CN102460159A - 用于测量糖化血红蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测量糖化血红蛋白的方法。本发明的方法包括：用红细胞溶解液(heemolysate)使血液样品溶血的溶血步骤；将经溶血的血液样品与珠缀合物(其中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合)反应的反应步骤；测量血液中总血红蛋白量的第一测量步骤；将正常血红蛋白与缀合有珠缀合物的糖化血红蛋白分离开的分离步骤；测量血液中糖化血红蛋白量的第二测量步骤；以及基于测得的血液样品中总血红蛋白和糖化血红蛋白的量来计算血液样品中糖化血红蛋白浓度的计算步骤。本发明用于测量糖化血红蛋白的方法能够简化测量步骤，其通过在来自含有正常血红蛋白和缀合有珠缀合物之糖化血红蛋白(其中珠与糖化血红蛋白相缀合)的血液样品的血液中测量血红蛋白的总量来实现。此外，由于不需要用于信号放大的单独染料，本发明使得可以更容易地测量血液样品中的糖化血红蛋白浓度。

Description

用于测量糖化血红蛋白的方法
技术领域
本发明涉及用于糖尿病测试的测量糖化血红蛋白的方法，更特别地涉及以更简化的步骤测量糖化血红蛋白的方法。
背景技术
在医学诊断或药物治疗的领域中，麻醉剂或有害化学品之分析物的浓度测量最近已被用于医学或环境领域。尤其是，随着人类日益期望摆脱各种疾病的困扰，对于医学诊断和治疗领域中使用的生物样品浓度的测量愈发引起关注。特别地，对于糖尿病而言，能够测量血糖的糖化血红蛋白测试允许通过一次测量而获得相对长期的血糖平均值，因而日益引起关注。
已知糖尿病(其为成人肾脏疾病的一个原因)可使预期平均寿命值降低15年。将血糖控制在较低值被认为能够预防由糖尿病所引起的慢性并发症。
血红蛋白A1c(HbA1c)称为“糖化血红蛋白”，其作为一部分血红蛋白存在于红细胞中。当血液中的血糖(葡萄糖)浓度升高时，葡萄糖部分缀合至血红蛋白。这种与葡萄糖缀合的血红蛋白称为“糖化血红蛋白”或
“HbA1c”。糖化血红蛋白的值与近2～3个月中血糖的值相平衡，因此，可以将糖化血红蛋白值认定为近2～3个月的血糖值。检查糖化血红蛋白值并将其用作糖尿控制和未来药物控制的指标。因此，测量糖化血红蛋白是很重要的。
糖化血红蛋白具有这样的结构，其中葡萄糖缀合至血液中β-链血红蛋白的N端缬氨酸，因此，必须特异性地仅检测和测量葡萄糖部分才能将其与血红蛋白相区分。可通过多种方法测量该部分，其中广泛使用的是应用抗体和硼酸亲和层析的方法。
为了定量地测量糖化血红蛋白值，给出糖化血红蛋白量基于总血红蛋白量的分数，这是因为每个人的总血红蛋白量是不同的。此时，同时测量总血红蛋白的量。对于成年男性来说，总血红蛋白的量一般为13.0～17.0g/dl；对于成年女性来说，为12.0～15.0g/dl；对于婴儿来说，为11.0～14.0g/dl。当糖化血红蛋白值为6.0％时，其可表示为三个月的血糖平均维持在120g/dl。美国糖尿病协会(AmericanDiabetes Association，ADA)推荐糖化血红蛋白值维持在7.0％或更少，且其正常范围为4.0～6.5％。
同时，在美国专利No.5,242,842、6,399,293和6，300,142中，额外地需要信号产生材料(例如染料)，因而测量步骤变得麻烦。在JP3340129中，额外地需要稀释步骤。因此，也必须进行额外的步骤。也就是说，该操作需要测量者直接参与多个步骤，这对于测量者来说是麻烦的。此外，测量者的参与可使测量过程复杂化，因而拖延测量时间。
因此，需要以更简化的步骤容易地测量全血样品中糖化血红蛋白浓度的方法。
公开内容
技术问题
本发明涉及使用比相关领域更简化的步骤容易地测量糖化血红蛋白浓度的方法。
技术方案
本发明一个方面提供了用于测量糖化血红蛋白的方法，该方法包括：用红细胞溶解液(hemolysate)使血液样品溶血的溶血步骤；将经溶血的血液样品与珠缀合物(其中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合)反应的反应步骤；测量血液中总血红蛋白量的第一测量步骤；将正常血红蛋白与缀合有珠缀合物的糖化血红蛋白分离开的分离步骤；测量血液中糖化血红蛋白量的第二测量步骤；以及基于测得的血液样品中总血红蛋白和糖化血红蛋白的量来计算血液样品中糖化血红蛋白浓度的计算步骤。
