CN101718794A - ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法 - Google Patents

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本发明涉及一种ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法，所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、二管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管和一管用于阴性对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的悬浮和分装。本发明方法制备的ABO/RhD血型定型检测试剂卡灵敏度高，特异性好，质量稳定且能同时进行正反定型。

Description

ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种血型定型卡及其应用。更具体的说，本发明涉及一种ABO/RhD血型定型检测试剂卡的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。
(二)背景技术
自1900年发现ABO血型以来，1907年由Hoktoen(美国科学家海克顿)首先提出了血型鉴定在输血治疗中的重要性。1908年其他学者又提出了交叉配合实验的概念，强调了血型鉴定的重要性。输血是临床抢救病人生命的重要医疗手段之一，正确鉴定血型是安全输血的首要步骤，ABO血型不相容在临床输血中会导致严重的即发性溶血性输血反应，危及患者生命。因此，ABO血型的准确定型至关重要，是安全输血的基础和保障。
Rh血型系统是仅次于ABO血型系统的重要血型系统，也是红细胞血型系统中最为复杂的一个系统，目前国际输血协会(ISBT)已确认Rh血型抗原有48个。Rh血型系统的5种主要抗原为D、C、E、c、e抗原，其中D抗原抗原性最强。红细胞表面含有D抗原为RhD阳性，红细胞表面不含有D抗原为RhD阴性。RhD阴性患者接受RhD阳性血液后，至少有20％患者会对D抗原发生免疫应答，在第二次体内接触该抗原后会发生溶血反应。另外，RhD阴性妊娠妇女的胎儿是RhD阳性时，在分娩或流产时，胎儿红细胞可能会通过胎盘进入母体，导致母体对D抗原发生免疫应答，该妇女再次妊娠时，可能发生新生儿溶血病。
卫生部在2000年就发文要求，规定每位供血及受血的个体均要进行ABO、Rh血型定型鉴定〔卫生部卫医发(2000)184号文件〕。
在国内外，已经有部分厂家生产用于ABO血型定型和RhD定型的ABO/RhD血型定型检测试剂卡，但其采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶的颗粒大小为70纳米以上，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得进行ABO血型定型的灵敏度降低。此外，已有的卡仅进行ABO正定型，不进行ABO反定型，降低了ABO血型定型的准确性，容易导致ABO血型定型的错误。
(三)发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好、质量稳定、能同时进行正反定型的ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：一种ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法，所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、二管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管和一管用于阴性对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管，
所述方法包括以下工艺过程：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸              (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠              (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清白蛋白        ≤4％。
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60内米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64。
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。
步骤五、分装
按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的ABO/RhD血型定型检测试剂卡。
本发明的有益效果是：
本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：
1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度。
2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内。
3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。
4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力。国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对ABO/RhD血型定型检测试剂卡的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对ABO/RhD血型定型检测试剂卡的特异性产生的不良影响。
本发明的另一方面，为了保证本发明ABO/RhD血型定型检测试剂卡的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。
本发明的再一方面，为了保证本发明ABO/RhD血型定型检测试剂卡的质量，在制备过程中还需要对与凝胶混合的抗体原料进行筛选。
综上所述，本发明的ABO/RhD血型定型检测试剂卡之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，各种凝胶的排列于一张卡上可以保证仅使用一张卡就能完成ABO血型正反定型和RhD血型定型，缓冲体系可以维持分型卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。
用此ABO/RhD血型定型检测试剂卡检测ABO血型和RhD血型，产生的阳性反应均不低于3+。一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。
总之，本发明的实施提供了标准化的ABO/RhD血型定型检测试剂卡产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的ABO/RhD血型定型检测试剂卡，为准确进行ABO血型正反定型和RhD血型定型、保证安全输血创造了条件。
(四)具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。
实施例1：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸              (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠              (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清白蛋白        ≤4％，
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。
用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64。
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶。
步骤五、分装
按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的ABO/RhD血型定型检测试剂卡。
步骤六、半成品测定
要求含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生≥3+的阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。
步骤七、封口
用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。
步骤八、保存试验
上述ABO/RhD血型定型检测试剂卡保存了1年以上，在此保存期间，该ABO/RhD血型定型检测试剂卡具有以下检测结果：
(1)外观：
ABO/RhD血型定型检测试剂卡中的抗A凝胶呈均匀蓝色，抗B凝胶呈均匀黄色，抗D凝胶和凝胶悬浮介质悬浮的凝胶呈均匀乳白色，胶面上端有1～2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物。
(2)灵敏度：
含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生≥3+的阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。
(3)特异性：
含有抗体的微柱凝胶管中，具有与抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面，呈现直线型。与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。而不含抗体只含有凝胶悬浮介质和凝胶混合物的凝胶管中红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部，呈现阴性反应。
实施例2：
所述ABO/RhD血型定型检测试剂卡使用方法如下：
1、ABO/RhD血型定型检测试剂卡有六个凝胶管。其中第一管为抗A凝胶，第二管为抗B凝胶，第三管为抗D凝胶，第四至第六管为空白凝胶(含有凝胶悬浮介质的凝胶)。第四、第五管分别加入待检血清(浆)用A型、B型试剂红细胞检测。第六管为阴性对照管。
2、用LISS溶液或生理盐水将待检者红细胞配制成0.8～1％(重量百分比)浓度，分别加入第一、第二、第三和第六支微管中，每管50μl。
3、将已知A型、B型红细胞用LI SS溶液或生理盐水调节至0.8～1％(重量百分比)浓度，分别加入到第四、五支微管中，每管50μl。
4、将待检者血清(浆)分别加入第四、第五、第六支微管中，每管25μl。
5、混匀后用微柱凝胶卡专用离心机离心，900rpm 2分钟，1500rpm 3分钟，取出后肉眼判定结果，记录。
6、判定结果
阳性结果：红细胞浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。
阴性结果：红细胞沉于微柱凝胶的底部。
血型判定见下表：
  抗A   抗B   抗D   A细胞  B细胞   阴性对照   结果
  +   0   +   0   +   0   A型D阳性
  0   +   +   +   0   0   B型D阳性
  0   0   +   +   +   0   O型D阳性
  +   +   +   0   0   0   AB型D阳性
  +   0   0   0   +   0   A型D阴性
  0   +   0   +   0   0   B型D阴性
  0   0   0   +   +   0   0型D阴性
  +   +   0   0   0   0   AB型D阴性
注：“+”为阳性“0”为阴性

