CN102445550A - ABO、RhD血型定型试剂卡及其制备方法及其采用的抗体稀释液 - Google Patents
ABO、RhD血型定型试剂卡及其制备方法及其采用的抗体稀释液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ABO、RhD血型定型试剂卡及其制备方法及其采用的抗体稀释液，通过磷酸钠盐缓冲体系维持体系的pH值，添加了吐温80，去除凝胶保存液成份，并且使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。通过添加牛血清白蛋白保护抗体的效价，消除凝胶的非特异性吸附。采用叠氮钠降低微生物污染，延长产品的保存期，消除微生物污染带来的血型定型错误。并在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、湿热灭菌、洗涤，消除凝胶中含有的微生物，去除凝胶保存液成份以及破损的凝胶颗粒，大大提高了产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及血型定型测试领域，特别涉及一种ABO、RhD血型定型试剂卡及其制备方法及其采用的抗体稀释液。
背景技术
在临床治疗中，输血是抢救伤病员生命的重要手段和措施。为保证输血的安全，选用可靠的实验方法，采用特异性、灵敏度高的实验技术是非常重要的。
血型是人类血液的主要特征之一，表达了血液各种成份抗原的遗传性状，其中ABO血型及RhD血型成为输血和器官移植中重要的血型系统。
早在1907年，Hoktoen就首先提出了血型检定对输血治疗的重要性，Ottenberg等在1908年进一步提出了供受体血液交叉配合试验的概念，更强调血型检定对临床输血的深远意义。ABO血型不相容输血，几乎毫无例外要发生溶血性输血反应症状：弥漫性血管内凝血、肾衰以致死亡。因此，ABO血型的准确定型至关重要。
2000年卫生部颁发的《临床输血技术规范》(卫医发[2000]184号)第四章第十五条明确规定：“输血科(血库)要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型(正反定型)，并常规检查患者的Rh(D)血型，正确无误时可进行交叉配血。”英国药典中特别强调“检测ABO血型要检测红细胞抗原和血清或血浆中抗体两方面。”
1990年，Lapierre发表了微柱凝胶免疫实验技术，这是人类红细胞血型学发展的里程碑。美国输血学会《输血技术手册》第12版(1996年)起就已经将该技术列入红细胞血型检测的常规技术中。如今，在世界先进国家，该新技术正在取代应用多年的血凝试验，应用在红细胞血型血清学临床常规检验工作中。其一般采用以下步骤进行制备：
步骤一、凝胶悬浮介质的配置
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯 (5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯 (1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸 (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠 (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾 (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠 (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清蛋白 ≤4％
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；
步骤二、凝胶制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶或葡聚糖凝胶，用步骤一配制的凝胶悬浮介质或生理盐水浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次；
步骤三、凝胶的配置
将步骤二制备的凝胶与各抗体均按照体积比2∶1-6∶1的比例混合，分别配置成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质或生理盐水按照体积比2∶1-6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质或生理盐水的凝胶；
步骤四、分装
按照每管22-28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6各微柱凝胶管的ABO血型定型检测试剂卡。
在国内外，已经有部分厂家按照上述方法生产用于ABO血型定型和RhD定型的ABO/RhD血型定型检测试剂卡，但是存在以下两点不足：一方面其采用的凝胶为葡聚糖凝胶，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得进行ABO血型定型的灵敏度降低；另一方面悬浮凝胶的介质为大多为生理盐水或低离子强度溶液，不能有效保护抗体的稳定性，影响产品正定型的准确性。此两个缺点降低了ABO血型定型的准确性，容易导致ABO血型定型的错误，此外，已有的ABO血型定型卡仅进行ABO正定型，不进行ABO反定型，使用不方便。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、质量稳定、保质期长和能同时进行正反定型的ABO、RhD血型定型试剂卡及其制备方法及其采用的抗体稀释液。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、抗体稀释液的配制，所述抗体稀释液配方如下：甘氨酸：10-20g/L，磷酸氢二钠：0.30-0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30-0.50g/L，牛血清白蛋白：12-20g/L，吐温80：0.005-0.015g/L，注射用水加至1L；
