KR100778889B1

KR100778889B1 - 전기화학적 당화단백질 검출 시스템

Info

Publication number: KR100778889B1
Application number: KR1020050068793A
Authority: KR
Inventors: 남학현; 장봉화; 양순해; 강보경; 최강; 최문희; 이종수; 차근식
Original assignee: 주식회사 아이센스
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2007-11-28
Also published as: KR20070014292A

Abstract

본 발명은 전기화학적 당화단백질 검출 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 결합시킨 후 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 필터링하기 위한 수단; 및 상기 당화단백질과 결합되지 않고 여과된 표식자 화합물을 정량하기 위한 수단을 포함하는 당화단백질 검출 시스템에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 전기화학적 당화단백질 검출 시스템은 종래 당화단백질을 직접적으로 정량하는 대신 당화단백질과 결합하고 남은 잔여 표식자 화합물을 여과한 후 정량함으로써 센서의 구성 및 제작방법을 크게 간소화하여 경제적이면서도 정확한 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 고가이며 수명에 제한이 큰 면역항체를 사용하지 않고 분석도구를 제작할 수 있는 등 센서 제작의 대량생산 및 품질관리 그리고 제품의 유통과정에서의 보관성 등을 획기적으로 개선할 수 있는 유용한 효과를 제공할 수 있다.

당화단백질, 당화헤모글로빈, 바이오센서, 보론산유도체, 다공성박막전극

Description

전기화학적 당화단백질 검출 시스템{ELECTROCHEMICAL DETERMINATION SYSTEM OF GLYCATED PROTEINS}

도 1은 본 발명에 따른 당화단백질 검출 시스템의 개념도;

도 2는 본 발명의 당화단백질 검출에 적합한 유도체들의 일예;

도 3a와 3b는 본 발명의 바람직한 일 실시형태를 도시한 당화단백질 검출 센서;

도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시형태를 도시한 당화단백질 검출 센서;

도 5a와 5b는 본 발명의 당화단백질 검출 시스템에 적합한 시료 전처리 분주기의 일 실시형태;

도 6은 본 발명을 구현할 수 있는 미세유로형 당화단백질 검출 시스템의 개념도;

도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 검출된 당화단백질의 분광학적 결과를 나타낸 그래프;

도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 센서 카트리지의 일 실시형태;

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 카트리지 센서와 모니터의 일 실시형태; 및

도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 스크린인쇄형 전극 카트리지의 일 실시형태.

<도면의 주요 부분에 관한 부호의 간단한 설명>

01: 하기판 02: 상기판

03: 하판접착테잎 04: 시료주입유로

05: 중간기판 06: 상판접착테잎

07: 기공 또는 보기창

10: 다공성전극체 11: 작동전극

12: 상대전극 13: 여과막

14: 흡수패드 15: 효소

16: 작동전극연결부 17: 상대전극연결부

20: 절연하판 21: 작동전극

22: 상대전극 23: 기준전극

24: 접착성격리판 25: 혈구여과시료주입구

26: 단백질필터 27: 모세관유로기공

28: 친수성절연상판

30: 당화단백질모니터 31: 디스플레이

32: 시작버튼 33: 메모리/셋팅버튼

34: 센서삽입부

40: 혈액용혈혼합기구 41: 혈액채취모세관

42: 혈액채취모세관뚜껑 43: 채취혈액주입플런저

44: 모세관삽입구 45: 용혈제재 및 표식자

46: 시료분주구 47: 시료분주구뚜껑

48: 단백질거름여과층

50: 단백질 51: 당화단백질

60: 효소기질보론산유도체(반응 전)

61: 효소기질보론산유도체(반응 후)

70: 전기화학표식자보론산유도체(반응 전)

71: 전기화학표식자보론산유도체(반응 후)

본 발명은 전기화학적 당화단백질 검출 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 결합시킨 후 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 필터링하기 위한 수단; 및 상기 당화단백질과 결합되지 않고 여과된 표식자 화합물을 정량하기 위한 수단을 포함하는 당화단백질 검출 시스템에 대한 것이다.

최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며, 구체적으로 각자가 스트립 형태의 바이오센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다. 그러나, 혈당은 환자의 식이상태 및 신체의 상태에 따라 변화가 심할 뿐만 아니라 측정에 필요한 혈액을 채취하는 과정에 통증이 수반되므로 환자가 정확하게 규정을 맞추어 측정하기가 어려운 단점이 있다.

