CN102435756A - ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，选用葡聚糖凝胶较之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶灵敏度准确性更高。应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时，又达到维持凝胶稳定的效果。

Description

ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法

技术领域

本发明提供一种ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，是对现有制备方法的改进，属于医学检测技术领域。

背景技术

人类红细胞血型是同种异型抗原，是人类遗传多态性标志之一。输血前血型定型和交叉配血是人类安全输血的保证，血型相容性检测是确保安全输血的最重要条件之一。

Rh血型系统是仅次于ABO血型系统的重要血型系统，也是红细胞血型系统中最为复杂的一个系统，目前国际输血协会（ISBT）已确认的Rh血型抗原有48个。其中D、C、c、E、e五种抗原抗原性最强，而D抗原抗原性又最强。由于RhD血型不合所引起的输血反应最为常见。

微柱凝胶免疫检测技术是20世纪90年代产生的一种免疫检测技术，其基本原理是利用分子筛技术，离心技术和特异性免疫反应技术原理，把血型血清学技术与凝胶分子筛技术有机结合起来，可灵敏地检测出可能存在的微弱血型抗原抗体反应，被认为是血型血清学检验的里程碑。

目前已有类似方法提出申请（申请号为200910234608.X），但是与本发明相比，其制备工艺不同，选用凝胶不同，并且在处理凝胶过程中本发明采用生理盐水进行处理，既能够达到是凝胶充分膨胀的作用，又能够节约生产成本。此外，在特异性抗体的选择配置过程中，本发明采用比较合理的溶液配比能够达到较好的检测结果。

发明内容

本发明提供一种ABO、RhD血型定型检测卡，具有灵敏度高、特异性好、质量稳定、易于操作、易于标准化、能同时进行正反定型的ABO、RhD血型定型。

本发明还提供了上述检测卡的制备方法，适用于工业化生产。

本发明提供一种ABO、RhD血型定型检测卡，具有以下结构：

一种ABO、RhD血型定型检测卡，其特征在于：

第一个微管中灌注抗A单克隆抗体微柱凝胶；

第二个微管中灌注抗B单克隆抗体微柱凝胶；

第三个微管中灌注抗D单克隆抗体微柱凝胶；

第四至第六个微管中灌注中性胶；

第四个微管作为阴性对照；

第五、第六微管作为反定型。

本发明所述 ABO 、 RhD 血型定型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

凝胶制备

将葡聚糖凝胶干粉用3～5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡24～48小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子；收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒；选用生理盐水进行凝胶的制备具有如下优点：

1.既能够达到是凝胶充分膨胀的作用，又能够节约生产成本；

2.浸泡24～48小时，能够使得凝胶充分溶胀，使得凝胶的膨胀率达到最佳，并减少凝胶的损失。

特异性抗体配制

取甘氨酸1.5×10^-3 g/ml、氯化钠0.85×10^-3 g/ml、磷酸二氢钠2.4×10^-3 g/ml、磷酸二氢钠4.8×10^-3 g/ml、牛血清白蛋白0.5～1%（每100ml特异性抗体溶液中含有0.5～1g牛血清白蛋白），以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6.6～6.8，然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A单克隆抗体效价≥128；

同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D溶液单克隆抗体，使得抗B单克隆抗体效价≥128，抗D单克隆抗体效价≥128；

本发明配方进行抗体配置具有如下优点：

在节约生产成本的基础之上，能够使得抗体溶液达到最佳的反应条件，并且能够最大限度的保护抗体，使得抗体效价在1～2年内，仍然抗A 效价≥128，抗B 效价≥128，抗D 效价≥128。

特异性凝胶配制

分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1:1～6:1比例混合，间断搅拌均匀25～35分钟，即为半成品特异性胶；

中性胶配制：用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照1:1～6:1混合，间断搅拌均匀1～2小时，即得半成品的中性胶；

本发明特异性凝胶配置，抗A、抗B和抗D特异性凝胶采用间断均匀25～35分钟，中性胶采用间断搅拌均匀1～2小时，能够使得抗体溶液与凝胶充分混匀，这样更加有利于检测时抗原抗体的充分反应，使得检测结果更加准确可信。

半成品检定

半成品检定主要进行特异性检测和抗体效价测定。

分装

按照每管24～26μl凝胶液，进行分装。

采取本发明使得特异性抗体具有如下特点：

1. 具有较强的缓冲能力，有利于保持整个反应体系处于要求的缓冲范围，同时保证反应体系的离子强度；

2. 本发明具有独特的润滑系统，采用一定浓度的牛血清白蛋白，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，并且比例适中，恰好使得无凝集的红细胞能够更加顺利的通过凝胶间隙，而凝集的红细胞团块则不能通过；

