PT1977244E

PT1977244E - Distinção entre meningites bacterianas e virais

Info

Publication number: PT1977244E
Application number: PT06841938T
Authority: PT
Inventors: Martin Chalumeau; Francois Dubos; Dominique Gendrel; Gerard Breart
Original assignee: Assist Publ Hopitaux De Paris
Priority date: 2005-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2010-11-11
Also published as: SI1977244T1; ES2352045T3; DE602006015702D1; WO2007068830A1; ATE475096T1; CA2633912A1; EP1977244A1; FR2894675B1; US8232046B2; PL1977244T3; US20090221021A1; EP1977244B1; FR2894675A1

Description

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DESCRIÇÃO "DISTINÇÃO ENTRE MENINGITES BACTERIANAS E VIRAIS" A presente invenção refere-se ao domínio da distinção entre meningites bacterianas e virais. Muito particularmente refere-se a um processo de detecção de uma infecção do tipo meningite bacteriana consistindo principalmente na determinação de parâmetros biológicos tais como a concentração de procalcitonina no sangue e a concentração de proteínas presentes no líquido cefalorraquidiano.

As meningites agudas são infecções comuns, maioritariamente de origem de virai (82-94%) e que podem então ser espontaneamente suprimidas. No entanto, quando são de origem bacteriana (6-18%), as meningites podem ser mortais e estão frequentemente associadas a sequelas neurológicas graves, particularmente quando o diagnóstico e o tratamento são iniciados tardiamente. Actualmente, devido à dificuldade de distinguir rapidamente e de modo inequívoco as meningites bacterianas das meningites virais, os pacientes nos quais é identificada uma meningite são tratados rapidamente com antibióticos em hospitalização e o seu tratamento é prolongado até a origem da meningite ser claramente diagnosticada. As consequências dessa administração sistemática de antibióticos aos pacientes nos quais é identificada uma meningite são importantes não só ao nível económico como também ao nível médico. De facto, esse tipo de administração contribui para o risco de desenvolvimento de estirpes bacterianas resistentes a antibióticos, doenças nosocomiais e especialmente apresentam um custo elevado. Um estudo efectuado nos Estados Unidos mostrou assim que a hospitalização de pacientes sofrendo de meningite virai representa um custo 2 de 250 a 300 milhões de dólares por ano (Khetsuriani et al., Neuroepidemiology 2003, vol. 22, páginas 345-352).

Consequentemente, parece necessário estabelecer um diagnóstico rápido e simples que permita distinguir as meningites bacterianas das meningites virais com uma sensibilidade de 100% para as meningites bacterianas. São conhecidos numerosos sinais clínicos para distinguir as meningites bacterianas das meningites virais com uma certa sensibilidade tal como descrito nos artigos de Michelow et al. (Pediatr. Infect. Dis. Journal, 2000, vol. 19, páginas 66-72) e Tatara et al. (Pediatr. Int., 2000, vol.42, páginas 541-546). A titulo de exemplo de tais sinais clínicos pode-se citar a púrpura, o aspecto designado "séptico e/ou tóxico" e as convulsões que contribuem para o diagnóstico de meningite bacteriana. No entanto, estes sinais clínicos nem sempre estão presentes e são detectáveis em pacientes que sofrem de meningite bacteriana.

Existem igualmente testes bacteriológicos susceptíveis de dar resultado com uma grande especificidade, mas estes testes não alcançam a sensibilidade requerida de 100% para as meningites bacterianas. Existe assim sempre um risco com tais testes de não identificar a totalidade dos pacientes sofrendo de meningites bacterianas. Tais testes não podem assim ser utilizados para evitar a administração sistemática de antibióticos aos pacientes nos quais tenha sido identificada uma meningite. A título de exemplo de testes bacteriológicos, podem-se citar a coloração de Gram ou os estudos de antigénios bacterianos do líquido cefalorraquidiano tal como descrito nas publicações de Nigrovic et al. (Pediatrias, 2002, vol. 110, páginas 712- 3 719), Saez-Llorens et al. (Lancet, 2003, vol. 88, páginas 615-620), Tunkel et al. (Clin. Infect. Dis., 2004, vol. 39, páginas 1267-1284), Maxson et al. (J. Pediatr., 1994, vol. 125, páginas 235-238) . Marcadores biológicos foram igualmente propostos para melhorar o diagnóstico etiológico das meningites, tal como descrito nas publicações de Seaz-Lorens et al. (Lancet, 2003, vol. 88, páginas 615-620) e Tunkel et al. {Clin. Infect. Dis., 2004, vol. 39, páginas 1267-1284). A titulo de exemplo dos marcadores biológicos propostos, podem-se citar marcadores presentes no sangue como a proteína C reactiva, a interleucina 6, leucócitos dos quais neutrófilos, marcadores presentes no líquido cefalorraquidiano tais como proteínas, leucócitos dos quais neutrófilos, e marcadores presentes no sangue e no líquido cefalorraquidiano como a procalcitonina, o lactato, a glicose, tais como os descritos em Ferriere et al. (Annales de biologie clinique, 2000, vol.58, páginas 49-59), Jereb et al. {Infection, 2001, vol. 29, páginas 209-212), Mary et al. (Annales de biologie clinique, 2003, vol. 61, páginas 127-137), Bender et al. (Neurology, vol. 63, páginas 1311-1313), Gendrel et al. (Méd. Mal. Infect., vol. 26, páginas 1068-1072), Van Rossum et al., (Lancet Infect. Dis., 2004, vol. 4, páginas 620-630), Schwartz et al. (Criticai care medicine, 2000, vol. 28, páginas 1828-1832), Viallon et al. (Presse médicale, 2000, vol. 29, páginas 584-588), Gendrel et al., (Presse médicale, 1998, vol. 27, páginas 1133-1139) .

Numerosas regras combinando estes sinais clínicos e/ou estes marcadores biológicos foram propostas para distinguir as meningites bacterianas e as virais.