당화단백질 특히 당화혈색소는 단백질이 체액 중 포도당과 장시간에 걸쳐 반응하여 아마도리 재배치 과정을 거쳐 생성되는 변형단백질들이다. 이렇게 생성된 당화단백질들은 보통 당뇨 환자의 2-3 개월의 혈당량의 평균과 밀접한 관계가 있음이 잘 알려져 있다. 따라서, 일상적인 혈당의 측정은 환자의 매일 매일의 건강상태를 확인하고 상태에 합당한 조치를 취하는데 중요한 반면 환자의 장기적인 혈당 관리 상태를 파악하고 합당한 치료 조치를 취하기 위해서는 당화 단백질/혈색소의 측정이 필요하다.

표준적인 당화단백질의 측정은 채취된 혈액시료를 적당한 시료, 예를 들어 트리톤 x-100과 같은 계면활성제와 섞어 용혈한 후 보론산유도체로 충진한 HPLC 컬럼을 통과시킨 다음 보통의 단백질과 분리하고 가시광선으로 분리되어 나온 단백질들의 특이 파장을 측정함으로써 당화된 비율을 산정하는 방법을 사용한다. 그러나, 표준 방법은 항상 시설이 잘 갖추어진 중앙 임상실험실에서 고가의 크로마토그 래피 장비를 사용하여 전문가가 실시해야 하는 단점이 있다. 따라서, 환자 개인 또는 개인 의사가 직접 당뇨환자의 상태를 파악하기에 용이하도록 현장에서 간편하게 당화단백질의 양을 결정할 수 있는 방법 및 기구에 대한 연구가 활발하게 진행되어왔다.

미국특허 제5,541,117호는 채취한 혈액을 용혈한 후, 이 시료가 당화혈색소에 특이적으로 결합하는 면역항체를 고정한 패드와 혈색소에 특이적인 면역항체를 고정한 패드에 연속적으로 전개되도록 하여 분리하고, 이 각 패드에 고정된 혈색소의 양을 반사광의 강도로 결정한 후 비율을 산정하는 방법을 제시하고 있다. 미국특허 제6,677,158호는 제5,541,117호와 유사한 방법을 제시하며 특히 당화단백질에 선택적 결합을 할 수 있는 화합물로 면역항체 대신 보론산유도체를 다공성 패드에 충전하는 방법을 제시하고 있다. 이와 같은 래피드 테스트 형태의 면역크로마토그래피 방법은 간편하게 당화혈색소의 비율을 결정할 수 있는 장점이 있는 반면 값이 비싼 항체들을 사용해야 하고, 전개지로 사용하는 다공성 패드 자체의 불균일성으로 인하여 일정한 품질을 갖는 제품으로 생산되도록 관리하는 것이 까다롭고 얻어지는 결과 또한 반정량적(semi-quantitative)인 단점이 있다.

미국특허 제5,242,842호는 당화단백질과 선택적 결합을 할 수 있는 발색단이 치환된 보론산유도체와 반응시킨 후 단백질과 당화단백질을 함께 침전시키거나 분리하고 발색단을 검출할 수 있는 분광학적 방법을 사용하여 두 물질의 존재 비율을 산정하는 방법을 제시하고 있다. 이 방법은 여과지에 단백질 및 보론산유도체와 결합한 당화단백질을 걸러내어 반사광을 측정할 수 있기 때문에 간단한 휴대용 기기 를 사용한 분석이 가능하다. 미국특허 제5,631,364호는 당화단백질 분석에 유용한 다양한 종류의 발색단이 치환된 보론산유도체의 제조방법을 제시한다. 그러나, 이 방법은 당화단백질과 결합하지 않은 보론산유도체를 세척하여야 하는 과정이 필요하며 시료의 양을 항상 정확히 맞추어야만 옳은 결과를 얻을 수 있다는 까다로운 면이 있다.

유럽특허 제EP0194084B1호는 페로센이 치환된 보론산 유도체를 사용하여 당화단백질과 결합시킨 후, 결합하지 않은 보론산페로센이 당산화효소의 전자전달 매개체 역할을 하도록 하여 전기화학적으로 당화단백질 양을 추정하는 방법을 제시하였다. 그러나, 이 방법은 혈액에 포함된 혈당의 영향을 배제할 수 없으므로 실용적으로 사용하기 어렵다. 미국특허 제6,054,039호는 전자전달매개체로 변형된 스크린인쇄전극에 당화단백질과 산화환원반응을 일으킬 수 있는 화합물들을 먹여놓은 다공성 막들을 적층하고 상대전극을 대면형으로 배치한 후 당화단백질의 양을 직접 측정할 수 있는 방법을 제시하였다. 그러나, 이 방법은 전극센서의 구성이 복잡하고 당화단백질의 상대적 양을 추정하기 어려운 단점이 있다.