3. 本发明的另一关键在于反应介质的选择，经过反复试验最终选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶，而不是大多数厂家使用的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，使得检测准确性灵敏度更高。同时，应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时，又达到维持凝胶稳定的效果。适当的葡聚糖凝胶浸泡时间，对于凝胶的充分膨胀非常重要。经过合理配比方式，使得凝胶能够满足制备ABO、RhD血型定型检测卡的需要，并且能够保证其产品质量。

本发明的积极效果是：选用葡聚糖凝胶较之使用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶灵敏度准确性更高。应用生理盐水溶液作为凝胶悬浮介质，用于凝胶处理，在节约生产成本的同时，又达到维持凝胶稳定的效果。适当的葡聚糖凝胶浸泡时间，对于葡聚糖凝胶的充分膨胀非常重要。

附图说明

图1：阳性反应图片；

图2：可疑阳性反应图片；

图3：阴性反应图片；

图4：溶血反应图片；

图5：混合反应图片；

图6：实施例1卡式法检测结果；

图7：实施例1试管法检测结果；

图8：实施例2卡式法检测结果；

图9：实施例2试管法检测结果；

图10：实施例3卡式法检测结果；

图11：实施例3试管法检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果。但不限定本发明权利要求保护的内容。

实施例 1 ：

凝胶悬浮溶液的配制

本发明所述凝胶悬浮溶液为生理盐水，配方如下：

氯化钠 8.5g；加入蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容1,000ml，使其终浓度为0.85%。

凝胶的制备

选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶。将葡聚糖凝胶干粉，用3倍体积的步骤一中的凝胶悬浮溶液浸泡24小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次。除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子。收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒。

抗体的选择

抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体，由长春博德生物技术有限责任公司生产，效价≥128。

抗D单克隆抗体，由BiotestAG生产，由长春生物制品研究所经销，效价≥128。

特异性抗体溶液配方如下：

甘氨酸1.5×10-3 g/ml、氯化钠0.85×10-3 g/ml、磷酸二氢钠2.4×10-3 g/ml、磷酸二氢钠 4.8×10-3 g/ml、牛血清白蛋白0.8%（每100ml特异性抗体溶液中含有0.8g牛血清白蛋白）；

以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6.6。然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A效价≥128。

同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D单克隆抗体溶液，使得抗B 效价≥128，抗D 效价≥128。

特异性胶及中性胶的配制

特异性胶配制：分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1:1比例混合，间断搅拌均匀25分钟，即为半成品特异性胶。

中性胶配制：用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照2: 1比例混合，间断搅拌均匀1小时，即为半成品的中性胶。

半成品检定

1. 特异性检定

1.1材料

（1）试剂：ABO、RhD血型定型检测卡。

（2）红细胞标本：健康人A₁、A₁B、A₂、A₂B、O、B、ODCe/Dce(OR₁R₁)、OdcE/DcE(OR₂R₂)；Odce/dce（R₀r）ODCe/dce（R₁r）Odce/dce（Or’r）Odce/dce（Orr）分别用生理盐水溶液配制成0.5%红细胞悬液。

（3）已知A型和B型血清用于反定型。

1.2试验

每型0.5%红细胞悬液加入一个卡的第一至第四支微管中各50μl；向第五、六支微管中加入已知A型和B型血清各50 μl，再向第五支微管中加入A型0.5%红细胞悬液50μl，第六支微管中加入B型0.5%红细胞悬液50 μl。用专用离心机离心5分钟，900 rpm 2分钟，1,500 rpm 3分钟，肉眼观察结果。

1.3结果判定

（1）阳性结果和阴性结果判定：

阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。

阴性结果：被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的尖底部。

溶血结果：凝胶上清呈透明红色。

（2）特异性结果判定，见表1。

阳性结果的卡间差异不超½+；阴性结果不应出现凝集或溶血。

表1 ABO、RhD血型检定微柱凝胶试剂特异性检测

2. 效价检定

按2000版中国生物制品规程 抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）制造及检定规程2.4.3项进行。

检测结果：抗A单克隆抗体效价≥128；抗B单克隆抗体效价≥128；抗D单克隆抗体效价≥128。

分装

按照每管24μl凝胶液进行分装。微管凝胶卡片排列的六支微柱管中，依次分别是抗A特异性胶，抗B特异性胶，抗D特异性胶，阴性对照中性胶，反定型（A型红细胞）中性胶，反定型（B型红细胞）中性胶。

