ES2902649T3 - Composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada y procedimiento para medir hemoglobina glucosilada utilizando la misma - Google Patents
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Abstract
Composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada, comprendiendo la composición: 1 un líquido hemolítico y 2 un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada y procedimiento para medir hemoglobina glucosilada utilizando la misma
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada con el fin de diagnosticar la presencia o ausencia de diabetes y a un procedimiento para medir hemoglobina glucosilada utilizando la misma y, más en particular, a una composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada, comprendiendo la composición un ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno, y a un procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada utilizando la misma.
Antecedentes
La diabetes es una enfermedad metabólica causada por una anomalía de la insulina, que regula el azúcar en sangre. Según la causa de la enfermedad, se clasifica en diabetes de tipo 1, que se produce como consecuencia de la deficiencia de insulina cuando las células productoras de insulina se destruyen debido a una anomalía en el sistema inmunológico, y diabetes de tipo 2, causada por una falta de secreción de insulina o un uso ineficaz de insulina.
La diabetes se caracteriza por la hiperglucemia, en la que la concentración de glucosa en sangre es elevada. El fracaso en el control de la glucosa en sangre puede provocar complicaciones tales como la retinopatía diabética, la enfermedad renal y lesiones en los pies. Por lo tanto, la importancia del control de la glucosa en sangre para los diabéticos es cada vez mayor.
Los marcadores de medición de diabetes convencionales utilizan la glucosa. Sin embargo, dado que la glucosa en sangre fluctúa mucho antes y después de una comida, existen problemas en el sentido de que el error debido al tiempo de medición y la fluctuación debida al estado del paciente pueden ser muy evidentes. Además, la medición de
la glucosa oxidasa, utilizada para medir la glucosa, puede ser vulnerable a las influencias ambientales tales como el pH u otras sustancias interferentes contenidas en la sangre, y puede afectar a la actividad enzimática al generar peróxido de hidrógeno.
Por lo tanto, recientemente, la hemoglobina glucosilada (HbA1c) se viene utilizando como un biomarcador capaz de determinar de forma más precisa y estable los niveles de glucosa en sangre que la glucosa. Una vez que se genera la hemoglobina glucosilada, esta es estable hasta que desaparecen los eritrocitos. Por lo tanto, dado que la hemoglobina glucosilada puede utilizarse como un indicador para mostrar el nivel medio de glucosa en sangre durante un periodo de 2 a 3 meses, se utiliza para diagnosticar e investigar el progreso del tratamiento de la diabetes en la práctica. Sin embargo, existe el problema de que el procedimiento de medición de hemoglobina glucosilada no es adecuado para pacientes con algunas enfermedades, como insuficiencia renal crónica terminal, que dificultan el mantenimiento de una glucemia constante, o para pacientes con anomalías eritrocitarias.
Para diagnosticar la diabetes utilizando hemoglobina glucosilada, es necesario juzgar la cantidad de hemoglobina glucosilada en relación con la cantidad de hemoglobina total en lugar del valor absoluto de hemoglobina glucosilada, puesto que las cantidades de hemoglobina total son diferentes para cada individuo, en función del sexo, la edad y las enfermedades relacionadas con la sangre. Por lo tanto, para utilizar la hemoglobina glucosilada como indicador de diagnóstico de la diabetes, se requiere una técnica capaz de distinguir la cantidad de hemoglobina total y la cantidad de hemoglobina glucosilada.
La hemoglobina está compuesta por proteínas hemo, en el centro del cual se coordinan los iones de hierro, y globina. La hemoglobina tiene una longitud de onda de absorción de 400 a 600 nm, que varía ligeramente dependiendo de modificaciones químicas, como la unión de la hemoglobina al oxígeno y la metilación de la misma. Entre las longitudes de onda de absorción, una longitud de onda de absorción de 430 nm puede representar la cantidad de hemoglobina total, puesto que es una característica común que incluye tanto la hemoglobina glucosilada como la hemoglobina normal. Por consiguiente, es necesario marcar selectivamente solo la hemoglobina glucosilada para distinguirla. Para este propósito, se utiliza un procedimiento de afinidad por ácido borónico. Este es un procedimiento en el que un tinte de color o una sustancia fluorescente se une al ácido borónico para reconocer cisdiol en el sitio de glucosa de la hemoglobina glucosilada y luego se utiliza como marcador. El procedimiento es excelente en cuanto a sensibilidad y estabilidad, como una reacción que adopta una enzima o una reacción antígeno-anticuerpo.
