KR20040018893A - 면역크로마토그라피법을 이용한 당화혈색소 진단 킷트 및분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원-항체 반응을 이용하여 당뇨 표지 물질인 당화혈색소가 혈액 속에 어느 정도 포함되어 있는지를 체외 진단하는 킷트와 방법에 관한 것이다. 당화 혈색소의 진단 방법은 혈액시료 내 존재하는 혈색소와 당 성분인 포도당이 결합하여 생성된 물질인 당화혈색소 각각을 동시에 정량 또는 반정량하여 그 비율을 측정하는 방법이다. 이러한 당화혈색소의 진단 방법은 지난 120일 내외의 당뇨 진행정도의 평균치를 확인하는데 이용하거나, 당뇨 치료시 회복 정도를 확인하는 지표로 삼는데 이용된다.

분석하고자 하는 혈색소, 당화혈색소와 선택적으로 결합 반응을 하는 항체들을 진단 킷트 성분으로 이용한다. 혈색소 측정의 경우는 혈색소의 빨간색을 검출에 이용하고, 당화혈색소의 경우는 당화혈색소와 선택적으로 결합하는 항체에 염료를 결합시켜 혈색소 고유의 색에 추가로 염료의 색을 가지게 한 뒤 이를 검출에 이용한다.

당화혈색소 진단 면역크로마토그라피법의 구성은 혈액 검체를 시료 결합액에 넣는 단계, 반응 처리된 시료를 멤브레인 스트립 면역 시스템에 도입하는 단계, 시스템에 도입된 시료가 모세관 현상으로 측정 위치로 이동하는 단계, 항원-항체 반응을 일으키는 단계, 여분의 미반응 물질을 제거하는 단계로 이루어져 있다.

이와 같은 분석 시스템의 개발은 단시간에 고가의 장비 없이 혈색소 내의 당화혈색소 비율을 확인할 수 있으므로, 손쉽게 식사 유무와 같은 외부의 조건에 영향을 받지 않고 일정 기간내의 평균 혈당치를 측정할 수 있게 한다.

Description

면역크로마토그라피법을 이용한 당화혈색소 진단 킷트 및 분석 방법 {Rapid Diagnosis Kit and Detection Method for Hemoglobin A1c Using Immunochoromatography}

이 기술은 환자 곁 검사와 같이 신속 질병 진단 킷트에 이용 가능한 방법으로, 혈액 검체 속에 존재하는 혈색소와 혈색소에 당 성분이 붙어 생성된 화합물 중에 한 성분인 당화혈색소를 동시에 분석하는 방법에 관한 내용이다. 이러한 방법은 생화학 물질과 중합 반응을 일으킨 화합물을 중합 반응 전의 물질과 동시에 분석할 수 있게 하는 기술이다. 이 과정에서 각각의 정량 분석을 수행하여 두 성분간의 비율을 검사 가능하도록 한다. 이로써 초기 물질 전체 중에 어느 정도가 중합 반응을 통하여 다른 물질로 변형이 되었는지 확인할 수 있는 방법이다. 이러한 실험과정에서 측정하고자 하는 일련의 물질 외의 다른 성분을 제거하기 위하여 면역크로마토그라피법의 모세관 현상과 항원-항체 반응이 이용되었다.

기존의 면역크로마토그라피법은 임신진단 시약, 간염진단 시약 등과 같은 정성분석에 주로 이용이 되고 있다. 이는 검사하고자 하는 시료를 모세관 현상으로 니트로셀룰로즈 멤브레인에 고정화시킨 항체 또는 항원이 있는 위치까지 이동시키고, 항원-항체의 선택적이고 특이적인 결합 반응이 일어나 신호가 발생하게 된다.

