KR100945571B1 - 단백질 측정용 바이오센서 - Google Patents

단백질 측정용 바이오센서 Download PDF

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차근식
남학현
조주영
김문환
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Abstract

특정 단백질과 임피던스를 형성하는 리셉터 층으로서 상기 특정 단백질과 선택적 결합을 유도할 수 있는 작용기를 갖는 전도성 고분자와 전도성 페이스트가 도포된 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 단백질 측정용 바이오센서; 상기 바이오센서를 포함하는 측정부와 시료 주입부를 포함하는 단백질 측정용 키트; 및 상기 단백질 측정용 키트를 이용하여 시료 내의 특정 단백질 농도를 측정하는 단백질 측정 방법이 제공된다.
당화단백질, 임피던스, 자기조립단일층, 전도성 고분자, 보론산(boronic acid) 유도체

Description

단백질 측정용 바이오센서{Protein Detecting Biosensor}
본 발명은 특정 단백질과 임피던스를 형성하는 리셉터 층으로서 상기 특정 단백질과 선택적 결합을 유도할 수 있는 작용기를 갖는 전도성 고분자와 전도성 페이스트가 도포된 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 단백질 측정용 바이오센서; 상기 바이오센서를 포함하는 측정부와 시료 주입부를 포함하는 단백질 측정용 키트; 및 상기 단백질 측정용 키트를 이용하여 시료 내의 특정 단백질 농도를 측정하는 단백질 측정 방법에 관한 것이다.
최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며, 구체적으로 각자가 스트립 형태의 바이오센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다.
이러한 혈당 측정으로, US 5,541,117에는 당화혈색소(당화헤모글로빈)에 특이적으로 반응하는 면역항체를 고정한 패드를 마련하고 시료가 고정된 패드로 전개 하도록 한 후 반사광의 강도로 산출하는 방법이 개시되어 있으나, 사용되는 항체의 가격이 고가이고 다공성 패드의 불균일성에 의해 일정한 품질의 센서를 생산하는 것이 어렵다는 문제점이 있다.
US 5,242,842에는 보론산 유도체와 당화단백질을 결합시킨 후 함께 침전시키거나 분리한 후 분광학적 방법을 사용하여 측정하는 방법이 개시되어 있으나, 당화단백질과 결합하지 않은 보론산 유도체를 세척하는 과정이 필요하고 시료의 양을 정확하게 맞추어야 정확한 결과를 얻을 수 있어서 측정이 까다로운 문제점이 있다.
또한, US 6,162,645, EP0455225B1 및 US 6,174,734에는 면역항체를 고정한 고체상을 사용하여 시료 중의 단백질을 분리한 후 표식자 화합물을 사용하여 당화단백질의 상대적 양을 결정하는 방법이 제시되어 있으나, 이러한 종래의 전기화학적 당화단백질 결정방법들은 당화단백질 및 당화단백질-표식자들을 전극표면에 경쟁적으로 모이게 한 후 표식자와 전기화학적 반응을 일으키는 기질을 주입하여 신호의 크기를 결정하는 것으로, 당화단백질의 농도 측정이 복잡하고 재현성이 어려운 문제점이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 일례는 작용기로서 보론산 유도체와 결합된 전도성 고분자로 형성된 리셉터층을 포함하는 작업전극, 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 당화단백질 측정용 바이오센서 및 이의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 시료 주입부 및 상기 바이오센서를 포함하는 측정부를 포함하는 당화단백질 측정용 키트를 제공한다.
또 다른 예는 상기 당화단백질 측정용 키트를 이용하여 시료 내 당화단백질 농도를 측정하는 단계를 포함하는 당화단백질 측정 방법을 제공한다.
본 발명은 특정 단백질과 결합하여 임피던스를 형성하는 리셉터 층으로서 상기 특정 단백질과 선택적 결합을 유도할 수 있는 작용기를 포함하는 전도성 고분자와 전도성 페이스트가 도포된 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 단백질 측정용 바이오센서; 상기 바이오센서를 포함하는 측정부와 시료 주입부를 포함하는 단백질 측정용 키트; 및 상기 단백질 측정용 키트를 이용하여 시료 내의 특정 단백질 농도를 측정하는 단백질 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이오센서 및 키트는 리셉터 층을 형성시키기 위한 부가적 인 전처리 과정을 생략할 수 있어서 빠르고, 간단하게 제작이 가능하며, 물리, 화학적으로 안정된 특성을 갖고, 측정이 용이하고 간편하며, 정확성 및 재현성이 향상되는 이점을 갖는다.