Las patentes de Estados Unidos n.° 5631364 y n.° 7374943 y la patente internacional n.° 2014-033258 divulgan un procedimiento que incluye la reacción de un derivado de ácido borónico que se une a colorante con una hemoglobina glucosilada de la sangre, la carga de la sustancia resultante en un cartucho compuesto por papel de
filtro poroso, la realización de un lavado y la medición de las reflectancias (%) de la hemoglobina total y la hemoglobina glucosilada que se une a colorante, determinando así las proporciones de los dos materiales.
Sin embargo, existen problemas en el sentido de que los derivados del ácido borónico conjugados con un colorante son vulnerables a la luz y al calor puesto que están directamente expuestos al ambiente externo y su procedimiento de síntesis es complicado. La mayoría de las moléculas de colorante de base orgánica presentan el problema de que la cantidad de colorante y la longitud de onda de coloración cambian o de que la luz a veces se extingue dependiendo del entorno circundante, como el pH, la polaridad y otras impurezas. Por consiguiente, existe la necesidad de un procedimiento para minimizar el efecto del mismo.
Por su parte, la patente europea n.° 2444803 y la patente coreana n.° 1128037 divulgan un procedimiento para permitir que los derivados del ácido borónico se unan a perlas y un procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada cargando directamente una muestra que se ha hecho reaccionar en un cartucho compuesto por papel de filtro poroso. Aunque la síntesis de perlas y derivados de ácido borónico es relativamente sencilla, dado que se mide la misma región de longitud de onda de la hemoglobina y la hemoglobina glucosilada, primero se mide la hemoglobina total, se mide el número de perlas que reaccionan con derivados del ácido borónico y se lava para eliminar la hemoglobina normal. Después de eso, es necesario llevar a cabo un procedimiento laborioso para medir la hemoglobina glucosilada restante después del lavado. Además, dado que se mide la misma región de longitud de onda, debe tenerse cuidado al lavar la hemoglobina normal.
Como resultado de los esfuerzos realizados para resolver los problemas anteriores, los inventores de la presente invención han descubierto que cuando se utiliza ácido borónico conjugado con nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno que tienen espectros de absorción diferentes de la hemoglobina o la hemoglobina modificada, las cantidades de hemoglobina y de hemoglobina glucosilada pueden medirse de forma rápida y precisa de una manera sencilla y estable utilizando un instrumento óptico, por lo que se ha completado la presente invención.
Divulgación
Problema técnico
Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada con el fin de diagnosticar de forma sencilla y precisa la presencia o ausencia de diabetes, y un procedimiento para medir hemoglobina glucosilada utilizando la misma. La invención se expone en el juego de reivindicaciones adjuntas.
Solución técnica
Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona una composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada. La composición del reactivo incluye ® un líquido hemolítico y @ un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada.
La presente invención también proporciona un procedimiento para medir hemoglobina glucosilada. El procedimiento incluye (a) introducir una muestra de sangre en una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada, incluyendo la composición ® un líquido hemolítico y @ un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada, seguido de hemólisis y reacción, (b) inyectar un reactivo en una almohadilla de absorción de un cartucho, seguido de lavado con un líquido de lavado, (c) medir una reflectancia óptica de la almohadilla de absorción utilizando un instrumento óptico para medir las cantidades de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada, y (d) calcular una proporción de hemoglobina glucosilada sobre la base de las cantidades medidas de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada. En la presente invención, el líquido hemolítico se selecciona del grupo que consiste en TRIS, HEPES, TES, MOPS y PIPES.
