CN101718784B - 新生儿溶血病检测试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新生儿溶血病检测试剂盒的制备方法，由四张微柱凝胶卡组成，分别为具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡I、HDN产前预测卡II、HDN产后检测卡I及HDN产后检测卡II。所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的悬浮和分装。所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml，对羟基苯甲酸丙酯1.0-1.5)×10-4g/ml，甘氨酸(1.6-1.9)×10-2g/ml，氯化钠(1.7-1.8)×10-3g/ml，磷酸二氢钾(2.1-2.4)×10-4g/ml，磷酸氢二钠(4.6-4.8)×10-4g/ml，牛血清白蛋白≤2％，以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。采用本发明方法制备的新生儿溶血病检测试剂盒，灵敏度高，特异性好且质量稳定。专用于新生儿溶血病检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种用于血型鉴定血型血清学检测试剂盒及其应用。更具体的说，本发明涉及一种新生儿溶血病检测试剂盒的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。
(二)背景技术
新生儿溶血病(简称HDN)是指母婴血型不合，胎儿和新生儿的红细胞被母亲的IgG血型抗体包被，并在婴儿的网状内皮系统内受到破坏的免疫性溶血性疾病。
本病的病因是母婴血型不合。胎儿的血型基因一半来自母亲，另一半来自父亲，当胎儿由父体遗传获得的显性抗原恰为母体缺乏时，此抗原在妊娠时通过胎盘进入母体，刺激母体产生相应的免疫抗体，此抗体可因再次怀孕得到刺激而加强。这种抗体的性质为免疫性抗体，并且能够通过胎盘。一旦这种抗体通过胎盘进入胎儿血循环，就可能与胎儿红细胞上相应抗原结合，导致红细胞发生溶血现象，引起死胎、流产或早产。出生后表现为贫血、黄疸，严重会导致心力衰竭及核黄疸。
理论上，凡是以IgG性质出现的血型抗体都可以引起新生儿溶血病，但主要发生在ABO及Rh系统，其中Rh系统的新生儿溶血病病情较严重。其它血型系统不合溶血病如Kidd、MN、Duffy等也有报道，但极少见。抗P1、抗Lea、Leb等属IgM性质，不能通过胎盘，故不会产生HDN。
(1)ABO新生儿溶血病
ABO血型不合新生儿溶血病是由于母婴ABO血型不合，母体的IgG抗A或抗B经过胎盘进入胎儿血循环破坏胎儿红细胞引起HDN。由于自然界中广泛存在着A型和B型物质，如寄生虫感染、预防接种等都可以使孕妇产生免疫性抗A及抗B抗体，即孕妇体内可以在妊娠前已存在免疫性抗体，所以ABO系统新生儿溶血病可以在第一胎就发病。从理论上讲，母/子血型为O/A、O/B、A/B、B/A等组合都有可能使婴儿发生HDN，但实际上90％以上的HDN患儿母亲为O型，这与O型母亲含有丰富的IgG抗A(B)抗体有关。A(B)型母亲所生B、AB型(A、AB)新生儿仅少数发生溶血病。IgG抗A(B)抗体效价与溶血程度有一定相关性，但并非绝对，这可能与新生儿A、B抗原强弱、型物质的含量、胎盘的屏障作用及IgG亚类不同等有关，ABO HDN一般不易作到产前准确预报。
但由于ABO HDN的发病程度与母体内IgG抗A、抗B的效价有一定相关性。因此，可以定期检测孕妇体内IgG抗A(B)的效价来判断胎儿的受害情况，如果母体内IgG抗A(B)效价随着孕期增加而增长，提示胎儿受害的可能性增大。患儿出生后第二天出现黄疸，5天达高峰，一般有贫血，肝脾肿大等症状，严重者可引起核黄疸，智力低下或胎儿水肿。
(2)Rh新生儿溶血病
Rh HDN是由于母婴Rh血型不合所致的Rh免疫抗体作用于胎儿红细胞造成的高胆红素血症。Rh血型抗体只能由人类红细胞作为抗原刺激引起同族免疫作用而产生，Rh HDN一般可作到产前预报。
大部分Rh HDN发生在母亲是Rh阴性的情况，抗体种类有抗D、抗cD、抗DE、抗CD、抗CDE等，汉族人中大约60％与抗D有关。
由于新生儿溶血病是新生儿期的常见病之一，因此，对新生儿溶血病作产前预报、产后早期诊断以便及时采取防治措施是很重要的。要做到产前预报和产后早期诊断就必须对孕妇作正确的免疫学分析及血型血清学检查。
目前国内外HDN的免疫学分析及血型血清学检查项目：
(1)产前预测
1、夫妇双方的ABO血型，以及Rh(D)血型
2、女血清灭活IgM抗体后，与男红细胞的反应。
3、女血清灭活IgM抗体后，与O型筛选红细胞的反应。
4、女血清灭活IgM抗体后如果存在有意义的IgG抗体，则需要检测此抗体效价。
(2)产后检测
1、母和子的ABO血型，母Rh(D)血型
2、子红细胞直接抗人球蛋白试验
3、子血清中游离抗体检测
4、子红细胞放散液检测
5、母血清灭活IgM抗体后，针对子红细胞上抗原的IgG抗体效价2～4项中如果有一项为阳性，则诊断为新生儿溶血病。
其所采用的检测方法有酶试验法、凝聚胺法、微胶柱法、抗人球蛋白技术等方法，传统试管方法操作繁琐、易漏检、错检、微胶柱方法成本过高或使测得效价高于实际效价等。至今，国内外没有特定的易操作、成本低廉、专用于新生儿溶血病检测的试剂盒生产。
(三)发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好且质量稳定的新生儿溶血病检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：一种新生儿溶血病检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒由四张微柱凝胶卡组成，分别为一张HDN产前预测卡I、一张HDN产前预测卡II、一张HDN产后检测卡I及一张HDN产后检测卡II，所述HDN产前预测卡I具有6个微柱凝胶管，分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管。其中前三管用于检测女ABO/RhD血型，后三管用于检测男ABO/RhD血型；所述HDN产前预测卡II具有6个微柱凝胶管，皆为含有IgG抗体的凝胶管；其中第一和第二管用于夫妇交叉试验，其余四管用于IgG效价测定；所述HDN产后检测卡I具有6个微柱凝胶管，分别为一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和一管含有凝胶悬浮介质的凝胶管。其中前三管用于检测母亲ABO/RhD血型，后三管用于检测新生儿ABO血型；所述HDN产后检测卡II具有6个微柱凝胶管，皆为含有IgG抗体的凝胶管。第一管用于新生儿红细胞直接抗人球蛋白试验检测，第二和第三管用于新生儿血清中游离抗体检测，其余三管用于IgG抗体效价测定。