우선, 본 발명의 일례는 단백질, 특히 당화단백질 농도를 측정할 수 있는 당화단백질 측정용 바이오센서에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 바이오센서는
작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 작업전극, 및
상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명은 상기 바이오센서를 이용하여 단백질, 특히 당화단백질 농도를 측정할 수 있는 당화단백질 측정용 키트에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 키트는
시료 주입부; 및
작용기로서 보론산 작용기(-B(OH)2)와 결합된 전도성 고분자로 형성된 리셉터층을 포함하는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 바이오센서를 포함하는 측정부
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 당화단백질은 단백질에 글루코오스가 결합된 것을 의미하는 것으로, 예컨대, 글루코오스가 결합된 헤모글로빈인 당화헤모글로빈일 수 있다. 상기 시료는 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 분리된 체액, 세포, 조직 등의 모든 생체 시료 를 포함하며, 예컨대 혈액일 수 있다. 본 발명의 바이오센서 또는 키트는 혈액을 시료로 하여 당화헤모글로빈 농도 측정함으로써, 혈당측정 용도로 적용될 수 있다.
상기 작용기는 당화단백질의 글리코실기와 결합하여 임피던스를 발생시키는 것으로, 예컨대 보론산(boronic acid) 작용기(-B(OH)2)일 수 있다.
상기 보론산 작용기는 전도성 고분자에 결합되어 작업전극 표면에 리셉터층을 형성시킬 수 있다. 상기 전도성 고분자는 전기전도성을 갖는 고분자를 의미하는 것으로, 예컨대, 폴리아닐린, 폴리피놀, 폴리싸이오펜, 폴리아세틸렌 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 고분자는 우수한 전기전도도를 갖고 다양한 응용이 가능하며, 열적 안정성과 화학적 안정성이 우수하므로, 적용시 바이오센서의 성능 및 수명을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
상기 보론산 작용기 (-B(OH)2)는 모든 보론산 유도체 화합물로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 3-아미노페닐보론산(3-Aminophenylboronic acid), 3-티오펜보론산(3-Thiopheneboronic acid), 3-포르밀-4-티오펜보론산(3-Formyl-4-thiopheneboronic acid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 유래하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 3-아미노페닐보론산으로 보로산 유도체의 폴리아닐린을 제작할 수 있으며, 3-티오펜보론산, 및/또는 3-포르밀-4-티오펜보론산으로 보론상 유도체의 폴리싸이오펜 전도성 고분자를 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같이 작용기를 전도성 고분자와 결합하여 작업 전극에 도입하는 경우, 기존의 싸이올(-thiol), 싸이오펜(-thiophene) 등과 같은 황화합물을 자가조립단일층(SAMs, self-assembled monolayers) 형성에 의한 화학적 방법과 비교하여, 경제적으로 보다 유리할 뿐 아니라, 작용기가 화학적, 물리적으로 보다 안정하게 작업전극에 도입될 수 있다는 이점을 갖는다.
상기 작업전극은 통상적으로 사용되는 모든 재질로부터 형성 가능하고, 예컨대, 금, 백금, 은, 은/염화은, 탄소, 구리, 니켈, 크롬, 팔라듐, 산화인듐주석 (ITO) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
작업전극 표면에 보론산 작용기와 전도성 고분자를 보다 안정적으로 도입하기 위하여, 전도성 페이스트를 추가로 도입할 수 있다. 상기 전도성 페이스트는 전기전도성을 갖는 페이스트 상 물질을 총칭하는 것으로, 예컨대, 탄소 페이스트, 은 페이스트, 구리 페이스트 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 작업전극 표면에 전도성 페이스트를 도포한 후 그 위에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 도입하거나, 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 전도성 페이스트와 혼합하여 작업전극 표면에 적용함으로써, 작업전극 표면에 당화단백질과 반응하여 임피던스를 발생시키는 안정적인 리셉터층을 형성시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 전도성 페이스트와의 혼합물을 기판에 적용하여 리셉터층 역할을 함께 하는 작업전극으로 사용할 수도 있다.