En la presente invención, el colorante encapsulado en las nanopartículas de sílice es azul de metileno.
En la presente invención, las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" se producen mediante la adición de un colorante y sílice a una solución de mezcla de agua y un tensioactivo o una solución de mezcla de agua y un disolvente orgánico, seguido de agitación y adición de un catalizador básico, y se unen específicamente a la hemoglobina glucosilada.
En la presente invención, el diámetro de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" es de 10 a 500 nm.
En la presente invención, el "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" se produce aminando "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno", seguido de conjugación con ácido
4-carboxilfenilborónico (CPBA), o por carboxilación o conversión de aldehido de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno", seguido de conjugación con ácido 3-aminofenilborónico (APBA).
En la presente invención, el instrumento óptico irradia una longitud de onda para medir la hemoglobina total y una longitud de onda para medir la hemoglobina glucosilada que se une al "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" como fuente de luz, midiendo así la reflectancia óptica.
En la presente invención, en el procedimiento de medición de la hemoglobina glucosilada, la diabetes se diagnostica según la proporción de hemoglobina glucosilada.
Efectos ventajosos
En una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada según la presente invención, dado que el colorante está encapsulado en nanopartículas de sílice, la longitud de onda de absorción inherente del colorante no se ve afectada por el pH y la composición presenta una excelente estabilidad incluso cuando se almacena durante un mes o más. Se encapsula una pluralidad de moléculas de colorante en una única nanopartícula de sílice, de modo que la cantidad de luz absorbida por una partícula es mayor que la absorbida por una molécula de colorante. Por consiguiente, es posible medir con precisión la cantidad de hemoglobina glucosilada en la sangre, que convencionalmente tiene un límite de detección bajo.
Descripción de dibujos
La FIGURA 1 es una vista que muestra un procedimiento de producción de "nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" según una realización de la presente invención;
La FIGURA 2 muestra la estructura de un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" producido según una realización de la presente invención;
La FIGURA 3 es una vista que muestra una reacción de unión del “ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante” y la hemoglobina glucosilada según una realización de la presente invención;
La FIGURA 4 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada utilizando una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada y un instrumento óptico de la presente invención;
La FIGURA 5 es una vista que muestra un procedimiento de irradiación del instrumento óptico según una realización de la presente invención;
La FIGURA 6 es un gráfico que muestra la similitud entre absorbancias en función de la longitud de onda de absorción del "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" producido según una realización de la presente invención y la longitud de onda de absorción de cada uno de los colorantes que se utilizan;
La FIGURA 7 es un gráfico que muestra (A) la imagen de la forma del "ácido borónico de nanopartícula de sílice encapsuladas en colorante" producido según una realización de la presente invención, medido utilizando un microscopio electrónico de barrido, y (B) el tamaño del mismo, analizado utilizando un procedimiento de dispersión dinámica de luz; y
La FIGURA 8 es un gráfico que muestra el valor de reflectancia del "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" en función de la concentración de hemoglobina glucosilada de una muestra de sangre, cuya concentración se conoce.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
En la presente invención, la intención es confirmar que cuando se utiliza ácido borónico conjugado con nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno que tienen espectros de absorción diferentes de la hemoglobina o la hemoglobina modificada, las cantidades de hemoglobina y hemoglobina glucosilada puedan medirse con precisión de una manera sencilla y estable utilizando un instrumento óptico.
En la presente invención, se produjo un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se unía específicamente a la hemoglobina glucosilada, y se le añadió un líquido hemolítico, produciendo así una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada. A continuación, se añadió una muestra de sangre a la composición de reactivo producida para realizar la hemólisis y llevar a cabo la reacción, y luego se inyectó en una almohadilla de absorción, seguido de lavado. La reflectancia óptica de la almohadilla de absorción se midió utilizando el instrumento óptico para medir las cantidades de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada. Como resultado, se confirmó que era posible diagnosticar la diabetes de una manera sencilla y rápida utilizando la proporción de hemoglobina glucosilada.
