WO2010147251A1 - 당화혈색소 측정 방법 - Google Patents

당화혈색소 측정 방법 Download PDF

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WO2010147251A1
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hemoglobin
glycated hemoglobin
measuring
blood sample
glycated
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PCT/KR2009/003303
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배병우
이성동
김형수
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주식회사 인포피아
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
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    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring glycated hemoglobin used to test for diabetes, and more particularly, to a method for measuring glycated hemoglobin in a more simplified process.
  • concentration measurement of analytes for anesthetics or harmful chemicals has been usefully used in the medical or environmental field.
  • the measurement of the concentration of biological samples used in the field of medical diagnosis and treatment is of increasing interest with the increase in human desire to be free from various diseases.
  • the glycated hemoglobin test which can measure blood glucose in relation to diabetes, has a growing interest in determining a relatively long-term blood glucose average with a single measurement.
  • Diabetes one of the causes of adult kidney disease, is known to reduce life expectancy by 15 years, and low blood sugar control is known to prevent the development of chronic complications caused by diabetes.
  • Hemoglobin A1c also known as glycated hemoglobin, is one of the hemoglobin (Hemoglobin) contained in human red blood cells (Red Blood Cells). When blood sugar (glucose) rises in the blood, some of the glucose in the blood binds to hemoglobin. Hemoglobin combined with glucose is called glycated hemoglobin, and hemoglobin is also called HbA1c. Since glycated hemoglobin levels are balanced with blood glucose levels over the last two to three months, glycated hemoglobin can be recognized as blood glucose levels over the last two to three months. It is important to measure glycated hemoglobin because it can be used as an indicator of diabetes management and future drug control by checking the level of glycated hemoglobin.
  • Glycosylated hemoglobin should be detected by measuring only the glucose portion specifically to distinguish it from hemoglobin in the form of glucose bound to the valine at the N-terminus of hemoglobin beta-chain in the blood. There are various ways to measure this part, and the method using an antibody and borate affinity chromatography are the most used.
  • glycated hemoglobin levels since the amount of total hemoglobin varies from person to person, it is expressed as the ratio of glycated hemoglobin to total hemoglobin, and the amount of total hemoglobin is also measured. Typical hemoglobin ranges for adults and infants range from 13.0 to 17.0 g / dl for men, 12.0 to 15.0 g / dl for women and 11.0 to 14.0 g / dl for infants. If the glycated hemoglobin level is 6.0%, it can be said that blood sugar was maintained at 120 g / dl on average for three months. The American Diabetes Association (ADA) states that glycated hemoglobin levels should be maintained below 7.0%, with a normal range of 4.0-6.5%.
  • ADA American Diabetes Association
  • One aspect of the present invention is to provide a method that can easily measure the concentration of glycated hemoglobin through a simplified process than the prior art.
  • the hemolysis step of hemolytic blood sample with hemolysis Reacting the bead conjugate in which beads and glycated hemoglobin binding material are bound with the hemolyzed blood sample; A first measuring step of measuring the amount of total hemoglobin in the blood; A separation step of separating normal hemoglobin from glycated hemoglobin bound to the bead conjugate; A second measuring step of measuring the amount of glycated hemoglobin in the blood; And a calculation step of calculating a concentration of glycated hemoglobin in the blood sample based on the total amount of glycated hemoglobin and the amount of glycated hemoglobin in the measured blood sample.
  • the hemolysis step and the reaction step are preferably performed in a single step by concurrently administering the hemolytic solution and the bead conjugate to the blood sample.
  • the hemolysin is preferably selected from the group consisting of tris, hepes, hess, TES, and PIPES.
  • the beads are preferably at least one of agarose, cellulose, sepharose, polystyrene, polymethyl methacrylate, polyvinyltoluene, latex beads and glass beads.
  • the glycated hemoglobin binding material is preferably at least one of boronic acid, concanavalin A, and an antibody.
  • the first measurement step and the second measurement step is preferably measured by the light reflection measurement method through an optical sensor.
  • the separation step is preferably performed by flowing a washing liquid.
  • the washing solution is preferably selected from the group of tris, hepes (HEPES), TES (TES), pipes (PIPES) and the like to operate between pH 7 ⁇ 8.5.
  • the separation step is preferably performed by absorbing normal hemoglobin using an absorption pad.
  • the absorbent pad is preferably a porous pad.
  • the size of the pores included in the porous pad is preferably larger than hemoglobin and smaller than the beads.
  • the measurement step is further simplified by measuring the amount of total hemoglobin from a whole blood sample including glycated hemoglobin and normal hemoglobin in a state in which the bead conjugate in which the beads and the glycated hemoglobin conjugate are bound to each other is combined.
  • the concentration of glycated hemoglobin in the blood sample can be more easily measured.
  • FIG. 1 shows a chemical structure in which a bead conjugate and glycated hemoglobin react using boronic acid as a glycated hemoglobin binding material.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a reaction step (a) of the present invention, a state in which a hemoglobin hemoglobin in which a normal hemoglobin and a bead conjugate are combined, and a state in which a normal hemoglobin is removed (c) are present in a sample after the reaction step It is shown.
  • FIG. 3 illustrates an exemplary method for measuring the concentration of hemoglobin.
  • Figure 4 schematically shows a state in which normal hemoglobin is absorbed by the absorption pad and the glycated hemoglobin bound to the bead conjugate is present in the measurement window.
  • 5 is a graph showing that the presence of beads does not affect the measured value of hemoglobin concentration.
  • the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, to provide a method that can more easily measure the glycated hemoglobin present in the blood sample.
