CN101718786A - 抗人球蛋白交叉配血卡的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人球蛋白交叉配血卡的制备方法，所述配血卡具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗人球蛋白试剂的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的配制和分装。所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml，对羟基苯甲酸丙酯1.0-1.5)×10^-4g/ml，甘氨酸(1.6-1.9)×10^-2g/ml，氯化钠(1.7-1.8)×10^-3g/ml，磷酸二氢钾(2.1-2.4)×10^-4g/ml，磷酸氢二钠(4.6-4.8)×10^-4g/ml，牛血清白蛋白≤2％，以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。本发明方法制备的抗人球蛋白交叉配血卡灵敏度高，特异性好且质量稳定。

Description

抗人球蛋白交叉配血卡的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种交叉配血卡及其应用。更具体的说，本发明涉及一种抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。

(二)背景技术

通过交叉配血试验可发现ABO血型鉴定错误、亚型、血型不合、不规则抗体等，正确进行交叉配血试验是安全输血的基础和保障。交叉配血试验是指受血者(患者)在输血前必须与供血者(待输用血)进行交叉配血，即必须保证受血者血清中不存在与献供血者红细胞上抗原起反应并导致供血者红细胞破坏的抗体。还要确保供血者血清中不存在与患者红细胞上抗原起反应并导致受血者红细胞破坏的抗体。目的是确保患者输用了供血者的血液后能在患者体内有效的存活，避免因输注不配合的血液成份所导致的不良溶血性输血反应，来保障安全、有效输血治疗的目的。

国家卫生部于2000年发文要求，凡输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩白细胞、手工分离浓缩血小板等的患者，应进行交叉配血试验。

在国内外，已经有部分厂家生产交叉配血卡，但其采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶的颗粒大小为70纳米以上，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得进行交叉配血试验的灵敏度降低。

(三)发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好且质量稳定的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种抗人球蛋白交叉配血卡的制备方法，所述配血卡具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗人球蛋白试剂(抗IgG)的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

选择抗人球蛋白试剂(抗IgG)，

抗IgG灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有含有抗人球蛋白试剂(抗IgG)的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的凝胶分别加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度。

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内。

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。

4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力。国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的特异性产生的不良影响。

本发明的另一方面，为了保证本发明抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。

本发明的再一方面，为了保证本发明抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)的质量，在制备过程中还需要对与凝胶混合的抗体原料进行筛选，其中：抗人球蛋白试剂(抗IgG)为最适稀释度，即抗人球蛋白试剂(抗IgG)经1∶2和1∶4稀释后对1∶16稀释的IgG性质抗D致敏的红细胞有肉眼可见凝集。

综上所述，本发明的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，缓冲体系可以维持分型卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。

用此抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)检测抗D、抗Jk^b、抗Fy^a效价，测得效价均不低于试管间接抗人球蛋白法。一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)，为准确进行交叉配血试验、保证安全输血创造了条件。

(四)具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

抗人球蛋白试剂(抗IgG)为最适稀释度，即：

选择抗人球蛋白试剂(抗IgG)，

抗IgG灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有抗人球蛋白试剂(抗IgG)的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的凝胶加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)。

步骤六、半成品测定

要求微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

步骤八、保存试验

上述抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)保存了1年以上，在此保存期间，该抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)具有以下检测结果：

(1)外观

微管内的抗人球蛋白凝胶应呈均匀绿色，胶面上端有1～2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物。

(2)灵敏度

用上述抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)检测抗D、抗Jk^b、抗Fy^a效价，测得效价均不低于试管间接抗人球蛋白法。

(3)特异性

要求微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。

实施例2：

1、在抗人球蛋白交叉配血卡(抗IgG)上对于每位供血者标记2管，分别为主侧和次侧管。

2、向主侧管中加入来自供血者的悬浮在LISS溶液中的0.8～1％体积百分比的红细胞50μl，后加入25μl受血者的血清或血浆，混合均匀。

3、向次侧管中加入受血者的悬浮在LISS溶液中的0.8～1％体积百分比的红细胞50μl，后加入25μl来自供血者的血清或血浆，混合均匀。

4、37℃孵育15分钟。

5、于微柱凝胶卡专用离心机离心5分钟，900rpm 2分钟，1500rpm3分钟，取出后肉眼判定结果，记录。

6、结果判定

6.1如果主侧管中的红细胞浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应，即受血者血清/血浆中的抗体与献血者的红细胞上的抗原为阳性反应，说明交叉配血主侧不相合。献血者的红细胞不能输用。

6.2如果次侧管中的红细胞浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应，即献血者血清/血浆中的抗体与受血者的红细胞上的抗原为阳性反应，说明交叉配血次侧不相合。献血者的血浆不能输用。

6.3如果主侧管的红细胞沉于微柱凝胶的底部，呈阴性反应，表明献血者的红细胞可以输用。如果次侧管的红细胞沉降于微柱凝胶的底部，表明献血者的血浆可以输用。如果主、次侧管均阴性，表明献血者的全血可以输用。

Claims (1)

1.一种抗人球蛋白交叉配血卡的制备方法，所述配血卡具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗人球蛋白试剂的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸          (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠          (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾      (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠      (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白    ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的凝胶；

步骤三、抗体的选择

选择抗人球蛋白试剂，

抗IgG灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清对照体积比1∶16稀释的IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集；

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有含有抗人球蛋白试剂的凝胶。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的凝胶分别加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的抗人球蛋白交叉配血卡。