상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자 및/또는 전도성 페이스트로부터 형성된 리셉터층 또는 작업전극은 통상적인 모든 방법으로 형성된 것일 수 있으며, 바람직하게는 스크린 프린팅 기법으로 형성된 것일 수 있다. 예컨대, 작업전극 표면에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자 또는 이와 전도성 페이스트와의 혼합물을 스크린 프린팅하여 작업전극 상에 리셉터층을 형성시키거나, 기판상에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자 또는 이와 전도성 페이스트와의 혼합물을 스크린 프린팅하여 그 자체로 당화단백질과 반응 가능한 작업전극을 형성시킬 수 있다.
상기 리셉터층 또는 작업전극 형성을 위한 전도성 고분자 및 전도성 페이스트 혼합물 내의 전도성 고분자와 전도성 페이스트의 혼합비는 소망하는 효과, 목적, 용도 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 실험적으로 얻어진 바로는, 예컨대, 중량 기준으로, 1:50 내지 500 (전도성 고분자 중량:전도성 페이스트 중량), 바람직하게는 1: 80 내지 120일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 바이오센서의 기판의 재질은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 실리콘, 유리, 용융실리카, 플라스틱, PDMS(Polydimetylysiloxan) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 재질로 된 것일 수 있다.
상기 바이오센서는 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함할 수 있다. 또한, 상기 바이오센서는 작업전극 또는 작업전극 표면에 형성된 리셉터층의 보론산 작용기와 당화단백질과의 결합에 의하여 발생하는 임피던스를 측정하기 위한 보조전극을 추가로 포함할 수 있다. 상기 기준전극과 보조전극은 각각 독립 적으로 금, 백금, 은, 은/염화은, 탄소, 구리, 니켈, 크롬, 팔라듐 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 형성된 것일 수 있고, 통상의 방법, 예컨대 스크린 프린팅 기법으로 형성된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 당화단백질 측정용 키트는 시료 주입부에 주입된 시료가 모세관 현상에 의해 측정부로 원활하게 이동할 수 있도록 공기 배출구를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서 및 키트의 당화단백질 측정 원리는 다음과 같다: 시료 중의 당화단백질의 존재에 의해 상기 작업전극에 도입된 보론산 작용기는 당화단백질에 대하여 강한 결합력을 가지므로, 시료 내에 당화단백질이 존재하면 당화단백질과 보론산 작용기와의 결합을 통해 작업전극 표면에 전도성 고분자-당화단백질 결합체가 형성된다. 이와 같이 형성된 결합체는 Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4- 또는 Ru(NH3)3+/Ru(NH3)2+과 같은 전자-환원쌍의 전근 표면으로의 전자 전달 반응을 방해하여 저항이 증가하는 것과 동일한 효과를 가져오며, 저항 증가는 형성된 결합체 개체수에 비례한다. 따라서, 이러한 저항을 이용하여 임피던스를 측정하면 당화단백질 농도의 정량적 측정이 가능하다 (도 2 참조).
상기 산화-환원쌍은 전극에 전자를 전달하여 산화-환원 반응을 일으키는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대, 페로센(ferrocene), 페로센 유도체 (예컨대, 데카메틸페로센(decamethylferrocene), 뷰틸페로센(butylferrocene)), 퀴논(quinones), 퀴논 유도체 (예컨대, 1,2-벤조퀴논(1,2-benzoquinone), 1,4-벤조퀴논(1,4-benzoquinone)), 유기 전도성 염(organic conducting salt) (예컨대, 테트라싸이아퓰밸런-파라-테트라싸이아노퀴노다이메쎄인(tetrathiafulvalene-p-tetracyanoquinodimethane)), 비오로겐(viologen), 헥사아민루세늄(III)클로라이드(hexaammineruthenium(III)chloride), 포타슘페리시아나이드 (potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene (DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌 (tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존 (3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나논(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine), 프루시안 블루(prussian blue) 등으로로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 산화-환원 쌍일 수 있으며, Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4- 및 Ru(NH3)3+/Ru(NH3)2+로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화-환원 쌍일 수 있다.
상기 산화-환원쌍은 키트 내에 준비되어 있거나, 측정시에 시료와 함께, 또는 시료 주입 전후에 키트에 첨가될 수 있다
본 발명의 한 구현예에 있어서, 당화단백질 농도를 비당화단백질을 포함하는 시료 내의 총 단백질 양에 대한 당화단백질의 상대적인 양으로 나타낼 수 있다. 예컨대, 당화단백질로서 당화헤모글로빈 농도를 측정하는 경우, 시료로 사용되는 혈액 내의 총 헤모글로빈 양에 대한 당화헤모글로빈의 상대적인 양으로 나타낼 수 있다. 따라서 당화헤모글로빈의 농도를 구하기 위해서는 당화헤모글로빈 양뿐 아니라 총 헤모글로빈의 양을 함께 측정해야 하므로, 종래에는 헤모글로빈과 당화헤모글로빈을 분리하는 단계를 거쳐 측정하는 방법이 사용되었다.
