CN107202896B - 一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法 - Google Patents

一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法，所述试剂卡包括竖直固定板（1），所述竖直固定板（1）顶部设置有水平支撑板（2），所述水平支撑板（2）上设置有八个微柱型凝胶管（3），所述微柱型凝胶管（3）包括反应腔（3.1）和凝胶分离柱（3.2），所述反应腔（3.1）顶部设置有一圈凸缘（3.3），所述凝胶分离柱（3.2）内自上而下设置有多层分离网（3.4），所述水平支撑板（2）下方设置有支撑架（4），所述微柱型凝胶管（3）插装于支撑架（4）内，所述水平支撑板（2）上方设置有保护膜（5），所述保护膜（5）覆盖于八个微柱型凝胶管（3）的凸缘（3.3）上。本发明一种IgG亚型分型检测试剂卡及其制备方法，其灵敏度高、特异性好并且稳定性高，操作简单、快速，结果易判读。

Description

一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法。
背景技术
免疫球蛋白（IgG）是人体免疫的主要作用分子，在健康人血浆中占免疫球蛋白总量的75%，当某种病原体侵入人体后，其表面抗原可作为一种物质刺激人体的免疫系统，使机体对其产生特异性的免疫力，这种免疫力来自体内产生的抗体。由于一种IgG亚型水平降低可以伴有一种或几种其他的IgG亚型水平的增高，从而使IgG总量水平仍然正常。因此，即使IgG总量在正常范围或者稍低于正常值范围，也需要测定IgG亚型水平。
孕妇在漫长的妊娠过程中，由于胎母出血的现实存在，少量胎儿血液进入母体，当与胎母血型不合时，胎儿红细胞上的血型抗原会免疫母体产生血型特异性IgG抗体，这些抗体会通过胎盘屏障进入胎儿血液循环，并与相应红细胞结合，并在补体等参与下导致胎儿红细胞破坏、溶解，轻者造成新生儿黄疸，重者导致新生儿核黄疸甚至死亡等严重后果。临床统计资料显示，因血型不合导致的新生儿黄疸发生率在30-60%不等，主要是由于方法学差异不同所致。在临床工作实践中也经常见到，孕妇产前血型特异性抗体效价很高，但新生儿出生后却没有发生新生儿溶血现象。国外有研究显示，在Rh血型系统引起的新生儿溶血病中，母体血清中IgG1和IgG3的水平与发病有密切的相关性，不同IgG亚类在新生儿溶血中发挥的作用不同。要深入探讨IgG亚类在新生儿溶血中的不同作用，并采取不同的临床干预治疗，首先需要建立方便快捷的检测方法。美国Sigma公司的ELISA检测试剂，可以检测血液中总IgG亚类，但不能检测血型特异性IgG亚类，对临床诊断和治疗的参考价值有限，且该方法检查耗时长，不适合单个样品和急诊即时检测。因此，研究方便、快捷、直观的分类检测IgG亚型的方法，对于及时分析、判断和干预治疗胎儿或新生儿溶血具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种快速检测IgG亚型分类试剂卡及其制备方法，其灵敏度高、特异性好并且稳定性高，操作简单、快速。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种快速检测IgG亚型分类试剂卡，它包括竖直固定板，所述竖直固定板顶部设置有水平支撑板，所述水平支撑板上设置有八个微柱型凝胶管，所述微柱型凝胶管包括反应腔和凝胶分离柱，所述反应腔位于凝胶分离柱上方，所述反应腔顶部设置有一圈凸缘，所述凝胶分离柱内自上而下设置有多层分离网，所述凸缘搁置于水平支撑板，所述水平支撑板下方设置有支撑架，所述微柱型凝胶管插装于支撑架内，所述水平支撑板上方设置有保护膜，所述保护膜覆盖于八个微柱型凝胶管的凸缘上。
所述反应腔内壁上均匀设置有多个缓冲凸点。
所述水平支撑板正面平行设置有多个隔条，所述隔条设置于相邻两个微柱型凝胶管之间。
第一、第五个微柱型凝胶管内设置有抗IgG1抗体，第二、第六个微柱型凝胶管内设置有抗IgG2抗体，第三、第七个微柱型凝胶管内设置有抗IgG3抗体，第四、第八个微柱型凝胶管内设置有抗IgG4抗体。
一种快速检测IgG亚型分类试剂卡的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质包括对羟基苯甲酸甲酯（5.5-6.5）x10-4g/ml、对羟基苯甲酸乙酯（1.2-1.6）x10-4g/ml、甘氨酸（1.3-1.6）x10-2g/m、氯化钠（0.7-1.0）x10-3g/m、磷酸二氢钾（2.3-2.5）x10-4g/ml、磷酸氢二钠（4.4-5.0）x10-4g/ml、PEG400（2.2-2.5）x10-2g/ml、牛血清白蛋白（5.0-5.5）x10-3g/ml和脂肪酸酯复合物（3.5-3.8）x10-2g/ml，以上试剂用蒸馏水溶解最终pH值为6.6-6.8；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用3～5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡24～48小时，待凝胶充分膨胀后，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶颗粒；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比1:1~6:1的比例混合，间断搅拌均匀1～2小时，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗 IgG3、抗 IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管20~30µL的量，分别加入到检查试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、密封保存
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶管的上口密封，贴标签标记后将快速检测IgG亚型分类试剂卡于2-25℃保存1年以上。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明首次采用了微柱凝胶法检测血型特异性抗体IgG亚类，能够方便、快捷、直观的分类检测IgG亚类，对于及时分析、判断和干预治疗胎儿或新生儿溶血具有重要意义；
2、本发明一种快速检测IgG亚型分类试剂卡应用范围广泛。快速检测IgG亚型分类试剂卡检测母体血清中血型特异性抗体IgG亚型效价，及时分析、判断，为临床提供更加有效的预报ABO血型不合HDN的方法，更好的预防新生儿溶血病的发生。快速检测IgG亚型分类试剂卡检测新生儿血液中IgG亚型效价，确定IgG抗体亚型及含量与婴儿发病的关系，则可有效提高治疗的准确性。
附图说明
图1为本发明一种快速检测IgG亚型分类试剂卡的结构示意图。
图2为本发明一种快速检测IgG亚型分类试剂卡的实际临床样本检测结果。
图3为本发明一种快速检测IgG亚型分类试剂卡的实际临床样本检测结果。
图4为本发明一种快速检测IgG亚型分类试剂卡的实际临床样本检测结果。
其中：
竖直固定板1
水平支撑板2
微柱型凝胶管3
反应腔3.1
凝胶分离柱3.2
凸缘3.3
分离网3.4
缓冲凸点3.5
支撑架4
保护膜5
隔条6。
实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图1所示，本实施例中的一种快速检测IgG亚型分类试剂卡，它包括竖直固定板1，所述竖直固定板1顶部设置有水平支撑板2，所述水平支撑板2上设置有八个微柱型凝胶管3，所述微柱型凝胶管3包括反应腔3.1和凝胶分离柱3.2，所述反应腔3.1位于凝胶分离柱3.2上方，所述反应腔3.1顶部设置有一圈凸缘3.3，所述凝胶分离柱3.2内自上而下设置有多层分离网3.4，所述凸缘3.3搁置于水平支撑板2上，所述水平支撑板2下方设置有支撑架4，所述微柱型凝胶管3插装于支撑架4内，所述水平支撑板2上方设置有保护膜5，所述保护膜5覆盖于八个微柱型凝胶管3的凸缘3.3上；
所述反应腔3.1内壁上均匀设置有多个缓冲凸点3.5；
所述水平支撑板2正面平行设置有多个隔条6，所述隔条6设置于相邻两个微柱型凝胶 管3之间；
第一、第五个微柱型凝胶管3内设置有抗IgG1抗体，第二、第六个微柱型凝胶管3内设置有抗IgG2抗体，第三、第七个微柱型凝胶管3内设置有抗IgG3抗体，第四、第八个微柱型凝胶管3内设置有抗IgG4抗体。
其制备方法包括以下步骤：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：
对羟基苯甲酸甲酯（5.5-6.5）x10-4g/mL
对羟基苯甲酸乙酯（1.2-1.6）x10-4g/mL
甘氨酸 （1.3-1.6）x10-2g/mL
氯化钠 （0.7-1.0）x10-3g/mL
磷酸二氢钾 （2.3-2.5）x10-4g/mL
磷酸氢二钠 （4.4-5.0）x10-4g/mL
PEG400 （2.2-2.5）x10-2g/mL
牛血清白蛋白 （5.0-5.5）x10-3g/mL
脂肪酸酯复合物 （3.5-3.8）x10-2g/mL
以上试剂用蒸馏水溶解，最终pH值为6.6-6.8；PEG400增加了其他物质的溶解性，提高了凝胶悬浮介质的稳定性，不易变质，但是会产生气泡；牛血清白蛋白的主要成分为蛋白质、多肽和激素，蛋白质除了可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白、球蛋白和胎球蛋白促细胞附着，胎球蛋白促细胞附着可以增强抗体与凝胶颗粒的结合，提高了特异性和灵敏度，但是会产生一定的气泡，会影响检测结果的判断；脂肪酸酯复合物由脂肪酸酯和脂肪酰胺等物质组成，是一种抗酸消泡剂，可以很好的消除试剂中的气泡；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用3～5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡24～48小时，待凝胶充分膨胀后，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶颗粒；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比1:1~6:1的比例混合，间断搅拌均匀1～2小时，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗 IgG3、抗 IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管20~30µL的量，分别加入到检测试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、半成品测定