이외에도 휴대용 당화단백질에 사용하기에 적합한 기술들이 유럽특허 제455,225호와 미국특허 제6,174,734호 및 제6,162,645호에 제시된 바 있다. 이 특허들은 당화단백질과 비당화단백질을 다 결합시킬 수 있는 면역항체를 고정한 고체상을 사용하여 시료 중의 단백질을 분리해낸 다음 효소-항체 접합 또는 보론산유도체 표식자화합물을 사용하여 당화단백질의 상대적 양을 결정하는 방법을 제시하고 있다. 또한, 미국특허출원 제2003/0073243호는 고체상 표면을 보론산유도체로 변 형시킨 후 당화혈색소만을 분리해내고 당화혈색소의 과산화수소에 대한 촉매적 성격을 이용하여 발색방법으로 고체상 표면에 결합된 당화혈색소의 양을 측정할 수 있는 방법을 제시하고 있다.

위에 인용한 기존의 기술들은 모두 당화단백질에 표식자를 결합시키고 이들을 분광학적 또는 전기화학적으로 측정한다는 특징을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 위의 종래 기술과는 달리, 당화단백질과 결합한 후 남은 표식자를 분리해내어 그 양을 측정함으로써 당화단백질의 양을 산정할 수 있음이 원리적으로 가능함을 알고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 당화단백질과 결합하지 않은 표식자를 직접 측정함으로써 이의 분광학적 측정시 단밸질에 의한 시료의 탁도나 고유의 색이 미치는 영향을 최소화할 수 있고, 이의 전기화학적 측정시 전극의 표면에 흡착하는 단백질의 방해 영향을 최소화할 수 있음과 동시에 잔여 표식자만을 걸러낼 수 있으면 효소 및 특별한 전자전달매개체 등을 일 구성요소로 하는 전극이 아닌 일반적인 전극만으로도 측정이 가능한 당화단백질 검출 시스템을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 모두 결합시킨 후 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 필터링하기 위한 수단; 및 상기 당화단백질과 결합되지 않고 여과된 표식자 화합물을 정량하기 위한 수단을 포함하는 당화단백질 검출 시스템을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 당화단백질 검출 시스템에 있어서, 상기 검출 시스템은 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 분자량이 상대적으로 작은 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 시료 용액에 첨가하여 당화단백질에 결합시킨 후, 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 걸러낼 수 있는 필터링 수단을 포함한다. 상기 필터링을 통하여 분자량이 큰 당화단백질 및 기타의 방해종들을 분자량이 작은 표식자 화합물과 분리하여 걸러낸다. 걸러진 시료에 포함된 표식자 화합물을 인지할 수 있는 본 발명 분야에서 통상적으로 사용되는 분석기기나 센서로 결정하여 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.

본 발명의 당화단백질 검출 시스템에 있어서, 상기 표식자 화합물은 보론산 유도체에 전기화학적 산화환원쌍 활성 기능기, 분광학적 발색단 기능기, 효소의 기질 기능기 등을 치환하여 만든 화합물이면 특히 한정하지 않으나, 바람직하게는 상기 표식자 화합물로 페로센 유도체, 안트라퀴논, 퀴논 및 그 유도체, 유기 전동성 염 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 비오로겐(viologen), 디메틸페로센(dimethylferrocene; DMF), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카복실산(ferocene monocarboxylic acid; FCOOH), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane; TCNQ), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone; PQQ), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene; TTF), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium; NMA+), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene; TTT), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium; NMP+), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid; MBTHDMAB), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzothio-zolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin; AAP), 디메틸아닐린 (dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine; TMB), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트](2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone) 및 벤지딘(benzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 치환체를 갖는 보론산유도체를 사용할 수 있다. 이러한 활성이 있는 치환체를 갖는 보론산 유도체는 당화단백질과 특이적으로 반응을 일으킬 수 있다.

본 발명의 당화단백질 검출 시스템의 일 실시형태는 바람직하게는, 당화단백질 검출용 전극센서로 구현될 수 있다.