이에, 본 발명의 한 구현예에서는, Fe3+를 헤모글로빈과 당화헤모글로빈의 반응지표물질로 사용하여 분리과정 없이 동시에 측정할 수 있다. 헤모글로빈의 경우 헤모글로빈을 구성하는 햄(HEME)기에 포함된 Fe2+와 완충용액에 혼합된 Fe3+와의 가역적 산화, 환원 반응에 의한 전류를 전기화학적 방법을 통해 측정할 수 있다. 즉 본 발명의 경우 기존의 당화단백질의 측정방법과는 달리 헤모글로빈과 당화단백질의 분리과정 없이 측정이 가능하다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 도 4에서 보는 것과 같이 각 측정 물질에 따른 센서가 구분되어 있을 수 있다. 예컨대, 본 발명의 키트는 상기 당화단백질의 측정을 위한 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용된 기준전극을 포함하는 바이오센서 이외에, 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용되지 않은 기준전극을 포함하여 비당화단백질을 포함하는 전체 단백질 농도를 측정하는 별도의 바이오센서를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 한 구체예에서, 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용되지 않은 기준전극을 포함하는 비당화단백질을 포함하는 전체 단백질 농도를 측정하기 위한 바이오센서는 Fe3+가 첨가되어 비당화헤모글로빈을 포함하는 전체 헤모글로빈 농도를 전류법으로 측정할 수 있는 것일 수 있다 (도 5 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 키트는 당화헤모글로빈과 전체 헤모글로빈을 동시에 측정하기 위해 채혈 모세관이 용이하게 삽입 결합할 수 있도록 마련된 플랑저, 용혈 시약 및 산화-환원 쌍이 포함된 완충용액이 들어있는 몸체, 상기 몸체의 일단부에 마련된 필터를 포함하는 배출구를 갖는 시료전처리 주입기를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
이하에서 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바이오센서 및 키트를 보다 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오센서를 모식적으로 보여주는 것이다. (a)는 작업전극(120), 기준전극(121), 보조전극(122), 및 상기 각 전극을 측정 장비와 연 결하는 전기연결선 (124)을 포함하는 바이오센서를 보여주는 것이고, (b)는 상기 3 개의 전극을 제외한 나머지 부분에 절연 물질을 이용하여 절연층(123)이 형성된 모습을 보여주고, (c)는 소량의 시료를 빠른 시간에 측정하기 위하여 양면테이프(125)를 적용하여 미세유로를 만들어 모세관 현상에 의하여 시료가 빠르게 이동할 수 있도록 만든 모습이다. 또한 도 1은 시료와 산화-환원 전자쌍을 포함하는 측정용액이 주입되는 시료 주입구(127), 및 원활한 시료 및/또는 용액의 원활한 이동을 위한 공기배출구(126)가 도시되어 있다. 당화단백질의 측정용 바이오센서의 경우 작업전극(120) 표면에 상기에서 제시한 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 적용하여 제작하는 반면, 전체 헤모글로빈 측정용 바이오센서의 경우 보론산 작용기와 결합된 전도성 고분자가 적용되지 않은 작업전극을 사용한다.
도 2는 본 발명에서 이용한 당화단백질 측정의원리를 보여주는 것으로, 시료 (예컨대, 혈액) 내에 존재하는 당화단백질에 대해 강한 결합력을 가지고 있는 보론산 작용기와 당화단백질의 결합을 통해 작업전극 표면에 새로운 분자 구조물이 형성되는데, 이는 Fe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4- 또는 Ru(NH3)3+/Ru(NH3)2+과 같은 산화-환원 물질의 전극 표면으로의 전자 전달 반응을 방해하는 저항이 증가하는 것과 동일하므로, 이를 이용해 임피던스를 측정하면 시료 중 당화단백질의 농도를 측정할 수 있게 된다.
