CN101718785B - 直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法，其特征在于所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，2人份/试剂卡，分别是二管含有抗IgG的凝胶管、二管含有抗C₃d的凝胶管和二管含有凝胶悬浮介质的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的配制和分装。本发明方法制备的直接抗人球蛋白试剂卡灵敏度高，特异性好，质量稳定且一张卡可以同时检测IgG类抗体致敏的红细胞和C₃d补体致敏的红细胞，并能准确判断是IgG类抗体还是补体致敏的红细胞。

Description

直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种用于检测致敏红细胞的不完全抗体和(或)补体的微柱凝胶卡及其应用。更具体的说，本发明涉及一种直接抗人球蛋白试剂卡的组成、制备方法及其应用，涉及血液检验等医学领域。

(二)背景技术

抗人球蛋白试验诞生于1945年。一些患者的血液中含有抗患者红细胞的凝集素，但将这些血清与红细胞后混合后并未出现凝集反应，而当加入血清抗体后，即抗人球蛋白试剂(抗IgG)、抗C₃d试剂，便出现凝集反应。该试验即称为抗人球蛋白试验。最初只用于检测血清中的抗体，之后同样的原理用于检测体内包被红细胞的抗体和补体。目前，直接抗人球蛋白试验在临床上主要应用于：胎母血型不合新生儿溶血病、免疫溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血、药物导致的免疫性溶血性贫血等。

抗人球蛋白试验是理论上最明确、最准确的方法，但是由于其繁琐的操作，且不能同时对多份样品进行检测，所以只能将该方法用于对少数标本的确定。长期以来，在我国临床常规检测中只能首先进行盐水血凝试验，然后用加入促进血凝试剂的筛检试验，最后才是对少数标本进行抗人球蛋白试验。

而直接抗人球蛋白试剂卡省略了传统的试管液体介质的繁琐洗涤程序，也省去了必须在阴性结果试管中加入不完全抗体致敏的红细胞，以确认阴性结果是否正确的步骤。使得试验如同盐水血凝试验一样简单、方便，且敏感性高，具有结果更易判断并能较长时间保存，标本用量少，又能同时检测多份标本等优点。

在国内外，尚无厂家生产直接抗人球蛋白试剂卡，只有部分厂家生产了类似产品，其只能检测到有抗体致敏了红细胞，但不能确定这种抗体是IgG类还是C₃d类。而且其采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶的颗粒大小为70纳米以上，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得试验的灵敏度降低。

(三)发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、质量稳定且一张卡可以同时检测IgG类抗体致敏的红细胞和C₃d补体致敏的红细胞，并能准确判断是IgG类抗体还是补体致敏的红细胞的直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法，所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，2人份/试剂卡，分别是二管含有抗IgG(抗人球蛋白)的凝胶管、二管含有抗C₃d的凝胶管和二管含有凝胶悬浮介质的凝胶管。所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

抗IgG试剂(抗人球蛋白)的选择：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗人球蛋白试剂(抗IgG)必须对按照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集。

抗C₃d试剂的选择：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗C₃d试剂必须对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与抗C₃d试剂原液的反应强度≥1+。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体试剂按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有抗人球蛋白试剂(抗IgG)的凝胶和含有抗C₃d试剂的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别加入到一空白卡片的6个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的直接抗人球蛋白试剂卡。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度；

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内(30-60纳米)；

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过；

4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力。国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对直接抗人球蛋白试剂卡的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对直接抗人球蛋白试剂卡的特异性产生的不良影响。

本发明的另一方面，为了保证本发明直接抗人球蛋白试剂卡的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。

本发明的再一方面，为了保证本发明直接抗人球蛋白试剂卡的质量，在制备过程中还对与凝胶混合的抗体原料进行筛选。

综上所述，本发明的直接抗人球蛋白试剂卡之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，一张卡可以同时检测IgG类抗体致敏的红细胞和C₃d补体致敏的红细胞，并能准确判断是抗体还是补体致敏的红细胞；缓冲体系可以维持试剂卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗抗体可以保障抗原的有效检出。

直接抗人球蛋白试剂卡一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的直接抗人球蛋白试剂卡产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的直接抗人球蛋白试剂卡，为临床准确进行抗人球蛋白试剂或补体致敏的红细胞检测，从而准确诊断胎母血型不合新生儿溶血病、免疫溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血、药物导致的免疫性溶血性贫血等疾病创造了条件。

(四)具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

抗人球蛋白试剂(抗IgG)的选择：按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗人球蛋白试剂(抗IgG)必须对体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集。

抗C₃d试剂的选择：按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗C₃d试剂必须对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与抗C₃d试剂原液的反应强度≥1+。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体试剂按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有抗人球蛋白试剂(抗IgG)的凝胶和含有抗C₃d试剂的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶加入到一空白卡片的6个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的直接抗人球蛋白试剂卡。

步骤六、半成品测定

要求抗IgG凝胶柱检测的抗D抗体、抗Fy^a抗体效价均不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果；抗IgG凝胶柱与IgG性质抗D致敏的红细胞反应为阳性，与C₃d致敏的红细胞反应为阴性，与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

要求抗C₃d凝胶柱与补体致敏的红细胞反应强度≥1+；抗C₃d凝胶柱与补体致敏的红细胞反应为阳性；与IgG性质抗D致敏的红细胞反应为阴性；与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

要求只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶柱与IgG性质抗D致敏的红细胞及C₃d致敏的红细胞反应均为阴性，与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

步骤八、保存试验

上述直接抗人球蛋白试剂卡保存了1年以上，在此保存期间，该直接抗人球蛋白试剂卡具有以下检测结果：

(1)外观

直接抗人球蛋白试剂卡中的抗人球蛋白(抗IgG)凝胶应呈均匀乳白色或淡绿色，其他凝胶应呈均匀乳白色，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物，胶面上端有1～2mm清澈透明的液体。

(2)灵敏度

要求抗IgG凝胶柱检测的抗D抗体、抗Fy^a抗体效价均不低于试管直接抗人球蛋白法测定结果。

要求抗C₃d凝胶柱与补体致敏的红细胞反应强度≥1+。

(3)特异性

抗IgG凝胶柱与IgG性质抗D致敏的红细胞反应为阳性，与C₃d致敏的红细胞反应为阴性，与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

抗C₃d凝胶柱与补体致敏的红细胞反应为阳性；与IgG性质抗D致敏的红细胞反应为阴性；与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶柱与IgG性质抗D致敏的红细胞及C₃d致敏的红细胞反应均为阴性，与ACD抗凝的A型、B型、O型的既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

Claims (1)

1.一种直接抗人球蛋白试剂卡的制备方法，其特征在于所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，2人份/试剂卡，分别是二管含有抗IgG试剂的凝胶管、二管含有抗C₃d试剂的凝胶管和二管含有凝胶悬浮介质的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8，

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的凝胶，

步骤三、抗体的选择

抗IgG试剂的选择：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗IgG试剂对按照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集，

抗C₃d试剂的选择：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗C₃d试剂对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与抗C₃d试剂的反应强度≥1+，

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体试剂按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有抗IgG试剂的凝胶和含有抗C₃d试剂的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶，

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别加入到一空白卡片的6个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的直接抗人球蛋白试剂卡。