步骤二：凝胶前处理
a.湿热灭菌：选用丙烯葡聚糖凝胶，按照质量体积比1∶1.2-1∶2加入生理盐水悬浮凝胶，进行湿热灭菌，湿热灭菌后备用；
b.洗胶：湿热灭菌后凝胶按照质量体积比1∶1.2-1∶2加入所述抗体稀释液，悬浮凝胶，凝胶静置时间不得少于6小时，以便凝胶自然沉降结实，倒去上清液，再加入质量体积比1∶1.2-1∶2的抗体稀释液，悬浮凝胶，如此重复至少2次，除去凝胶保存液成份、凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀的凝胶；
步骤三：配料
按照质量体积比1.3∶1-1.7∶1配制成IgM性质的单克隆抗A凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D凝胶；以及不含抗体的抗体稀释液的的凝胶，即中性胶；
步骤四：分装
将所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶、中性胶分别加入到微柱凝胶管中，前三管为抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶，后三管为中性胶。
步骤五：封口
将分装好的微柱凝胶卡的上部微柱凝胶管口进行封口处理。
优选的，所述抗体稀释液配方还包括以下组分：
氯化钠：1.5-2.0g/L，叠氮钠：0.005-0.015g/L。
优选的，所述分装是在微柱凝胶管中按照每管25-30ul的灌装量，分别灌注所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶和中性胶。
优选的，所述封口是用铝箔对微柱凝胶管口进行热力塑封。
优选的，所述封口步骤后增加步骤六：贴签，即封口完成后，在微柱凝胶管上贴签，形成ABO、RhD血型定型试剂卡。
优选的，在步骤六后增加步骤七：封装，即对ABO、RhD血型定型试剂卡进行无菌塑封和装盒。
一种用于制备权利要求1或2所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的抗体稀释液，其特征在于，所述抗体稀释液配方如下：
甘氨酸：10-20g/L，磷酸氢二钠：0.30-0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30-0.50g/L，牛血清白蛋白：12-20g/L，吐温80：0.005-0.015g/L，注射用水加至1L。
优选的，所述抗体稀释液还包括以下组分：
氯化钠：1.5-2.0g/L，叠氮钠：0.005-0.015g/L。
一种ABO、RhD血型定型试剂卡，其特征在于，所述ABO、RhD血型定型试剂卡采用权利要求1或2所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法制备。
采用本技术方案的有益效果是：通过磷酸钠盐缓冲体系维持体系的PH值，添加了吐温80，去除凝胶保存液成份，并且使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。通过添加牛血清白蛋白保护抗体的效价，消除凝胶的非特异性吸附。采用叠氮钠降低微生物污染，延长产品的保存期，消除微生物污染带来的血型定型错误。并在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、湿热灭菌、洗涤，消除凝胶中含有的微生物，去除凝胶保存液成份以及破损的凝胶颗粒，大大提高了产品的质量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1，
一种ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、抗体稀释液的配制，所述抗体稀释液配方如下：
氯化钠：1.5g/L，甘氨酸：20g/L，磷酸氢二钠：0.30g/L，磷酸二氢钠：0.50g/L，牛血清白蛋白：12g/L，叠氮钠：0.015g/L，吐温80：0.005g/L，注射用水加至1L；
步骤二：凝胶前处理
a.湿热灭菌：选用丙烯葡聚糖凝胶，按照质量体积比1∶1.2加入生理盐水悬浮凝胶，进行湿热灭菌，湿热灭菌后备用；
b.洗胶：湿热灭菌后凝胶按照质量体积比1∶2加入所述抗体稀释液，悬浮凝胶，凝胶静置时间为6小时，以便凝胶自然沉降结实，倒去上清液，再加入质量体积比1∶1.2的抗体稀释液，悬浮凝胶，如此重复2次，除去凝胶保存液成份、凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀的凝胶；
步骤三：配料
按照质量体积比1.3∶1配制成I gM性质的单克隆抗A凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D凝胶；以及不含抗体的抗体稀释液的的凝胶，即中性胶；
步骤四：分装
