상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 용액에 첨가하여 당화단백질에 모두 결합시킨 후 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단 백질을 필터링하기 위한 수단; 및 상기 당화단백질과 결합되지 않고 여과된 표식자 화합물을 정량하기 위한 수단을 포함하는 당화단백질 검출 시스템을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 당화단백질 검출 시스템에 있어서, 상기 검출 시스템은 당화단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 분자량이 상대적으로 작은 표식자 화합물을 당화/비당화단백질이 공존하는 시료 용액에 첨가하여 당화단백질에 결합시킨 후, 상기 당화단백질과 결합된 표식자 화합물 및 상기 비당화단백질을 걸러낼 수 있는 필터링 수단을 포함한다. 상기 필터링을 통하여 분자량이 큰 당화단백질 및 기타의 방해종들을 분자량이 작은 표식자 화합물과 분리하여 걸러낸다. 걸러진 시료에 포함된 표식자 화합물을 인지할 수 있는 본 발명 분야에서 통상적으로 사용되는 분석기기나 센서로 결정하여 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.
본 발명의 당화단백질 검출 시스템에 있어서, 상기 표식자 화합물은 보론산 유도체에 전기화학적 산화환원쌍 활성 기능기, 분광학적 발색단 기능기, 효소의 기질 기능기 등을 치환하여 만든 화합물이면 특히 한정하지 않으나, 바람직하게는 상기 표식자 화합물로 페로센 유도체, 안트라퀴논, 퀴논 및 그 유도체, 유기 전동성 염 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 비오로겐(viologen),디메틸페로센(dimethylferrocene; DMF), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카복실산(ferocene monocarboxylic acid; FCOOH), 7,7,8,8- 테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane; TCNQ), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone; PQQ), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene; TTF), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium; NMA+), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene; TTT), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium; NMP+), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid; MBTHDMAB), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존(3-methyl-2-benzothio-zolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin; AAP), 디메틸아닐린 (dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine; TMB), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트](2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone) 및 벤지딘(benzidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 치환체를 갖는 보론산유도체를 사용할 수 있다. 이러한 활성이 있는 치환체를 갖는 보론산 유도체는 당화단백질과 특이적으로 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 당화단백질 검출 시스템의 일 실시형태는 바람직하게는, 당화단백질 검출용 전극센서로 구현될 수 있다.
본 발명에 따른 당화단백질 검출용 전극센서의 바람직한 일 실시형태는, 미세다공성막의 양면에 대칭으로 형성된 작동전극 및 상대전극으로 이루어진 전극체를 포함한 것으로, 상기 작동전극 앞에는 상기 단백질제거필터가 소정 거리 이격되어 형성되고, 상기 상대전극의 타면에는 흡수패드가 부착되어 단백질이 제거된 표식자 화합물을 포함한 시료가 한 방향으로 원활히 흐르도록 구성됨이 바람직하다. 상기 흡수패드는 다공성 전극의 한 면에 가해진 시료를 빨아들여 전극의 반대편으로 용이하게 이송되도록 하는 역할을 한다. 본 발명의 일 실시예로 사용되는 다공성 금전극만으로는 친수성이 충분하지 못하여 시료의 이송이 충분히 균일하게 이루어지지 못하여 분석 오차가 심하게 날 수 있다. 흡수패드는 이러한 문제를 해결해 준다. 이를 통하여 단백질이 제거된 잔여 시료가 한 방향으로 흐르도록 하며, 잔여 시료 중에 포함된 표식자 화합물을 분광학적 방법 또는 전기화학적 분석 방법으로 결정할 수 있도록 한다. 이는 상기 전극체에 정해진 시간 동안 전압 또는 펄스 전압을 가하여 발생되는 전류를 읽을 수 있는 장치에 연결하여 상기 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 당화단백질 검출용 전극센서의 바람직한 다른 일 실시형태는, 일 개의 절연체 기판 상에 형성된 시료인입부; 상기 시료인입부에 설치된 단백질제거필터; 하나 또는 두 개의 절연체 기판 상에 형성된 작동전극, 상대전극, 선택적으로는 기준전극으로 이루어진 전극체; 및 시료가 상기 시료인입부로부터 상기 전극체에 이르도록 구성한 모세관유로 또는 미세유로를 포함하고, 상기 절연체 중 상판을 친수성 처리하여 주입된 시료가 상기 유로를 따라 흐르기 쉽도록 구성될 수 있다. 이를 통하여 단백질이 제거된 잔여 시료가 한 방향으로 흐르도록 하며, 잔여 시료 중에 포함된 표식자 화합물을 전기화학적 분석 방법 또는 분광학적 분석 방법으로 결정할 수 있도록 한다. 이는 상기 전극체에 정해진 시간 동안 전압 또는 펄스 전압을 가하여 발생되는 전류를 읽을 수 있는 장치에 연결하여 당화단백질의 존재량을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 당화단백질의 양은 표식자 화합물의 총 농도에서 검출된 표식자 화합물의 농도차로부터 결정될 수 있다.