此时，可通过将红细胞溶解液和珠缀合物同时放入血液样品中而将所述溶血和反应步骤作为一个步骤来实施。
所述红细胞溶解液可选自：TRIS、HEPES、TES和PIPES。
所述珠可以是琼脂糖(
Figure BDA0000133320690000021
agarose)珠、纤维素珠、琼脂糖凝胶(
Figure BDA0000133320690000022
sepharose)珠、聚苯乙烯珠、聚甲基丙烯酸甲酯珠、聚乙烯基甲苯珠和玻璃珠中的至少一种。
所述糖化血红蛋白结合材料可以是硼酸、伴刀豆球蛋白A和抗体中的至少一种。
所述第一和第二测量步骤可基于使用光学传感器的光反射测量来进行。
所述分离步骤可通过提供清洗溶液来进行。
所述清洗溶液可选自在pH7～8.5范围内反应的TRIS、HEPES、TES和PIPES。
可通过使用吸收垫吸收正常血红蛋白来实施分离步骤。
所述吸收垫可为多孔的垫。
所述多孔垫之孔的尺寸可大于血红蛋白的尺寸且小于所述珠的尺寸。
有益效果
根据用于测量糖化血红蛋白的方法，从全血样品中测量总血红蛋白的量，所述全血样品包含经珠缀合物缀合的糖化血红蛋白和正常血红蛋白，其中所述珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合。因而，测量步骤得到进一步地简化。由于不需要用于信号放大的单独染料，本发明使得可以更容易地测量血液样品中的糖化血红蛋白浓度。
附图说明
图1显示糖化血红蛋白与珠缀合物反应的化学结构，所述珠缀合物使用硼酸作为糖化血红蛋白结合材料。
图2示意本发明的反应步骤(图2(a))；反应步骤之后正常血红蛋白和与珠缀合物缀合之糖化血红蛋白共存于样品中的状态(图2(b))；以及正常血红蛋白被除去的状态(图2(c))。
图3显示测量血红蛋白浓度的示例步骤。
图4示意正常血红蛋白被吸收进吸收垫中的状态，同时与珠缀合物缀合的糖化血红蛋白被单独分离出来。
图5显示珠的存在对血红蛋白浓度测量值没有影响。
最佳方式
本发明旨在解决现有技术中的上述问题，并且本发明的一个目的是提供能够更容易地测量血液样品中糖化血红蛋白的方法。
更具体地，根据本发明的一个方面，提供了用于测量糖化血红蛋白的方法，其包括：用红细胞溶解液使血液样品溶血的溶血步骤；将经溶血的血液样品与珠缀合物(其中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合)反应的反应步骤；测量血液中总血红蛋白量的第一测量步骤；将正常血红蛋白与缀合有珠缀合物的糖化血红蛋白分离开的分离步骤；测量血液中糖化血红蛋白量的第二测量步骤；以及基于测得的血液样品中总血红蛋白和糖化血红蛋白的量来计算血液样品中糖化血红蛋白浓度的计算步骤。
下文会详细地描述本发明。
相对于血液中总血红蛋白的量来测量血液样品中糖化血红蛋白的浓度。因此，为了测量糖化血红蛋白的浓度，进行了使血液样品溶血以暴露包含在血液中的正常血红蛋白和糖化血红蛋白的溶血步骤。
此时，可使用的红细胞溶解液具有一定渗透压的缓冲液浓度(在该渗透压下能够发生溶血)且pH为7～8.5，优选地选自TRIS、HEPES、TES和PIPES。更优选地，所述红细胞溶解液是含有表面活性剂的缓冲溶液，例如20mM HEPES缓冲溶液(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，HEPES；pH 8.1)。然而，红细胞溶解液不限于这些溶液，可使用本领域中广为人知的任何合适的溶液。血红蛋白和糖化血红蛋白共存于溶血的血液样品中。
随后进行将经溶血的血液样品与珠缀合物(其中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合)反应的反应步骤。本文中使用的术语“珠缀合物”是指与结合材料相缀合的珠，所述结合材料可缀合至糖化血红蛋白。所述珠缀合物通过糖化血红蛋白结合材料与糖化血红蛋白相连接。本文中使用的术语“糖化血红蛋白结合材料”是指可特异性地缀合至糖化血红蛋白的材料。例如，硼酸、伴刀豆球蛋白A和抗体中的至少一种(优选硼酸)可用作糖化血红蛋白结合材料。