  • the hemolysis step of hemolysis of the blood sample with hemolysis Reacting the bead conjugate in which beads and glycated hemoglobin binding material are bound with the hemolyzed blood sample; A first measuring step of measuring the amount of total hemoglobin in the blood; A separation step of separating normal hemoglobin from glycated hemoglobin bound to the bead conjugate; A second measuring step of measuring the amount of glycated hemoglobin in the blood; And a calculation step of calculating a concentration of glycated hemoglobin in the blood sample based on the total amount of hemoglobin and the amount of glycated hemoglobin in the measured blood sample.
  • the hemolysis step for exposing the normal hemoglobin and glycated hemoglobin contained in the blood is first performed by hemolysis of the blood sample. do.
  • hemolysates that can be used are hemolysates that have a buffer concentration of osmotic pressure capable of hemolysis and operate between pH 7 and 8.5, and are used for tris, hepes, TES and pipes ( Preferably selected from the group consisting of PIPES). More preferably, as the buffer solution containing the surfactant, for example, 20 mM Hepes buffer solution (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid HEPES; pH 8.1) is preferably used.
  • the hemolytic solution is not limited thereto and may use any suitable hemolytic solution known in the art. Hemoglobin and hemoglobin are present in hemolyzed blood samples.
  • the bead conjugated to the hemolyzed blood sample and the bead conjugate in which the glycated hemoglobin binding material is bound to perform a reaction step for the glycated hemoglobin to be labeled by the beads.
  • the term "bead conjugate” means that the bead is bound to a binding material capable of binding to glycated hemoglobin, and the bead conjugate is attached to the glycated hemoglobin by the glycated hemoglobin binding material.
  • glycosylated hemoglobin binding material used in the present invention means a substance capable of specifically binding to glycated hemoglobin, for example boronic acid (boronic acid), concanavalin A (concanavalin A) and It may be at least one of the antibodies, preferably boronic acid may be used.
  • FIG. 1 illustrates a chemical structure in which a bead conjugate and glycated hemoglobin react using boronic acid as a glycated hemoglobin binding material.
  • boronic acid As shown in FIG. 1, the OH functional group of boronic acid and the cis-diol of a sugar bound to a glycated hemoglobin end react with each other to form a pentagonal ring structure.By using this property, boronic acid is a glycated hemoglobin in total hemoglobin. Only specifically bound.
  • glycated hemoglobin binding material when the label is attached to the glycated hemoglobin binding material, only glycated hemoglobin may be selectively labeled, and prior art distinguishes glycated hemoglobin by attaching a dye or a magnetic substance.
  • beads having a constant size are used for separation of glycated hemoglobin.
  • Beads that can be used in the present invention are a polymeric polysaccharide support such as agarose, cellulose or sepharose, polystyrene, polymethylmethacrylate, polyvinyltoluene It may be at least one of latex beads and glass beads, such as polyvinyltolune, and sepharose beads are preferably used.
  • the beads used in the present invention do not act as dyes and allow the glycated hemoglobin to be separated from normal hemoglobin by the volume of the beads in a later step.
  • the particle size of the beads is preferably selected in consideration of the precipitation time of the glycated hemoglobin binding material-bead combined with the glycated hemoglobin and the degree of reaction with the glycated hemoglobin after the reaction.
  • the hemolysis step and the reaction step may be carried out in a separate step, but preferably may be performed in a single step by simultaneously administering the hemolytic solution and the bead conjugate to a blood sample.
  • the cartridge used as the reaction vessel it is preferable to shake the cartridge used as the reaction vessel to promote the reaction of the blood sample and the hemolyte and the bead conjugate in the hemolysis step and the reaction step.
  • This is to induce blood samples to be hemolyzed by the hemolyzed blood and to simultaneously induce glycated hemoglobin to specifically react with the bead conjugate.
  • the hemolyzed blood sample may take a certain time, for example, 3 minutes to sufficiently react with the bead conjugate.
  • the hemolysis step and the reaction step include a glycated hemoglobin in which the normal hemoglobin and the bead conjugate are combined in the sample, and the amount of total hemoglobin in the blood is measured. That is, Figure 2 (a) shows a process in which the bead conjugate is combined with glycated hemoglobin, Figure 2 (b) shows the state of the total hemoglobin containing both the labeled glycated hemoglobin and normal hemoglobin. 2 (c) shows a state in which normal hemoglobin is removed from the blood sample and only glycated hemoglobin remains.
  • the first measurement step of measuring the total hemoglobin concentration in the blood in the state where the bead conjugated glycated hemoglobin and normal hemoglobin is present is performed, which is determined by the amount of glycated hemoglobin according to the measurement method using the light reflection characteristic. It can be measured.
  • the characteristic of hemoglobin that specifically absorbs an optical signal of a specific frequency is used.
  • the glycated hemoglobin measuring device preferably measures the amount of glycated hemoglobin by using a light emitting element such as a photodiode and a light receiving element.
  • FIG. 3 shows an exemplary measurement procedure, wherein the reaction is preferably carried out in a cartridge comprising a transparent measuring window as shown in FIG. 3.
  • the light emitting device emits an optical signal having a specific wavelength.
  • the hemoglobin of the blood sample may specifically emit an optical signal having a wavelength of about 430 nm indicating absorption.
  • the light receiving element receives an optical signal emitted from the light emitting element and passed through the cartridge. That is, the amount of hemoglobin contained in the cartridge can be measured by outputting the light emission control signal to the light emitting device and converting the optical signal input from the light receiving device into an electrical signal through an A / D converter.