또 다른 기존의 항원-항체 반응을 이용한 측정 방법으로는 액상에서 효소와 방사선 동위 원소를 이용하여 신호를 검출하는 방법이 있다. 이러한 방법은 효소 이용의 경우 분자량이 상대적으로 큰 효소를 항체에 결합시켜 반응에 적용하므로 실제 항원-항체 반응보다는 분자량이 증가되어 분자 이동 및 신호 발생에 영향을 끼치게 된다. 방사선 동위 원소를 이용하는 경우에는 효소를 이용한 경우에 발생하는 문제점은 해결할 수 있으나, 유해한 방사선 동위 원소가 사용되므로 세심한 주의가 필요하고 신호 검출시 고가의 검출기를 필요로 하는 단점도 존재한다.

한편, 생화학 물질 분석 실험에서 하나의 물질과 그 유도체를 동시에 확인하고자 할 때 한번 이상의 신호 분석을 필요로 한다. 유사한 구조를 가지고 있는 화합물들을 분리, 분석하는데 주로 이용되는 분석 기기는 친화크로마토그라피법, 이온 크로마토그라피법, HPLC 등이 있다. 이러한 기기는 전문적인 기술과 고가의 장비및 유지비가 소요되므로 일반인이 접근하기에는 큰 어려움이 따른다. 이러한 문제점들을 해결하고 손쉽게 신호를 측정하기 위하여 면역크로마토그라피법과 분광법의 장점을 이용하여 측정 방법을 개발하고자 한다.

당뇨병의 지표 물질로 알려져 있는 당화혈색소는 혈액 내의 포도당(혈당)이 일정 비율로 혈색소(헤모글로빈)와 결합하여 생성하는데, 혈당이 증가하게 되면 당화혈색소의 양도 따라서 증가하게 된다. 이렇게 생성된 당화혈색소는 혈색소의 수명과 같은 2∼3달 동안 혈액 내에 존재하게 된다. 당화혈색소를 이용한 당뇨 진단은 기존의 혈당 진단 방법과는 달리 식사 유무나 시간에 따라 측정값이 변화하지 않고 일정한 값을 나타내므로, 하루에 여러 번 반복하여 조사하는 기존 검사의 단점을 개선할 수 있는 좋은 진단방법으로 알려져 있다. 일반적으로 혈액 내의 당화혈색소가 전체 혈색소의 6% 이하이면 정상 혈당 상태를 나타내지만, 10% 정도로 증가할 경우 당뇨병을 나타내는 표식으로 알려져 있다. 현재 당화혈색소 검사를 통한 당뇨 진단 방법은m-aminophenylboronate 칼럼을 이용한 친화크로마토그라피법, 이온 교환크로마토그라피법, 전기영동법, 등전점 분석법(Isoelectric focusing) 등이 주로 이용되어 왔다. 이와 같은 방법은 검사 시료 당 상대적으로 높은 소요 비용, 분석물의 대상 물질과의 선택적 반응의 감소, 이온결합력, pH, 온도와 같은 외부 조건 변화에 따른 재현성의 감소, 각 개체의 표준화 어려움, 장시간의 소요 시간, 자동화의 곤란, 여러 시료의 동시 분석의 어려움 등 여러 문제점이 있다 (J. Clin. Pathol., 37, 841-851, 1984,Anal. Biochem., 175, 347-360, 1988). 이러한 단점들을 개선하기 위하여 신속 진단 방법 중에 면역크로마토그라피법을 이용하여 신속성과 함께 재현성을 부각시키면서 정량 분석에 이용하고자 한다.

기존에 당화혈색소를 분석하는데 주로 이용되고 있는 기법들은 고가의 장비와 전문 분석 기술을 가지고 있는 사람을 필요로 한다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 임신진단 시약이나 간염진단 시약에 이용되는 방법인 면역크로마토그라피법을 이용하고자 한다. 현재 정성 분석에 주로 이용되는 면역크로마토그라피법은 콜로이드 금을 신호 발생원으로 사용하고 있는데, 이는 임신진단 시약과 간염진단 시약의 경우 hCG나 HBV(Hepatitis B virus), anti-HBV, anti-HCV(Hepatitis C virus)등이 육안으로 검출이 불가능하여 콜로이드 금의 빨간색을 신호로 이용하는 방법이다. 그러나, 혈색소는 피의 색깔을 붉게 나타내는 주요 성분이므로 콜로이드 금을 이용한 별도의 색을 신호로 이용할 필요가 없다. 그러므로 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체를 니트로셀룰로즈 멤브레인이나 나일론 멤브레인의 일정 부위에 고정화시키고 기존의 정성 분석 킷트와 같이 모세관 현상으로 혈색소가 이동하여 오면 특정 부위에 멈추게 하여 신호 측정에 이용할 수 있다. 일정 부위에 멈춘 혈색소는 그 양에 따라 혈액 특유의 빨간색을 나타내게 된다.