본 발명에 따른 당화단백질 검출용 전극센서의 바람직한 일 실시형태는, 미세다공성막의 양면에 대칭으로 형성된 작동전극 및 상대전극으로 이루어진 전극체를 포함한 것으로, 상기 작동전극 앞에는 상기 단백질제거필터가 소정 거리 이격되어 형성되고, 상기 상대전극의 타면에는 흡수패드가 부착되어 단백질이 제거된 표식자 화합물을 포함한 시료가 한 방향으로 원활히 흐르도록 구성됨이 바람직하다. 상기 흡수패드는 다공성 전극의 한 면에 가해진 시료를 빨아들여 전극의 반대편으로 용이하게 이송되도록 하는 역할을 한다. 본 발명의 일 실시예로 사용되는 다공성 금전극만으로는 친수성이 충분하지 못하여 시료의 이송이 충분히 균일하게 이루어지지 못하여 분석 오차가 심하게 날 수 있다. 흡수패드는 이러한 문제를 해결해 준다. 이를 통하여 단백질이 제거된 잔여 시료가 한 방향으로 흐르도록 하며, 잔여 시료 중에 포함된 표식자 화합물을 분광학적 방법 또는 전기화학적 분석 방법으로 결정할 수 있도록 한다. 이는 상기 전극체에 정해진 시간 동안 전압 또는 펄스 전압을 가하여 발생되는 전류를 읽을 수 있는 장치에 연결하여 상기 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 당화단백질 검출용 전극센서의 바람직한 다른 일 실시형태는, 일 개의 절연체 기판 상에 형성된 시료인입부; 상기 시료인입부에 설치된 단백질제거필터; 하나 또는 두 개의 절연체 기판 상에 형성된 작동전극, 상대전극, 선 택적으로는 기준전극으로 이루어진 전극체; 및 시료가 상기 시료인입부로부터 상기 전극체에 이르도록 구성한 모세관유로 또는 미세유로를 포함하고, 상기 절연체 중 상판을 친수성 처리하여 주입된 시료가 상기 유로를 따라 흐르기 쉽도록 구성될 수 있다. 이를 통하여 단백질이 제거된 잔여 시료가 한 방향으로 흐르도록 하며, 잔여 시료 중에 포함된 표식자 화합물을 전기화학적 분석 방법 또는 분광학적 분석 방법으로 결정할 수 있도록 한다. 이는 상기 전극체에 정해진 시간 동안 전압 또는 펄스 전압을 가하여 발생되는 전류를 읽을 수 있는 장치에 연결하여 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 당화단백질의 양은 표식자 화합물의 총 농도에서 검출된 표식자 화합물의 농도차로부터 결정될 수 있다.

본 발명의 당화단백질 검출 시스템은 추가적으로 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 상기의 단백질이 제거된 잔여물 속의 표식자 화합물을 전기화학적 방법 또는 분광학적 검출 방법으로 결정하여 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정할 수 있다. 이때, 상기 여과된 잔류물 속의 표식자 화합물의 양은 흡수도, 형광, 인광, 또는 화학발광의 양을 측정하여 결정될 수 있다.

상기 수단은, 바람직하게는 비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 것으로서 도 6의 구성을 갖도록 구성되어 있는데, 그 중 한 유로의 내부는 표식자 화합물, 바람직하게는 치환체를 가지는 보론산 유도체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료액체의 흐름을 지속할 수 있는 표식자 화합물, 바람직하게는 보론산 유도체 고정 삽입물을 장착하여 당화단백질을 걸러내기 위한 수단; 및 상기 유로의 끝 부분에 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 구비할 수 있고, 다른 유로에는 당화혈색소와 직접적인 산화환원반응을 일으켜 전기화학적으로 검출될 수 있는 시안산철(Ⅱ)/(Ⅲ)이 있어서 당화/비당화 혈색소의 총량을 검출할 수 있도록 구비된다. 이러한 미세유로형 당화단백질 검출 시스템은 당화혈색소의 양을 당화/비당화혈색소 총량에 대하여 특별한 분리과정 없이 측정이 가능하다는 장점을 갖는다.

상기 수단은, 바람직하게는 비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 기구로, 그 한 유로에는 비당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되고, 다른 유로에는 당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되도록 구성된 것으로서, 두 유로의 내부는 모두 분석 대상 단백질에 대해 특이 결합을 하는 면역 항체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료 액체의 흐름을 지속할 수 있는 면역항체를 포함하는 삽입물을 설치하여 당화단백질 및 비당화단백질을 모두 걸러내기 위한 수단; 및 표식자 화합물들만 미세유로의 끝 부분까지 흘러가 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화 대 비당화단백질의 상대적 양을 각각 결정할기 위한 수단을 구비할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 당화단백질 검출 시스템에 적합한 시료전처리 분주 기구를 포함한다.