Assim, podem-se citar a regra de Jaeger et al. (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 200, vol. 19, páginas 1418- 4 1421) que é um modelo baseado na determinação da concentração de glicose e de glóbulos brancos no sangue e da concentração de neutrófilos e proteínas no líquido cefalorraquidiano. A regra de Bonsu et al. {Pediatr. Infect. Dis. J., 2004, vol. 23, páginas 511-517) é uma equação fraccional polinomial baseada na determinação da concentração de neutrófilos e de proteínas no líquido cefalorraquidiano e tem também em consideração a idade do paciente. A regra de Freedman et al. (Freedman et al., (Arch. Pediatr. Adolesc. Med., 2001, vol. 155, páginas 1301-1306) baseia-se numa lista de diferentes características incluindo a idade do paciente, a coloração de Gram do líquido cefalorraquidiano e a concentração de glóbulos brancos, de proteínas, de glicose no líquido cefalorraquidiano. A regra de Nigrovic et al. (Pediatrics 2002, vol. 110, páginas 712-719) é igualmente baseada numa lista de características incluindo a presença de convulsões no paciente, a concentração de neutrófilos no sangue, a coloração de Gram do líquido cefalorraquidiano, a concentração de neutrófilos e de proteínas no líquido cefalorraquidiano. A regra de Ooestenbrink et al. (Arch. Pediatr. Adolesc. Med., 2002, vol. 156, páginas 1189-1194) associa numa grelha complexa elementos clínicos com elementos bioquímicos.

No entanto, actualmente não existem testes rápidos e simples que permitam distinguir as meningites bacterianas 5 das virais com a sensibilidade requerida de 100% para as meningites bacterianas e com uma especificidade suficientemente elevada.

Os inventores estabeleceram agora um processo rápido e simples de detecção precoce da presença de uma meningite bacteriana apresentando uma sensibilidade de 100% para as meningites bacterianas e isto com uma especificidade superior a 50%.

Assim, um primeiro objectivo da invenção corresponde a um processo in vitro de detecção da presença de uma meningite bacteriana que consiste em: i) a determinação da concentração de procalcitonina presente numa amostra sanguínea de teste; e ii) a comparação da concentração assim determinada com a concentração de procalcitonina presente numa amostra de referência ou com um valor de referência. iii) a determinação da concentração de proteínas presentes numa amostra de líquido cefalorraquidiano de teste; e iv) a comparação da concentração assim determinada com a concentração de proteínas numa amostra de referência ou com um valor de referência.

Entenda-se por meningite bacteriana, uma inflamação das meninges que pode ser provocada por diferentes tipos de germes mas principalmente três: os meningococos (Neisseria meningitidis), os pneumococos (Streptococcus pneumoniae) e os Haemophilus influenzae de tipo b.

Entenda-se por procalcitonina a proteína precursora da calcitonina de 116 aminoácidos de cadeia simples descrita 6 por Le Moullec JM et al. (SEQ ID NO: 8 da patente US 6,905,687, FEBS Letter, 1984, páginas 167-193) e actualmente designada ProCT ou PCT. Embora verificada em diferentes tecidos, a procalcitonina é sintetizada maioritariamente no figado. Experiências efectuadas em animais e no homem, deixam supor que a procalcitonina está implicada na reacção inflamatória, sem que o seu papel esteja actualmente claramente estabelecido. A procalcitonina foi descrita como um marcador precoce de infecções bacterianas graves (pielonefrite) (Gendrel et al., Archives de Pédiatrie, Elsevier, Paris, 1998, vol. 5, páginas 269S-273S).

Entenda-se por amostra sanguínea de teste uma amostra sanguínea de um indivíduo susceptível de estar afligido de meningite bacteriana. As amostras sanguíneas podem ser obtidas de acordo com técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica com o auxílio, por exemplo, de um agulha munida de uma seringa introduzida numa veia do antebraço ou da prega do cotovelo de um indivíduo. Uma amostra de 1 a 3 mL de sangue obtida numa criança poderá ser suficiente para realizar o processo de acordo com a presente invenção. Vantajosamente, a amostra de sangue pode ser tratada para inibir as propriedades bactericidas normais do sangue e eventuais agentes anti-microbianos através da diluição do sangue e da adição de inibidores tais como o polianetolsulfonato de sódio (SPS) à concentração de 0,025%.

Vantajosamente, a amostra sanguínea de teste corresponde a uma amostra de soro ou de plasma de um indivíduo no qual se pretende determinar o estatuto em relação a meningite bacteriana. Uma tal amostra de soro ou de plasma pode ser obtida simplesmente pelo perito na técnica através de 7 centrifugação de uma amostra sanguínea e recuperação do sobrenadante.

Entenda-se por amostra de referência do passo ii), qualquer amostra onde a concentração de procalcitonina após comparação com a concentração de procalcitonina da amostra sanguínea de teste acima mencionada ofereça uma indicação da presença de uma meningite bacteriana no referido indivíduo do qual provem a referida amostra sanguínea de teste.

De facto, os inventores demonstraram que os indivíduos afligidos de meningite bacteriana apresentam uma concentração de procalcitonina no sangue aumentada em relação a indivíduos saudáveis ou sofrendo de uma meningite virai. Assim, os inventores puderam determinar que uma concentração de procalcitonina superior ou igual a 0,5 ng/mL na amostra sanguínea de teste permite concluir que há uma infecção no indivíduo testado quanto a uma meningite bacteriana. A título de exemplo do valor de referência, podemos assim citar uma concentração de procalcitonina de 0,5 ng/mL. A título de exemplo da amostra de referência do passo ii), podem-se citar amostras sanguíneas provenientes de um indivíduo saudável ou provenientes de um indivíduo sofrendo de uma meningite virai, amostras de soro sanguíneo provenientes de um indivíduo saudável ou provenientes de um indivíduo sofrendo de uma meningite virai, amostras de plasma sanguíneo provenientes de um indivíduo saudável ou provenientes de um indivíduo sofrendo de uma meningite virai ou ainda uma solução de procalcitonina a uma concentração determinada. 8

Entenda-se por indivíduo saudável, um indivíduo que não apresente patologias.