당화혈색소의 경우는 혈색소와 마찬가지로 빨간색을 띄고 있는데, 여기에 또다른 색깔을 추가로 띄게 하여 혈색소와 구분하고 신호 검출에 이용하고자 한다.

먼저 당화혈색소에 대한 항체(당화혈색소 항체)를 혈액 용혈 시약이 포함되어 있는 완충용액에 넣는다. 이때 당화혈색소 항체에는 색깔을 띠는 염료와 결합시켜 놓는다. 혈액 용혈 시약이 포함되어 있는 완충용액에 혈액이 도입되면 혈액이 용혈되는 것과 동시에 적혈구 내의 당화혈색소는 항원-항체 반응을 일으켜 완충용액 속의 당화혈색소 항체와 결합하게 된다. 이러한 혈액을 혈색소 항체가 고정화되어 있는 스트립에 떨어뜨리게 되면 혈색소와 당화혈색소는 임신 진단 시약과 같이 혈색소 항체가 고정화되어 있는 부위에 빨간색을 띠며 신호를 나타나게 된다. 이때 당화혈색소는 빨간색 이외의 다른 염료의 색깔을 추가로 띠게 되므로 이를 측정하면 당화혈색소의 분석이 가능하다. 이를 정량 분석 시스템에 적용하고자 한다. 혈색소 항체를 고정화시킨 멤브레인에 거름종이와 같이 이용한 immunofiltration 방법으로 혈색소와 당화혈색소만을 검출하는 간단한 구조의 킷트도 제작 가능하나, 이러한 방법은 시료 도입 위치와 신호 측정 위치가 동일하여 불순물에 의한 신호 간섭과 신호 측정 표면에 의한 지지대 결핍에 따른 간섭 효과 때문에 분광법으로 측정시 영향을 줄 수 있다. 이러한 단점을 보안하고자 모세관 현상을 도입하여 킷트제작에 이용하였다.

상기와 같이 제안하는 측정 방법은 종이크로마토그라피법에서 이용되는 모세관 현상, 항원-항체 반응을 이용하여 전체 시스템을 구성하였다. 이러한 경우 신호검출을 간단한 반사회절분광법이나 육안으로도 판단이 가능하므로, 소형화된 기기나 기준 색상도 등으로 신호 판단을 할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 면역크로마토그라피법을 이용한 당화혈색소 진단 킷트의 전체도