按照每管30u l的灌装量，将所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶、中性胶分别加入到微柱凝胶管中，前三管为抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶，后三管为中性胶。
步骤五：封口
将分装好的微柱凝胶卡用铝箔对微柱凝胶管口进行热力塑封。
步骤六：贴签，即封口完成后，在微柱凝胶管上贴签，形成ABO、RhD血型定型试剂卡。
步骤七：封装，即对ABO、RhD血型定型试剂卡进行无菌塑封和装盒。
实施例2，
一种ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、抗体稀释液的配制，所述抗体稀释液配方如下：
氯化钠：2.0g/L，甘氨酸：10g/L，磷酸氢二钠：0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30g/L，牛血清白蛋白：20g/L，叠氮钠：0.005g/L，吐温80：0.015g/L，注射用水加至1L；
步骤二：凝胶前处理
a.湿热灭菌：选用丙烯葡聚糖凝胶，按照质量体积比1∶2加入生理盐水悬浮凝胶，进行湿热灭菌，湿热灭菌后备用；
b.洗胶：湿热灭菌后凝胶按照质量体积比1∶1.2加入所述抗体稀释液，悬浮凝胶，凝胶静置时间为7小时，以便凝胶自然沉降结实，倒去上清液，再加入质量体积比1∶2的抗体稀释液，悬浮凝胶，如此重复3次，除去凝胶保存液成份、凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀的凝胶；
步骤三：配料
按照质量体积比1.7∶1配制成IgM性质的单克隆抗A凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D凝胶；以及不含抗体的抗体稀释液的的凝胶，即中性胶；
步骤四：分装
按照每管25ul的灌装量，将所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶、中性胶分别加入到微柱凝胶管中，前三管为抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶，后三管为中性胶。
步骤五：封口
将分装好的微柱凝胶卡用铝箔对微柱凝胶管口进行热力塑封。
步骤六：贴签，即封口完成后，在微柱凝胶管上贴签，形成ABO、RhD血型定型试剂卡。
步骤七：封装，即对ABO、RhD血型定型试剂卡进行无菌塑封和装盒。
实施例3，
一种ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、抗体稀释液的配制，所述抗体稀释液配方如下：氯化钠：1.8g/L，甘氨酸：15g/L，磷酸氢二钠：0.40g/L，磷酸二氢钠：0.45g/L，牛血清白蛋白：17g/L，叠氮钠：0.010g/L，吐温80：0.011g/L，注射用水加至1L；
步骤二：凝胶前处理
a.湿热灭菌：选用丙烯葡聚糖凝胶，按照质量体积比1∶1.8加入生理盐水悬浮凝胶，进行湿热灭菌，湿热灭菌后备用；
b.洗胶：湿热灭菌后凝胶按照质量体积比1∶1.7加入所述抗体稀释液，悬浮凝胶，凝胶静置时间为8小时，以便凝胶自然沉降结实，倒去上清液，再加入质量体积比1∶1.6的抗体稀释液，悬浮凝胶，如此重复至少2次，除去凝胶保存液成份、凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀的凝胶；
步骤三：配料
按照质量体积比1.5∶1配制成IgM性质的单克隆抗A凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D凝胶；以及不含抗体的抗体稀释液的的凝胶，即中性胶；
步骤四：分装
按照每管28ul的灌装量，将所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶、中性胶分别加入到微柱凝胶管中，前三管为抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶，后三管为中性胶。
步骤五：封口
将分装好的微柱凝胶卡用铝箔对微柱凝胶管口进行热力塑封。
步骤六：贴签，即封口完成后，在微柱凝胶管上贴签，形成ABO、RhD血型定型试剂卡。
步骤七：封装，即对ABO、RhD血型定型试剂卡进行无菌塑封和装盒。
实施例4，
一种ABO、RhD血型定型试剂卡，由一张聚丙烯塑料透明卡片并排六支微柱管，从左向右第一支至第三支微管分别充填抗A、抗B、抗D(单克隆抗体IgM试剂)凝胶，称之为特异性胶，检测人红细胞ABO、RhD抗原，第四支至第六支微管充填不含抗体的凝胶，称之为中性胶，第四支微管作为阴性对照管；第五支和第六支微管作为ABO血型反定型管。采用实施例1、实施例2或实施例3所述的方法制备而成。
实施例5，
一种用于制备实施例4所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的抗体稀释液，配方如下：
氯化钠：1.5g/L，甘氨酸：20g/L，磷酸氢二钠：0.30g/L，磷酸二氢钠：0.50g/L，牛血清白蛋白：12g/L，叠氮钠：0.015g/L，吐温80：0.005g/L，注射用水加至1L。
实施例6，
一种用于制备实施例4所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的抗体稀释液，配方如下：
氯化钠：2.0g/L，甘氨酸：10g/L，磷酸氢二钠：0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30g/L，牛血清白蛋白：20g/L，叠氮钠：0.005g/L，吐温80：0.015g/L，注射用水加至1L。