Es decir, se encapsuló un colorante azul de metileno de color azul en nanopartículas de sílice, se sustituyó el grupo hidroxilo (-OH) de su superficie con un grupo amino primario y se fijó a la superficie de las mismas ácido 4-carboxilfenilborónico (CPBa ), que es un material de unión a hemoglobina glucosilada, produciendo así un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas". El ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno se mezcló con el líquido hemolítico para la hemólisis de la muestra de sangre, produciendo así una
composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada. A continuación, se añadió la muestra de sangre a la composición de reactivo producida para realizar la hemólisis y llevar a cabo la reacción, y luego se inyectó en la almohadilla de absorción, seguido de lavado. Se irradiaron fuentes de luz roja (430 nm) y azul (650 a 700 nm) sobre la almohadilla de absorción utilizando el instrumento óptico para medir así la reflectancia óptica de la hemoglobina total y la hemoglobina glucosilada marcada con el colorante. De este modo, fue posible confirmar que la proporción de hemoglobina glucosilada podía medirse de forma sencilla y rápida.
Por tanto, la presente invención se refiere a una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada, incluyendo la composición ® un líquido hemolítico y @ un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada.
Dado que la concentración de hemoglobina glucosilada en la muestra de sangre se mide en relación con la cantidad de hemoglobina total en la sangre, para medir la concentración de hemoglobina glucosilada, la muestra de sangre debe primero hemolizarse con el fin de exponer así la hemoglobina normal y la hemoglobina glucosilada contenida en la sangre.
En la presente invención, puede utilizarse cualquier líquido hemolítico sin limitación, siempre y cuando tal líquido hemolítico tenga una concentración de tampón a presión osmótica a la que la hemólisis sea factible, y los ejemplos del mismo pueden incluir TRIS, HEPES, MOPS, TES y PIPES, cada uno con un pH de 7 a 8,5. La muestra de sangre que se hemoliza incluye hemoglobina y hemoglobina glucosilada juntas.
Tal como se muestra en la FIGURA 1, las "nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" pueden producirse añadiendo un colorante y sílice a una solución de mezcla de agua y un tensioactivo o una solución de mezcla de agua y un disolvente orgánico, seguido de agitación y luego adición de un catalizador básico.
En la presente invención, el colorante encapsulado en las nanopartículas de sílice es azul de metileno que tiene un valor mayor de 400 a 600 nm, dentro del cual aparece el espectro completo de toda la hemoglobina roja, incluyendo la hemoglobina y la hemoglobina glucosilada.
Es posible excluir la hemoglobina metilada, que está presente en un pequeño número y que aparece entre 620 y 630 nm. El colorante es, preferiblemente, azul de metileno a 660 nm, que puede mantener un color azul incluso en condiciones básicas de pH 9 o superiores, en las que se realiza la síntesis de nanopartículas de sílice.
El tensioactivo no está particularmente limitado, pero en la presente invención se puede usar Triton x-100 o nhexano. Los ejemplos de sílice pueden incluir ortosilicato de tetraetilo u ortosilicato de tetrametilo.
El catalizador básico sirve para promover la encapsulación del colorante por un precursor de sílice, que puede promover la hidrólisis del agua y el precursor de sílice. Los precursores de sílice ionizada reaccionan entre sí para producir agua y alcohol (ROH), que se conectan entre sí para formar una red de sílice y crecer.
Los ejemplos del catalizador básico pueden incluir hidróxido de amonio, cloruro de tetrapropilamonio, hidróxido de tetrapropilamonio, bromuro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrabutilamonio o hidróxido de tetrabutilamonio.
En el caso de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno", dado que el colorante no se escapa al exterior, la estabilidad y la sensibilidad pueden aumentar, la biotoxicidad puede ser baja y los grupos funcionales en la superficie de las mismas pueden cambiarse fácilmente.
El diámetro de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" puede ser de 10 a 500 nm, y preferiblemente de 30 a 100 nm, lo que permite mantener las propiedades inherentes del colorante. Cuando el diámetro es inferior a 10 nm, es difícil realizar la operación. Cuando el diámetro es superior a 500 nm, dado que aumenta su espesor, el colorante puede aparecer turbio.