Entenda-se por meningite virai, uma inflamação das meninges que pode ser provocada por diferentes vírus como enterovírus tais como Echovirus, Coxsackie e mais raramente vírus do grupo herpes tais como os herpes 1 e 2, o citomegalovírus, o vírus de Epstein-Barr, o vírus varicela zoster e o vírus HHV6 e mais raramente arboviroses.

De acordo com uma forma de realização preferida do referido processo de acordo com a invenção, a referida amostra de referência do passo ii) é uma solução de procalcitonina a uma concentração determinada.

Entenda-se por solução de procalcitonina a uma concentração determinada, uma solução de procalcitonina a uma concentração compreendida entre 0,05 ng/mL e 10 ng/mL, de preferência entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL e de maior preferência de 0,5 ng/mL. Uma tal solução pode ser obtida simplesmente pelo perito na técnica através da dissolução de uma quantidade determinada de procalcitonina purificada e/ou recombinante num volume de água ou de solução tampão, tal como PBS. Uma tal proteína purificada e/ou recombinante pode em particular ser obtida de acordo com as técnicas descritas na patente US 6,905,687. A determinação da concentração de procalcitonina presente numa amostra sanguínea de teste pode ser realizada de acordo com técnicas bem conhecidas do perito na técnica. A título de exemplo, podem-se citar técnicas imunológicas quantitativas utilizando anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente à procalcitonina tais como a técnica de ELISA ou ainda as técnicas descritas no Pedido PCT WO 97/20213. 9

De acordo com uma segunda forma de realização preferida do referido processo de acordo com a invenção, a determinação da concentração de procalcitonina presente numa amostra sanguínea de teste compreende pôr em contacto a amostra com um anticorpo que se ligue especificamente à procalcitonina. A determinação da concentração de procalcitonina com ajuda de anticorpos que se liguem especificamente à procalcitonina pode-se efectuar de acordo com técnicas bem conhecidas do perito na técnica tal como por exemplo através de técnicas imunológicas quantitativas tais como a técnica de ELISA, as técnicas descritas no Pedido PCT WO 97/20213, a técnica descrita em Guillani et al. (Câncer Res.r 1989, vol. 49, páginas 6845-6851) e os métodos implementados nos estojos LUMItest® igualmente designados B.R.A.H.M.S. PCT LIA, B.R.A.H.M.S. PCT KRYPTOR® e LIAISON B.R.A.H.M.S. PCT disponíveis em B.R.A.H.M.S. Diagnostica (Berlim, Alemanha). As referidas técnicas imunológicas quantitativas podem pôr a funcionar anticorpos monoclonais que se liguem especificamente à procalcitonina marcados directamente ou indirectamente com auxílio de um segundo anticorpo marcado por exemplo com uma enzima tal como peroxidase, fosfatase alcalina e β-galactosidase, através de um reagente luminescente tal como fluoresceína, rodamina cianina ou com o auxílio de um segundo anticorpo biotinilado.

Os anticorpos ou os fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente à procalcitonina podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais. Os fragmentos de anticorpo que se ligam à procalcitonina podem ser escolhidos de entre o grupo que compreende os fragmentos Fab, F(ab')2, FV e sFv. A título de exemplo de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à procalcitonina, podem-se citar os 10 anticorpos descritos nas patentes US 6,451,311, US 5,330,909 e US 6,133,427, os anticorpos disponíveis em ABCAM com as referências «abl4813», «abll498», «abll494», «abl4817», «abl4816», «ab24454», os anticorpos disponíveis em CHEMICON com a referência «MAB3490» e os anticorpos disponíveis em GeneTex®, Inc. com as referências «GTX14813», «GTX11498», «GTX11494», «GTX14817» e «GTX14816».

Entenda-se por proteínas do líquido cefalorraquidiano, as proteínas presentes no líquido contido nos espaços delimitados pelas meninges e nos ventrículos do cérebro. A título de exemplo de proteínas do líquido cefalorraquidiano, pode-se citar a pré-albumina, a albumina, a αΐ-globulina, a a2-globulina, a βΐ-globulina e a p2-globulina e as γ-globulinas.

Entenda-se por amostra de líquido cefalorraquidiano de teste, uma amostra de líquido cefalorraquidiano de um indivíduo susceptível de sofrer de meningite bacteriana. No processo de acordo com a invenção, a amostra sanguínea de teste e a amostra de líquido cefalorraquidiano de teste provêm do mesmo indivíduo. As amostras de líquido cefalorraquidiano podem ser obtidas de acordo com técnicas bem conhecidas do perito na técnica por exemplo através de uma punção lombar.

Entenda-se por amostra de referência do passo iv), qualquer amostra cuja concentração de proteínas após comparação com a concentração de proteínas da referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste ofereça uma indicação da presença de uma meningite bacteriana no referido indivíduo do qual provém a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste. 11

De facto, os inventores demonstraram que indivíduos sofrendo de meningite bacteriana apresentam uma concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano aumentada em relação aos indivíduos saudáveis ou sofrendo de uma meningite virai. Assim, os inventores puderam determinar que uma concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano superior ou igual a 0,5 g/L na amostra de líquido cefalorraquidiano de teste permite concluir uma infecção do indivíduo testado por uma meningite bacteriana. A título de exemplo do valor de referência, pode-se assim citar uma concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano de 0,5 g/L. 0 processo de acordo com a invenção, ao identificar os indivíduos cuja concentração de procalcitonina é superior ou igual a 0,5 ng/mL e/ou cuja concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano é superior ou igual a 0,5 g/L, permite identificar os indivíduos que sofrem de uma meningite bacteriana com uma sensibilidade de 100%. A título de exemplo da amostra de referência do passo iv), podem-se citar amostras de líquido cefalorraquidiano provenientes de um indivíduo saudável ou provenientes de um indivíduo sofrendo de uma meningite virai ou uma solução de proteínas a uma concentração determinada.