  • glycated hemoglobin bound to the bead conjugate to detect the amount of hemoglobin in the total blood and measure the amount of glycated hemoglobin prior to the bead attachment.
  • the bead conjugated to glycated hemoglobin did not affect the measured value of the total hemoglobin amount, as can be seen in Example 1, so that unnecessary steps could be omitted. It was made.
  • a separation step of separating normal hemoglobin from the glycated hemoglobin bound to the bead conjugate should be performed.
  • the separation step is performed by absorbing only normal hemoglobin using an absorption pad. Can be.
  • the absorbent pad that can be used in the present invention is preferably a porous pad, wherein the size of the pores included in the porous pad should be larger than hemoglobin but smaller than the beads.
  • a porous pad selected from polyester, polyurethane, and the like can be used.
  • the absorption pad absorbs the measured blood sample mixture and blocks the movement of the blood sample mixture.
  • the absorbent pad is preferably located below the measurement region as shown in FIG. 4.
  • the separating step may be an absorbent pad type, but is not limited thereto.
  • the separation step is preferably performed by flowing a washing liquid for clearer separation and shortening the separation time.
  • Washing liquid that can be used in the present invention is preferably selected from the group of tris, Hepes (HEPES), TES (PIPES) and the like. As the wash solution washes the blood sample mixture, non-specific hemoglobin (Ao) present in the blood sample is removed.
  • hemoglobin (Hb) present in red blood cells of blood samples is mostly unglycosylated normal hemoglobin (Ao), where only 4-14% of normal hemoglobin is present as glycated hemoglobin (HbA1c) in response to glucose. do. Therefore, in order to measure glycated hemoglobin in blood, it is necessary to remove general hemoglobin, and for this purpose, it is desirable to be able to easily separate and measure glycated hemoglobin using a washing solution capable of washing normal hemoglobin.
  • a second measurement step of measuring the concentration of the separated glycated hemoglobin is performed.
  • the second measuring step may be performed by the same method as the first measuring step described above. That is, the second measurement step is also preferably measured by the light reflection measurement method through the optical sensor.
  • the relative amount of glycated hemoglobin in the blood sample is then measured by dividing the total hemoglobin by the amount of glycated hemoglobin. At this time, the glycated hemoglobin ratio is calculated by the following equation.
  • Ratio of glycated hemoglobin (%) glycated hemoglobin / total hemoglobin ⁇ 100
  • the reaction is preferably performed in a cartridge including a measurement area
  • the "measurement area" is an area for measuring the amount of hemoglobin and glycated hemoglobin in the blood sample in the cartridge.
  • the region above the absorbent pad may be referred to.
  • the measurement region may measure the amount of hemoglobin according to the light reflection characteristic measurement method.
  • hemoglobin takes advantage of its specific absorption of optical signals at specific frequencies. By the characteristics of such hemoglobin, it is possible to compare the concentration of light and the color tone, thereby measuring the concentration of hemoglobin.
  • the measurement area may further include an optical window through which light is reflected through an external optical sensor to measure light reflection characteristics.
  • CM Sepharose beads are washed three times with distilled water to a total volume of 1 L and then twice with 100 mM MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) PH 4.7.
  • the washing method is based on the method of precipitation after adding the buffer and discarding the supernatant.
  • the washing step removes the ethanol components remaining in the beads and changes the yield of 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC or EDAC) to an optimal synthetic pH with good yield.
  • EDC 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • EDC or EDAC is a zero-length crosslinking agent connecting the carboxyl group and the primary amine.
  • EDC 46 g of EDC and 4.65 g of APBA were dissolved in 100 mM MES (PH 4.7), and then sequentially added to the bead solution, and reacted at 4 ° C. for 2 hours.
  • APBA is sensitive to light and must be reacted in the dark.
  • EDC absorbs moisture well, so close the lid immediately after weighing and be careful about storage.
  • Synthesis by adding crosslinker EDC and synthetic material boronic acid is synthesized at low temperature in order to improve efficiency such as the production of synthetic by-products.
  • FIG. 1 illustrates an exemplary chemical structure in which a bead conjugate and glycated hemoglobin react using aminophenyl-boronic acid (APBA) as a glycated hemoglobin binding material.
  • APBA aminophenyl-boronic acid
  • FIG. 1 the OH functional group of boronic acid and the cis-diol of a sugar bound to a glycated hemoglobin end react with each other to form a pentagonal ring structure.By using this property, boronic acid is a glycated hemoglobin in total hemoglobin. Only specifically bound.
  • the following samples were prepared by centrifuging any 10 samples including the blood of diabetic patients and normal persons and adjusting the ratio of plasma and precipitated red blood cells. Hemoglobin levels were measured using Hb 201 (HemoCue, Sweden).
  • Clover A1C (Inpopia Co., Ltd.) is converted to factory mode. In factory mode, the intensity of reflected light is displayed on the LCD as raw data. After the clover A1C cartridge (Inpopia Co., Ltd.) is put into the clover A1C, 700ul of the hemolytic solution and the bead conjugate mixture are injected into the reaction zone. Shake each sample well, inject 4ul into the hemolysis, and operate the machine. After 5 minutes, read the data displayed on the LCD of the Clover A-One cartridge.
  • the graph is shown in FIG.
  • the x axis is hemoglobin value and the y axis is k / s value.
  • the k / s value represents the intensity of the reflected light.
  • the correlation between the x-axis and the y-axis as shown in FIG. 5 indicates that the reflected light of the beads also changes constantly in proportion to the change of the hemoglobin value.