도 3은 본 발명에 따른 바이오센서의 제작 과성을 모식적으로 보여주는 것으로, 보론산 작용기를 포함하는 전도성 고분자(110)을 작업전극(120)을 구성하는 전 도성 페이스트 (탄소 반죽, 111)에 혼합하고, 물리적 방법으로 혼합 및 교반한다. 이는 전도성 페이스트에 보론산 작용기가 균일하게 혼합됨으로써 전극의 재현성 및 정확성을 부여하기 위한 과정이다. 보론산 작용기는 비전도성의 특성을 가지고 있기 때문에 전도성 탄소 반죽에 혼합된다면 탄소 반죽의 바탕 저항값이 증가해 제작된 탄소 전극의 전자 전달효율이 감소되고 결과 적으로 전극 임피던스가 증가된다. 이에 본 발명에서는 탄소 전극의 기본 전도성을 유지하면서 보론산 작용기를 탄소 반죽에 도입하기 위해 보론산 작용기를 전도성 고분자에 결합시켜 보론산 작용기를 말단 작용기로 갖는 전도성 고분자의 형태로 도입하는 것을 특징으로 한다. 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 적절히 혼합된 탄소 반죽은 스크린-프린팅 기법을 통해 기판(123, 예컨대, 절연성 플라스틱)위에 작업전극(120)으로 형성된다. 기준전극(121)은 일정전위를 유지할 수 있는, 예컨대 은/염화은 또는 유사 기준전극으로 사용할 수 있는 물질로부터 형성된 것이 바람직하여, 일 구현예에서는 은 반죽을 이용해 스크린-프린팅 할 수 있다. 보조전극(122)은 측정시료와 화학적 반응을 일으키지 않는 도체가 바람직하며, 일 구현예에서는 보론산 작용기를 포함하는 전도성 고분자를 포함하지 않는 탄소 반죽을 이용해 보조전극(122)을 스크린-프린팅 한다.
도 4는 본 발명에 따른 측정 방법을 개략적으로 나타낸 것으로, 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용된 작업전극을 포함하는 바이오센서를 통하여 임피던스 (예컨대 Fe3+/Fe2+) 측정에 의하여 당화단백질 농도를 측정하는 과정과, 보론 산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용되지 않은 작업전극을 포함하는 바이오센서를 통하여 전류법(Fe3+)에 의하여 전체 단백질 농도를 측정하는 과정이 나타나 있다. 상기 당화단백질 농도 측정과 전체 단백질 농도 측정은 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용된 작업전극을 포함하는 바이오센서와 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 적용되지 않은 작업전극을 포함하는 바이오센서를 포함하는 키트 내에서 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있으며, 순차적으로 수행되는 경우 그 순서에는 제한이 없다. 도 4는 각 측정 물질에 따라 바이오센서가 구분되어 각 과정이 각각 진행되는 모습을 보여준다.
도 5는 용혈 시약(Hemolysis reagent), 완충용액, Fe3+가 화합된 용액에 일정 양의 혈액을 첨가한 측정용액을 각 전극에 주입하는 방식의 일례를 모식적으로 나타낸 그림으로, 헤모글로빈과 당화단백질 측정을 위한 두 개의 작업전극 (당화단백질 측정용 전극은 보론산 유도체를 포함하는 전도성 고분자를 포함하는 작업전극을 가진 전극이여, 헤모글로빈 측정용 전극은 상기 전도성 고분자를 포함하지 않는 작업전극을 각 각 의미함)를 측정 키트에 삽입하며 용혈 과정을 거친 측정용액을 혈액 주입구(140)로 주입하면 모세관 현상에 의해 소량의 용액이 유로를 통해 각 전극으로 이동하게 된다.
도 6은 채취한 전혈(Whole blood)을 용혈 과정을 통해 당화단백질 및 헤모글로빈의 측정을 위한 측정 용액으로 변형시키기 위한 방법을 모식적으로 나타낸 것으로, 모세관 현상을 이용한 채혈침이 구비된 혈액 포집 모세관(201)으로 일정 양의 혈액을 채취한 뒤 쉽게 찢어질 수 있는 막으로 구성된 혈액 주입 구(202)에 삽입하여 용혈시약, 완충용액, Fe3+가 혼합된 측정용액(204)에 주사기의 피스톤 원리를 이용하여 플런저(203)로 밀어 넣게 된다. 상기 측정용액(204)과 혼합된 혈액 중 기타 고형물질은 필터(205)를 통하여 제거된다. 혼합된 측정용액은 용액 주입 구(207)를 통해 혈액 주입구(140)에 끼워져 주입되게 된다. 뚜껑(206)은 혼합 및 시료 주입 전 오염을 방지하는 역할을 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 바이오센서의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조 방법은 기판에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 작업전극을 형성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일례에서, 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 작업전극을 형성시키는 단계는 기판에 작업전극을 형성시킨 후, 상기 작업전극 표면에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 적용하여 수행되는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 작업전극을 형성시키는 단계는 기판에 작업전극을 형성시킨 후, 상기 작업전극 표면에 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 전도성 페이스트와의 혼합물을 적용하여 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자가 보다 안정적으로 작업전극에 결합되어 있도록 하는 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하는 작업전극을 형성시키는 단계는 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 전도성 페이스트와의 혼합물을 기판에 적용하여 그 자체를 보론산 작용기가 표면에 형성된 작업전극으로 형성시키는 것일 수 있다.