所述方法包括以下工艺过程：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯 (5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯 (1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸 (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠 (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾 (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠 (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清白蛋白 ≤2％，
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgG性质的抗人球蛋白试剂，要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见，与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与无IgG致敏的红细胞反应为阴性。
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，按需要分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶和含有IgG性质的抗人球蛋白凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。
步骤五、分装
按照每管22-28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡I、具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡II、具有6个微柱凝胶管的HDN产后检测卡I和具有6个微柱凝胶管的HDN产后检测卡II，从而组成了一套新生儿溶血病检测试剂盒。
本发明的有益效果是：
本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：
1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度；
2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内(30-60纳米)；
3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过；
4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力。国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对新生儿溶血病检测试剂盒的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对新生儿溶血病检测试剂盒的特异性产生的不良影响。
本发明的另一方面，为了保证本发明新生儿溶血病检测试剂盒的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。
本发明的再一方面，为了保证本发明新生儿溶血病检测试剂盒的质量，在制备过程中还对与凝胶混合的抗体原料进行筛选。
综上所述，本发明的新生儿溶血病检测试剂盒之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，四种微柱凝胶卡即可以保证完成产前的预测又能完成产后的检查，缓冲体系可以维持微柱凝胶卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。
用此新生儿溶血病检测试剂盒检测ABO或Rh血型，产生的阳性反应均不低于4+，要求抗人球蛋白凝胶检测的抗D效价、抗Jkb效价、抗Fya效价均不低于试管间接抗人球蛋白方法。一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。
总之，本发明的实施提供了标准化的新生儿检测产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的新生儿检测试剂盒，为尽早诊断和治疗新生儿溶血病创造了条件。
(四)具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。
实施例1：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯 (5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯 (1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸 (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠 (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾 (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠 (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清白蛋白 ≤2％，
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgG性质的抗人球蛋白试剂，要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见，与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与无IgG致敏的红细胞反应为阴性。