도 2는 혈색소가 당과 결합되어 당화혈색소가 되는 반응도

도 3은 신호검출지역의 신호 발생 과정도

도 4는 진단 킷트의 검체 시료의 도입과 이동 그림

도 5는 적층플라스틱카드의 구성도

도 6은 2개의 신호검출지역을 가진 당화혈색소 진단 킷트의 전체도

항원-항체 반응을 이용한 멤브레인 형태의 체외 진단 킷트의 구성은 시료 패드, 신호 검출용 니트로셀룰로즈 멤브레인, 흡습 패드로 구성된 스트립(도 1)과 incubation 용액, 세척 용액으로 구성되어 있다. 이러한 스트립은 일반적으로 검사하고자 하는 대상 물질(예를 들면 임신진단 시약의 hCG)의 유무를 판단하는데 주로이용하는 정성분석용 킷트와 유사한 구조이다. 단지 임신진단 시약 등의 신호 발생원으로 이용되고 있는 콜로이드 금을 항체와 물리적으로 결합을 시킨 성분과 이를 처리한 패드가 제외된 것이 차이점이다. 대신 당화혈색소 항체가 용해되어 있는 완충용액과 반응물 세척액을 추가하였다. 혈액 채취 직후 incubation 과정으로 당화혈색소 항체가 존재하고 있는 완충용액에 혈액을 떨어뜨려 용혈현상과 항원-항체 반응이 일어나도록 시간을 준다. 이때 당화혈색소 항체에는 혈색소의 빨간색과 다른 파장을 가진 염료를 중합 반응으로 결합시켜 항체가 염료의 색상을 띠게 미리 준비하여 놓는다. 염료 이외에 FITC와 같은 형광물질도 중합시켜 항체에 결합시킬 수 있다. 이렇게 준비한 검사 혈액과 반응시킨 완충용액의 일부를 취하여 검사 스트립에 떨어뜨린다. 시료의 이동은 C형간염항체진단 시약과 동일한 면역크로마토그라피 방법으로, [도 1]과 같이 스트립의 모든 패드 일부분을 교차시켜 유체의 이동이 계속적으로 이어지게 하고 시료를 스트립에 분주한 동일한 위치에 세척액을 추가로 넣어준다. 이로써 시료 검체가 모세관 현상으로 스트립 전체로 이동 가능하게 하고, 미반응 물질을 흡수 패드로 이동, 제거하게 한다[도 4]. 신호 검출 방법은 표준 검정 가능한 농도 범위 내에서 포토다이오드를 이용한 분광분석법으로 정량에 이용할 수 있다. 이때 신호 바탕값의 안정화와 항체의 안정적인 고정화를 위하여 신호 검출 패드는 정성분석용 면역크로마토그라피법에 많이 이용되는 니트로셀룰로즈 멤브레인이나 나일론 멤브레인을 이용한다. 이러한 분석 방법은 어떻게 분석 결과를 정확하게 읽어 낼 수 있는가와 재현성이 뒷받침되어야 한다. 이에 분광광도법을 이용한 정량 분석 방법은 좋은 재현성을 나타낸다.

신호검출지역에는 혈색소를 선택적으로 인지하는 항체가 고정화되어 있다. 이때 고정화 방법은 단백질의 소수성을 이용하여 항체를 물리적인 결합이나 화학적인 결합으로 니트로셀룰로즈 멤브레인 또는 나일론 멤브레인에 고정화시킨다. 검사대상인 시료 성분 중 당화혈색소는 완충용액 용기에서 항원-항체 반응이 일어난 뒤 모세관 현상으로 신호검출지역을 통과하게 된다. 신호검출지역을 지나면서 혈색소는 이 위치에 고정화된 항체와 결합 반응을 일으켜 더 이상 진행을 하지 못하고, 다른 성분들만이 위로 진행을 하게 된다. 당화혈색소의 경우에도 혈색소β-chain 아미노 말단(-NH₂)을 제외한 나머지 부분은 혈색소와 동일한 구조(도 2)로 이루어져 있으므로, 혈색소와 선택적으로 결합하는 항체와도 항원-항체 결합 반응을 할 수 있다. 이때 당화혈색소는 완충용액 용기에서 당화혈색소인 항체와 이미 결합되어 있는 상태이고 당화혈색소 항체는 염료와 결합되어 있는 상태이다. 그러므로 혈색소 항체가 고정화되어 있는 위치에서 당화혈색소 역시 [도 3]과 같이 샌드위치 형태로 결합되어 있게 된다. 이로써 신호 측정 부위에 당화혈색소의 유무에 따라 색상이 변하게 된다. 정상의 경우에도 당화혈색소는 존재하기 때문에 당화혈색소 결합에 따른 색상이 나타나지만, 당뇨병이 있는 경우 당화혈색소의 양이 정상인 보다 많으므로 더 많은 양의 염료 색깔이 혈색소 항체가 고정화되어 있는 신호 발생 부위에 나타나게 된다. 이는 혈색소의 빨간색이 염료색과 더 많이 합쳐지게 되어 혼합색으로 보이게 됨을 의미한다. 이러한 구성을 가지고 신호를 발생시킨 면역크로마토그라피법은 빨간색 대비 혼합색으로의 변화 정도를 색상 대조표나 기준표를 이용하여 육안으로 판정하는 반정량 시스템에 응용 가능하게 한다. 포토다이오드와 같은 광학 반사 회절법에 이용 가능한 기기 분석 방법으로는 혈색소 고유의 파장과 염료의 파장 2개를 각각 측정하고 수치화 함으로써 정량 시스템에 이용할 수 있다.