在步骤五中的试剂卡的微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，即红细胞可以全部通过凝胶到达并且沉积微柱凝胶管的底部；
步骤七、密封保存
用铝箔纸通过压膜方式将微柱凝胶管的上口密封，贴标签标记后将试剂卡于2-25℃保存1年以上。
在保存期间，检测IgG亚型分类试剂卡具有以下检测结果：
（1）外观
微柱凝胶管内的凝胶应呈均匀乳白色，凝胶上端有1～2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物；
（2）灵敏度
用上述一种快速检测IgG亚型分类试剂卡检测IgG类抗体效价，测得效价均不低于试管间接IgG亚型分型检测方法；
（3）特异性
要求微柱凝胶管中加入抗体后，与具有抗体相应抗原的红细胞产生阳性反应，即红细胞集中在凝胶上层表面或凝胶中。而与不含有抗体对应抗原的红细胞产生阴性反应，红细胞可以全部通过凝胶到达微管底部，沉积在微管底部。
所述一种快速检测IgG亚型分类试剂卡使用方法如下：
1、一种快速检测IgG亚型分类试剂卡上的八个微柱凝胶管分别是两管含有抗IgG1抗体的凝胶管、两管含有抗IgG2抗体的凝胶管、两管含有抗 IgG3抗体的凝胶管和两管含有抗 IgG4抗体的凝胶管；
2、用生理盐水将待检新生儿红细胞调节至体积百分比为0.8～1%的红细胞，然后将调节后的红细胞吸取50µL分别加入到八个微柱凝胶管中；
3、将检测IgG亚型分类试剂卡放置在专用离心机中，先在900rpm下离心2分钟，然后在 1500rpm下离心3分钟，取出后肉眼判定结果并作记录；
4、结果判定
阳性结果：红细胞浮在凝胶表面或凝胶中，则为阳性反应；
阴性结果：红细胞沉淀于凝胶的底部，则为阴性反应。
出现阳性结果所对应的微柱凝胶管，即为待检样本IgG亚型。
除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种快速检测IgG亚型分类试剂卡凝胶悬浮介质的制备方法：
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质包括对羟基苯甲酸甲酯（5.5-6.5）x10-4g/ml、对羟基苯甲酸乙酯（1.2-1.6）x10-4g/ml、甘氨酸（1.3-1.6）x10-2g/m、氯化钠（0.7-1.0）x10-3g/m、磷酸二氢钾（2.3-2.5）x10-4g/ml、磷酸氢二钠（4.4-5.0）x10-4g/ml 、PEG400（2.2-2.5）x10-2g/ml、牛血清白蛋白（5.0-5.5）x10-3g/ml和脂肪酸酯复合物（3.5-3.8）x10-2g/ml，以上试剂用蒸馏水溶解最终pH值为6.6-6.8；
步骤二、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶的筛选
选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，凝胶颗粒大小为30-60纳米，用3～5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡24～48小时，待凝胶充分膨胀后，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去破损的凝胶碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子，得到颗粒大小均匀、完整且呈球形的凝胶颗粒；
步骤三、抗体的选择
选择单克隆抗IgG1抗体，效价≥128；
选择单克隆抗IgG2抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG3抗体，效价≥32；
选择单克隆抗IgG4抗体，效价≥32；
步骤四、含有抗IgG抗体凝胶的配制
将步骤二得到的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶与步骤三的四种抗体按照体积比1:1~6:1的比例混合，间断搅拌均匀1～2小时，分别配制成含有抗IgG1、抗IgG2、抗 IgG3、抗 IgG4试剂的凝胶；
步骤五、分装
将步骤四配制的四种凝胶均按照每管20~30微升的量，分别加入到检查试剂卡的八个微柱管中，形成具有八个微柱凝胶管的IgG亚型分型检测试剂卡；
步骤六、密封保存
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