Como derivados del ácido borónico que imparten selectividad para la hemoglobina glucosilada a las "nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante", es preferible utilizar el ácido 4-carboxilfenilborónico (CPBA) y el ácido 3-aminofenilborónico (APBA). Cuando se utiliza el CPBA, las "nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" pueden aminarse. Cuando se utiliza el APBA, después de que se carboxilan las "nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante", la conjugación puede realizarse mediante acoplamiento cruzado de carbodiimida. Dado que el ácido 4-carboxilfenilborónico (CPBA) tiene una estabilidad térmica relativamente mayor que el ácido 3-aminofenilborónico (APBA), es preferible utilizar el CPBA.
Tal como se muestra en las FIGURAS 2 y 3, el "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" puede reaccionar con el cis-diol de la hemoglobina glucosilada. Se encapsula una pluralidad de moléculas de colorante en las nanopartículas de sílice, de modo que la cantidad de luz absorbida por una partícula es mayor que la absorbida por una molécula de colorante. En consecuencia, puede mejorarse el límite de detección de hemoglobina glucosilada.
Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada. El procedimiento incluye (a) introducir una muestra de sangre en una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada, incluyendo la composición ® un líquido hemolítico y @ un " ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada, seguido de hemólisis y reacción, (b) inyectar un reactivo en una almohadilla de absorción de un cartucho, seguido de lavado con un líquido de lavado, (c) medir la reflectancia óptica de la almohadilla de absorción utilizando un instrumento óptico para medir las cantidades de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada, y (d) calcular una proporción de hemoglobina glucosilada sobre la base de las cantidades medidas de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada.
Tal como se muestra en las FIGURAS 4 y 5, puede utilizarse cualquier instrumento óptico sin limitación particular siempre que el instrumento óptico pueda medir la reflectancia óptica utilizando propiedades ópticas. El instrumento óptico puede irradiar simultáneamente una longitud de onda para medir la hemoglobina total y una longitud de onda específica del "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante (azul)" como fuentes de luz (por ejemplo: rojo (430 nm) y azul (650 a 700 nm)), y puede medirse la señal óptica reflejada utilizando un detector de fotodiodo (PD), midiendo así las cantidades de hemoglobina y hemoglobina glucosilada utilizando un convertidor de señal óptica.
La proporción de hemoglobina glucosilada puede obtenerse calculando la cantidad de hemoglobina glucosilada en relación con la cantidad de hemoglobina total utilizando la siguiente ecuación.
Proporción de hemoglobina glucosilada % = hemoglobina glucosilada/hemoglobina total Generalmente, en el caso de que la proporción de hemoglobina glucosilada sea del 6,5 % o más, el caso puede diagnosticarse como diabetes.
Modo de llevar a cabo la invención
A continuación, se describirá la presente invención con más detalle con referencia a los ejemplos. Los expertos en la materia deben entender que estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención y que el alcance de la presente invención no debe interpretarse como limitado por estos ejemplos.
Ejemplo 1: producción de ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul (BD@SNP-CPBA)
1-1: síntesis de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul (BD@SNP)
Se añadieron 135,0 ml de ciclohexano, 31,8 ml de Triton X-100, 32,4 ml de n-hexanol, 6,12 ml de azul de metileno 0,1 M y 2,7 ml de TEOS (ortosilicato de tetraetilo) a un matraz de fondo redondo de 1 l, y se mezclaron uniformemente durante 1 hora utilizando un agitador. Se añadieron 1,08 ml de amoniaco acuoso (NH4OH) al 25~30 % y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas. Luego se añadieron 200 ml de etanol para terminar la reacción. El lavado con etanol y el lavado con DI se realizaron, respectivamente, cuatro y tres veces utilizando una centrífuga a 3800 rpm durante 15 minutos, seguido de secado en un horno a 60 °C.
