CN101706508A - Abo亚型检定试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ABO亚型检定试剂盒的制备方法，所述试剂盒由四张微柱凝胶检测卡组成：一张ABO亚型定型卡、一张ABO亚型定型卡I型、一张ABO亚型定型卡II型和一张ABO亚型定型卡III型，所述每张卡均具有6个微柱凝胶管。所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的悬浮和分装。采用本发明方法制备的ABO亚型检定试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定且能系统的检测ABO血型系统的亚型。

Description

ABO亚型检定试剂盒的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种用于ABO亚型检定试剂盒及其应用。更具体的说，本发明涉及一种ABO亚型检定试剂盒的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。

(二)背景技术

正确鉴定血型是安全输血的首要步骤，输血是临床抢救病人生命的重要医疗手段之一，而准确的ABO亚型检定则是安全输血的保障。ABO血型系统是最重的血型系统，也是比较复杂的血型系统之一，这正是由于ABO血型系统存在着多种亚型。ABO血型的鉴定，是由正反定型两者决定的，正定型检测红细胞的抗原，反定型检测人血清中的抗体。正反方向ABO血型抗原和抗体同时检测，才能正确地、完整地进行ABO血型的定型检测。因为有许多肿瘤及感染性疾病病情严重的患者、老年人等诸多情况下，正反定型结果不一致，因此对临床患者正确判断血型，必须ABO血型正反定型，其意义更为重要，往往直接关系到输血安全。

ABO血型系统具有多种亚型，其亚型是表型，很多亚型具有特异性的抗原，主要是经血型血清学试验仪抗原性弱为主要特征的多种表型。而经血型血清学确定的红细胞同一ABO亚型，经过抗原分子水平、糖基转移酶和基因水平研究等，亦证实其存在着异质性。对一些ABO亚型的基因基础进行了研究，如A₂和A₃，发现同一ABO血型亚型，具有不同的基因背景。

近期杜若莆研究员在其专著中总结了我国汉族人超过100万人的调查结果。其中A型、B型、AB型和O型的频率分别为：20％-30％、20％-38％、6％-12％、和30％-40％。世界各地区人种间的ABO型频率见下表。

ABO血型抗原在各人种间的分布频率表

A₁和A₂是血型血清学方法确定的最重要的A型红细胞亚型。一般认为，有两种A型抗原：A₁和A₂。A₁型红细胞上有这两种抗原，A₂型红细胞只要A抗原。B型人血清中含有两种抗体：抗-A和抗-A₁，A₁型人红细胞与这两种抗体反应，A₂型人红细胞这只与抗-A反应。B型人血清经A₂红细胞吸收后，只与A₁型红细胞反应，但过量地用A₂型红细胞吸收，则失去所有抗体.占1％-22％的A₂型人和22％-26％的A₂B型人的血清中可能产生抗-A₁。在室温下，该抗-A₁只凝集A₁红细胞，不凝集A₂红细胞。

A₃型红细胞的最大特征是混合视野凝集，即A₃细胞与抗-A和大多数抗-A，B孵育后出现一些油数个红细胞形成的小凝集块，并被绝大部分游离的非凝集红细胞包围。大部分A₃人血清中无抗-A₁，偶见A₃人有抗-A₁，分泌型人唾液中有A型物质。A₃红细胞表明有较强H抗原，但是A₃型人血清中H转移酶水平却在很大程度上低于A₁或A₂血清。A₃红细胞是血清学试验鉴定的，但在分析A₃型人血清中转移酶及其基因时发现，虽然都是A₃的人血清，其有关酶和基因都不近一致，存在着异质性。

A_X表型主要血清学特征是：与大多数B型人血清中的抗-A不发生凝集，而与大多数O型抗-A₁B发生凝集。不出现混合视野凝集。血清中经常含有抗-A₁，偶尔含有既凝集A₁也凝聚A₂的抗体。A_X分泌型唾液中含有正常的H抗原，但H抗原极少。A_X红细胞能吸收抗-A，但放散抗-A的能力要比A₁红细胞强。