당화혈색소 항체에 혈색소와 같은 파장의 빛을 흡수하는 형광물질을 결합시킨 경우에는, 흡수분광법과 형광법을 하나의 포토다이오드를 이용하여 동시에 한 자리에서 측정 가능한 시스템을 디자인 할 수도 있다.

한편, 당화혈색소를 이용한 당뇨병 진단 킷트는 전체 혈색소와 당화혈색소는 아미노 말단(-NH₂)을 제외한 나머지 부분이 동일한 구조로 이루어져 있어서, 이를 이용하면 또 다른 신호 측정 시스템을 가능하다. 이를 위하여 당화혈색소와 상이한 구조를 가지고 있는 아미노 말단 부위를 인지하여 결합하는 혈색소 항체를 고정화한다. [도 6]과 같이 anti-Hb가 고정화되어 있는 신호검출지역에서는 혈색소만을 단독으로 측정한다. 이어 anti-HbA1c가 고정화되어 있는 지역에서 당화혈색소와 선택적으로 결합하는 항체를 고정화하여 방화혈색소만을 검출하는 시스템의 구상도 가능하다. 이로써 신호검출지역 2개의 신호 강도를 비교함으로 두 성분의 비율을 판정하게 디자인할 수 있다.

신호 검출 지역 상부에는 도 1과 같이 일반적인 면역크로마토그라피법과 동일하게 검정선(control line)을 위치시킨다. 이는 검사에 이용되는 면역크로마토그라피 스트립 항체의 생물학적 변성 등을 확인하는 것으로, 본 시스템에서는 당화혈색소와 선택적으로 결합하는 항체를 항원으로 인식하여 결합하는 또 다른 항체를이용하여 제작한다. 이로써 당화혈색소 항체가 염료와 사전에 결합되어 있으므로 검정선 신호 발생 유무는 항체가 변성됨이 없이 정상적인 항원-항체 반응에 참여했는지를 확인하는 지표이다.

일반적으로 알려져 있는 면역크로마토그라피법의 단점은 평형 반응이 아닌 비평형 반응에서 신호가 발생함으로 정량분석에 이용이 불가능하다고 알려져 있다.

그러나, 전체 혈색소 성분 중의 당화혈색소의 비율을 측정하는 당뇨 측정 시스템에는 전체 혈색소가 멤브레인에 고정화되어 있는 항체와 100% 반응에 참여하지 않고 일정 비율만이 반응에 참여하더라도 당화혈색소 역시 같은 비율만 반응에 참여하면 전체 혈색소 내의 당화혈색소 비율을 측정하는데는 아무 문제가 발생하지 않는다.

이로써 본 특허에 이용되는 시스템은 전체 생화학적인 물질 중에 한 부분만이 변형된 물질의 비율을 측정하는데 신속한 측정 방법으로 이용 가능한 좋은 실험 방법이 된다.

킷트의 가장 상단부에 위치하는 흡습패드는 반응에 참여하지 않은 시료나 신호 표지 물질들의 미반응 물질을 신호 측정 지역에서 제거하는데 이용된다. 과량으로 사용되는 완충용액내의 당화혈색소 항체, 반응에 참여하지 않는 혈액 성분 등은 신호측정부위에서 제거를 위하여 계속적인 모세관 현상을 유도시키기 위함이다. 이는 일반적인 임신진단시약과 같은 정성분석용 면역크로마토그라피법과 같은 내용이다.