De acordo com uma terceira forma de realização preferida do referido processo de acordo com a invenção, a referida amostra de referência do passo iv) pode corresponder a uma solução de proteínas a uma concentração determinada.

Entenda-se por solução de proteínas a uma concentração determinada, uma solução de proteínas a uma concentração compreendida entre 0,05 e 5 g/L, de preferência entre 0,1 e 1 g/L e de modo particularmente preferido de 0,5 g/L. Uma 12 tal solução pode ser obtida simplesmente pelo perito na técnica através da dissolução de uma quantidade determinada de proteínas, em particular da BSA (Albumina de Soro Bovino) à concentração desejada num volume de água ou de solução tampão tal como PBS. A determinação da concentração de proteínas presentes numa amostra de líquido cefalorraquidiano de teste pode efectuar-se de acordo com técnicas bem conhecidas do perito na técnica, tais como técnicas imunológicas que utilizam anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se liguem especificamente as proteínas do líquido cefalorraquidiano, técnicas baseadas na medição da actividade enzimática das referidas proteínas do líquido cefalorraquidiano, testes de biologia molecular, testes físicos, testes químicos tais como testes colorimétricos, determinação da massa das referidas proteínas do líquido cefalorraquidiano tal como espectroscopia de massa.

De acordo com uma quarta forma de realização preferida do referido processo de acordo com a invenção, o passo iii) de determinação da concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano é efectuado através de um teste colorimétrico.

Um tal teste colorimétrico compreende pôr em contacto a referida amostra de líquido cefalorraquidiano com um reagente colorimétrico cuja reacção com as referidas proteínas permite determinar a sua concentração. A título de exemplo de testes colorimétricos, podem-se citar os métodos de coloração com metanol acético, com amidoschwartz ou com vermelho de pirogalol utilizados por exemplo no estojo disponível em ROCHE DIAGNOSTICS com a referência «03515826». 13

Vantajosamente, o referido indivíduo de quem provém a referida amostra sanguínea de teste e eventualmente a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste tem uma idade compreendida entre 2 semanas e 25 anos, de preferência entre 3 semanas e 18 anos e de maior preferência preferencialmente entre 1 mês e 16 anos.

Ainda vantajosamente, o processo de acordo com a invenção é efectuado em amostras de teste provenientes de um indivíduo que esteja estabelecido como estando a sofrer de uma meningite, a qual é assim potencialmente de origem bacteriana. A título de exemplo de tais indivíduos, podem-se citar indivíduos apresentando mais de 5 glóbulos brancos/mm3, de preferência mais de 7 glóbulos brancos/mm3 no seu líquido cefalorraquidiano tal como descrito nas publicações de Greenlee et al. (Dis. Clin. North. Am., 1990, vol.4, páginas 583-598) e Saez-Lorens et al. (Dis. Clin. North. Am., 1990, vol.4, páginas 623-644). A determinação da concentração de glóbulos brancos presentes no líquido cefalorraquidiano pode ser efectuada através de técnicas bem conhecidas do perito na técnica.

Ainda vantajosamente, o processo de acordo com a invenção não é efectuado sobre amostras sanguíneas de teste e eventualmente de líquido cefalorraquidiano provenientes de indivíduos cuja probabilidade de sofrerem de meningite bacteriana é tal, que a implementação do referido processo de acordo com a invenção seja inútil. A título de exemplo de tais indivíduos, podem-se citar os indivíduos que tenham sido submetidos a uma intervenção neurocirúrgica, os indivíduos que sofram de imunossupressão 14 e/ou os indivíduos que apresentem púrpura, um aspecto séptico e/ou tóxico e/ou convulsões.

Entenda-se por imunodepressão, uma diminuição ou uma supressão das reacções imunitárias de um organismo.

Entenda-se por púrpura manchas hemorrágicas causadas por sangue extravasado para fora dos capilares da pele ou das mucosas podendo se traduzir em petéquias ou numa equimose. Estas manchas são de cor vermelho vivo ou azuladas e não desaparecem com pressão.

Entenda-se por aspecto séptico e/ou tóxico, um indivíduo apresentando uma aparência letárgica, sinais de fraca perfusão como uma cor de pele pálida, acinzentada tal como descrito na publicação de Baker et al. (Pediatrias, 1990, vol. 85, páginas 1040-1043), sinais de hipoventilação ou hiperventilação ou cianose tal como descrito na publicação de Baraff et al. (Pediatrics, 1993, vol. 2, páginas 1-12).

Entenda-se por convulsões, contracções involuntárias e instantâneas, determinantes de movimentos localizados num ou mais grupos musculares ou generalizados por todo o corpo.

Ainda vantajosamente, o processo de acordo com a invenção não é efectuado em amostras cuja qualidade não permita a implementação do processo de acordo com a invenção. A título de exemplo de tais amostras, podem-se citar amostras de líquido cefalorraquidiano cuja colheita resultou numa hemorragia localizada do paciente. Tais amostras de líquido cefalorraquidiano apresentam então uma concentração de glóbulos vermelhos superior a 12.000 glóbulos vermelhos/mm3, de preferência superior a 10.000 15 glóbulos vermelhos/mm3. A determinação da concentração de glóbulos vermelhos presentes na amostra de líquido cefalorraquidiano pode ser efectuada através de técnicas bem conhecidas do perito na técnica.

Ainda vantajosamente, o processo de acordo com a invenção não é implementado em amostras de teste provenientes de pacientes nos quais foi realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas antecedentes à colheita das referidas amostras sanguíneas e eventualmente cefalorraquidianas de teste.

Entenda-se por tratamento antibiótico, a administração de um antibiótico escolhido de entre o grupo que compreende a família de β-lactaminas tais como penicilina e ampicilina, as cefalosporinas, a família de aminósidos tais como gentamicina, a família de fenicóis tais como cloranfenicol.