상기 작업전극의 형성, 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자, 및 이와 전도성 페이스트와의 혼합물의 적용은 통상적인 방법에 의할 수 있으며, 예컨대 스크린 프린팅 기법에 의하여 수행할 수 있다.
상기 전극, 전도성 고분자 및 전도성 페이스트는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 당화단백질 측정용 키트를 이용하여 시료 내 당화단백질 농도를 측정하는 당화단백질 측정 방법에 관한 것이다. 당화단백질 측정 원리 및 과정은 앞서 설명한 바와 같다.
이상과 같은 구성의 본 발명은 선택적 결합을 유도하는 리셉터 층을 화학적 전처리 과정 없이 도입하기 때문에 센서의 제작이 간편해지는 효과가 있다.
또한, 리셉터 층을 구성하는 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자는 물리적, 화학적으로 안정한 특징을 가지고 있어 센서의 안정성을 향상시켜 사용 수명을 연장시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 센서의 제작에 있어 스크린-프린팅 기법을 이용하는데 있어 탄소 반죽과 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자의 혼합, 교반이 물리적으로 균일하게 이루진다는 가정을 만족한다면, 센서의 재현성 및 정확성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 빠르고 정확하게 당화단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있어 측정 의 정확성 및 신뢰성을 향상시킬 수 있으며, 일회용의 센서로 만들기에도 적합하다.
이하, 본 발명을 구체적 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 보론산 작용기가 결합된 폴리아닐린 전도성 고분자와 탄소 페이스트를 작업전극으로 이용하는 당화단백질 측정용 센서의 제작 및 임피던스 측정
작업전극은 3-아미노페닐보론산(Aldrich) 이용하여 보론산 작용기를 포함하는 폴리아닐린 전도성 고분자 합성하고 (수율: 약 20-30%), 이를 탄소 페이스트(Dupont)과 중량기준으로 1:100의 비율로 혼합, 교반한 뒤 스크린-프린팅 기법을 통해 절연성 플라스틱 기판위에 형성하였다. 기준전극으로는 은 페이스트(Asahi)를, 보조전극으로는 탄소 페이스트(Dupont)를 사용하였으며, 절연층은 절연 페이스트(Asahi)를 이용하였다.
임피던스의 측정은 임피던스 측정법을 이용하였으며, 실험 조건은 다음과 같이 하였다 (Anal. chem. 2008, 80, 8035-8044). 완충 용액은 pH 7.4, 10mM PBS와 2.5mM Fe3+을 바탕 용액으로 사용하였으며, 혈액 샘플은 용혈된 혈액샘플(Reference Material Institute for Clinical Chemistrys Standards, JCCRM)을 사용하였으며, 표준물질로는 전체 헤모글로빈 양(140 ± 10 g/L) 에 대하여 5 내지 12 중량%의 당화헤모글로빈을 포함하는 JCCLS CRM004a (Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards)을 사용하였다.
측정 조건은 다음과 같다. 측정 주파수 영역은 100 내지 0.1 kHz로 하였으며, 직류전압 130mV, 교류전압은 10mV로 하였다. 전하이동저항은 4 mL pH 8.5의 완충용액으로 제조한 여러 농도의 스톡 용액에서 40 μL를 취하여 전극과 산화-환원 쌍이 있는 용액에 주입하여 측정하였다 (도 7 참조).