A_e1红细胞一般情况不被抗-A或抗-A，B凝集，但经吸收放散试验可证实结合抗-A、抗-B。唾液中含有H物质，不含A物质。血清中含抗-A₁，也可能含抗-A₂。血清中及红细胞膜上均查不到A转移酶，血清中H转移酶要弱于A₁和A₂型人血清中的酶。

西方人的B亚型要少于A亚型。在日本，Yamaguchi等研究了700000名献血员，发现有B型抗原人频率是A型的一半，但B_X和B_m频率要比A_X和A_m高很多。在我国，胡荣花灯发现B₂亚型人的红细胞、血清、唾液标本检测等特征都与A₂相同，我国B亚型频率高于A亚型。确定对B亚型的判定标准比较困难，对B亚型的判定应与A亚型的标准大致相同。如B₃细胞最主要的特征与A₃相同，即与相应抗体出现混合视野外观。此外绝大多数B₃血清中无抗-B，唾液中正常的B抗原。同A₃一样，B₃在基因水平上也具有异质性。

Bx细胞也存在异质性。典型的Bx特征是与抗-A，B和抗-B发生弱凝集；血清中含很弱的抗-B；分泌型Bx人唾液中含有B物质，Bx细胞可以作为指示细胞，经凝集抑制试验证实唾液中有B物质。Bx个体的血清和红细胞膜上未检出B-转移酶。

1959年Cameron报道，在4年时间里，发现了7例患者红细胞上有B抗原，而血清中有抗-B，但该抗-B并不与自身红细胞B抗原反应。这些人分泌中有A和H抗原，却无B抗原。Cameron认为这类B抗原不是红细胞本身的，而是获得性B抗原，与疾病有关。20时间70年代，发现获得性B患者不含有B转移酶，90年代应用分子生物学技术进行限制性片段长度多态性研究表明，获得性B抗原患者并不含有B基因。这样在基因水平更明确了获得性B的性质。

1952年Bhende等在印度发现了3个人的红细胞为O型，缺失H抗原，分泌液中无H抗原，但在血清中有抗-H抗体，称该类血型为孟买型或Oh型，也称之非分泌孟买型。

一些非分泌型人的红细胞缺失H，但是也抗-A和(或)抗-B反应都出现弱凝集，此类人称A_h、B_h、或AB_h，H部分缺失的非分泌型人被称之为副孟买型，在欧洲人种该类型比较多。但是目前福孟买型也包括了H抗原完全缺失和H部分缺失的分泌型人。

从上述可知，为常人所熟知的ABO血型系统其实是非常复杂的，而且其是最重的血型系统，存在的亚型也较多，所以准确、快速、简便的进行ABO亚型检定就显得极其重要。而正确鉴定血型则是安全输血的首要步骤，输血是临床抢救病人生命的重要医疗手段之一，准确的ABO血型鉴定则是安全输血的保障。

目前国内，还没有系统的成套产品用于ABO亚型检定的试剂，试剂难以获得；其二是需要多种抗体和多种反定红细胞才能最终确定ABO亚型；其三是采用传统的试管方法很繁琐，使得很多医疗机构不进行ABO亚型检定，从而导致了严重的输血事故。

在国外，已经有少部分厂家生产用于亚型检定的产品，但其采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶的颗粒大小为70纳米以上，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得进行ABO亚型检定的灵敏度降低。此外，已有的卡不成系列，只能检测单个的亚型，不能系统的检测ABO血型系统的亚型。此外，国外ABO亚型检定抗体不全，其针对的人群也有所不同。

(三)发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、质量稳定且能系统的检测ABO血型系统的亚型的ABO亚型检定试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：一种ABO亚型检定试剂盒，所述试剂盒由四张微柱凝胶检测卡组成，所述四张微柱凝胶检测卡分别为一张ABO亚型定型卡、一张ABO亚型定型卡I型、一张ABO亚型定型卡II型和一张ABO亚型定型卡III型，所述每张卡均具有6个微柱凝胶管，其中所述ABO亚型定型卡的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和三管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；所述ABO亚型定型卡I型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶管和两管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；所述ABO  型定型卡II型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶管和一管用作自身对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；所述ABO亚型定型卡III型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和两管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管和一管用作自身对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管。

所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸          (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠          (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾    (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠    (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白  ≤2％

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

抗A为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗B为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗AB为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗A₁为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4

抗H为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的ABO亚型定型卡、ABO亚型定型卡I型、ABO亚型定型卡II型和ABO亚型定型卡III型，从而组成了一套ABO亚型检定试剂盒。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度；

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内(30-60纳米)；

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过；

4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就抑不同.几种酯的复合，具有更好的防腐能力.国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对ABO亚型检定试剂盒的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对ABO亚型检定试剂盒的特异性产生的不良影响.