实施例7，
一种用于制备实施例4所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的抗体稀释液，配方如下：
氯化钠：1.8g/L，甘氨酸：15g/L，磷酸氢二钠：0.40g/L，磷酸二氢钠：0.45g/L，牛血清白蛋白：17g/L，叠氮钠：0.010g/L，吐温80：0.011g/L，注射用水加至1L。
上述实施例中所述的抗体稀释液，其配方各组分的配比范围为：
氯化钠：1.5-2.0g/L，甘氨酸：10-20g/L，磷酸氢二钠：0.30-0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30-0.50g/L，牛血清白蛋白：12-20g/L，叠氮钠：0.005-0.015g/L，吐温80：0.005-0.015g/L，注射用水加至1L。
采用本技术方案的有益效果是：通过磷酸钠盐缓冲体系维持体系的PH值，添加了吐温80，去除凝胶保存液成份，并且使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。通过添加牛血清白蛋白保护抗体的效价，消除凝胶的非特异性吸附。采用叠氮钠降低微生物污染，延长产品的保存期，消除微生物污染带来的血型定型错误。并在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、湿热灭菌、洗涤，消除凝胶中含有的微生物，去除凝胶保存液成份以及破损的凝胶颗粒，大大提高了产品的质量。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、抗体稀释液的配制，所述抗体稀释液配方如下：
甘氨酸：10-20g/L，磷酸氢二钠：0.30-0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30-0.50g/L，牛血清白蛋白：12-20g/L，吐温80：0.005-0.015g/L，注射用水加至1L；
步骤二：凝胶前处理
a.湿热灭菌：选用丙烯葡聚糖凝胶，按照质量体积比1∶1.2-1∶2加入生理盐水悬浮凝胶，进行湿热灭菌，湿热灭菌后备用；
b.洗胶：湿热灭菌后凝胶按照质量体积比1∶1.2-1∶2加入所述抗体稀释液，悬浮凝胶，凝胶静置时间不得少于6小时，以便凝胶自然沉降结实，倒去上清液，再加入质量体积比1∶1.2-1∶2的抗体稀释液，悬浮凝胶，如此重复至少2次，除去凝胶保存液成份、凝胶破损碎片，收集得到颗粒大小均匀的凝胶；
步骤三：配料
按照质量体积比1.3∶1-1.7∶1配制成IgM性质的单克隆抗A凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D凝胶；以及不含抗体的抗体稀释液的的凝胶，即中性胶；
步骤四：分装
将所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶、中性胶分别加入到微柱凝胶管中，前三管为抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶，后三管为中性胶。
步骤五：封口
将分装好的微柱凝胶卡的上部微柱凝胶管口进行封口处理。
2.根据权利要求1所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述抗体稀释液配方还包括以下组分：氯化钠：1.5-2.0g/L，叠氮钠：0.005-0.015g/L。
3.根据权利要求1或2所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述分装是在微柱凝胶管中按照每管25-30ul的灌装量，分别灌注所述抗A凝胶、抗B凝胶、抗D凝胶和中性胶。
4.根据权利要求3所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述封口是用铝箔对微柱凝胶管口进行热力塑封。
5.根据权利要求4所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，所述封口步骤后增加步骤六：贴签，即封口完成后，在微柱凝胶管上贴签，形成ABO、RhD血型定型试剂卡。
6.根据权利要求4所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法，其特征在于，在步骤六后增加步骤七：封装，即对ABO、RhD血型定型试剂卡进行无菌塑封和装盒。
7.一种用于制备权利要求1或2所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的抗体稀释液，其特征在于，所述抗体稀释液配方如下：
甘氨酸：10-20g/L，磷酸氢二钠：0.30-0.50g/L，磷酸二氢钠：0.30-0.50g/L，牛血清白蛋白：12-20g/L，吐温80：0.005-0.015g/L，注射用水加至1L。
8.根据权利要求7所述的抗体稀释液，其特征在于，所述抗体稀释液还包括以下组分：
氯化钠：1.5-2.0g/L，叠氮钠：0.005-0.015g/L。
9.一种ABO、RhD血型定型试剂卡，其特征在于，所述ABO、RhD血型定型试剂卡采用权利要求1或2所述的ABO、RhD血型定型试剂卡的制备方法制备。
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