이렇게 구성한 모든 패드들은 한쪽이 접착력이 있는 적층플라스틱카드(도 5)로 서로 일부분을 겹쳐서 [도 1]과 같이 고정화시킴으로써, 면역크로마토그라피법을 이용할 수 있는 하나의 전체 킷트로 제작 구성한다.

현대인들의 건강에 대한 관심이 높아지면서 자신의 신체 이상 유무를 손쉽게 측정하고자 하는 욕구가 증대되고 있다. 기존의 개발되어 있는 진단제품들은 고가이며 전문적인 기술을 습득한 소수만이 기기를 다룰 수 있었다. 이러한 문제점을 극복하고자 최근에는 소형화되고 다루기 쉬운 제품의 개발이 빠른 속도로 진행되어 상당한 기술적인 발전을 이루고 있다. 본 발명은 이러한 방법들 증 일반인이 쉽게 다루고 그 결과를 즉석에서 확인할 수 있도록 임신진단 시약과 같은 멤브레인을 이용한 면역크로마토그라피법을 이용하고자 한다. 이와 같이 쉽고 간단한 조작으로 당뇨병의 유무만을 판정할 수 있을 뿐만 아니라, 병의 진행 정도와 치료 정도등의 확인을 가능하게 할 수 있다. 따라서 면역크로마토그라피법을 이용한 진단 킷트는 검사에 필요한 직접적, 간접적 소요 비용을 감소시킴으로 경제적으로도 기여를 하고, 일반인도 쉽게 검사에 접근 가능하므로 조기 진단 등에 널리 이용 가능하다고 판단된다.

Claims (5)

1. 항원 항체를 이용한 면역크로마토그라피법에 있어서, 니트로셀룰로즈 또는 나일론 멤브레인 표면에 항체를 고정화시켜 신호 검출 지역으로 설정하고, 시료패드, 신호발생패드, 흡습패드 순으로 일부분을 겹쳐서 위치시키는 분석킷트(일명 스트립)에서

   가) 분광법을 통한 정량분석시스템과

   나) 형광분석법을 통한 정량분석시스템과

   다) 색대조표를 이용한 반정량분석시스템
2. 당화혈색소 항체와 염료를 중합 반응시킨 물질이 포함되어 있는 완충 용액을 이용하여, 혈액 시료를 용혈시키고 항원-항체 반응을 일으킨 뒤 면역 진단 스트립에 도입하는 방법
3. 제 2항에 있어서, 완충 용액 내에 당화혈색소 항체에

   가) 염료를 중합반응시켜 색을 띠게 하는 방법과

   나) 형광물질을 결합시켜 색을 띠게 하는 방법
4. 면역크로마토그라피법을 이용한 혈색소 내의 당화혈색소 비율 정량분석 진단 킷트에서,

   가) 신호 바탕값의 안정화를 위하여 표면이 일정한 니트로셀룰로즈 멤브레인 또는 나일론 멤브레인 위치까지 모세관 현상으로 이동시켜 신호를 측정하는 방법과

   나) 상기 (가)항에서 이동한 물질 중 신호 방해 물질은 흡습 패드를 이용하여 신호 검출 위치에서 제거하는 방법과

   다) 혈색소 항체를 고정화시켜 멤브레인의 일정한 위치에서 혈색소와 당화혈색소 성분을 동시에 정량 검출하는 방법과

   라) 상기 (다)항과 같은 구조의 반정량 방법과

   마) 혈색소 정량에는 혈색소 고유의 색깔을, 당화혈색소 정량에는 합성시킨 염료 또는 형광 물질의 색깔을 이용하여 측정하는 방법과

   바) 상기 (마)항의 두 값의 비를 측정값으로 정량분석에 이용하는 방법
5. 제 4항에서 있어서, 한 지점에서 하나의 광원을 이용하여

   가) 혈색소 정량에는 흡수분광법, 당화혈색소 정량에는 형광분석법을 적용하여 정량분석하여 비율을 측정하는 방법과

   나) 혈색소 정량에는 반사회절분광법, 당화혈색소 정량에는 형광분석법을 적용하여 정량분석하여 비율을 측정하는 방법