상기 시료전처리 분주 기구는, 바람직하게는 시료채취용 모세관; 상기 채취된 시료를 주입하기 위한 모세관삽입구가 형성된 시료주입플런저; 및 일단에는 상기 시료주입플런저가 장착되고, 타단에는 시료를 분주하기 위한 시료분주구가 형성된 주사기 형태의 용기를 포함하여 구성될 수 있다.

상기 시료의 전처리는, 바람직하게는 주입 시료가 용혈제 및 표식자 화합물과 섞여, 상기 시료전처리 분주 기구의 상기 주사기 형태의 용기 내에서 수행될 수 있다.

상기 시료전처리 기구는 추가적으로 단백질제거여과층을 더 포함할 수 있다. 이는 센서에 장착되는 필터를 대체하여 동일 역할을 수행하게 함으로써 센서의 구성을 간단하게 구성할 수 있어, 센서의 대량 생산이 용이해지는 장점을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 일 실시형태를 보인 참고 도면을 참조하여 보다 상세히 설 명한다. 단, 하기 실시형태는 본 발명을 예시하기 위한 최선의 실시형태를 보인 것으로 본 발명의 내용이 하기 실시형태만으로 한정되거나 제한되는 것이 아님은 물론이다.

도 1은 본 발명에 따른 당화단백질 검출 시스템의 개념도를 도시한 것이다. 보론산유도체를 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 모두 결합시킨 후 분자량이 큰 단백질들을 제거한 후 보론산유도체를 검출할 수 있는 적절한 방법, 즉 분광학 방법 또는 전기화학적 방법을 사용하여 보론산유도체의 총 농도에서 검출된 보론산유도체의 농도를 빼내어 당화단백질의 양을 측정하는 개념도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 당화단백질의 검출에 적절한 전기화학적 활성기가 치환된 보론산유도체들의 일예를 나타낸 것이다. 구체적으로, 화학식 (1)은 4-[2-아미노에틸-(2-안트라-5,10-디옥소-카보닐)아미노]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[2-aminoethyl-(2-anthra-5,10-dioxo-carbonyl)amino]-phenyl boronic acid monohydrochloride); 화학식 (2)는 4-[11H-안트라{1,2-d}이미다졸-5,10-디옥소]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[11H-anthra{1,2-d}imidazole-5,10-dioxo]-phenyl boronic acid monohydrochloride); 화학식 (3)은 4-[N-{안트라퀴논-1-카보닐}-벤조이미다졸]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[N-{anthraquinone-1-carbonyl}-benzoimidazole]-phenyl boronic acid monohydrochloride); 화학식 (4) 는 4-[2-아미노에틸-(2-안트라-5,10-디옥소-아미노)카보닐]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[2-aminoethyl-(2-anthra-5,10-dioxo-amino)carbonyl]-phenyl boronic acid monohydrochloride); 화학식 (5)는 3-아미노-4-[2-안트라-5,10-디옥소-아조]페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (3-amino-4-[2-anthra-5,10-dioxo-azo]phenyl boronic acid monohydrochloride); 화학식 (6)은 4-[2-{N-페로세노일-벤조이미다졸}]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[2-{N-ferrocenoyl-benzoimidazole}]-phenyl boronic acid monohydrochloride); 및 화학식 (7)은 4-[N,N-2-아미노에틸-(4-페로세노일벤조일}-아미노]-페닐 보론산 모노하이드로클로라이드 (4-[N,N-2-aminoethyl-(4-ferrocenoylbenzoyl}-amino]-phenyl boronic acid monohydrochloride)를 각각 나타낸다.

도 3은 본 발명의 일 실시형태에 따른 검출 시스템의 예를 도시한 것으로, 도 3a와 3b의 전극센서 시스템은 다공성막 재질 (10) 바람직하게는 마이크로미터 크기의 기공을 갖는 나일론 또는 셀룰로오스 막에 진공플라즈마 증착법 또는 금속페이스트로 전극을 앞뒤 면에 대칭이 되도록 작동전극(11)과 상대전극(12)을 형성하고 작동전극 앞에 단백질제거필터(13)와 상대전극에 흡수패드(14)를 부착하여 단백질이 제거된 보론산유도체 표식자를 포함하는 시료가 한 방향으로 흐를 수 있도록 한 것이다. 사용하고자 하는 보론산유도체의 표식자가 효소기질인 경우 작동전극(11)의 표면을 표식자에 상응하는 효소(15)로 변형하여 표식자의 양을 결정할 수 있도록 만들며(도 3a), 일반적인 전기화학활성 표식자인 경우에는 작동전극 표면을 변형시키지 않고 그대로 사용한다(도 3b).