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Abstract

본 발명은 당화혈색소 측정 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 혈액 샘플을 용혈액으로 용혈시키는 용혈 단계; 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체를 상기 용혈된 혈액 샘플과 반응시키는 반응단계; 혈액 내의 총 혈색소의 양을 측정하는 제 1 측정 단계; 비드접합체와 결합된 당화혈색소로부터 정상 혈색소를 분리하는 분리 단계; 혈액 내 당화혈색소의 양을 측정하는 제 2 측정 단계; 및 상기 측정된 혈액 샘플 내 총 혈색소의 양과 당화혈색소의 양을 기초로 하여 상기 혈액샘플 내 당화혈색소의 농도를 계산하는 계산 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 당화혈색소 측정방법에 의하면, 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체가 결합된 당화혈색소 및 정상 혈색소를 포함하는 혈액 시료의 상태에서 혈액 내 총 혈색소의 양을 측정함으로써 측정 단계를 보다 단순화할 수 있으며, 또한 본 발명에 의하면 신호 증폭을 위한 별도의 염료를 필요로 하지 않으므로 보다 용이하게 혈액 샘플 내의 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있다.

Description

당화혈색소 측정 방법
본 발명은 당뇨병 여부를 검사하는데 이용되는 당화혈색소 측정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 보다 단순화된 과정으로 당화혈색소를 측정하는 방법에 관한 것이다.
최근 의학적 진단이나 약물을 통한 치료 영역에 있어서, 마취제 또는 유해한 화학물질에 대한 분석 물질의 농도 측정이 의학적 또는 환경적 분야에서 유용하게 사용되고 있다. 그 중 의학적 진단 및 치료 분야에 사용되는 생체 시료 농도의 측정은 다양한 질환으로부터 해방되고 싶어하는 인간의 욕구 증가와 함께 관심이 계속 증가하고 있다. 특히 당뇨병과 관련하여 혈당을 측정할 수 있는 당화혈색소 검사는 한번의 측정으로 비교적 장기간의 혈당 평균치를 알 수 있으므로 그에 대한 관심이 증가하고 있다.
성인 신장병에 이르는 원인의 한 가지인 당뇨병은 평균 수명 기대치를 15년까지 줄일 수 있는 것으로 알려져 있으며, 낮은 혈당 수치 조절로 당뇨병에 의한 만성 합병증의 발생을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.
헤모글로빈 A1c(HbA1c)는 당화혈색소라고도 불리며, 이는 혈색소(Hemoglobin) 중의 하나로 사람의 적혈구(Red Blood Cell)에 들어있다. 혈액 속의 혈당(포도당)이 상승하면 혈액 내 포도당의 일부가 혈색소에 결합하게 된다. 이렇게 포도당과 결합한 혈색소(Hemoglobin)를 당화혈색소(glycated Hemoglobin)라고 하며, 헤모글로빈 에이원씨(HbA1c)라고도 불린다. 당화혈색소의 수치는 지난 2~3 개월 동안의 혈당 수치와 균형을 이루므로, 당화혈색소는 지난 2~3 개월 동안의 혈당 수치로서 인정될 수 있다. 당화혈색소의 수치를 확인함으로써 당뇨의 관리와 향후 약물 조절 등의 지표로 이용될 수 있으므로 당화혈색소의 측정이 중요하다.
당화혈색소는 혈액 내에 존재하는 헤모글로빈 베타-체인의 N-말단의 발린(valine)에 글루코스가 결합한 형태로 헤모글로빈과 구분하기 위해 글루코스 부분만을 특이적으로 감지하여 측정하여야 한다. 이 부분을 측정하는 방법은 여러 가지가 있으며, 항체를 이용하는 방법과 붕산염 친화성 크로마토그래피가 가장 많이 이용된다.
당화혈색소 수치를 정량적으로 측정하기 위해서는 사람마다 총 혈색소의 양이 다르기 때문에, 총 혈색소 양에 대한 당화혈색소 양의 비율로 나타내며, 이 때 총 혈색소의 양도 함께 측정하게 된다. 성인 및 영유아의 일반적인 총 혈색소 범위는 남성의 경우 13.0 ~17.0 g/dl, 여성의 경우 12.0~15.0 g/dl, 영유아의 경우 11.0~14.0 g/dl의 범위를 갖는다. 당화혈색소의 수치가 6.0%라면 3개월 동안 혈당이 평균적으로 120 g/dl로 유지되었다고 표현할 수 있다. 미국당뇨협회(ADA)에서는 7.0% 이하로 당화혈색소의 수치를 유지하여야 한다고 하며, 정상범위는 4.0~6.5%이다.
한편, 미국등록특허 US5,242842 및 미국등록특허 6,399,293 및 6,300,142의 경우 염료 등의 신호 발생 물질이 추가로 요구되어 측정 단계가 번거로우며, JP3340129에서는 희석하는 단계가 추가로 요구되는 등 역시 추가의 단계들이 수행되어야 한다. 즉 이러한 작업은 측정자에게 여러 단계의 직접적인 개입을 요구하므로 측정자는 번거로움을 느낄 수 있다. 또한 측정자의 개입은 측정 과정을 복잡하게 할 수 있고 자연스레 측정시간이 지체되는 문제점이 있다.
따라서, 보다 단순화된 절차의 수행을 통해 용이하게 총 혈액 샘플 내의 당화혈색소 농도를 측정하기 위한 방법이 요구된다.
