CN105067820A - IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents

IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法 Download PDF

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孙兵
钱国强
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract

本发明涉及一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，包括以下步骤：凝胶悬浮介质的配制、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选、抗体的选择、含有抗IgG抗体凝胶的配制、分装和密封保存六个步骤。本发明IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法应用范围广、灵敏度高、特异性好并且稳定性高，对于及时分析、判断和干预治疗胎儿或新生儿溶血具有重要意义。

Description

IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
免疫球蛋白(IgG)是人体免疫的主要作用分子，在健康人血浆中占免疫球蛋白总量的75％，当某种病原体侵入人体后，其表面抗原可作为一种物质刺激人体的免疫系统，使机体对其产生特异性的免疫力，这种免疫力来自体内产生的抗体。由于一种IgG亚型水平降低可以伴有一种或几种其他的IgG亚型水平的增高，从而使IgG总量水平仍然正常。因此，即使IgG总量在正常范围或者稍低于正常值范围，也需要测定IgG亚型水平。
孕妇在漫长的妊娠过程中，由于胎母出血的现实存在，少量胎儿血液进入母体，当与胎母血型不合时，胎儿红细胞上的血型抗原会免疫母体产生血型特异性IgG抗体，这些抗体会通过胎盘屏障进入胎儿血液循环，并与相应红细胞结合，并在补体等参与下导致胎儿红细胞破坏、溶解，轻者造成新生儿黄疸，重者导致新生儿核黄疸甚至死亡等严重后果。临床统计资料显示，因血型不合导致的新生儿黄疸发生率在30-60％不等，主要是由于方法学差异不同所致。在临床工作实践中也经常见到，孕妇产前血型特异性抗体效价很高，但新生儿出生后却没有发生新生儿溶血现象。国外有研究显示，在Rh血型系统引起的新生儿溶血病中，母体血清中IgG1和IgG3的水平与发病有密切的相关性，不同IgG亚类在新生儿溶血中发挥的作用不同。要深入探讨IgG亚类在新生儿溶血中的不同作用，并采取不同的临床干预治疗，首先需要建立方便快捷的检测方法。美国Sigma公司的ELISA检测试剂，可以检测血液中总IgG亚类，但不能检测血型特异性IgG亚类，对临床诊断和治疗的参考价值有限，且该方法检查耗时长，不适合单个样品和急诊即时检测。因此，研究方便、快捷、直观的分类检测IgG亚类的方法，对于及时分析、判断和干预治疗胎儿或新生儿溶血具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好并且稳定性高的IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，所述检测试剂卡的制备方法如下：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质包括对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)x10-4g/ml、对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)x10-4g/ml、甘氨酸(1.6-1.9)x10-2g/m、氯化钠(1.7-1.8)x10-3g/m、磷酸二氢钾(2.1-2.4)x10-4g/ml、磷酸氢二钠(4.6-4.8)x10-4g/ml，以上试剂用蒸馏水溶解最终pH值为6.6-6.8；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片以及聚集的凝胶颗粒，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗IgG3、抗IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管22～28微升的量，分别加入到检查试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、密封保存
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶管的上口密封，贴标签标记后将IgG亚型分型检测试剂卡于18-25℃保存1年以上。
本发明IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，所述IgG亚型分型检测试剂卡上的八个微柱凝胶管分别是两管含有抗IgG1抗体的凝胶管、两管含有抗IgG2抗体的凝胶管、两管含有抗IgG3抗体的凝胶管和两管含有抗IgG4抗体的凝胶管。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、首次采用了微柱凝胶法检测血型特异性抗体IgG亚类，能够方便、快捷、直观的分类检测IgG亚类，对于及时分析、判断和干预治疗胎儿或新生儿溶血具有重要意义；
2、本发明所述IgG亚型分型检测试剂卡应用范围广泛。IgG亚型分型检测试剂卡检测母体血清中血型特异性抗体IgG亚型效价，及时分析、判断，为临床提供更加有效的预报ABO血型不合HDN的方法，更好的预防新生儿溶血病的发生。IgG亚型分型检测试剂卡检测新生儿血液中IgG亚型效价，确定IgG抗体亚型及含量与婴儿发病的关系，则可有效提高治疗的准确性。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。
实施例1
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)x10-4g/ml
对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)x10-4g/ml
甘氨酸(1.6-1.9)x10-2g/ml
氯化钠(1.7-1.8)x10-3g/ml
磷酸二氢钾(2.1-2.4)x10-4g/ml
磷酸氢二钠(4.6-4.8)x10-4g/ml
以上试剂用蒸馏水溶解，最终pH值为6.6-6.8；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片以及聚集的凝胶颗粒，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗IgG3、抗IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管22～28微升的量，分别加入到检测试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、半成品测定
在步骤五中的试剂卡的微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达并且沉积微柱凝胶管的底部；
步骤七、密封保存
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶管的上口密封，贴标签标记后将试剂卡于18-25℃保存1年以上。
在保存期间，IgG亚型分型检测试剂卡具有以下检测结果：
(1)外观
微柱凝胶管内的凝胶应呈均匀乳白色，凝胶上端有1～2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物；
(2)灵敏度
用上述IgG亚型分型检测试剂卡检测IgG类抗体效价，测得效价均不低于试管间接IgG亚型分型检测方法；
(3)特异性
要求微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。
实施例2
所述IgG亚型分型检测试剂卡使用方法如下：
1、IgG亚型分型检测试剂卡上的八个微柱凝胶管分别是两管含有抗IgG1抗体的凝胶管、两管含有抗IgG2抗体的凝胶管、两管含有抗IgG3抗体的凝胶管和两管含有抗IgG4抗体的凝胶管；
2、用生理盐水将待检新生儿红细胞调节至体积百分比为0.8～1％的红细胞，然后将调节后的红细胞吸取50U1分别加入到八个微柱凝胶管中；
3、将IgG亚型分型检测试剂卡放置在专用离心机中，先在900rpm下离心2分钟，然后在1500rpm下离心3分钟，取出后肉眼判定结果并作记录；
4、结果判定
阳性结果：红细胞浮在凝胶表面或凝胶中，则为阳性反应；
阴性结果：红细胞沉淀于凝胶的底部，则为阴性反应。
出现阳性结果所对应的微柱凝胶管，即为待检样本IgG亚型。

Claims (2)

1.一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，其特在于所述检测试剂卡的制备方法如下：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质包括对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)x10-4g/ml、对羟基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)x10-4g/ml、甘氨酸(1.6-1.9)x10-2g/m、氯化钠(1.7-1.8)x10-3g/m、磷酸二氢钾(2.1-2.4)x10-4g/ml、磷酸氢二钠(4.6-4.8)x10-4g/ml，以上试剂用蒸馏水溶解最终pH值为6.6-6.8；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片以及聚集的凝胶颗粒，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比2∶1～6∶1的比例混合，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗IgG3、抗IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管22～28微升的量，分别加入到检查试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、密封保存
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶管的上口密封，贴标签标记后将IgG亚型分型检测试剂卡于18-25℃保存1年以上。
2.根据权利要求1所述的一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，其特征是：所述IgG亚型分型检测试剂卡上的八个微柱凝胶管分别是两管含有抗IgG1抗体的凝胶管、两管含有抗IgG2抗体的凝胶管、两管含有抗IgG3抗体的凝胶管和两管含有抗IgG4抗体的凝胶管。
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