도 4는 본 발명의 다른 실시형태에 따른 당화단백질 검출 시스템의 예를 나타낸 것으로, 플라스틱, 실리콘 또는 세라믹과 같은 절연기판(20)에 작동전극(21), 상대전극(22) 및 기준전극(23)이 진공증착, 스크린프린팅 또는 사진식각법 등의 방법으로 형성되어 있으며, 이 전극판 위에 시료의 흐름을 인도하는 유로가 형성되어 있는 양면 테잎 또는 일정한 두께를 갖는 접착 층(24)을 형성하고, 시료주입부(25)에 단백질제거패드(26)가 있으며, 주입된 시료는 모세관유로(27)를 따라 흐르기 쉽도록 적절한 친수성 처리가 된 상판(28)을 장착하여 도 1에 제시한 개념을 실현할 수 있는 전극센서를 구성할 수 있도록 한 것이다.

당화단백질의 절대량보다 단백질 전체량에 대한 당화단백질의 상대적 비율이 중요한 경우는 비당화단백질 또는 전체 단백질 양을 측정할 수 있는 전극을 같이 사용할 수 있다. 대표적으로, 당화혈색소의 경우 필터패드 (13) 또는 (25) 전에 헤모글로빈 혈색소와 산화환원 반응을 잘하는 페리시안나이드(Fe³⁺)를 포함하는 시약 또는 그러한 시약이 고정된 시료 층과 반응하도록 한 후, 단백질제거필터를 통과하게 하여 환원된 Fe²⁺의 양을 측정함으로써 전체 혈색소의 양을 결정할 수 있다. 걸러진 시료에 포함된 Fe²⁺/Fe³⁺의 결정은 산화와 환원의 이중 펄스를 사용하여 정확히 할 수 있다.

도 5a는 본 발명에 따른 검출 시스템의 또 다른 중요 구성 부품으로, 생체로부터 채취한 체액을 정확한 양만 취하여 적절하게 전처리하고 표식자 화합물과 결합시킬 수 있는 시료 전처리 주입 기구(40)를 나타낸 것이다. 생체의 시료를 모세관(41)으로 채취한 후 모세관부착뚜껑(42)을 플런저(43)에 마련된 시료주입구(44)를 통하여 삽입하고 흔들어서 채취한 시료와 미리 채워놓은 용혈제 및 표식자 화합물(45)과 함께 골고루 섞어준다. 충분한 반응시간이 지난 후 시료배출구(46)를 통하여 시료가 빠져 나오도록 시료분출구 뚜껑(47)을 열고 준비된 전극센서 또는 분광 셀에 적정량의 시료를 모세관부착뚜껑(42)과 결합된 플런저(43)를 밀어서 분주하여 준다. 본 발명의 구성품인 시료전처리 분주기구(40)는 별도의 피펫이나 용기를 따로 사용하지 않고 일정량의 시료를 전처리하고 측정 센서에 분주하여 줄 수 있는 장점을 갖는다.

도 5b는 시료의 분출구 부분에 단백질제거필터(48)를 장착하여 센서에 장착하는 동일 역할의 필터 (13) 또는 (25)를 대체할 수 있다. 이 경우 센서의 구성이 간단해짐으로써 센서의 대량생산이 용이해지는 장점이 있게 된다.

도 6은 본 발명의 모든 과정을 미세유로형 단일 분석 칩(microfluidic lab-on-a-chip)에 구현한 경우의 흐름도이다. 도 6a의 미세유로칩은 단백질제거 필터 대신 분석하고자 하는 단백질에 대하여 특이 결합을 할 수 있는 면역항체를 사용하 여 당화/비당화 단백질들을 제거하고 표식자만을 검출하는 방법이다. 도 6b는 당화단백질만을 제거하여 비당화단백질의 양을 모두 검출하는 방법으로 두 물질 사이의 상대적 양을 결정할 수 있는 방법을 제시한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다.