이에 본 발명의 한 측면은 종래 보다 단순화된 과정을 통해 용이하게 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 혈액 샘플을 용혈액으로 용혈시키는 용혈 단계; 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체를 상기 용혈된 혈액 샘플과 반응시키는 반응단계; 혈액 내의 총 혈색소의 양을 측정하는 제 1 측정 단계; 비드 접합체와 결합된 당화혈색소로부터 정상 혈색소를 분리하는 분리 단계; 혈액 내 당화혈색소의 양을 측정하는 제 2 측정 단계; 및 상기 측정된 혈액 샘플 내 총 혈색소의 양과 당화혈색소의 양을 기초로 하여 상기 혈액샘플 내 당화혈색소의 농도를 계산하는 계산 단계를 포함하는 당화혈색소 측정방법이 제공된다.
상기 용혈 단계 및 반응단계는 용혈액 및 비드접합체를 혈액 샘플에 동시 투여함으로써 단일의 단계로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 용혈액은 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES) 및 피페스(PIPES)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 비드는 아가로즈, 셀룰로즈, 세파로즈, 폴리스티렌, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐톨루엔, 라텍스 비드 및 유리 비드 중 적어도 하나인 것이 바람직하다.
상기 당화혈색소 결합물질은 보로닉산(boronic acid), 콘카나발린 A(concanavalin A) 및 항체(antibody) 중 적어도 하나인 것이 바람직하다.
상기 제 1 측정 단계 및 제 2 측정 단계는 광 센서를 통한 광반사 측정 방식으로 측정하는 것이 바람직하다.
상기 분리단계는 세척액을 흘려주어 수행되는 것이 바람직하다.
상기 세척액은 pH 7~8.5사이에서 작용하는 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES), 피페스(PIPES)등의 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 분리 단계는 정상 혈색소를 흡수 패드를 이용하여 흡수하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 흡수 패드는 다공성 패드인 것이 바람직하다.
상기 다공성 패드에 포함된 포어(pore)의 크기는 혈색소보다 크고 비드 보다 작은 것이 바람직하다.
본 발명의 당화혈색소 측정방법에 의하면, 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체가 결합된 상태의 당화혈색소 및 정상 혈색소를 포함하는 전체 혈액 시료로부터 총 혈색소의 양을 측정함으로써 측정 단계를 보다 단순화하고, 신호 증폭을 위한 별도의 염료를 필요로 하지 않으므로 보다 용이하게 혈액 샘플 내의 당화혈색소의 농도를 측정할 수 있다.
도 1은 보론산을 당화혈색소 결합물질로 이용하여 제조된 비드접합체와 당화혈색소가 반응하는 화학구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 반응 단계(a), 상기 반응 단계를 거친 후 샘플 내에 정상 혈색소와 비드 접합체가 결합된 당화혈색소가 함께 존재하는 상태(b) 및 정상 혈색소가 제거된 상태(c)를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 혈색소의 농도를 측정하기 위한 예시적인 방법을 도시한 것이다.
도 4는 정상 혈색소가 흡수 패드로 흡수되고 측정 창에는 비드접합체와 결합된 당화혈색소가 분리하여 존재하는 상태를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5는 비드의 존재가 혈색소 농도의 측정 값에 영향이 없음을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 혈액 샘플에 존재하는 당화혈색소를 보다 용이하게 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
보다 상세하게, 본 발명의 일 견지에 따르면, 혈액 샘플을 용혈액으로 용혈시키는 용혈 단계; 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체를 상기 용혈된 혈액 샘플과 반응시키는 반응단계; 혈액 내의 총 혈색소의 양을 측정하는 제 1 측정 단계; 비드 접합체와 결합된 당화혈색소로부터 정상 혈색소를 분리하는 분리 단계; 혈액 내 당화혈색소의 양을 측정하는 제 2 측정 단계; 및 상기 측정된 혈액 샘플 내 총 혈색소의 양과 당화혈색소의 양을 기초로 하여 상기 혈액샘플 내 당화혈색소의 농도를 계산하는 계산 단계를 포함하는 당화혈색소 측정방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
혈액 샘플 내의 당화혈색소 농도는 혈액 내 총 혈색소의 양에 상대적으로 측정되므로, 당화혈색소의 농도를 측정하기 위해서는 먼저 혈액 샘플을 용혈시켜서 혈액에 포함된 정상 혈색소 및 당화혈색소를 노출시키기 위한 용혈단계를 수행한다.
이 때 사용될 수 있는 용혈액은 용혈이 가능한 삼투압의 버퍼농도를 지니고 pH 7~8.5사이에서 작용하는 용혈액을 사용하며, 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES) 및 피페스(PIPES)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 계면활성제가 들어있는 완충용액으로서, 예컨대 20 mM 헤페스 완충용액(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid HEPES; pH 8.1)을 사용하는 것이 바람직하다. 다만, 용혈액은 이에 제한되지 않고 당해 기술분야에 알려진 어떠한 적절한 용혈액을 사용할 수 있다. 용혈된 혈액 샘플에는 혈색소(Hemoglobin) 및 당화혈색소(glycated Hemoglobin)가 함께 존재한다.
그 다음, 상기 용혈된 혈액 샘플에 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체를 반응시켜서, 당화혈색소가 비드에 의해 표지되도록 하는 반응 단계를 수행한다. 본 발명에서 사용되는 "비드접합체"의 용어는 당화혈색소에 결합할 수 있는 결합물질에 비드가 결합한 것을 의미하며, 상기 비드접합체는 당화혈색소 결합물질에 의해 당화혈색소에 부착된다. 이 때 본 발명에서 사용되는 "당화혈색소 결합물질"의 용어는 당화혈색소에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 예를 들어 보론산(boronic acid), 콘카나발린 A(concanavalin A) 및 항체(antibody) 중 적어도 하나일 수 있으며, 바람직하게는 보론산을 사용할 수 있다.