图1示意糖化血红蛋白与珠缀合物反应的化学结构，所述珠缀合物使用硼酸作为糖化血红蛋白结合材料。如图1所示，硼酸的OH官能团与连接至糖化血红蛋白末端之糖的顺式-二醇相互反应，形成五元环结构。利用这一特性，硼酸特异性地仅结合至总血红蛋白中的糖化血红蛋白。
因此，当将标记物连接至糖化血红蛋白结合材料时，只有糖化血红蛋白可被选择性地标记。在相关领域中，将染料或磁性材料连接至糖化血红蛋白结合材料，从而区分糖化血红蛋白。然而，在本发明中，使用具有预定尺寸的珠来分离糖化血红蛋白。
本发明中可使用的珠可以是聚合物多糖支持物(例如琼脂糖、纤维素或琼脂糖凝胶)、乳胶珠(例如，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚乙烯基甲苯)和玻璃珠中的至少一种，优选琼脂糖凝胶珠。
本发明中使用的珠不发挥染料作用，而是在后续步骤中借助其体积使得糖化血红蛋白与正常血红蛋白相分离。此时，优选地考虑以下因素来选择珠的直径：反应之后结合了糖化血红蛋白的糖化血红蛋白结合材料的沉淀时间以及与糖化血红蛋白的反应性。
此时，溶血步骤和反应步骤可单独进行。优选地，可通过将红细胞溶解液和珠缀合物同时放入血液样品中而将溶血步骤和反应步骤作为一个步骤来实施。
在溶血和反应步骤中，优选地搅拌用作反应容器的盒以加速血液样品与红细胞溶解液和珠缀合物的反应。这旨在用红细胞溶解液将血液样品溶血以释放糖化血红蛋白并同时引发糖化血红蛋白与珠缀合物的特异性反应。此时，为使溶血的血液样品与珠缀合物充分地反应，可需要例如3分钟的预定时间。
如图2所示，溶血和反应步骤之后，正常血红蛋白和连接有珠缀合物的糖化血红蛋白共存于血液样品中。此时，测量总血红蛋白的量。也就是说，图2(a)显示珠缀合物连接至糖化血红蛋白的过程，图2(b)显示总血红蛋白的状态，其中包含经标记的糖化血红蛋白和正常的血红蛋白。此外，图2(c)显示在从血液样品中除去正常血红蛋白之后仅剩下糖化血红蛋白的状态。
也就是说，在连接有珠缀合物的糖化血红蛋白与正常血红蛋白一起存在的状态下，进行测量血液中总血红蛋白浓度的第一测量步骤。可基于使用光反射特性的测量来测量糖化血红蛋白的量。例如，当要测量血液样品中的糖化血红蛋白的量时，利用了血红蛋白特异性吸收具有特定频率之光信号的特性。此时，糖化血红蛋白测量仪器优选地使用光发射装置(例如，发光二极管)和光接收装置(例如，光电二极管)来测量糖化血红蛋白的量。图3显示示例的测量过程。如图3所示，为测量血红蛋白的浓度，该反应优选在包括透明测量窗的盒中进行。
换句话说，所述光发射装置发出具有特定波长的光信号。例如，当要测量糖化血红蛋白的量时，所述光发射装置可发出波长为约430nm的光信号(即血液样品中的血红蛋白特异性吸收的光信号)。此时，光接收装置接收从所述光发射装置中发出的并穿过盒的光信号。也就是说，向光发射装置输出光发射控制信号，并且使用模数转换器(analog-to-digital，A/D)将从光接收装置输入的光信号转化成电信号。从而可测量盒中所包含的血红蛋白的量。
在相关领域中，为防止与糖化血红蛋白连接的珠影响糖化血红蛋白量的测量值，在连接珠之前检测血液中总血红蛋白的量。为测量糖化血红蛋白的量，必须进行将连接有珠缀合物的糖化血红蛋白解离的步骤。然而，本发明人发现，即使当珠缀合物连接至糖化血红蛋白时(可参见实施方案1)对总血红蛋白量的测量值也没有影响，因此，可省去该不必要的步骤。
随后，为了获得糖化血红蛋白的浓度，必须进行将正常血红蛋白与跟珠缀合物连接的糖化血红蛋白分离开的分离步骤。优选地，所述分离步骤可通过使用吸收垫仅吸收正常血红蛋白来进行。
在本发明中，可使用多孔垫作为吸收垫。多孔垫中形成的每个孔的尺寸必须大于血红蛋白的尺寸且小于所述珠的尺寸。更详细地，可使用由选自聚酯、聚氨酯等中的一种所形成的多孔垫。结果如图4所示，正常的血红蛋白被吸收垫所吸收，从而使缀合有珠缀合物的糖化血红蛋白单独分离出来。结果，只有缀合有珠缀合物的糖化血红蛋白被分离出来并留在测量窗中。
测量完成之后，吸收垫吸收血液样品的混合物，从而阻止血液样品混合物的运动。例如，如图4所述，所述吸收垫优选地位于测量区域下方。该分离步骤可基于但不限于吸收垫。