<실시예 1>

Bio-Rad사의 10% HbA1c control 표준용액 200 ㎕를 800 ㎕의 용혈제와 섞어 0.16 mM의 용혈된 HbA1c를 준비하고, 이를 pH 10.5인 인산 완충용액(phosphate buffer)과 섞어 500 ㎕의 0.128, 0.096, 0.064, 0.032, 0.0032 mM의 시료로 준비하고, 동일 완충용액 500 ㎕에 녹인 p-phenylboronic amine(PBA)과 섞어 준 다음 10분간 방치한다. 이와 같이 준비한 시료를 Amicon사의 제품인 Ultra-4 Centrifugal Filter Device에 넣어 원심분리기로 혈색소 단백질들을 분리하였다. 다음 분리되어 나온 용액에 포함된 PBA의 UV 흡광도를 quartz 분광셀에 넣어 얻은 후, HbA1c의 각 농도에 대하여 상응하는 PBA의 흡광도를 240 nm에서 측정하였다.

도 7은 그 결과를 도시한 것으로서 걸러져 나온 용액에 포함된 PBA의 흡광도로 HbA1c의 농도가 증가할수록 정비례하여 자유로운 PBA의 흡광도가 감소함을 볼 수 있다.

<실시예 2>

본 발명의 개념을 구현하기에 적합한 전극센서를 도 8과 같이 구현하였다. 먼저, 폴리에틸렌 (polyethylene; PET) 하기판(01)에 시료주입유로(04)가 형성되어 있는 테이프(03)를 적층하고, 그 위에 혈구 및 단백질제거를 위하여 셀룰로오스 막 또는 나일론 막(13)을 올려놓은 다음 이를 중간기판(05)로 고정하였다. 다시 그 위에 나일론에 금을 양면에 진공 증착하여 작동전극(11)과 상대전극(12)를 형성한 전극체(10)을 올려놓고 양면테이프 중간기판(06)으로 고정하고, 흡수패드(14)를 상대전극(12) 위에 고정하고, 마지막으로 상기판 PET(02)로 전체 전극체를 보호하였다. 이와 같이 형성한 전극으로 실시예 1에서 제시한 방법과 도 2의 유도체 중 페로센이 치환된 보론산유도체 표식자를 사용하여 얻은 시료를 주입하여 +400 mV의 전압을 가하여 얻은 전류를 측정한 결과 HbA1c의 양이 증가할수록 신호 전류의 크기가 정비례로 감소하는 결과를 얻었다.

<실시예 3>

실시예 2의 방법으로 구현한 전극체를 병렬로 연결하여 도 9와 같이 준비하였다. 이와 같이 준비된 시료의 한쪽 전극에는 실시예 2의 방법으로 준비한 시료를 주입하고, 다른 쪽에는 페리시아나이드로 처리한 시료를 주입하여 +400 mV의 전압을 걸어주고 전류를 측정하여 전체 혈색소의 양에 비례하는 신호를 얻었다. 두 전극에서 얻은 전류신호의 비로부터 당화혈색소의 존재비를 계산하였다. 이때 사용한 기기의 구성은 도 9와 같다.

<실시예 4>

PET 필름에 스크린 인쇄로 전극을 형성한 후 이 전극체들을 병렬로 연결하고 전극구조에 있어서 시료주입구(25)를 통해 시료주입이 용이하도록 통기부(29)를 두고 도 10과 같이 준비하였다. 다음 한쪽 전극에는 실시예 2의 방법으로 준비한 시료를 주입하고, 다른 쪽에는 페리시아나이드로 처리한 시료를 주입하여 +400 mV의 전압을 걸어주고 전류를 측정하여 전체 혈색소의 양에 비례하는 신호를 얻었다. 두 전극에서 얻은 전류신호의 비로부터 당화혈색소의 존재비를 계산하였으며 결과는 바이오래드사의 표준장비로 얻은 결과와 잘 일치하였다.

본 발명에 따른 당화단백질 검출 시스템은 현재까지 알려진 당화단백질 결정법에서 사용하던 당화단백질에 대한 직접적 정량 시스템 대신 당화단백질과 결합하고 남은 잔여 표식자 화합물을 여과한 후 정량함으로써 센서의 구성 및 시스템 제작을 크게 간소화 하였으며, 결과 경제적이면서도 정확한 결과를 얻을 수 있는 분석 시스템을 고안하였다. 본 발명의 효과는 당화단백질 결정에 고가이며 수명에 제한이 큰 면역항체를 사용하지 않고 분석도구를 제작할 수 있는 것이며, 단백질이 분석도구 및 센서에 흡착하여 일으키는 방해문제를 최소화할 수 있고, 특히 전극센서의 구성에서 전극을 항체나 효소 등으로 변형시키지 않고도 제작이 가능하며, 센서 제작의 대량생산 및 품질관리 그리고 제품의 유통과정에서의 보관성 등을 획기적으로 개선할 수 있는 유용한 효과를 제공할 수 있다.