도 1에는 보론산을 당화혈색소 결합물질로 이용한 비드접합체와 당화혈색소가 반응하는 화학구조가 예시적으로 설명되어 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 보론산의 OH 작용기와 당화혈색소 말단에 결합된 당의 시스-디올(sis-diol)이 반응하여 오각형의 링 구조를 이루며, 이러한 특성을 이용하여 보론산은 총 혈색소 중에서 당화혈색소에만 특이적으로 결합된다.
따라서, 상기 당화혈색소 결합물질에 표지체를 부착시키는 경우 당화혈색소만을 선택적으로 표지할 수 있으며, 선행기술로는 염료 또는 자기를 띠는 물질 등을 부착시켜서 당화혈색소를 구분한다. 그러나, 본 발명에서는 당화혈색소의 분리를 위해 일정한 크기를 갖는 비드를 이용한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비드(bead)는 아가로즈(agarose), 셀룰로즈(cellulose) 또는 세파로즈(sepharose)와 같은 고분자 다당류 지지체, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltolune)과 같은 라텍스(latex) 비드 및 유리(glass) 비드 중 적어도 하나일 수 있으며, 바람직하게는 세파로스 비드를 사용한다.
본 발명에 사용되는 상기 비드는 염료로서 작용하지 않으며, 당화혈색소를 이후 단계에서 비드의 부피에 의해 정상 혈색소로부터 분리할 수 있도록 한다. 이때 비드의 입경 크기는 반응 후 당화혈색소와 결합한 당화혈색소 결합물질-비드의 침전 시간과 당화혈색소와 반응하는 정도를 고려하여 선택하는 것이 바람직하다.
한편, 상기 용혈 단계 및 반응 단계는 별도의 단계로 수행될 수 있으나, 바람직하게는 상기 용혈액 및 비드접합체를 혈액 샘플에 동시에 투여함으로써 단일의 단계로 수행될 수 있다.
이때 용혈 단계 및 반응단계에서 혈액샘플과 용혈액 및 비드접합체의 반응을 촉진하도록 반응 용기로 사용되는 카트리지를 흔들어 주는 것이 바람직하다. 이는 혈액샘플이 용혈액에 의해 용혈되어 빠져 나오고 동시에 당화혈색소가 비드접합체와 특이적으로 반응하도록 유도하기 위함이다. 여기서 용혈된 혈액샘플이 비드접합체와 충분히 반응할 수 있도록 일정 시간, 예를 들면 3분의 시간을 소요할 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 용혈 단계 및 반응 단계를 거치면 샘플 내에는 정상 혈색소와 비드 접합체가 결합된 당화혈색소가 함께 존재한며, 이 때 상기 혈액 내의 총 혈색소의 양을 측정한다. 즉, 도 2(a)에서는 비드접합체가 당화혈색소과 결합하는 과정을 도시하며, 도 2(b)는 상기 표지된 당화혈색소 및 정상 혈색소가 모두 포함된 총 혈색소의 상태를 도시한다. 한편, 도 2(c)는 혈액 샘플로부터 정상 혈색소가 제거되고 당화혈색소만 남은 상태를 나타낸다.
즉, 비드접합체가 결합된 당화혈색소 및 정상 혈색소가 함께 존재하는 상태에서 혈액 내 총 혈색소의 농도를 측정하는 제 1 측정 단계가 수행되며, 이는 광반사 특성을 이용한 측정방식에 따라 당화혈색소의 양을 측정할 수 있다. 예를 들면 혈액샘플의 당화혈색소의 양을 측정하고자 할 경우 특정 주파수의 광신호를 특이적으로 흡수하는 혈색소의 특성을 이용한다. 이 때 당화혈색소 측정장치는 포토 다이오드와 같은 발광소자와 수광소자를 이용하여 당화혈색소의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 도 3은 예시적인 측정 과정을 도시하며, 도 3에 나타난 바와 같이 혈색소의 농도를 측정하기 위해 상기 반응은 투명한 측정창을 포함하는 카트리지 내에서 수행되는 것이 바람직하다.
부연하면 발광소자는 특정 파장을 갖는 광신호를 발광한다. 예를 들면 당화혈색소의 양을 측정하고자 할 경우 혈액샘플의 혈색소는 특이적으로 흡광을 나타내는 약 430nm 파장을 갖는 광신호를 발광할 수 있다. 이때 수광소자는 발광소자로부터 방사되어 카트리지를 통과한 광신호를 수신한다. 즉, 발광소자로 발광 제어 신호를 출력하고 수광소자로부터 입력되는 광신호를 A/D변환기를 통해 전기 신호로 변환하여 카트리지에 담겨져있는 혈색소의 양을 측정할 수 있다.
공지 기술에서는 당화혈색소에 붙은 비드가 당화혈색소 양의 측정 값에 영향을 주는 것을 방지하기 위하여, 비드의 부착 전에 총 혈액의 혈색소 양을 검출하고 당화혈색소의 양을 측정하기 위하여 비드접합체에 결합한 당화혈색소를 해리시키는 단계를 거쳐야 했으나, 본 발명자들은 실시예 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 당화혈색소에 비드접합체가 결합한 상태에서도 총 혈색소 양의 측정 값에 영향이 없는 것을 발견하여, 불필요한 단계를 생략할 수 있도록 하였다.