优选地，所述分离步骤通过提供清洗溶液而实现更高的可靠性和更短的分离时间。在本发明中，所述清洗溶液可选自TRIS、HEPES、TES和PIPES。当清洗溶液清洗血液样品混合物时，非特异性地存在于血液样品中的普通血红蛋白Ao被除去。
换句话说，血液样品的红细胞中的大多数血红蛋白(Hb)是非糖化的普通血红蛋白Ao。此时，只有4～14％的普通血红蛋白与葡萄糖反应，并作为糖化血红蛋白HBA1c而存在。因此，为了测量血液中的糖化血红蛋白，必须除去普通血红蛋白。为此，优选地使用能够清洗普通血红蛋白的清洗溶液来更容易地分离糖化血红蛋白，以便测量糖化血红蛋白。
这导致在测量床上仅剩下糖化血红蛋白。此时，进行测量所分离的糖化血红蛋白浓度的第二测量步骤。该第二测量步骤可以与第一测量步骤相同的方式进行。也就是说，优选地，第二测量步骤也基于使用光学传感器的光反射测量来进行。
随后，用糖化血红蛋白的量除以总血红蛋白的量，从而测量血液样品中糖化血红蛋白的相对量。此时，通过以下等式来计算糖化血红蛋白的百分比。
糖化血红蛋白的百分比(％)＝糖化血红蛋白/总血红蛋白×100
如上文所述，优选地在具有测量区域的盒中进行该反应，以便容易地测量血红蛋白的浓度。“测量区域”是指在所述盒中测量血液样品中血红蛋白和糖化血红蛋白的区域，并且可表示位于图4中吸收垫上的区域。此时，可以基于光反射特性测量在测量区域内测量血红蛋白的量。例如，可利用血红蛋白特异性吸收具有特定频率之光信号的特性。由于光的强度和对比度可随血红蛋白特性而有所区别，因而可测量血红蛋白的浓度。此外，所述测量区域还可包括光学窗口，通过外部光学传感器接收的光从该窗口反射，以测量光反射特性。
参考以下旨在举例说明的实施方案来描述本发明。因此，本发明不限于这些实施方案。
实施方式
实施方案1：制备珠缀合物，其中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合
(1)清洗步骤
用蒸馏水清洗CM琼脂糖凝胶珠三次，使总体积为1L，随后用100mM的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)(pH4.7)清洗两次。此时，改良了清洗方法，包括添加缓冲液、沉淀缓冲液以及弃去缓冲液上层。在清洗步骤中，除去所述珠剩余的乙醇成分，并换成高产率最佳合成pH的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)。
(2)缀合步骤
EDC或EDAC是用于将羧基偶连至伯胺的零长度(zero-length)交联剂。当使用该交联剂时，偶连至CM琼脂糖凝胶的羧基和3-氨基苯基硼酸(3-APBA)的氨基可被缀合从而合成APBA珠。
将46gEDC和4.65gAPBA溶于100mM MES(pH 4.7)中，依次加入珠溶液中，并在4℃下反应2小时。由于APBA对光敏感，该反应需要在暗处进行。由于EDC吸潮，因此在称重之后需要将其在密封状态下小心储存。
添加和合成作为交联剂之EDC和作为合成材料之硼酸的步骤在低温下进行，以提高效率(例如针对合成副产物的产生)。
(3)终止和封闭步骤
各加入500mL的1M醋酸钠溶液(干重(dry weight， DW))、100mM醋酸溶液(干重)、50mM NaOH溶液(干重)和1M NaCl溶液(干重)，并在室温下反应1小时。这时，由于反应物对光敏感，反应在暗处进行。合成完成之后，用醋酸钠终止反应，用醋酸、NaOH和NaCl清洗并封闭剩余的EDC。
(4)清洗步骤
最后，用蒸馏水将珠缀合物清洗三次，随后用20mM HEPES(pH 8.1)清洗两次，并调节至最终pH7.4。
图1中示意糖化血红蛋白与珠缀合物反应的化学结构，所述珠缀合物使用氨基苯基硼酸(APBA)作为糖化血红蛋白结合材料。如图1所示，硼酸的OH官能团和连接至糖化血红蛋白末端之糖的顺式-二醇相互反应，形成五元环结构。利用该特征，硼酸仅特异性地与总血红蛋白中的糖化血红蛋白结合。
实施例2：珠对糖化血红蛋白测量值的影响
进行以下实验以检验反射光是否根据总血红蛋白量一致性地测量，而与由珠尺寸决定的折射或特异性缀合至珠的糖化血红蛋白的量无关。