Claims (1)

1.一种ABO/RhD血型定型检测试剂卡的制备方法，所述试剂卡上具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管分别是一管含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶管、一管含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶管、二管用于反定型的含有凝胶悬浮介质的凝胶管和一管用于阴性对照的含有凝胶悬浮介质的凝胶管，其特征在于：所述方法包括以下工艺过程：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10-4g/ml
甘氨酸          (1.6-1.9)×10-2g/ml
氯化钠          (1.7-1.8)×10-3g/ml
磷酸二氢钾      (2.1-2.4)×10-4g/ml
磷酸氢二钠      (4.6-4.8)×10-4g/ml
牛血清白蛋白    ≤4％，
以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8，
步骤二、凝胶的制备
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的凝胶，
步骤三、抗体的选择
选择IgM性质的单克隆抗A抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗B抗体，效价≥128
选择IgM性质的单克隆抗D抗体，效价≥64，
步骤四、凝胶的配制
将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的各抗体均按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有IgM性质的单克隆抗A抗体的凝胶、含有IgM性质的单克隆抗B抗体的凝胶和含有IgM性质的单克隆抗D抗体的凝胶；将步骤二制备的凝胶与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝胶悬浮介质的凝胶，
步骤五、分装
按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的各凝胶分别加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的ABO/RhD血型定型检测试剂卡。
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