그 다음 단계로, 당화혈색소의 농도를 구하기 위해, 비드접합체와 결합된 당화혈색소로부터 정상 혈색소를 분리하는 분리 단계를 수행하여야 하며, 바람직하게 상기 분리 단계는 흡수 패드를 이용하여 정상 혈색소만을 흡수시켜서 수행될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 흡수 패드는 다공성 패드인 것이 바람직하며, 이 때 다공성 패드에 포함된 구멍의 크기는 혈색소보다 크지만 비드보다는 작은 크기를 가지는 것이어야 한다. 보다 상세하게 폴리에스터 및 폴리우레탄 등로부터 선택된 다공성 패드가 사용될 수 있다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 정상 혈색소는 상기 흡수 패드로 흡수되고, 비드와 결합된 당화혈색소가 따로 분리되며, 측정 창에는 비드접합체와 결합된 당화혈색소만을 분리하여 존재하도록 한다.
상기 흡수 패드는 측정이 끝난 혈액샘플 혼합물을 흡수하여 혈액샘플 혼합물의 이동을 차단한다. 예를 들면 이때 흡수 패드는 도 4에 도시된 바와 같이 측정영역의 하부에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 분리단계는 흡수 패드 형식일 수 있으나, 다만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 분리단계는 보다 명확한 분리 및 분리 시간의 단축을 위해 세척액을 흘려주어 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 세척액은 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES) 및 피페스(PIPES)등의 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 세척액이 혈액샘플 혼합물을 세척함에 따라 혈액샘플 내에 비특이적으로 존재하는 일반 혈색소(Ao)가 제거된다.
부연하면, 혈액샘플의 적혈구 내에 존재하는 헤모글로빈(Hb)은 대부분 비당화된 일반 헤모글로빈(Ao)이며, 이때 일반 헤모글로빈 중 4~14%만이 글루코즈(glucose)와 반응하여 당화된 헤모글로빈(HbA1c)으로 존재한다. 따라서 혈액 속의 당화된 헤모글로빈을 측정하기 위해서는 일반 헤모글로빈을 제거해야만 하며, 이를 위해 일반 헤모글로빈을 세척할 수 있는 세척액을 이용하여 당화된 헤모글로빈을 보다 용이하게 분리하여 측정할 수 있게 하는 것이 바람직하다.
그 결과 측정층에 당화혈색소만이 남는 결과가 되며, 이 때 상기 분리된 당화혈색소의 농도를 측정하는 제 2 측정단계를 수행한다. 제 2 측정단계는 상술한 제 1 측정 단계와 동일한 방법에 의해 수행될 수 있다. 즉, 제 2 측정 단계 역시 광 센서를 통한 광반사 측정 방식으로 측정하는 것이 바람직하다.
이 후 총 혈색소의 양을 당화혈색소의 양으로 나누어 혈액샘플 내의 당화혈색소의 상대적인 양을 측정한다. 이 때 당화혈색소 비율은 다음 식에 의해 계산된다.
당화혈색소의 비율(%)=당화혈색소/총혈색소×100
상술한 바와 같이 혈색소 농도의 용이한 측정을 위해 상기 반응은 측정영역이 포함된 카트리지 내에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 "측정영역"은 카트리지에서 혈액샘플 내의 혈색소 및 당화혈색소의 양을 측정하는 영역으로, 예를 들어 도 4에서 흡수 패드 상부의 영역을 지칭할 수 있다. 이때 측정영역은 광반사 특성 측정방식에 따라 혈색소의 양을 측정할 수 있다. 예를 들면 혈색소가 특정 주파수의 광신호를 특이적으로 흡수하는 특성을 이용한다. 이러한 혈색소의 특성에 의해 빛의 농도나 색조의 비교가 가능하여 혈색소의 농도를 측정할 수 있다. 나아가 측정영역은 광반사 특성 측정을 위해 외부 광센서를 통해 빛이 반사되는 광 윈도우를 더 포함할 수 있다.
본 발명을 하기의 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하나, 이는 예시를 목적으로 한 것으로서 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체의 제조
(1) 세척단계:
CM세파로스 비드를 총 부피가 1L가 되도록 증류수로 세 번 세척한 후, 100mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) PH 4.7 로 두 번 세척한다. 이 때 세척 방식은 버퍼를 첨가 후 침전시키고 상층액을 버리는 방식에 의한다. 세척 단계를 통해 비드에 남아있는 에탄올 성분을 없애고 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC or EDAC)의 수율이 좋은 최적 합성 pH로 변경한다.
(2) 접합단계:
상기 EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC or EDAC)는 카르복실기와 1차 아민을 연결하는 제로-길이(zero-length) 교차결합제(crosslinking agent) 로써 상기 시약을 이용하여 카르복실기가 연결되어 있는 CM 세파로스와 3-아미노페닐 보론산의 아민기를 접합(conjugation)하여 APBA 비드를 합성할 수 있다.
EDC를 46g, APBA를 4.65g 넣어 100mM MES(PH 4.7)에 녹인 뒤 차례로 비드 용액에 첨가하고, 4℃에서 두 시간 반응시킨다. APBA는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 반응시켜야 하며, EDC는 습기를 잘 흡수하므로 무게 잰 후 바로 뚜껑을 닫아서 보관에 유의하여야 한다.
교차결합제(cross linker)인 EDC와 합성 물질인 보론산을 첨가하여 합성하는 단계는 합성 부산물 생성 등 효율을 좋게 하기 위해 저온에서 합성한다.