通过将10份样品(包括糖尿病人和正常人的血液)离心并调节血浆和沉淀红细胞之比来制备以下样品。
使用Hb 201(HemoCue，Sweden)测量总血红蛋白的量。
两份样品具有0～5g/dl的量
三份样品具有5～10g/dl的量
两份样品具有11～15g/dl的量
三份样品具有15～20g/dl的量
将CLOVERA1C(INFOPIA Co.Ltd.)转换为工厂模式。在所述工厂模式中，反射光的强度作为原始数据显示在液晶显示器(LCD)上。将CLOVER A1C CARTRIDGE(INFOPIA Co.Ltd.)插入CLOVER A1C，随后以700μl将红细胞溶解液和珠缀合物的混合物注射进反应区域中。充分地搅拌每种样品，随后以4μl注射进红细胞溶解液中。运行该机器。5分钟之后，读取CLOVER A1C CARTRIDGE的LCD屏上显示的数据。
结果如下表1所示。
表1(血红蛋白量与k/s值之间的相关性)
  样品编号   糖化血红蛋白％   总血红蛋白g/dl   k/s
  1   5.1   2.8   0.152
  7.6   6.0   0.339
  3   5.2   11.1   0.720
  4   5.3   7.4   0.490
  5   8.6   4.5   0.255
  6   9.6   20.0   1.219
  6.7   12.9   0.837
  8   5.4   18.5   1.157
  9   10.1   9.3   0.563
  10   4.9   17.0   1.043
图5描绘了该结果。在该图中，x轴表示总血红蛋白的量，y轴表示k/s值。k/s值是指反射光的强度。
从图5中可见，x和y轴之间有相关性。随着总血红蛋白量的改变，珠的反射光一致性地与之成比例地改变。
尽管本发明是参照特定示例性实施方案进行描述的，但是本领域技术人员应当理解，在不背离所附权利要求书中限定的本发明之精神和范围的前提下，可对其进行形式和细节上的多种改动。因此，所公开的实施方案应当被认为是示例性的而非限制性的。本发明的范围由权利要求书(而非详细描述)所限定，并且所有等同范围内的差异均应当认为涵盖在本发明中。

Claims (11)

1.一种用于测量糖化血红蛋白的方法，其包括：
用红细胞溶解液使血液样品溶血的溶血步骤；
将经溶血的血液样品与珠缀合物反应的反应步骤，所述珠缀合物中珠与糖化血红蛋白结合材料相缀合；
测量血液中总血红蛋白量的第一测量步骤；
将正常血红蛋白与缀合有所述珠缀合物的糖化血红蛋白分离开的分离步骤；
测量血液中糖化血红蛋白量的第二测量步骤；以及
基于测得的血液样品中总血红蛋白和糖化血红蛋白的量来计算该血液样品中糖化血红蛋白浓度的计算步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中通过将所述红细胞溶解液和珠缀合物同时放入所述血液样品中而将所述溶血和反应步骤作为一个步骤来实施。
3.根据权利要求1的方法，其中所述红细胞溶解液选自TRIS、HEPES、TES和PIPES。
4.根据权利要求1的方法，其中所述珠为琼脂糖珠、纤维素珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、聚甲基丙烯酸甲酯珠、聚乙烯基甲苯珠和玻璃珠中的至少一种。
5.根据权利要求1的方法，其中所述糖化血红蛋白结合材料为硼酸、伴刀豆球蛋白A和抗体中的至少一种。
6.根据权利要求1的方法，其中所述第一和第二测量步骤基于使用光学传感器的光反射测量来进行。
7.根据权利要求1的方法，其中所述分离步骤通过提供清洗溶液来进行。
8.根据权利要求7的方法，其中所述清洗溶液选自TRIS、HEPES、TES和PIPES。
9.根据权利要求1的方法，其中所述分离步骤通过使用吸收垫吸收正常血红蛋白来进行。
10.根据权利要求9的方法，其中所述吸收垫是多孔垫。
11.根据权利要求10的方法，其中所述多孔垫具有孔，每个所述孔的尺寸大于所述血红蛋白的尺寸且小于所述珠的尺寸。
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