본 발명의 당화단백질 검출 시스템은 추가적으로 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 상기의 단백질이 제거된 잔여물 속의 표식자 화합물을 전기화학적 방법 또는 분광학적 검출 방법으로 결정하여 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정할 수 있다. 이때, 상기 여과된 잔류물 속의 표식자 화합물의 양은 흡수도, 형광, 인광, 또는 화학발광의 양을 측정하여 결정될 수 있다.
상기 수단은, 바람직하게는 비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 것으로서 도 6의 구성을 갖도록 구성되어 있는데, 그 중 한 유로의 내부는 표식자 화합물, 바람직하게는 치환체를 가 지는 보론산 유도체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료액체의 흐름을 지속할 수 있는 표식자 화합물, 바람직하게는 보론산 유도체 고정 삽입물을 장착하여 당화단백질을 걸러내기 위한 수단; 및 상기 유로의 끝 부분에 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화단백질 대 비당화단백질의 상대적 양을 결정하기 위한 수단을 구비할 수 있고, 다른 유로에는 당화혈색소와 직접적인 산화환원반응을 일으켜 전기화학적으로 검출될 수 있는 시안산철(Ⅱ)/(Ⅲ)이 있어서 당화/비당화 혈색소의 총량을 검출할 수 있도록 구비된다. 이러한 미세유로형 당화단백질 검출 시스템은 당화혈색소의 양을 당화/비당화혈색소 총량에 대하여 특별한 분리과정 없이 측정이 가능하다는 장점을 갖는다.
상기 수단은, 바람직하게는 비당화단백질과 당화단백질이 혼합된 시료를 두 개의 개별적 미세유로로 흘려보낼 수 있게 만든 기구로, 그 한 유로에는 비당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되고, 다른 유로에는 당화단백질에 대한 표식자 화합물과 반응을 거친 후 흐름이 지속되도록 구성된 것으로서, 두 유로의 내부는 모두 분석 대상 단백질에 대해 특이 결합을 하는 면역 항체를 화학적 또는 물리적으로 고정시켜 변형한 표면 또는 시료 액체의 흐름을 지속할 수 있는 면역항체를 포함하는 삽입물을 설치하여 당화단백질 및 비당화단백질을 모두 걸러내기 위한 수단; 및 표식자 화합물들만 미세유로의 끝 부분까지 흘러가 전기화학적 방법 또는 분광학적 방법으로 당화 대 비당화단백질의 상대적 양을 각각 결정할기 위한 수단을 구비할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 당화단백질 검출 시스템에 적합한 시료전처리 분주 기구를 포함한다.
상기 시료전처리 분주 기구는, 바람직하게는 시료채취용 모세관; 상기 채취된 시료를 주입하기 위한 모세관삽입구가 형성된 시료주입플런저; 및 일단에는 상기 시료주입플런저가 장착되고, 타단에는 시료를 분주하기 위한 시료분주구가 형성된 주사기 형태의 용기를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 시료의 전처리는, 바람직하게는 주입 시료가 용혈제 및 표식자 화합물과 섞여, 상기 시료전처리 분주 기구의 상기 주사기 형태의 용기 내에서 수행될 수 있다.
상기 시료전처리 기구는 추가적으로 단백질제거여과층을 더 포함할 수 있다. 이는 센서에 장착되는 필터를 대체하여 동일 역할을 수행하게 함으로써 센서의 구성을 간단하게 구성할 수 있어, 센서의 대량 생산이 용이해지는 장점을 제공할 수 있다.