1-2: aminación de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul (BD@SNP)
Para realizar el acoplamiento cruzado de los grupos carboxilo de BD@SNP y CPBA, el grupo hidroxilo (-OH) en la superficie de BD@SNP se sustituyó por un grupo amina primario. Es decir, se añadieron 100 mg de BD@SNP a 100 ml de etanol y se dispersaron durante 30 minutos utilizando un dispersor ultrasónico. Luego, se añadió 1 ml de APTES (3-aminopropiltrietoxisilano) en un agitador, seguido de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la reacción, el lavado con etanol y el lavado con DI se realizaron, respectivamente, cuatro y tres veces utilizando una centrífuga a 3800 rpm durante 15 minutos, seguido de secado en un horno a 60 °C, produciendo así BD@SNP aminadas (BD@SNP-NH2).
1-3: unión de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul aminado (BD@SNP-NH2) y CPBA
Para proporcionar capacidad de unión a la hemoglobina glucosilada, según un procedimiento de acoplamiento cruzado de carbodiimida utilizando clorhidrato de 1-etil-3[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC), que es un agente de acoplamiento cruzado que conecta un grupo carboxilo y un grupo amina primario, se fijó el ácido 4-carboxilfenilborónico (CPBA), que es un material de unión a hemoglobina glucosilada, sobre la superficie de las nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul aminado (BD@SNP-NH2).
Es decir, para activar el grupo funcional carboxilo de CPBA en un entorno en el que la luz estaba bloqueada, se disolvió 3,48 mM de CPBA en solución tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 0,1 M (pH 6,0). Se le añadió EDC con una concentración final de 1 mM y se dejó que la reacción progresara durante 30 minutos con agitación. Luego, se añadió BD@SNP-NH2, seguido de reacción en un agitador a temperatura ambiente durante 10
a 20 horas.
Una vez completada la reacción, el lavado con etanol y el lavado con DI se realizaron, respectivamente, cuatro y tres veces utilizando una centrífuga a 3800 rpm durante 15 minutos, seguido de secado a temperatura ambiente o liofilización, produciendo así un ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante azul (BD@SNP-CPBA).
Cada uno de los colorantes "azul de metileno" utilizados en la síntesis y el "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" se diluyeron con agua desionizada (agua DI), y luego se realizó la medición con espectroscopía UV/Vis. Como resultado, tal como se muestra en la FIGURA 6, puede observarse que el " ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante" tiene una longitud de onda de absorción inherente del colorante azul incluso después de la síntesis. Con respecto a esto, las partículas se analizaron utilizando un microscopio electrónico de barrido y un procedimiento de dispersión dinámica de luz. Como resultado, tal como se muestra en la FIGURA 7, fue posible confirmar que se sintetizaron nanopartículas que tenían una morfología uniforme y un tamaño de aproximadamente 30 a 40 nm.
Ejemplo 2: medición de hemoglobina glucosilada utilizando una composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada que contiene BD@SNP-CPBA y líquido hemolítico
Se colocaron 200 |jl de una composición de reactivo que contenía un líquido hemolítico (ZnCh, NaCl, MgCh, Triton X-100, NaN3, glicina, HEPES, pH 8,1) y BD@SNP-CPBA producido en el Ejemplo 1 en un tubo marrón, y se le añadieron 5 j l de una muestra de sangre en la que se midió el valor porcentual de hemoglobina glucosilada utilizando un instrumento de referencia (analizador Tosoh G11), seguido de reacción durante 2 minutos. Se colocaron 25 j l de la solución de reacción en una almohadilla de absorción de un cartucho de un instrumento óptico (Epithod®616, DxGen) para que fuera absorbida durante 15 segundos, y se añadieron 25 j l de una solución de lavado (solución de mezcla de morfolina, NaCl, Triton X-100, glicerol y NaN3), seguido de lavado durante 15 segundos. A continuación, se midieron las reflectancias ópticas de la hemoglobina total roja y la hemoglobina glucosilada BD@SNP-CPBA azul en el cartucho en el instrumento óptico (Epithod®616, DxGen). El % de reflectancia (% R) medido para cada longitud de onda se utilizó convirtiéndolo en un valor K/S, que es un índice cuantitativo de la cantidad de sustancia colorante presente en la superficie, y la fórmula para convertir el % de reflectancia en el valor de K/S es la siguiente.