封口

将制备的微柱凝胶卡上部微柱管口用拥有专利技术的铝箔封口机进行热力塑封。

成品检定

1. 外观

外观整洁，塑卡透明或微带乳光，凝胶呈均匀微颗粒状，无干裂、无气泡、上清清晰，抗A微管中上清略呈兰色，抗B略呈黄色，抗D略呈灰色，其他三个中性胶管中上清为白色。无浑浊，无异物。封装无破损。

2. 分装量的质量控制指标

检查方法：容量法

记录与计算：

记录每次称量结果，按以下公式计算：

结果判定：

每卡装量均符合标示装量。

3. 密封密闭性质量控制指标

检查方法：质量法

结果判定：

①直立前后称重，重量相同，密封密闭合格。

②直立前后称重，重量减轻，密封密闭不合格。

检测结果合格

4. 特异性检定

同半成品检测方法。

5. 精密度测定

同一样本重复测定20次，结果一致。

应用说明（与试管法对比）

卡式法

1. 标本采集：采集被检对象静脉血，将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。

2. 红细胞标本的制备：配制0.5%红细胞生理盐水悬液。

3. 血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2,000rpm, 10分钟，取上清，该上清不得有絮状物或沉淀。

4. 实验步骤

（1）将微柱凝胶试剂卡的6个凝胶微管标号。

（2）将待检者0.5%红细胞悬液分别加入第1至第4支微管中，每管50μl。

（3）将待检者血清分别加入第5支和第6支微管中，每管50μl。

（4）将已知A型和B型红细胞0.5%浓度悬液，每管50μl分别加入第五和第六支微管中。

（5）即刻使用专用离心机离心5分钟，900 rpm 2分钟，1,500 rpm 3分钟，取出肉眼判定结果。

5. 结果判定

5.1阳性反应（4+，3+，2+，1+）；见图1：阳性反应。

阳性反应表示反应体系中有相应特异性的抗原抗体，反应强度以4+～1+依次减弱，具体如下：

4+为红细胞复合物位于凝胶表面；

3+为大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中上部；

2+为大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少布分位于凝胶中上部；

1+为红细胞复合物位于凝胶中近底部。

5.2可疑阳性反应（±）；见图2：可疑阳性反应。

可与在同一个凝胶试剂卡中同时孵育离心的阴性管结果对照，如与阴性结果有差别，判断可为±，为弱阳性反应；如同阴性结果一致，可判断其为阴性。

5.3阴性反应（-）；见图3：阴性反应。

离心后红细胞沉积在微柱凝胶管底部。表示反应体系中未有相应特异性的红细胞抗原抗体。

5.4溶血反应（H）；见图4：溶血反应。

微柱凝胶管中液体出现清澈透明红色，表示红细胞在微柱管中发生溶血。

完全溶血为微柱凝胶和液体中无凝集或未凝集的红细胞；

不完全溶血则可见残留红细胞在凝胶表面、胶中或胶底部。

5.5混合反应（M）；见图5：混合反应。

首先应明确混合反应是指反应体系中存在阳性反应，也存在阴性反应。在微柱凝胶管中，对某特异性抗体，同时存在阳性和阴性红细胞。离心后该抗体和阳性红细胞形成的抗原抗体复合物位于凝胶表面或胶中；而阴性红细胞位于微柱凝胶管底部。在抗原红细胞为新鲜红细胞时，阳性混合反应一般呈4+或3+，少数情况如阳性细胞上抗原性很弱，也可能呈很少细胞的3+或2+反应，但如果阳性反应为1+时，则很难辨别标本是混合反应还是非混合反应的若阳性反应，此时进一步区分混合标本还是非混合标本的临床意义往往不是很大。如确需搞清则可通过多次加入标本、离心，以增加混合标本中阳性细胞数量来进行分析。

应强调新鲜红细胞标本出现的混合反应格局和指示细胞（已经化学处理活化和固化的红细胞）的混合反应格局是不同的。

对于新鲜红细胞，在判断混合标本或非混合标本时，前者特点是阳性反应很强，但微柱凝胶管底部也有沉淀的阴性红细胞；而对于后者，根据阳性反应的强度，微柱凝胶管中的血液凝集块连续位于凝胶表面或胶中，强阳性管中凝胶底部没有或有极少的阴性红细胞。在应用指示红细胞的间接凝集试验中，阳性反应指示红细胞一般情况不位于凝胶中部；强阳性反应4+及阴性反应，与新鲜红细胞的反应格局一样，但对于3+～1+阳性反应只是部分指示红细胞位于凝胶表面，部分指示红细胞则位于凝胶管底部，3+为大部分指示红细胞位于凝胶表面，少部分沉于凝胶管底部；2+或1+则反之，少部分指示红细胞位于凝胶表面，大部分沉于凝胶管底部。