Em geral, na prática, é realizado um passo de coloração de Gram da amostra de líquido cefalorraquidiano de teste que permite identificar a presença de bactérias na referida amostra de teste. A coloração de Gram do líquido cefalorraquidiano pode-se efectuar de acordo com técnicas bem conhecidas do perito na técnica tais como a técnica de Gram modificada por Hucker. A coloração de Gram é uma coloração diferencial baseada na maior permeabilidade da parede das bactérias Gram negativas ao álcool. Consiste, em primeiro lugar, em realizar um complexo corante solúvel em álcool (cristal violeta-lugol) que cora de violeta o citoplasma de todas as bactérias. Em segundo lugar, intervém a descoloração através de álcool, que atravessa bem a parede das bactéria Gram-negativas, e que dissolve o complexo corante. Nas bactérias Gram-positivas a parede não se deixa atravessar. A coloração de Gram do líquido cefalorraquidiano pode permitir a detecção de bactérias que causam meningites tais como H. influenzae, S. pneumoniae, 16 N. meningitidis. Η. influenzae e N. meningitidis são bactérias Gram-negativas enquanto que S. pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva. 0 processo de acordo com a invenção é implementado após um primeiro passo de colheita de uma amostra sanguínea do referido indivíduo e, eventualmente, uma amostra de líquido cefalorraquidiano do referido indivíduo.

As amostras sanguíneas e de líquido cefalorraquidiano podem ser obtidas simplesmente de acordo com técnicas de colheita descritas anteriormente.

De acordo com uma forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção, este compreende ainda um passo de administração de antibióticos aos pacientes para os quais a presença de uma meningite bacteriana foi diagnosticada.

Um segundo objectivo da invenção corresponde a um estojo que consiste em: meios de detecção da procalcitonina, meios de detecção de proteínas, de preferência numa amostra de líquido cefalorraquidiano. 0 estojo de acordo com a invenção permite diagnosticar a presença de uma meningite bacteriana num indivíduo.

Entenda-se por meios de detecção da procalcitonina, meios de implementação de técnicas imunológicas quantitativas compreendendo anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se liguem especificamente à proteína procalcitonina. Tais meios de detecção permitem determinar a concentração de procalcitonina numa amostra sanguínea. 17

De acordo com uma forma de realização preferida do estojo de acordo com a invenção, os referidos meios de detecção da procalcitonina são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente à procalcitonina.

Entenda-se por anticorpos tanto anticorpos policlonais como monoclonais, de preferência anticorpos monoclonais. A titulo de exemplo de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente à procalcitonina, podem-se citar os anticorpos descritos nas patentes US 6,451,311, US 5,330,909 e US 6,133,427, os anticorpos disponíveis em ABCAM com as referências «abl4813», «abcl498», «abcl494», «abl4817», «abl4816», «ab24454», o anticorpo disponível em CHEMICON com a referência «MAB3490» e os anticorpos disponíveis em GeneTex®, Inc. com as referências «GTX14813», «GTX11498», «GTX11494», «GTX14817» e «GTX14816».

Entenda-se por fragmento de anticorpo que se ligue especificamente à procalcitonina, os fragmentos Fab, F(ab')2, FV e sFv de anticorpos monoclonais que se liguem especificamente à procalcitonina.

Vantajosamente, o estojo de acordo com a invenção compreende ainda uma solução de procalcitonina a uma concentração determinada como amostra de referência.

Entenda-se por solução de procalcitonina a uma concentração determinada, uma solução de procalcitonina a uma concentração compreendida entre 0,05 ng/mL e 10 ng/mL, de preferência entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL e de maior preferencia de 0,5 ng/mL. 18

Entenda-se por meio que permite a detecção de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano, qualquer meio que permita a revelação da presença de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano tal como anticorpos dirigidos contra proteínas do líquido cefalorraquidiano, enzimas que permitem revelar a actividade das referidas proteínas ou ainda reagentes cuja reacção com as referidas proteínas permite determinar a sua concentração tais como corantes. Tais meios permitem determinar a concentração de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano.

De acordo com uma forma de realização preferida do estojo de acordo com a invenção, os referidos meios que permitem a detecção de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano são reagentes colorimétricos, cuja reacção com as referidas proteínas permite determinar a concentração de proteínas na referida amostra. A título de exemplo de tais reagentes colorimétricos, podem-se citar o vermelho de pirogalol, uma solução de amidoschwartz, uma solução de metanol acético ou uma mistura destes.

Ainda vantajosamente, o estojo de acordo com a invenção compreende também uma solução de proteínas a uma concentração determinada.

Entenda-se por solução de proteínas a uma concentração determinada, uma solução de proteínas a uma concentração compreendida entre 0,05 e 5 g/L, de preferência entre 0,1 e 1 g/L e de modo particularmente preferido de 0,5 g/L.

Em geral, uma lista de instruções a seguir para utilizar os referidos meios de detecção para diagnosticar a presença de uma meningite bacteriana num indivíduo é adicionada ao estojo de acordo com a invenção. 19

Um terceiro objectivo da invenção corresponde à utilização de um estojo tal como descrito anteriormente para o fabrico de uma ferramenta de diagnóstico da meningite bacteriana.

De acordo com uma forma de realização preferida da utilização de acordo com a invenção, a referida ferramenta de diagnóstico é destinada a indivíduos cuja idade esteja compreendida entre 2 semanas e 25 anos, de preferência entre 3 semanas e 18 anos e de maior preferência entre 1 mês e 16 anos.

De acordo com uma segunda forma de realização preferida da utilização de acordo com a invenção, a referida ferramenta de diagnóstico está destinada a indivíduos que esteja estabelecido estarem a sofrer de uma meningite, a qual é assim potencialmente de origem bacteriana. A título de exemplo de tais indivíduos, podem-se citar indivíduos nos quais uma amostra de liquido cefalorraquidiano apresenta mais de 5 glóbulos brancos/mm3, de preferência mais de 7 glóbulos brancos/mm3.