Claims

당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 모두 결합시킨 후 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 필터링하기 위한 수단; 및 상기 당화단백질과 결합되지 않고 여과된 표식자 화합물을 정량하기 위한 수단을 포함하는 당화단백질 검출 장치.
제 1항에 있어서, 상기 검출 시스템은 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 당화단백질 검출 장치.
제 1항에 있어서, 상기 여과된 표식자화합물의 양은 흡수도, 형광, 인광 또는 화학발광의 양을 측정하여 결정됨을 특징으로 하는 당화단백질 검출 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식자 화합물은 전기화학적 산화환원쌍 활성 기능기, 분광학적 발색단 기능기 또는 효소의 기질 기능기를 갖는 화합물임을 특징으로 하는 당화단백질 검출 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식자 화합물은 페로센유도체, 안트라퀴논, 퀴논 및 그 유도체, 및 유기 전도성 염을 포함함을 특징으로 하는 당화단백질 검출 장치.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식자 화합물은 비오로겐(viologen),디메틸페로센(dimethylferrocene; DMF), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카복실산(ferocene monocarboxylic acid; FCOOH), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane; TCNQ), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone; PQQ), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene; TTF), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium; NMA+), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene; TTT), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium; NMP+), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid; MBTHDMAB), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzothio-zolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin; AAP), 디메틸아닐린 (dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine; TMB), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트](2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone) 및 벤지딘(benzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 치환기를 갖는 보론산유도체임을 특징으로 하는 당화단백질 검출 장치.
미세다공성막의 양면에 대칭으로 형성된 작동전극 및 상대전극으로 이루어진 전극체를 포함한 것으로, 상기 작동전극 앞에는 상기 단백질제거필터가 소정 거리 이격되어 형성되고, 상기 상대전극의 타면에는 흡수패드가 부착된 당화단백질 검출용 전극 센서.
일 개의 절연체 기판 상에 형성된 시료인입부; 상기 시료인입부에 설치된 단백질제거필터; 하나 또는 두 개의 절연체 기판 상에 형성된 작동전극, 상대전극, 선택적으로는 기준전극으로 이루어진 전극체; 및 시료가 상기 시료인입부로부터 상기 전극체에 이르도록 구성한 모세관유로 또는 미세유로를 포함하고, 상기 절연체 중 상판이 친수성 처리된 당화단백질 검출용 전극 센서.
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비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 당화단백질 검출 시스템으로서, 한 유로의 내부는 표식자 화합물을 가지는 보론산 유도체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료액체의 흐름을 지속할 수 있는 표식자 화합물 고정 삽입물을 장착하여 당화단백질을 걸러내기 위한 수단; 다른 유로에는 당화/비당화단백질과 모두 산화환원 반응을 할 수 있는 시안산철과 반응이 일어날 수 있도록 하는 수단; 및 상기 유로의 끝 부분에 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 포함하는 미세유로형 당화단백질 검출 장치.
비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 당화단백질 검출 시스템으로서, 그 한 유로에는 비당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되고, 다른 유로에는 당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되도록 구성된 것으로서, 두 유로의 내부는 모두 분석 대상 단백질에 대해 특이 결합을 하는 면역 항체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료 액체의 흐름을 지속할 수 있는 면역항체를 포함하는 삽입물을 설치하여 당화단백질 및 비당화단백질을 모두 걸러내기 위한 수단; 및 표식자 화합물들만 미세유로의 끝 부분까지 흘러가 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화 대 비당화단백질의 상대적 양을 각각 결정하기 위한 수단을 포함하는 미세유로형 당화단백질 검출 장치.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 표식자 화합물은 비오로겐(viologen),디메틸페로센(dimethylferrocene; DMF), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카복실산(ferocene monocarboxylic acid; FCOOH), 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane; TCNQ), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone; PQQ), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene; TTF), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium; NMA+), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene; TTT), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium; NMP+), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid; MBTHDMAB), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzothio-zolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin; AAP), 디메틸아닐린 (dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine; TMB), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트](2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone) 및 벤지딘(benzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 치환기를 갖는 보론산유도체임을 특징으로 하는 미세유로형 당화단백질 검출 장치.