그 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 각 농도에 따른 임피던스 값은 주파수에 따른 Zreal과 Zimage로 나타낸 감응곡선을 통해 볼 수 있으며, 당화단백질의 농도가 증가함에 따라 전하전이저항(Rct)에 일치하는 반원의 크기가 커지는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 상기 결과에 따른 검정 곡선으로, 농도에 따른 전하전이저항 값은 좋은 직선성(r2 0.9979)을 보이는 것으로 보아 본 발명의 당화단백질 측정용 바이오센서는 임피던스 측정법을 이용한 센서로서 적용이 가능함을 알 수 있다.
실시예 2: 보론산 작용기가 결합된 폴리싸이오펜 전도성 고분자와 탄소 페이스트를 작업전극으로 이용하는 당화단백질 측정용 센서의 제작 및 임피던스 측정
전도성 탄소 페이스트(Dupont)를 스크린-프린팅 기법을 이용하여 제작한 작 업전극에 3-Thiopheneboronic acid(Aldrich) 40mM과 불화나트륨(NaF) 120mM을 메틸알콜(MeOH)에 용해시킨 용액에 담궈 -0.1V에서 1.5V의 전위영역을 100mV/sec.의 주사속도로 10회 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 진행시켜 보론산 작용기가 결합된 폴리싸이오펜을 증착시켰다. 기준전극으로는 실시예 1과 동일하게 은 페이스트(Asahi)를, 보조전극으로는 탄소 페이스트(Dupont)를 사용하였으며, 절연층은 절연 페이스트(Asahi)를 이용하였다.
상기와 같이 제작된 전극의 당화단백질의 대한 임피던스의 측정방법은 상기 실시예 1과 같으며, 그 결과는 도9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 각 농도에 따른 임피던스 값은 주파수에 따른 Zreal과 Zimage로 나타낸 감응곡선을 통해 볼 수 있으며, 당화단백질의 농도가 증가함에 따라 전하전이저항(Rct)에 일치하는 반원의 크기가 커지는 것으로 보아 전기화학적 증착법을 이용한 폴리싸이오펜 역시 폴리아닐린과 마찬가지로 당화단백질의 측정 센서로 적용이 가능함을 확인할 수 있다.
도 10은 상기 결과에 따른 검정 곡선으로, 농도에 따른 전하전이저항 값은 좋은 직선성(r2 0.9974)을 보이는 것으로 보아 본 발명의 당화단백질 측정용 바이오센서는 임피던스 측정법을 이용한 센서로서 적용이 가능함을 알 수 있다.
비교예: 보론산 작용기와 탄소 페이스트를 작업전극으로 이용하는 당화단백질 측정용 센서의 제작 및 임피던스 측정
전도성을 띠지 않고 물에 녹지 않는 3-아세트아미도페닐보론산(3-Acetamidophenylboronic acid, Aldrich)을 탄소 페이스트(Dupont)과 중량기준으로 1:100의 비율로 혼합하여 스크린-프린팅 기법으로 작업전극을 제작한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 당화단백질 측정용 센서를 제작하고 임피던스를 측정하였다.
이와 같이 얻어진 각 농도에 따른 임피던스 값을 주파수에 따른 Zreal과 Zimage로 나타낸 감응곡선으로 나타내어 도 11에 나타내었으며, 이에 대한 검정곡선을 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 바와 같이, 전도성을 띠지 않는 고분자를 사용하는 경우 직선을 유지하지 못하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 표적물질 농도에 따른 측정 민감도가 떨어짐을 의미하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 측정센서의 정면도이다.
도 2는 임피던스 측정을 통한 당화헤모글로빈 농도 측정 원리를 모식적으로 보여주는 것이다.
도 3은 바이오센서 제작 과정을 모식적으로 보여주는 것이다.
도 4는 당화헤모글로빈 측정 방법을 개략적으로 보여주는 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 키트 카트리지의 정면도이다.
도 6은 주사기 형태의 혈액 혼합 및 주입 장치의 모식도이다.
도 7은 전도성 고분자로 폴리아닐린을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 감응곡선이다.
도 8은 전도성 고분자로 폴리아닐린을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 검정곡선이다.
도 9는 전도성 고분자로 폴리싸이오펜을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 감응곡선이다.
도 10은 전도성 고분자로 폴리싸이오펜을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 검정곡선이다.
도 11는 비전도성 고분자인 3-아세트아미도페닐보론산을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 감응곡선이다.
도 12은 비전도성 고분자인 3-아세트아미도페닐보론산을 사용한 경우의 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 검정곡선이다.