De acordo com uma terceira forma de realização preferida da utilização de acordo com a invenção, a referida ferramenta de diagnóstico não está destinada a indivíduos cuja probabilidade de sofrerem de meningite bacteriana seja tal, que a implementação da referida ferramenta de diagnóstico seja inútil. A titulo de exemplo de tais indivíduos, podem-se citar os indivíduos que tenham sido previamente submetidos a uma intervenção neurocirúrgica, os indivíduos que sofram de imunodepressão e/ou os indivíduos que apresentem púrpura, um aspecto séptico e/ou tóxico e/ou convulsões. 20

De acordo com uma quarta forma de realização preferida de utilização de acordo com a invenção, a referida ferramenta de diagnóstico não está destinada a indivíduos aos quais tenha sido realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas anteriores à colheita nos referidos indivíduos de uma amostra sanguínea e, eventualmente, de uma amostra de líquido cefalorraquidiano.

De acordo com uma quinta forma de realização preferida da utilização de acordo com a invenção, a referida ferramenta de diagnóstico não está destinada a indivíduos que apresentem mais de 12.000 glóbulos vermelhos/mm3, de preferência mais de 10.000 glóbulos vermelhos/mm3 no seu líquido cefalorraquidiano.

Um quarto objectivo da invenção corresponde à utilização de um estojo de acordo com a invenção num processo para detectar a presença de uma meningite bacteriana.

Sobressai assim da invenção que é possível identificar a presença de uma meningite bacteriana comparando a concentração de procalcitonina presente numa amostra sanguínea de teste proveniente de um indivíduo com a concentração de procalcitonina presente numa amostra de referência ou com um valor de referência, e a concentração de proteínas presentes numa amostra de líquido cefalorraquidiano de teste proveniente de um indivíduo com a concentração de proteínas presentes numa amostra de referência ou com um valor de referência.

Vantajosamente, as referidas comparações são efectuadas através de meios informáticos, de preferência através de um computador. 21

Estas comparações permitem estabelecer um diagnóstico em relação a uma meningite bacteriana para o referido indivíduo.

Ainda vantajosamente, o método de acordo com a invenção pode compreender a impressão de um relatório. 0 referido processo é implementado num indivíduo possuindo uma idade compreendida entre 2 semanas e 25 anos, de preferência entre 3 semanas e 18 anos e de maior preferência entre 1 mês e 16 anos. 0 referido processo é implementado num indivíduo cujo líquido cefalorraquidiano pode apresentar mais de 5 glóbulos brancos/mm3, de preferência mais de 7 glóbulos brancos/mm3. 0 referido processo não é implementado num indivíduo cuja probabilidade de meningite bacteriana é tal, que a implementação do referido processo seja inútil. A título de exemplo de tais indivíduos, podem-se citar os indivíduos que tenham sido previamente submetidos a uma intervenção neurocirúrgica, os indivíduos que sofram de imunodepressão e os indivíduos que apresentem púrpura, um aspecto séptico e/ou tóxico e/ou convulsões. 0 referido processo não é implementado num indivíduo para ao qual tenha sido realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas antecedentes à colheita de uma amostra sanguínea e, eventualmente, de uma amostra de líquido cefalorraquidiano. 0 referido processo não é implementado com concentrações de procalcitonina e, eventualmente, de proteínas no líquido 22 cefalorraquidiano obtidas a partir de amostras cuja qualidade seja insuficiente. A titulo de exemplo de tais amostras, podem-se citar amostras de liquido cefalorraquidiano cuja colheita resultou numa hemorragia localizada do paciente. Tais amostras de liquido cefalorraquidiano apresentando então uma concentração de glóbulos vermelhos superior a 12.000 glóbulos vermelhos/mm3, de preferência superior a 10.000 glóbulos vermelhos/mm3.

Os exemplos que se seguem permitem ilustrar a invenção e são dados a titulo não limitativo.

EXEMPLOS I. Exemplo 1: Detecção da presença de uma meningite bacteriana numa população de 201 pacientes em que 21 sofrem de meningite bacteriana I.1 População estudada O estudo baseou-se em 201 crianças admitidas no hospital Saint-Vincent de Paul em Paris entre 2000 e 2004 para os pacientes que sofriam de meningite virai e entre 1995 e 2004 para os pacientes que sofriam de meningite bacteriana. O interesse deste estudo reside em particular no facto de ter sido conduzido numa grande população de pacientes nos quais a presença de uma meningite foi claramente estabelecida à posteriori, após o período de vacinação contra Haemophilus influenza b que se iniciou em 1994 tal como descrito na publicação de Dumonceaux et al. (Archives de Pédiatrie, 1999, vol. 6, páginas 617-624). A aplicação a estes 201 pacientes de diferentes regras conhecidas para distinguir as meningites bacterianas das 23 meningites virais tal como descrito anteriormente (Regras de Jaeger et al., Bonsu et al., Freedman et al., Ooestenbrink et al.) não permitiu detectar de uma maneira rápida e simples os pacientes que sofriam de meningites bacterianas com uma sensibilidade de 100%, uma boa especificidade e uma boa aplicabilidade clinica. Apenas a regra de Nigrovic et al. permitiu detectar o conjunto de pacientes que sofriam de uma meningite bacteriana com uma boa especificidade e uma boa aplicabilidade clinica. No entanto, a aplicação desta regra de Nigrovic et al. a uma grande população de 890 pacientes mostrou que a sensibilidade desta regra não era de 100% para as meningites bacterianas.

Em relação à arte anterior, os Inventores procuraram assim estabelecer um processo rápido e simples que permite distinguir as meningites bacterianas das meningites virais com uma sensibilidade de 100% para as meningites bacterianas.

De entre estas 201 crianças, apenas os pacientes cuja idade estava compreendida entre 28 dias e 16 anos foram tidos em consideração neste estudo para testar a eficácia do processo de detecção da presença de uma meningite bacteriana de acordo com a invenção.