(K = coeficiente de absorción, S = coeficiente de dispersión)
Por lo tanto, después del % de valor de reflectancia obtenido al irradiar la fuente de luz roja que representa la cantidad de hemoglobina glucosilada y el % de valor de reflectancia obtenido de la fuente de luz azul que representa la hemoglobina total, se sustituyeron cada uno por el valor de K/S, se calcularon las proporciones de los mismos, midiendo así la cantidad de hemoglobina glucosilada en la sangre.
Tal como se muestra en la FIGURA 8, pudo observarse que, a medida que aumenta la proporción de hemoglobina glucosilada contenida en la sangre, aumenta la cantidad relativa (valor K/S) de la unión de “ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en colorante” a la misma. Por lo tanto, se confirmó que el procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada según la presente invención puede utilizarse ampliamente para el diagnóstico de la diabetes.
Aunque anteriormente se han descrito en detalle partes específicas de la presente invención, los expertos en la materia apreciarán que esta descripción específica es solo una realización preferida, y que el alcance de la presente invención no queda limitado por la misma. Por consiguiente, el alcance real de la presente invención viene definido por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Aplicabilidad industrial
La composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada según la presente invención contiene un líquido hemolítico, de modo que la composición de reactivo puede reaccionar con la hemoglobina glucosilada al mismo tiempo que la hemólisis, marcando así la hemoglobina glucosilada. Además, dado que la hemoglobina glucosilada puede medirse de una manera sencilla utilizando un analizador óptico simplemente inyectando un líquido de lavado en un cartucho de medición sin ningún procedimiento de separación, la composición de reactivo puede utilizarse ampliamente para el diagnóstico de la diabetes.
Claims (8)
1. Composición de reactivo para medir hemoglobina glucosilada, comprendiendo la composición:
® un líquido hemolítico y @ un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada.
2. Composición de reactivo según la reivindicación 1, en la que el líquido hemolítico se selecciona del grupo que consiste en TRIS, HEPES, TES, MOPS y PIPES.
3. Composición de reactivo según la reivindicación 1, en la que las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" se producen mediante la adición de azul de metileno y de sílice a una solución de mezcla de agua y un tensioactivo o una solución de mezcla de agua y un disolvente orgánico, seguido de agitación y de la adición de un catalizador básico, y se unen específicamente a la hemoglobina glucosilada.
4. Composición de reactivo según la reivindicación 1, en la que el diámetro de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" es de 10 a 500 nm.
5. Composición de reactivo según la reivindicación 1, en la que el "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" se produce aminando "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno", seguido de conjugación con ácido 4-carboxilfenilborónico (CPBA), o por carboxilación de las "nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno", seguido de conjugación con ácido 3-aminofenilborónico (APBA).
6. Procedimiento para medir la hemoglobina glucosilada, comprendiendo el procedimiento:
(a) introducir una muestra de sangre en una composición de reactivo para medir la hemoglobina glucosilada, incluyendo la composición ® un líquido hemolítico y @ un "ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno" que se une específicamente a la hemoglobina glucosilada, seguido de hemólisis y reacción;
(b) inyectar un reactivo en una almohadilla de absorción de un cartucho, seguido de lavado con un líquido de lavado;
(c) medir una reflectancia óptica de la almohadilla de absorción utilizando un instrumento óptico para medir las cantidades de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada; y
(d) calcular una proporción de hemoglobina glucosilada sobre la base de las cantidades medidas de hemoglobina total y hemoglobina glucosilada.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el instrumento óptico irradia simultáneamente una longitud de onda para medir la hemoglobina total y una longitud de onda para medir la hemoglobina glucosilada que se une al ácido borónico de nanopartículas de sílice encapsuladas en azul de metileno como fuentes de luz, midiendo así la reflectancia óptica.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la diabetes se diagnostica en función de la proporción de hemoglobina glucosilada.
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