--도면 부호의 설명--
110: 보론산 작용기가 도입된 전도성 고분자
111: 전도성 페이스트 112: 절연성 플라스틱 기판
120: 작업전극 121: 기준전극
122: 보조전극 123: 절연층
124: 전기 연결선 125: 양면테이프
126: 공기배출구 140: 시료주입부
201: 혈액포집 모세관 202: 혈액주입구
203: 플런저 204: 측정용액
205: 필터 206: 혈액주입장치
207: 용액 주입구 및 뚜껑

Claims (19)

  1. 보론산 작용기(-B(OH)2)가 결합된 폴리아닐린, 폴리피놀, 폴리싸이오펜, 및 폴리아세틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 전도성 고분자와 전도성 페이스트와의 혼합물을 포함하는 작업전극, 및
    상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극
    을 포함하는, 당화단백질 측정용 바이오센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 작업전극은 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 전도성 페이스트의 혼합물을 스크린 프린팅 기법으로 형성시킨 것인,
    당화단백질 측정용 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전도성 페이스트는 탄소 페이스트, 은 페이스트 및 구리 페이스트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
    당화단백질 측정용 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오센서는 작업전극의 임피던스의 측정을 위한 보조전극을 추가로 포함하는 것인
    당화단백질 측정용 바이오센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 당화단백질은 헤모글로빈에 글루코오즈가 결합된 당화헤모글로빈인,
    당화단백질 측정용 바이오센서.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자는 아미노페닐보론산(3-Aminophenylboronic acid), 3-티오펜보론산(3-Thiopheneboronic acid), 및 3-포르밀-4-티오펜보론산(3-Formyl-4-thiopheneboronic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 중합하여 얻어진 것인,
    당화단백질 측정용 바이오센서.
  8. 시료 주입부; 및
    보론산 작용기(-B(OH)2)가 결합된 폴리아닐린, 폴리피놀, 폴리싸이오펜, 및 폴리아세틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 전도성 고분자와 전도성 페이스트와의 혼합물을 포함하는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 바이오센서를 포함하는 측정부
    를 포함하는, 당화단백질 측정용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 작업전극은 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자와 전도성 페이스트의 혼합물을 스크린 프린팅 기법으로 형성시킨 것인,
    당화단백질 측정용 키트.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 전도성 페이스트는 탄소 페이스트, 은 페이스트, 및 구리 페이스트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
    당화단백질 측정용 키트.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 측정부는 작업전극의 임피던스의 측정을 위한 보조전극을 추가로 포함하는 것인
    당화단백질 측정용 키트.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 시료는 생체에서 분리된 혈액이고,
    상기 당화단백질은 헤모글로빈에 글루코오즈가 결합된 당화헤모글로빈인,
    당화단백질 측정용 키트.
  13. 삭제
  14. 제8항에 있어서,
    상기 보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자는 아미노페닐보론산(3-Aminophenylboronic acid), 3-티오펜보론산(3-Thiopheneboronic acid), 및 3-포르밀-4-티오펜보론산(3-Formyl-4-thiopheneboronic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 중합하여 얻어진 것인,
    당화단백질 측정용 키트.
  15. 제8항에 있어서,
    시료 주입부에 주입된 시료가 모세관 현상에 의해 측정부로 이동할 수 있도 록 공기 배출구를 추가로 포함하는
    당화단백질 측정용 키트.
  16. 제8항에 있어서,
    보론산 작용기가 결합된 전도성 고분자를 포함하지 않는 작업전극 및 상기 작업전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 비당화단백질 농도 측정을 위한 측정부를 추가로 포함하는
    당화단백질 측정용 키트.
  17. 제8항에 있어서,
    상기 측정부에 산화-환원쌍을 추가로 포함하여, 상기 작업전극에 형성된 리셉터 층과 당화단백질과의 결합물에 의한 산화-환원 쌍의 전자전달을 방해에 의하여 발생하는 임피던스를 측정하는 것을 특징으로 하는,
    당화단백질 측정용 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 산화-환원 쌍은 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt), 비오로겐(viologen), 헥사아민루세늄(III)클로라이드(hexaammineruthenium(III)chloride), 포타슘페리시아나이드 (potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene (DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌 (tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존 (3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나논(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine), 및 프루시안 블루(prussian blue)으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 것인,
    당화단백질 측정용 키트.
  19. 제8항 내지 제12항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 당화단백질 측정용 키트를 포함하여 생체로부터 분리된 시료 내의 당화단백질 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
    당화단백질 측정 방법.
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