Além disso, de entre estes 201 pacientes, apenas os pacientes que apresentavam mais de 7 glóbulos brancos/mm3 no seu liquido cefalorraquidiano, foram tidos em consideração neste estudo.

Entre estes 201 pacientes, os indivíduos cuja probabilidade de sofrerem de meningite bacteriana era tal que a implementação do processo de acordo com a invenção era 24 inútil, não foram tidos em consideração neste estudo. Assim os pacientes que tinham sido previamente submetidos a uma intervenção neurocirúrgica, os indivíduos sofrendo de imunodepressão e/ou os indivíduos que apresentavam púrpura, um aspecto séptico e/ou tóxico e/ou convulsões foram excluídos deste estudo.

Ademais, entre estes 201 pacientes, os indivíduos cuja qualidade das amostras não permitia a implementação do processo de acordo com a invenção não foram tidos em consideração neste estudo. Assim, os pacientes cuja colheita de líquido cefalorraquidiano resultou numa hemorragia, os pacientes que apresentavam mais de 10.000 glóbulos vermelhos/mm3, foram excluídos deste estudo.

Do mesmo modo, os pacientes para os quais tinha sido realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas anteriores à colheita de amostras sanguíneas de teste e eventualmente de líquido cefalorraquidiano, foram excluídos destes estudo.

Consequentemente, entre estes 201 pacientes apenas 167 pacientes foram utilizados para testar a eficácia de detecção da presença de uma meningite bacteriana de acordo com a invenção.

Entres estes 167 pacientes, sobre os quais o estudo foi conduzido, 146 pacientes foram diagnosticados como apresentando uma meningite virai e 21 pacientes foram diagnosticados como apresentando uma meningite bacteriana. Entre estes 21 pacientes, 11 foram admitidos no hospital Saint-Vincent de Paul em Paris entre 1995 e 1999 e 10 entre 2000 e 2004. Os patogénios responsáveis pela meningite bacteriana nestes 21 pacientes são Streptococcus pneumoniae em 10 pacientes, Neisseria meningitidis em 9 pacientes, 25

Haemophilus influenza í) em 1 paciente e Streptococcus grupo B em 1 paciente. 1.2 Determinação da concentração de procalcitonina numa amostra sanguínea de teste proveniente de um paciente

Foram colhidos 3 mL de sangue dos 167 pacientes com auxilio de uma agulha munida de uma seringa introduzida numa veia da prega do cotovelo dos pacientes.

As amostras de sangue foram centrifugadas durante 10 minutos a 3800 rpm à temperatura ambiente (cerca de 20°C) depois o plasma foi recuperado com o auxilio de uma pipeta de plástico. A concentração de procalcitonina nestas amostras foi determinada utilizando uma técnica imunoluminométrica com o auxilio do estojo LUMItest® PCT disponível em BRAHMS Diagnostica e de acordo com o protocolo de dosagem da Procalcitonina fornecido com este estojo. 1.3 Determinação da concentração de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano de teste proveniente de um paciente

Foram colhidos 2 mL de líquido cefalorraquidiano dos 167 pacientes com o auxílio de uma punção lombar. As amostras foram de seguida rapidamente utilizadas para a dosagem das proteínas totais de acordo com o método colorimétrico com vermelho de pirogalol através da utilização do estojo disponível em Roche Diagnostics com a referência «03515826» e de acordo com o protocolo fornecido com este estojo. I.I Determinação da presença de uma meningite bacteriana A determinação da presença de uma meningite bacteriana num paciente foi em seguida realizada em função da concentração 26 de procalcitonina no seu sangue e da concentração de proteínas no seu líquido cefalorraquidiano; estas concentrações foram obtidas de acordo com os métodos descritos respectivamente nos parágrafos anteriores 1.1 e 1.2. O número de pacientes possuindo uma concentração de procalcitonina no seu sangue superior ou igual a 0,5 ng/mL (PCT >0,5 ng/mL) e/ou uma concentração de proteínas no seu líquido cefalorraquidiano superior ou igual a 0,5 g/L (CSF >0,5 g/L) foi determinado.

Meningite bacteriana (n=21) Meningite virai (n=146) n O, o n O. O PCT > 0,5 ng/mL 16 89 15 11 PCT < 0,5 ng/mL 2 11 119 89 CSF >0,5 g/L 18 86 31 22 CSF < 0,5 g/L 3 14 112 78 PCT > 0,5 ng/mL ou CSF >0,5 g/L 21 100 85 58

Os inventores mostraram assim que todos os pacientes que sofriam de uma meningite bacteriana apresentavam tanto uma concentração de procalcitonina no seu sangue superior ou igual a 0,5 ng/mL (PCT >0,5 ng/mL) como uma concentração de proteínas no seu líquido cefalorraquidiano superior ou igual a 0,5 g/L (CSF >0,5 g/L).

Além disso, os inventores demonstraram que a determinação num paciente de uma concentração de procalcitonina no sangue superior ou igual a 0,5 ng/mL ou uma concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano superior ou igual a 0,5 g/L permite detectar todos os pacientes que sofram de meningite bacteriana.

De facto, os dois pacientes com uma meningite bacteriana que apresentavam uma concentração de procalcitonina no seu 27 sangue inferior a 0,5 ng/mL tinham uma concentração de proteínas no seu líguido cefalorraguidiano superior ou igual a 0,5 g/L. Os três pacientes com uma meningite bacteriana que apresentavam uma concentração de proteínas no seu líquido cefalorraquidiano inferior a 0,5 g/L tinham uma concentração de procalcitonina no seu sangue superior a 0,5 ng/mL.