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，按需要分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶和含有IgG性质的抗人球蛋白凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。
步骤五、分装
按照每管22-28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片(6管/卡)的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡I、HDN产前预测卡II、HDN产后检测卡I和HDN产后检测卡II，从而组成了一套新生儿溶血病检测试剂盒。
步骤六、半成品测定
要求含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生4+的阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。要求抗人球蛋白凝胶检测的抗D效价、抗Jkb效价、抗Fya效价均不低于试管间接抗人球蛋白方法。
步骤七、封口
用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。
步骤八、保存试验
上述新生儿检测试剂盒保存了1年以上，在此保存期间，该新生儿检测试剂盒具有以下检测结果：
(1)外观
新生儿检测试剂盒中的抗A凝胶应呈均匀蓝色，抗B凝胶应呈均匀黄色，抗D凝胶应呈均匀白色，抗人球蛋白凝胶应呈均匀淡绿色，胶面上端有1～2mm清澈透明的无色透明液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物。
(2)灵敏度
抗A凝胶要求与A1、A1B、A2、A2B红细胞均产生4+凝集反应。即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。抗B凝胶要求与B和AB型红细胞产生4+凝集反应。抗D凝胶要求与A型RhD阳性、B型RhD阳性、AB型RhD阳性、O型RhD阳性红细胞产生4+凝集反应。要求抗人球蛋白凝胶检测的抗D效价、抗Jkb效价、抗Fya效价均不低于试管间接抗人球蛋白方法。
(3)特异性
含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。检测IgG性质抗D抗体，要求与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应，而和O型RhD阴性红细胞反应为阴性；检测IgG性质抗Jkb抗体，要求与O型Jkb阳性红细胞产生凝集反应，而与O型Jkb阴性红细胞反应为阴性；检测IgG性质抗Fya抗体，要求与O型Fya阳性红细胞产生凝集反应，而与O型Fya阴性红细胞反应为阴性。
Claims (1)
1.一种新生儿溶血病检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述试剂盒由四张微柱凝胶卡组成，分别为一张HDN产前预测卡I、一张HDN产前预测卡II、一张HDN产后检测卡I及一张HDN产后检测卡II，所述HDN产前预测卡I具有6个微柱凝胶管，分别是二管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、二管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管和二管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管；所述HDN产前预测卡II具有6个微柱凝胶管，皆为含有IgG抗体的凝胶管；所述HDN产后检测卡I具有6个微柱凝胶管，分别为二管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、二管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管和一管含有凝胶悬浮介质的凝胶管；所述HDN产后检测卡II具有6个微柱凝胶管，皆为含有IgG抗体的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8，
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的凝胶，
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64
选择IgG性质的抗人球蛋白试剂，要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与无IgG致敏的红细胞反应为阴性，
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶和含有IgG性质的抗人球蛋白凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶，
步骤五、分装
按照每管22-28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别按不同的用途加入到四张空白卡片的微柱管中，分别形成具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡I、具有6个微柱凝胶管的HDN产前预测卡II、具有6个微柱凝胶管的HDN产后检测卡I和具有6个微柱凝胶管的HDN产后检测卡II，从而组成了一套新生儿溶血病检测试剂盒。
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| Title |
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| Y. LAPIERRE et al..The gel test: a new way to detect red cell antigen-antibody reactions.《TRANSFUSION》.1990,第30卷(第2期),109-113. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101718784A (zh) | 2010-06-02 |
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