本发明的另一方面，为了保证本发明ABO亚型检定试剂盒的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。

本发明的再一方面，为了保证本发明ABO亚型检定试剂盒的质量，在制备过程中还对与凝胶混合的抗体原料进行筛选。

本发明的还有一方面，所述的卡形成系列，能系统的检测ABO血型系统的亚型。此外，ABO亚型检定抗体齐全，能针对所有的人群。

综上所述，本发明的ABO亚型检定试剂盒之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，4种亚型定型卡组成一个试剂盒，相互配合使用，就可以准确地进行ABO亚型检定；缓冲体系可以维持分型卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。

ABO亚型检定试剂盒一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的ABO亚型检定试剂盒产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的ABO亚型检定试剂盒，为准确进行ABO亚型检定和保证安全输血创造了条件。

(四)具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯  (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸            (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠            (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾        (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠        (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白      ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

抗A为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗B为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗AB为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗A₁为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4

抗H为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的ABO亚型定型卡、ABO亚型定型卡I型、ABO亚型定型卡II型和ABO亚型定型卡III型，从而组成了一套ABO亚型检定试剂盒。

步骤六、半成品测定

要求含有抗体的微柱凝胶管中，要求抗A凝胶与A₁、A₁B、A₂、A₂B红细胞产生4+阳性反应，要求抗B凝胶与B和AB型红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗AB凝胶与AB、A、B红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗A₁凝胶与A₁、A₁B红细胞均产生4+阳性反应，与A₂、A₂B红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗H凝胶与O红细胞均产生阳性反应。不小于3+的阳性反应即是红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

步骤八、保存试验

上述ABO亚型检定试剂盒保存了1年以上，在此保存期间，该ABO亚型检定试剂盒具有以下检测结果：

(1)外观

ABO亚型检定试剂盒中的凝胶均应呈均匀乳白色，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物，胶面上端有1～2mm清澈透明的液体，含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶应呈均匀蓝色、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶应呈均匀黄色、含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶应呈均匀白色、含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶应呈均匀白色、含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶应呈均匀白色，含有凝胶悬浮介质的凝胶也应呈均匀白色。

(2)灵敏度

要求含有抗体的微柱凝胶管中，要求抗A凝胶与A₁、A₁B、A₂、A₂B红细胞产生4+阳性反应，要求抗B凝胶与B和AB型红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗AB凝胶与AB、A、B红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗A₁凝胶与A₁、A₁B红细胞均产生4+阳性反应，与A₂、A₂B红细胞产生≥3+凝集反应，要求抗H凝胶与O红细胞均产生阳性反应。不小于3+的阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。

(3)特异性

含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。

Claims (1)

1.一种ABO亚型检定试剂盒的制备方法，其特征在于：所述试剂盒由四张微柱凝胶检测卡组成，所述四张微柱凝胶检测卡分别为一张ABO亚型定型卡、一张ABO亚型定型卡I型、一张ABO亚型定型卡II型和一张ABO亚型定型卡III型，所述每张卡均具有6个微柱凝胶管，其中所述ABO亚型定型卡的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和三管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；ABO亚型定型卡I型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶管和两管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；ABO亚型定型卡II型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶管和一管用作自身对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管；ABO亚型定型卡III型的6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、两管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管和一管用作自身对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸          (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠          (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾      (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠      (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白    ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8，

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶，

步骤三、抗体的选择

抗A为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗B为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗AB为IgM性质的单克隆抗体，效价≥128

抗A₁为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4

抗H为IgM性质的单克隆抗体，效价≥4，

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗AB抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗A₁抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗H抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶，

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的ABO亚型定型卡、ABO亚型定型卡I型、ABO亚型定型卡II型和ABO亚型定型卡III型，从而组成了一套ABO亚型检定试剂盒。