Consequentemente, os inventores demonstraram que a combinação dos dois parâmetros biológicos, concentração de procalcitonina no sangue e concentração de proteínas no líquido cefalorraquidiano de um indivíduo, permite detectar a presença de uma meningite bacteriana num paciente de modo simples e rápido com uma sensibilidade de 100%. II. Exemplo 2: Detecção da presença de uma meningite bacteriana numa população de 202 pacientes dos quais 87 sofrem de meningite bacteriana A eficácia do processo de detecção da presença de uma meningite bacteriana de acordo com a invenção foi testada numa população de 202 pacientes dos quais 87 pacientes sofriam de meningite bacteriana. O estudo foi conduzido tal como descrito anteriormente no exemplo 1. O processo de acordo com a invenção permitiu detectar todos os pacientes que sofriam de meningite bacteriana.

Lisboa, 4 de Novembro de 2010

Claims

1/ REIVINDICAÇÕES 1. Processo in vitro de detecção da presença de uma meningite bacteriana compreendendo: i) a determinação da concentração de procalcitonina presente numa amostra sanguínea de teste; e ii) a comparação da concentração assim determinada com a concentração de procalcitonina presente numa amostra de referência ou com um valor de referência; e iii) a determinação da concentração de proteínas presentes numa amostra de líquido cefalorraquidiano de teste; e iv) a comparação da concentração assim determinada com a concentração de proteínas presentes numa amostra de referência ou com um valor de referência.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida amostra de referência do passo ii) ser escolhida de entre o grupo que compreende: uma amostra sanguínea proveniente de um indivíduo saudável; uma amostra sanguínea proveniente de um indivíduo no qual está presente uma meningite virai; e uma solução de procalcitonina a uma concentração determinada, em particular uma concentração de procalcitonina compreendida entre 0,05 ng/mL e 10 ng/mL, de preferência entre 0,1 ng/mL e 1 ng/mL.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o passo i) ser efectuado através de técnicas imunológicas quantitativas. 2/

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a referida amostra de referência do passo iv) ser escolhida de entre o grupo que compreende: uma amostra de liquido cefalorraquidiano proveniente de um individuo saudável, uma amostra de liquido cefalorraquidiano proveniente de um individuo no qual está presente uma meningite virai; e uma solução de proteínas a uma concentração determinada, em particular uma concentração de proteínas compreendida entre 0,05 g/L e 5 g/L, de preferência entre 0,1 g/L e 1 g/L.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicação 1 a 4, caracterizado por o passo iii) ser efectuado através de teste colorimétrico.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a referida amostra sanguínea de teste e eventualmente a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste ser proveniente de um indivíduo cuja idade está compreendida entre 2 semanas e 25 anos, de preferência entre 3 semanas e 18 anos.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a referida amostra sanguínea de teste e eventualmente a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste ser proveniente de um indivíduo que esteja estabelecido que sofra de uma meningite, em particular de um indivíduo que apresente mais de 5 glóbulos brancos/mm3, de preferência mais de 7 glóbulos brancos/mm3 no seu líquido cefalorraquidiano. 3/

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a referida amostra sanguínea de teste e eventualmente a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste não ser proveniente de um indivíduo que tenha sido previamente submetido a uma intervenção neurocirúrgica, de um indivíduo que sofra de imunodepressão e/ou de um indivíduo que apresente púrpura, um aspecto séptico e/ou tóxico e/ou convulsões.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a referida amostra sanguínea de teste e eventualmente a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste não ser proveniente de um indivíduo para o qual tenha sido realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas antecedentes à colheita da referida amostra sanguínea de teste e eventualmente da referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a referida amostra de líquido cefalorraquidiano de teste não apresentar uma concentração de glóbulos vermelhos superior a 12.000 glóbulos vermelhos/mm3, de preferência superior a 10.000 glóbulos vermelhos/mm3.

11. Estojo compreendendo: meios de detecção da procalcitonina e eventualmente uma solução de procalcitonina a uma concentração determinada; e meios de detecção de proteínas numa amostra de líquido cefalorraquidiano e eventualmente uma solução de proteínas a uma concentração determinada. 4/

12. Estojo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por os referidos meios de detecção da procalcitonina serem meios de implementação de técnicas imunológicas quantitativas compreendendo anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente à procalcitonina.

13. Estojo de acordo com uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado por os referidos meios de detecção de proteínas serem reagentes colorimétricos cuja reacção com as referidas proteínas permite determinar a sua concentração, sendo os referidos meios de detecção escolhidos de entre o grupo que compreende o vermelho de pirogalol, uma solução de amidoschwartz, uma solução de metanol acético ou uma mistura destes.

14. Utilização de um estojo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13 para o fabrico de uma ferramenta de diagnóstico da meningite bacteriana.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14 caracterizada por a referida ferramenta de diagnóstico estar destinada a indivíduos cuja idade está compreendida entre 2 semanas e 25 anos, de preferência entre 3 semanas e 18 anos.

16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15 caracterizada por a referida ferramenta de diagnóstico estar destinada a indivíduos que está estabelecido que estejam a sofrer de meningite, em particular indivíduos que apresentem mais de 5 glóbulos brancos/mm3, de preferência mais de 7 glóbulos brancos/mm3 no seu líquido cefalorraquidiano. 5/

17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16 caracterizada por a referida ferramenta de diagnóstico não estar destinada a indivíduos que tenham sido previamente submetidos a uma intervenção neurocirúrgica, indivíduos que sofram de imunodepressão e/ou indivíduos que apresentem púrpura, um aspecto séptico e/ou convulsões.

18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 caracterizada por a referida ferramenta de diagnóstico não estar destinada a indivíduos que apresentem mais de 12.000 glóbulos vermelhos/mm3, de preferência mais de 10.000 glóbulos vermelhos/mm3 no seu líquido cefalorraquidiano.

19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18 caracterizada por a referida ferramenta de diagnóstico não estar destinada a indivíduos nos quais tenha sido realizado um tratamento antibiótico nas 48 horas antecedentes à colheita nos referidos indivíduos de uma amostra sanguínea e eventualmente de uma amostra de líquido cefalorraquidiano.

20. Utilização de um estojo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13 num processo in vitro para detectar a presença de uma meningite bacteriana num indivíduo. Lisboa, 4 de Novembro de 2010