血型判定：见表2：

表2： 微柱凝胶免疫检测ABO、RhD血型检定

6. 注意事项

(1) 为了便于鉴别，抗A微管略呈兰色，抗B略呈黄色，抗D略呈灰色，其他三个中性胶管为白色。

(2) 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。

(3) 血清标本：血清标本必须充分去纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。

(4) 如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。

(5) 对于RhD阴性结果应按有关规定进一步的确认试验，必要时送血型参比实验室进行确认实验。

试管法

1. 标本采集：采集被检对象静脉血，将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。

2. 红细胞标本的制备：配制0.5%红细胞生理盐水悬液。

3. 血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2,000rpm, 10分钟，取上清，该上清不得有絮状物或沉淀。

4. 材料

（1）经国家批准的单克隆抗体或多克隆抗体的抗-A。

（2）经国家批准的单克隆抗体或多克隆抗体的抗-B。

（3）经国家批准的单克隆抗体或多克隆抗体的抗-D。

（4）A和B型标准红细胞。

5. 实验步骤

（1）检测红细胞（正定型）

① 在一支干净，有标记的试管中滴入1滴抗-A试剂。

② 在一支干净，有标记的试管中滴入1滴抗-B试剂。

③ 在一支干净，有标记的试管中滴入1滴抗-D试剂。

④ 轻摇试管，使内容物混匀。900～1000g离心15～30秒。

⑤ 轻轻重悬细胞沉淀，并检查凝集反应。

⑥ 结果判定

（2）检测血清（反定型）

① 在两支干净试管上标记A₁、B。

② 每管加2滴待检血清。

③ 标A₁的试管中加入1滴A₁细胞。

④ 标B的试管中加入1滴B细胞。

⑤ 轻摇试管，使内容物混匀。900～1000g离心15～30秒。

⑥ 检查覆盖在细胞沉淀上的溶血现象，轻轻重悬细胞沉淀，并检查凝集反应。

⑦ 结果判定。

6. 结果分析

（1）抗体试剂与待检红细胞发生凝集反应和红细胞试剂与待检血清发生的溶血或凝集反应均判读为阳性结果。

（2）细胞沉淀重悬后仍呈现细胞悬液状态为阴性结果。

步骤十结果比较

卡式法与试管法检测结果一致（见图6；图7），卡式法具有简便快捷、结果易于观察保存，操作易于标准化的优点。

实施例 2 ：

凝胶悬浮溶液的配制

本发明所述凝胶悬浮溶液为生理盐水，配方如下：

氯化钠8.5g；加入蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容1,000ml，使其终浓度为0.85%。

凝胶的制备

选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶。将葡聚糖凝胶干粉，用4倍体积的步骤一中的凝胶悬浮溶液浸泡36小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次。除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子。收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒。

抗体的选择

抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体，由长春博德生物技术有限责任公司生产，效价≥128。

抗D单克隆抗体，由BiotestAG生产，由长春生物制品研究所经销，效价≥128。

特异性抗体溶液配方如下：

甘氨酸 1.5×10-3 g/ml；氯化钠0.85×10-3 g/ml；磷酸二氢钠2.4×10-3 g/ml；磷酸二氢钠4.8×10-3 g/ml；牛血清白蛋白0.9%（每100ml特异性抗体溶液中含有0.9g牛血清白蛋白）；

以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6.7。然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A效价≥128。

同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D单克隆抗体溶液，使得抗B 效价≥128，抗D 效价≥128。

特异性胶及中性胶的配制

特异性胶配制：分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照3:1比例混合，间断搅拌均匀25分钟，即为半成品特异性胶。

中性胶配制：用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照4:1比例混合，间断搅拌均匀1小时，即为半成品的中性胶。

半成品检定

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

分装

按照每管25μl凝胶液进行分装。微管凝胶卡片排列的六支微柱管中，依次分别是抗A单克隆抗体特异性胶，抗B单克隆抗体特异性胶，抗D单克隆抗体特异性胶，阴性对照中性胶，反定型（A型红细胞）中性胶，反定型（B型红细胞）中性胶。

