en fast fase.

12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6-10, karakterisert ved at utfellingen således dannet, blir fraskilt ved hjelp av et kromatografi eller filtreringsmedium eller ved sentrifugering.

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at separasjonstrinnet (b) ikke er spesifikt for proteinet som blir undersøkt.

14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 13, karakterisert ved at det andre signaldannende middel binder i hovedsak spesifikt til nevnte glykerte og tilsvarende ikke-glykerte protein.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 12, karakterisert ved at det andre signaldannende middel binder ikke-spesifikt til blodproteiner.

16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 15, karakterisert ved at det bestemmes glykert albumin og/eller glykert komplement C3.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at det påvises glykert albumin, hvor det andre signaldannende middel er valgt fra metallsalter, metalchelater, anioniske fargemidler, pofyri-ner og syntetiske derivater derav, ponceau S, coomassie brilliant blue, bicinkoninsyre og bromfenolblått.

18. Analytisk forsøkssett til utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter: et før-ste signaldannende middel som er i stand til å merke et glykert blodprotein; et adskillende middel i flytende fase som er i stand til å utfelle nevnte protein i sine glykerte og ikke-glykerte former; eventuelt et andre signaldannende middel som er i stand til å merke nevnte protein i sine glykerte og ikke-glykerte former; og eventuelt buffer og/eller stabilisator og/eller lyserende reagenser, hvor minst ett av nevnte første middel å nevnte adskillende middel i hovedsak er spesifikke for nevnte protein.

19. Anordning for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at anordningen omfatter: innretninger for å trekke ut en blodprøve; innretninger for å sette nevnte blodprøve i kontakt med følgende midler - (i) eventuelt et hemolyserende middel, (ii) et første signaldannende middel (som angitt i krav 1), (iii) et separerende middel i flytende fase som er i stand til å felle ut et blodprotein i sine glykerte og ikke-glykerte former, (iv) eventuelt et andre signaldannende middel som definert i krav 1, (v) eventuelt en stabilisator, (vi) eventuelt en buffer, individuelt eller i én eller flere kombinasjoner derav, samt innretninger for å påvise de signaldannende midler bundet til blodproteiner, adskilt av nevnte adskillende middel, og eventuelt for å påvise ett eller flere blodproteiner adskilt med nevnte adskillende middel, men som i hovedsak er ubundet av nevnte signaldannende midler.

20. Anordning ifølge krav 19, karakterisert ved at den omfatter en blod oppsamlende innretning, innretninger for å passere en blod-prøve inn i et reaksjonskammer inneholdende en fast fase anbragt for å motta separert protein, innretninger for å innføre reagenser i nevnte kammer og et spektrometer anbragt for å påvise fotonemisjon fra eller absorpsjon av proteiner adskilt på nevnte faste fase ved i det minste én og fortrinnsvis ved i det minste to på forhånd valgte bøl-gelengder .