(3) 퀀칭(quenching) 및 블로킹(blocking) 단계:
1M 소듐 아세테이트(in D.W), 100mM 아세트산(in D.W), 50mM NaOH/1M NaCl (in D.W)용액을 각각 500ml씩 첨가하고, 1시간동안 상온에서 반응시킨다. 이 때 반응물은 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 반응시킨다. 합성이 끝나고 남은 EDC를 소듐 아세테이트로 퀀칭하고 아세트산과 NaOH, NaCl 로 세척 및 블로킹한다.
(4) 세척 단계
마직막으로 증류수로 3회 세척한 후, 20mM HEPES(PH 8.1) 버퍼로 2회 세척하고, 최종 pH는 7.4로 맞춘다.
도 1에는 아미노페닐보론산(aminophenyl-boronic acid, APBA)을 당화혈색소 결합물질로 이용한 비드접합체와 당화혈색소가 반응하는 화학구조가 예시적으로 설명되어 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 보론산의 OH 작용기와 당화혈색소 말단에 결합된 당의 시스-디올(sis-diol)이 반응하여 오각형의 링 구조를 이루며, 이러한 특성을 이용하여 보론산은 총 혈색소 중에서 당화혈색소에만 특이적으로 결합된다.
실시예 2: 당화혈색소 측정 값에 대한 비드의 영향
비드 크기에 따른 굴절이나 비드에 특이적으로 결합한 당화혈색소의 양과 상관 없이 총 헤모글로빈의 양에 따라 반사광이 일정하게 측정되는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 실시 하였다.
당뇨환자와 정상인의 혈액을 포함한 임의의 10개 샘플을 원심분리한 후 혈장과 침전된 적혈구의 비율을 조절하는 방법으로 다음의 샘플을 준비하였다. 헤모글로빈 수치의 측정은 Hb 201(HemoCue, Sweden)을 사용하였다.
-0~5g/dl:2개
-5~10g/dl:3개
-11~15g/dl:2개
-15~20g/dl:3개
클로버 에이원씨((주)인포피아)를 팩토리모드로 전환하며, 팩토리모드에서는 반사광의 세기를 미가공(raw) 데이터로 LCD에 표시해 준다. 클로버 에이원씨 카트리지((주)인포피아)를 클로버 에이원씨에 넣은 후에 용혈액과 비드접합체 혼합물을 700ul를 반응구역에 주입한다. 각 샘플 잘 흔들어 준 후 4ul을 용혈액에 주입한 후 기계를 작동 시킨다. 5분 후에 클로버 에이원씨 카트리지의 LCD창에 표시된 데이터를 읽는다.
그 결과 값은 하기 표 1과 같다.
표 1 헤모글로빈 수치와 k/s 값의 상관성
샘플 번호 당화혈색소 수치% 총 헤모글로빈 g/dl k/s
1 5.1 2.8 0.152
2 7.6 6.0 0.339
3 5.2 11.1 0.720
4 5.3 7.4 0.490
5 8.6 4.5 0.255
6 9.6 20.0 1.219
7 6.7 12.9 0.837
8 5.4 18.5 1.157
9 10.1 9.3 0.563
10 4.9 17.0 1.043
그 결과 그래프를 도 5에 나타내었다. 상기 그래프에서 x축은 헤모글로빈 수치이며, y축은 k/s 값이다. k/s값은 반사광의 세기를 나타낸다.
따라서, x축과 y 축이 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 상관성이 있다는 것은, 헤모글로빈의 수치가 변함에 따라 비드의 반사광이 또한 그에 비례하여 일정하게 변하는 것을 확인할 수 있는 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 혈액 샘플을 용혈액으로 용혈시키는 용혈 단계;
    비드와 당화혈색소 결합물질이 결합된 비드접합체를 상기 용혈된 혈액 샘플과 반응시키는 반응단계;
    혈액 내 총 혈색소의 양을 측정하는 제 1 측정 단계;
    비드 접합체와 결합된 당화혈색소로부터 정상 혈색소를 분리하는 분리 단계;
    혈액 내 당화혈색소의 양을 측정하는 제 2 측정 단계; 및
    상기 측정된 혈액 샘플 내 총 혈색소의 양과 당화혈색소의 양을 기초로 하여 상기 혈액샘플 내 당화혈색소의 농도를 계산하는 계산 단계
    를 포함하는 당화혈색소 측정방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 용혈 단계 및 반응단계는 용혈액 및 비드접합체를 혈액 샘플에 동시 투여함으로써 단일의 단계로 수행되는 당화혈색소 측정방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 용혈액은 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES) 및 피페스(PIPES)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당화혈색소 측정방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 비드는 아가로즈, 셀룰로즈, 세파로즈, 폴리스티렌, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐톨루엔, 라텍스 비드 및 유리 비드 중 적어도 하나인 당화혈색소 측정방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 당화혈색소 결합물질은 보론산(boronic acid), 콘카나발린 A(concanavalin A) 및 항체(antibody) 중 적어도 하나인 당화혈색소 측정방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 측정 단계 및 제 2 측정단계는 광 센서를 통한 광반사 측정 방식으로 수행되는 당화혈색소 측정방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 분리단계는 세척액을 흘려주어 수행되는 당화혈색소 측정방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 세척액은 트리스(tris), 헤페스(HEPES), 테스(TES) 및 피페스(PIPES)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당화혈색소 측정방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 분리 단계는 정상 혈색소를 흡수 패드를 이용하여 흡수하여 수행되는 당화혈색소 측정방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 흡수 패드는 다공성 패드인 당화혈색소 측정방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 다공성 패드에 포함된 포어(pore)의 크기는 혈색소보다 크고 비드 보다 작은 당화혈색소 측정방법.
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