封口

将制备的微柱凝胶卡上部微柱管口用拥有专利技术的铝箔封口机进行热力塑封。

成品检定

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

应用说明

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

结果比较

卡式法与试管法检测结果一致（见图8；图9），卡式法具有简便快捷、结果易于观察保存，操作易于标准化的优点。

实施例 3 ：

凝胶悬浮溶液的配制

本发明所述凝胶悬浮溶液为生理盐水，配方如下：

氯化钠8.5g；加入蒸馏水溶解后，用蒸馏水定容1,000ml，使其终浓度为0.85%。

凝胶的制备

选择颗粒大小适中的葡聚糖凝胶。将葡聚糖凝胶干粉，用5倍体积的步骤一中的凝胶悬浮溶液浸泡48小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次。除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子。收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒。

抗体的选择

抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体，由长春博德生物技术有限责任公司生产，效价≥128。

抗D单克隆抗体，由BiotestAG生产，由长春生物制品研究所经销，效价≥128。

特异性抗体溶液配方如下：

甘氨酸 1.5×10-3 g/ml；氯化钠0.85×10-3 g/ml；磷酸二氢钠2.4×10-3 g/ml；磷酸二氢钠 4.8×10-3 g/ml；牛血清白蛋白1%（每100ml特异性抗体溶液中含有1g牛血清白蛋白）；

以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6.8。然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A效价≥128。

同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D单克隆抗体溶液，使得抗B 效价≥128，抗D 效价≥128。

特异性胶及中性胶的配制

特异性胶配制：分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照5:1比例混合，间断搅拌均匀35分钟，即为半成品特异性胶。

中性胶配制：用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照6:1比例混合，间断搅拌均匀2小时，即为半成品的中性胶。

半成品检定

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

分装

按照每管26μl凝胶液进行分装。微管凝胶卡片排列的六支微柱管中，依次分别是抗A单克隆抗体特异性胶，抗B单克隆抗体特异性胶，抗D单克隆抗体特异性胶，阴性对照中性胶，反定型（A型红细胞）中性胶，反定型（B型红细胞）中性胶。

封口

将制备的微柱凝胶卡上部微柱管口用拥有专利技术的铝箔封口机进行热力塑封。

成品检定

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

应用说明

方法同实施例1。

结果与实施例1一致。

结果比较

卡式法与试管法检测结果一致（见图10；图11），卡式法具有简便快捷、结果易于观察保存，操作易于标准化的优点。

Claims (2)

1.一种ABO、RhD血型定型检测卡，其特征在于：

第一个微管中灌注抗A单克隆抗体微柱凝胶；

第二个微管中灌注抗B单克隆抗体微柱凝胶；

第三个微管中灌注抗D单克隆抗体微柱凝胶；

第四至第六个微管中灌注中性胶；

第四个微管作为阴性对照；

第五、第六微管作为反定型。

2. 根据权利要求1所述ABO、RhD血型定型检测卡的制备方法，包括以下步骤：

凝胶制备

将葡聚糖凝胶干粉用3～5倍体积的生理盐水凝胶悬浮溶液浸泡24～48小时，待凝胶充分膨胀后，用凝胶悬浮溶液洗涤5次，然后再用蒸馏水洗涤5次，除去凝胶破损碎片和聚集的凝胶颗粒以及凝胶中过多的盐离子；收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形凝胶颗粒；

特异性抗体配制

取甘氨酸1.5×10^-3 g/ml、氯化钠0.85×10^-3 g/ml、磷酸二氢钠2.4×10^-3 g/ml、磷酸二氢钠4.8×10^-3 g/ml、牛血清白蛋白0.5～1%（每100ml特异性抗体溶液中含有0.5～1g牛血清白蛋白），以上试剂用蒸馏水溶解后，调PH为6.6～6.8，然后将其与抗A单克隆抗体混合，使得抗A单克隆抗体效价≥128；

同样配方配制抗B单克隆抗体、抗D溶液单克隆抗体，使得抗B单克隆抗体效价≥128，抗D单克隆抗体效价≥128；

特异性凝胶配制

分别取抗A单克隆抗体、抗B单克隆抗体和抗D单克隆抗体与已溶胀的葡聚糖凝胶按照1:1～6:1比例混合，间断搅拌均匀25～35分钟，即为半成品特异性胶；

中性胶配制：用生理氯化钠溶液与溶胀葡聚糖凝胶按照1:1～6:1混合，间断搅拌均匀1～2小时，即得半成品的中性胶；

半成品检定

半成品检定主要进行特异性检测和抗体效价测定；

按照每管24～26μl凝胶液，进行分装。

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